Abstract
Påvisning av genuttrykk i forskjellige typer hjