Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Kombinera Double Fluorescens Published: March 26, 2016 doi: 10.3791/53976
* These authors contributed equally

Abstract

Detektion av genuttryck i olika typer av hjärnceller, t.ex., neuroner, astrocyter, oligodendrocyter, oligodendrocyt prekursorer och mikroglia, kan hämmas av bristen på specifika primära eller sekundära antikroppar för immunfärgning. Här beskriver vi ett protokoll för att detektera uttrycket av tre olika gener i samma hjärnavsnittet under användning dubbel fluorescens in situ hybridisering med två genspecifika prober, följt av immunfärgning med en antikropp med hög specificitet riktad mot det protein som kodas av en tredje gen. Den Aspartoacyclase (ASPA) genen, mutationer av vilket kan leda till en sällsynt mänsklig vit substans sjukdom - Canavan sjukdom - tros uttryckas i oligodendrocyter och mikroglia men inte i astrocyter och neuroner. Men den exakta uttrycksmönstret av ASPA i hjärnan har ännu inte fastställts. Detta protokoll har tillåtit oss att bestämma att ASPA uttrycks i en delmängd av mogna oligodendrocyter ennd den kan i allmänhet tillämpas på ett brett spektrum av genuttryck mönsterstudier.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Gliaceller, som är de mest förekommande celler i det centrala nervsystemet (CNS), består av oligodendrocyter (de myeliniserande cellerna i CNS), oligodendrocyter prekursorer (OP, även känd som "NG2 celler"), astrocyter och mikroglia. Det finns ett växande intresse för funktioner gliaceller och deras potentiella roll i neurologiska sjukdomar 1. Till exempel är Canavan sjukdom (CD) en ärftlig neurodegenerativ sjukdom börjar tidigt i barndomen med spong leukodystrofi och en progressiv förlust av nervceller, vilket leder till döden vanligen före 10 års ålder 2,3. Mutationer i Aspartoacyclase (ASPA) gen som leder till drastiskt minskad ASPA aktivitet 4 i CD har identifierats. ASPA är ett enzym som katalyserar det deacetylering av N-acetylaspartate (NAA), en molekyl mycket koncentrerad i hjärnan, vilket genererar acetat och aspartat 5-7. Många CD patienter visar högre nivåer av NAA grund av brist på ASPA acvitet. Vissa studier spekulerar att NAA-härledda acetat kan vara en viktig källa av fettsyror / lipider i hjärnan under utveckling och CD kan bero på minskad myelinsyntes under utveckling som orsakas av fel i NAA att brytas ned 3,5,6.

ASPA återfinns framför allt i njurar, lever och vita substansen i hjärnan, och med tanke på den viktiga roll som ASPA CD har den cellulära uttryck av detta enzym i hjärnan studerats av flera laboratorier. Genom att titta på ASPA enzymatisk aktivitet i hjärnan, tidigare studier funnit att ökningen av ASPA aktivitet under hjärnans utveckling parallell tidsförloppet för myeline 8-10. På cellnivå, analyser för enzymatisk aktivitet liksom in situ hybridisering (ISH) och immunohistokemi (IHC) analyser tyder på att ASPA huvudsakligen uttrycks i oligodendrocyter i hjärnan men inte i neuroner eller astrocyter 11-16. Några studier har visat att ASPA kan ocksåuttryckas i mikroglia i CNS 12,14. Hittills uppgifter om ASPA uttryck i OPS är begränsade. Enligt en färsk studie där transcriptomes av olika celltyper i musen hjärnbarken inklusive neuroner, astrocyter, OP, nybildade oligodendrocyter, myeliniserande oligodendrocyter, mikroglia, endotelceller och pericyter analyserades med RNA-sekvensering 17, är ASPA uteslutande uttrycks i oligodendrocyter , i synnerhet i myeliniserande oligodendrocyter (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Trots dessa studier ASPA uttrycksmönster i hjärnan, ett antal osäkerheter kvarstår.

Olika tekniker kan användas för att studera gen-uttrycksmönster. IHC är ett vanligt använt förfarande för att detektera den funktionella produkten (dvs protein) av en genexpression i vävnadssnitt. Trots sin stora användbarhet, har denna teknik begränsningar som dess tillämpning och specificitet är föremål to tillgänglighet och specificitet av antikroppen behövs. Som jämförelse har ISH fördelen av att kunna avslöja expressionen av varje gen på mRNA-nivå. Det kan dock vara tekniskt utmanande att använda flera prober samtidigt för att lokalisera en genuttryck till specifika celltyper. I den här artikeln beskriver vi ett protokoll som kombinerar dubbel fluorescens RNA in situ hybridisering med fluorescens inmärkning av ett protein. Vi har använt denna uppsättning tekniker för att undersöka uttrycksmönstret för Aspa i mushjärna. Denna metod tillåter den exakta studier av genuttryck med användning av konfokalmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Etik uttalande:
Mus djurhållning och hantering är i enlighet med brittiska inrikesdepartementet regler och UCL riktlinjer etikkommittén, som överensstämmer med djuren (Scientific Procedures) Act 1986 i Storbritannien och dess tillägg Regulations 2012.

OBS: Samtliga lösningar bör göras med dietylpyrokarbonat (DEPC) - behandlat vatten för att förstöra eventuella kvarvarande RNas. För DEPC behandling, tillsätt DEPC (1 ml per liter), skaka kraftigt tills alla DEPC kulorna har försvunnit sedan autoklav för att försämra DEPC.

1. RNA Probe Synthesis

  1. VARNING: Vid hantering av formamid, bära personlig skyddsutrustning (PPE) och använda säkerhetsbänk. Förbereda hybridiseringsbuffert: DEPC-behandlat avjoniserat vatten med 50% (vol / vol) avjoniserad formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2 PO 4, 5 mM Na 2 HPO 4, 0,01 mg / ml jäst tRNA, 1 x Denhardts solutipå, och 10% vikt / vol dextransulfat.
  2. Välja en DNA-klon som innehåller cDNA-sekvensen av genen av intresse i en plasmid med RNA-polymeras-promotorer. För detta exempel, använda en pCMV-SPORT6 klon, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), med T7 och SP6 RNA-polymeras-promotorer för Aspa (Supplementary Figur 1).
  3. Förbereda lineariserad plasmid-DNA som mall.
    1. Växer den DNA-klon, extrahera plasmiden med en småskalig plasmid-reningskit enligt tillverkarens protokoll och sekvensen med T7 och SP6 universella primers.
    2. Smälta 1020 | ig plasmid-DNA med ett restriktionsenzym som klyver vid 5'-änden av sense-strängen av cDNA. För detta exempel, använda 100 enhet Sall att smälta pCMV-SPORT6- Aspa plasmid. Inkubera i 1,5 h vid 37 ° C
    3. Köra en liten alikvot på en agarosgel för att kontrollera att plasmiden är helt linjäriserad.
  4. rena denlineariserad plasmid med användning av fenol-kloroform.
    1. Lägga 1/10 volym av 3 M natriumacetat, en volym av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) - jämviktad fenol och en volym kloroform / isoamylalkohol (IAA) (24: 1).
    2. Centrifugera vid 16.000 xg i 1 min vid RT (20-25 ° C, RT) och extrahera övre vattenfasen.
    3. Lägga en volym kloroform / IAA, centrifugera vid 16.000 xg under 1 min och extrahera övre vattenfasen.
    4. Upprepa steg 1.4.3.
    5. Tillsätt 2 volymer etanol och lämna vid -20 ° C i 1 h eller O / N.
    6. Centrifugera vid 16.000 xg vid 4 ° C under 10 min. Kassera supernatanten.
    7. Tvätta pelleten med 70% kall etanol och återsuspendera vid approximativt 1 | j, g cDNA per 2,5 ^ i TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
  5. Syntetisera de två sonderna, en märkt med digoxigenin (DIG) och den andra med fluorescein isotiocyanat (FITC).
    1. Välja lämplig RNA-polymeras för att göra anti-sense sond (komplementär till mål-mRNA). För detta exempel använda T7 RNA-polymeras för att göra Aspa prob.
    2. Förbereda in vitro transkriptionsreaktion: tillsätt 1 | j, g av den linjäriserade DNA, 4,0 | il 5 x transkriptionsbuffert, 6,0 | il av 100 mM DTT, 2,0 ^ il 10 x DIG eller FITC-RNA märkningsblandning innehållande dNTPs, 1 | j, l RNas-inhibitor, och 20 till 40 enheter av RNA-polymeras; göra den slutliga volymen upp till 20 | il med DEPC-behandlat vatten.
    3. Inkubera vid 37 ° C i 1,5 h.
  6. RUN1 xl av transkriptionsreaktionen på en 1,0% agarosgel för att kontrollera att reaktionen har fungerat. Gelén bör visa den linjära mallen och ett ljust band av sonden.
  7. Gör upp volymen till 100 pl med hybridiseringsbuffert och lagra 10 l alikvoter vid -80 ° C.

2. Perfusion, Fixering och Tissue Collection

  1. VARNING: Vid hantering av paraformaldehyd (PFA), både fast ochVatten, bära skyddsutrustning och använda säkerhetsbänk. Framställa formaldehydlösning genom upplösning av 4% (vikt / volym) PFA in 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) lösning med användning av värme (55 ° C). Filtrera formaldehydlösningen med filterpapper.
  2. Förbereda sackaroslösning genom att lösa 20% (vikt / volym) sackaros i destillerat vatten och tillsätt 0,1% (volym / volym) DEPC lösning. Lämna O / N vid RT med en lös lock och sedan autoklav.
  3. Terminalt söva en mus genom intraperitoneal injektion av pentobarbiton (50 mg / kg). Utvärdera anestesidjupet av tå nypa och frånvaron av tillbakadragande reflex indikerar djup anestesi.
  4. När musen är under djup anestesi, göra ett snitt under bröstkorgen och skär genom bröstkorgen på båda sidor, lyft att exponera hjärtat.
  5. Infoga en 25 G-nål in i den vänstra kammaren hos hjärtat. Göra ett litet snitt i det högra förmaket av hjärtat.
  6. BEGJUTA djuret med 20 ml PBS och därefter 40 ml formaldehydlösning. För P30 och äldremöss, använd en perfusionshastighet av 12 ml / min men för yngre djur använder en lägre hastighet (7-10 ml / min).
  7. Dissekera hjärnan.
    1. Sever musen huvudet med kirurgisk sax genom att göra ett snitt posterior från öronen. Gör en kaudal mittlinje snitt i huden och arbeta rostrally att ta bort huden från skallen.
    2. Med början från den kaudala delen, skär genom toppen av skallen längs mittlinjen och mellan ögonen med Iris sax. Avlägsna parietala och frontala benplattor genom att luta en sida av en benplatta varje gång och snäppa bort det med pincett.
    3. luta försiktigt hjärnan uppåt från den främre delen med pincett och skär synnerverna och andra kranialnerver. Lyft försiktigt hjärnan ur skallen.
  8. Placera hjärnan i en mus coronal hjärn matris. Skiva hjärnan i tre approximativt 4 mm bitar med en fjäder rakblad.
  9. Överföra skivor i 4% PFA-lösning och inkubera O / N vid 4 ° C.
  10. överföring hjärnaskivor för att DEPC-behandlat 20% sackaroslösning och inkubera O / N vid 4 ° C
  11. Placera varje hjärna skiva i en torr cryomould, omge med optimal skär temperatur (oktober) medium och frysa på torris. Förvara vid -80 ° C.

3. cryosectioning

  1. Skär 15 um sektioner av fryst vävnad i en kryostat och samla sektionerna på objektglas. Om det behövs, fukta sektionerna med DEPC-behandlat PBS och platta till dem med en fin pensel.
  2. Lämnar objektglasen torka i ungefär 1 h för att säkerställa att vävnaden häftar vid sliden.

4. Hybridisering

  1. Förbered 65 ° C tvättbuffert: 150 mM NaCl, 15 mM Na-3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1x salin natriumcitrat), 50% (volym / volym) formamid och 0,1% (volym / volym) Tween- 20.
  2. Förbereda MABT buffert: 100 mM maleinsyra, 150 mM NaCl, 0,1% (volym / volym) Tween-20, pH 7,5.
  3. Späd de två sonderna (DIG-märkta och FITC-labelled) 1/1000 i hybridiseringsbuffert förvärmas till 65 ° C och blanda väl.
  4. Applicera cirka 300 pl hybridiseringsblandning på varje bild, coverslipwith ugnsbakade (200 ° C) täck och inkubera O / N vid 65 ° C i en fuktig kammare.
  5. Överför objektglasen i ett Coplin innehållande förvärmda tvättbuffert. Tvätta bilderna i 30 min två gånger vid 65 ° C med tvättbuffert.
  6. Tvätta bilderna i 10 min tre gånger med MABT vid RT.

5. Visualisering av FITC Probe

  1. Förbereda ISH blockerande buffert: MABT med 2% blockeringsreagens och 10% värmeinaktiverat fårserum.
  2. Valfritt: använda en hydrofob penna för att rita cirklar runt de vävnadssnitt på objektglaset för att minska volymen av antikroppslösningar krävs.
  3. Inkubera objektglasen under 1 h vid RT med ISH blockerande buffert i en fuktig kammare.
  4. Inkubera objektglasen O / N vid 4 ° C med en pepparrotsperoxidas (POD) - konjugatd anti-FITC-antikropp utspätt 1/500 (volym / volym) i ISH blockeringsbuffert.
  5. Placera objektglasen i ett Coplin innehållande PBS med 0,1% (volym / volym) Tween-20 (PBST). Tvätta 3 gånger i 10 min i PBST och ersätt med färsk PBST varje gång.
  6. Omedelbart före användning, förbereda fluorescerande tyramide genom att späda 100 gånger i Amplification spädningsmedel. I det här exemplet använda FITC-tyramid.
  7. Lägg till detta att bilderna och låt stå i 10 minuter vid RT.
  8. Placera objektglasen i ett Coplin och tvätta 3 gånger i PBST under 10 min.

6. Visualisering av DIG Probe

  1. Förbereda 0,1 M Tris-HCl, pH 8,2.
  2. Inkubera objektglasen med ISH blockerande buffert under 1 h vid RT.
  3. Inkubera objektglasen O / N vid 4 ° C med alkalisk fosfatas (AP) -konjugerad anti-DIG-antikropp utspädd 1/1500 (volym / volym) i ISH blockeringsbuffert.
  4. Tvätta med MABT under 10 minuter tre gånger.
  5. Tvätta två gånger med 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 under 5 minuter vid RT.
  6. Omedelbart före användning, förbereda Fast Red lösning genom upplösning av tabletterna i 0,1 M Tris pH 8,2. Filtrera lösningen genom ett 0,22 pm filter.
  7. Inkubera objektglasen vid 37 ° C med Fast Red lösning i en fuktad kammare. Eftersom tiden för optimal utveckling varierar, kontrollera bilderna regelbundet med ett fluorescerande mikroskop för att övervaka bildningen av fällning. För detta exempel, stoppa reaktionen efter 2-3 h.
  8. Tvätta med PBST i 10 min tre gånger.

7. Immunohistokemi

  1. Förbered IHC blockerande buffert: 10% (v / v) serum (av en annan art till primär antikropp värd) i PBST.
  2. Inkubera objektglasen med IHC blockerande buffert under 1 h vid RT i en fuktig kammare.
  3. Förbered primära antikroppen: Späd den primära antikroppen vid en lämplig spädning i PBST med 5% serum (av en annan art till primär antikropp värd). I det här exemplet använder en kanin anti-Olig2 antikropp vid 1/400 (v / v) utspädning.
  4. Inkubera i den primära antikroppen lösning vid 4 ° CO / N.
  5. Tvätta med PBST i 10 min tre gånger.
  6. Förbered sekundär antikropp: Späd en fluorofor-konjugerad sekundär antikropp vid en lämplig spädning i PBST med 5% (volym / volym) serum (från en annan art till primär antikropp värd) och 0,1% (v / v) Hoechst 33258. För detta exempel använd en åsna anti-kanin Alexa647 sekundär antikropp vid 1/1000 (v / v) utspädning.
  7. Inkubera i den sekundära antikroppslösningen vid RT under 1 timme.
  8. Tvätta med PBST i 10 min tre gånger.

8. Monterings

  1. Delvis Torka glasen vid rumstemperatur, och montera med en fluorescensmonteringsmedium. Låt objektglasen torka och sedan bilden i ett konfokalmikroskop enligt 10X, 20X och 63x mål med 4 olika kanaler med följande exciteringsvåglängder: 570 nm för Fast Red, 488 nm för FITC, 647 nm för Olig2 inmärkning och 350 nm för Hoechst .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den här artikeln beskriver en metod för en dubbel fluorescens ISH följt av inmärkning i mushjärna avsnitt. En kort beskrivning av detta protokoll visas i figur 1. Det första steget var att syntetisera prober som är specifika för Aspa och Mbp (myelinbasprotein). För att kontrollera att sondema hade syntetiserats gjordes en liten alikvot av varje reaktion kördes på en agarosgel. Svag linjär mall och en stor mängd av den RNA-prob kan ses (Figur 2). Dubbel fluorescens ISH för Aspa och Mbp, följt av Olig2 inmärkning och Hoechst nukleär färgning, utfördes på mus hjärnsektioner. Vi skannade hjärnan avsnitt i en konfokalmikroskop och sys bilderna tillsammans för att avslöja fördelningen av genuttryck signaler i hjärnan. Aspa uttryck i Mbp -positivt (MBP +) celler observerades över hela behå i (Figur 3). Vi har även granskat Aspa uttryck i olika hjärnstrukturer med hjälp av en högre förstoring. Aspa-uttryck i oligodendrocyter i hjärnbarken och corpus callosum visas i figur 4. Den sam-lokalisering av Mbp, Olig2 och aspa indikerar att aspa uttrycks i en underuppsättning av mogna oligodendrocyter i hjärnbarken och corpus callosum (Figur 4). dessa resultat visar att detta protokoll samtidigt kan detektera uttrycket av tre olika gener i hjärnsektioner.

Figur 1
Figur 1. Protokoll för Double fluorescens in situ hybridisering Följt av immunfärgning. Detta protokoll löper över 5 dagar och detekterar uttrycket av tre gener./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Undersökning av Aspa RNA Probe på agarosgel. Den linjära mall och en stor del av RNA-sond av en mindre molekylvikt kan observeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Dubbel fluorescerande in situ-hybridisering för Aspa och Mbp i mus hjärnsektioner. Aspa (röd) och Mbp (grön) i hjärnan. Skala bar:. 500 pm Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Expression av Aspa i Oligodendrocyter i cortex och corpus callosum. Paneler visar representativa bilder ISH för Aspa (röd) och Mbp (grön), följt av immunfärgning av Olig2 (blå) i kombination med Hoechst-färgning. Aspa uttrycktes i några M Mbp + / Olig2 + celler i cortex (A och B) och i corpus callosum (C och D). bp + / Olig2 + / Aspa + celler indikeras med pilar och Mbp + / Olig2 + / Aspa - celler indikeras med pilar i de förstorade panelerna (B och D). Skalstrecken: 100 | am (A och C); 20 pm (B och D). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande Figur 1

Kompletterande Figur 1. Sekvens och karta över Aspa Clone (IRAVp968C0654D). 1,5 kb cDNA-sekvensen för Aspa sattes in i pCMV-Sport6 ​​plasmid (A). Kartan över pCMV-Sport6-Aspa plasmiden visas i (B).m / filer / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att ladda ner filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Detta protokoll ger en steg-för-steg-procedur för en dubbel-RNA in situ-hybridisering följt av immunfärgning. Vi har använt detta protokoll för att bekräfta att Aspa uttrycks i mogna oligodendrocyter i flera områden i hjärnan.

Detta förfarande i flera steg har många potentiella fallgropar som kan påverka känsligheten och bör undvikas. Först, alla lösningar och lagrings buffertar för transkriptionsreaktionen måste vara RNas-fri. För det andra, är valet av cDNA-schabloner viktigt och vi föredrar mallar ca 1 kb i längd. Det är nödvändigt att rensa upp cDNA mallar med fenol / kloroformextraktion och åter fälla dem innan transkription in vitro. Dessutom måste transkriptionen av sonden vara optimal; Om sonden inte produceras i tillräcklig mängd, kommer det att minska kvaliteten på ISH. kan kontrolleras genom att undersöka den på en agarosgel kvaliteten av sonden och god kvalitet kommer att varaframgår av den starka ljusstyrkan av sonden bandet jämfört med mallen bandet (Figur 2). Vid användning av dubbel ISH används två olika märkta prober används, vanligen en märkt med DIG och den andra med FITC. FITC-märkta sonden anses vara den minst detekterbara och bör väljas om mål-mRNA förväntas bli högst i vävnaden. Denna sond brukar utarbetas första och det DIG-märkta sonden är utvecklad sekund.

En annan avgörande steg är vävnadspreparatet. Möss perfuserades med DEPC-behandlat PBS följt av 4% PFA, post-fixerades i 4% PFA O / N och därefter kryoskyddades i 20% sukros lösningar som har DEPC-behandlade för att förstöra eventuellt kvarvarande RNas. Fixering tid är ganska viktigt; över- eller under fixering kan leda till en svagare signal, kanske på grund av minskad sondpenetration (över fixering) eller nedbrytning av mRNA (under fixering). Vävnaden därefter cryosectioned och två sönder hybridiseras O / N. formamidenanvänds i hybridiseringsbuffert måste avjoniserat. En mycket viktig faktor under O / N hybridisering vid 65 C är för att undvika avdunstning och koncentration av hybridiseringsblandningen eftersom det kan äventyra känslighet. I experimentet som beskrivs vi utfört hybridisering vid 65 CO / N, men det kan vara värt att försöka lägre temperaturer för olika sönder, om det verkar vara svårt att detektera mål-mRNA.

Det finns ett val av reagens för att detektera de hybridiserade proberna. Fast Red är ett känsligt fluorescerande reagens, men inte alla partier av Fast Red ger samma resultat. Det behöver AP för utveckling och ger fluorescens med rodamin excitering. Enligt vår erfarenhet, är det viktigt att göra det färska med 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 och filtrera den före användning. En icke-fluorescerande alternativ är färgutveckling med nitro-blue tetrazolium (NBT) och 5-brom-4-klor-3'-indolyphosphate (BCIP) som arbetar med samma AP-konjugerad antikropp. anofins alternativ är att använda fluorescerande tyramide för detektion. Även fluorescerande tyramide system är inte de mest känsliga metoder är under utveckling reaktion med pepparrotsperoxidas mycket snabb och det finns åtminstone tre fluorescerande färger (FITC, Cyanine 3 och Cyanine 5) som kan användas. En begränsning av detta protokoll är att vissa målantigener (eller epitoper), särskilt låga överflöd proteiner, kanske inte upptäckas efter ISH processen och därmed inte lämpar sig för IHC efter ISH. I vår immunfärgning, antikropp upptäckt av Olig2 verkar opåverkad. Användaren måste välja rätt antikropp för inmärkning följande ISH.

IHC och ISH används ofta tekniker för genuttryck mönster studier, och båda har fördelar och nackdelar. IHC är en mycket känslig metod för att detektera cellulära uttrycket av gener i hjärnan sektioner, men dess beroende av antikroppen påverkar dess specificitet och begränsar dess tillämpning. Däremot har ISH en hög specificity och sonden av vilken gen som helst kan lätt syntetiseras genom transkription in vitro med användning av genspecifika cDNA som mall. Protokollet som vi utvecklat utnyttjar båda metoderna, som kombinerar dubbel ISH med IHC att uppnå trippel detektion av genuttryck med hög specificitet.

Kort sagt, det protokoll som vi beskriver här möjliggör samtidig färgning av två mRNA och ett protein, så det ger ett användbart verktyg för att illustrera samlokaliserade genuttryck. Trots att mRNA-expression inte alltid korrelerar med proteinuttryck, är ISH en kraftfull teknik som gör det möjligt för oss att undersöka genuttryck med hög specificitet. Vår protokoll dubbel fluorescens ISH i kombination med IHC har visat sig vara en framgång i att upptäcka Aspa uttryck i en delmängd av oligodendrocyter i hjärnvävnaden hos vuxna möss, och det kan lätt anpassas för en mängd olika vävnader av olika ursprung och utvecklingsstadier. Dessutom, detta protokollkan också användas för att detektera uttryck av små RNA såsom miRNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
QIAprep Miniprep Qiagen 27104
Deionized formamide Sigma F9037 for ISH blocking buffer
Sodium chloride Sigma S3014
Trizma Base Sigma T1503
Hydrochloric acid VWR International 20252.290
Sodium phosphate monobasic anhydrous Sigma S8282
Sodium phosphate dibasic dihydrate Sigma 30435
Yeast tRNA Roche 10109495001
50x Denhardt's solution Life Technologies 750018
Dextran sulfate Sigma D8906
Aspa cDNA clone Source Bioscience IRAVp968C0654D
SalI New England Biolabs R0138
Sodium acetate Sigma S2889
Equilibrated phenol Sigma P4557
Chloroform Sigma-Aldrich C2432
Isoamyl alcohol Aldrich 496200
Ethanol VWR International 20821.321
T7 RNA polymerase Promega P4074
Transcription buffer Promega P118B
100 mM DTT Promega P117B
UTP-DIG NTP mix Roche 11277073910
Rnasin Promega N251B
Paraformaldehyde Sigma P6148
Filter paper Fisher scientific 005479470
Sucrose Sigma 59378
Diethyl pyrocarbonate Sigma D5758
Pentobarbitone Animalcare Ltd BN43054
Dissecting scissors World Precision Instruments 15922
25 gauge needle Terumo 300600
Peristaltic pump Cole-Parmer Instrument Co. Ltd WZ-07522-30
Iris scissors Weiss 103227
No.2 tweezers World Precision Instruments 500230
Coronal Brain Matrix World Precision Instruments RBMS-200C
Razor blade Personna Medical PERS60-0138
OCT medium Tissue tek 4583
Cryostat/microtome Bright
Superfrost plus slides Thermo Scientific J1800AMNZ
Sodium citrate Sigma S4641 for 65 °C wash buffer
Formamide Sigma-Aldrich F7503
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379
Coverslips VWR International 631-0146
Coplin Jar Smith Scientific Ltd 2959
Blocking reagent Roche 11096176001
Heat-inactivated sheep serum Sigma S2263
Hydrophobic pen Cosmo Bio DAI-PAP-S 1:500
α-FITC POD-conjugated antibody Roche 11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System Perkin Elmer NEL741001KT 1:1,500
α-DIG AP-conjugated Roche 11093274910
Fast red tablets Roche 11496549001
.22 µM filter Millex SLGP033RS
α-Olig2 Rabbit antbody Millipore AB9610
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody Life technologies A-31573 1:1,000
bisBenzimide H 33258 sigma B2883
Mounting medium Dako S3023
Leica SP2 confocal microscope Leica

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10, (11), 1355-1360 (2007).
  2. Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28, (6), 941-953 (2003).
  3. Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56, (4), 477-483 (2014).
  4. Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5, (2), 118-123 (1993).
  5. Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32, (4), 550-551 (1989).
  6. Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8, (8), 468-470 (1992).
  7. Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81, (2), 89-131 (2007).
  8. D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20, (4), 1275-1278 (1973).
  9. Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79, (1), 211-220 (2001).
  10. Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505, (2), 206-210 (2012).
  11. Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14, (14), 1837-1840 (2003).
  12. Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472, (3), 318-329 (2004).
  13. Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20, (12), 2139-2141 (2006).
  14. Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59, (10), 1414-1434 (2011).
  15. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107, (2), 176-182 (2002).
  16. Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140, (1), 105-115 (2003).
  17. Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34, (36), 11929-11947 (2014).
Kombinera Double Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering med inmärkning för detektion av uttryck av tre gener i mus hjärnsektioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jolly, S., Fudge, A., Pringle, N., Richardson, W. D., Li, H. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (109), e53976, doi:10.3791/53976 (2016).More

Jolly, S., Fudge, A., Pringle, N., Richardson, W. D., Li, H. Combining Double Fluorescence In Situ Hybridization with Immunolabelling for Detection of the Expression of Three Genes in Mouse Brain Sections. J. Vis. Exp. (109), e53976, doi:10.3791/53976 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter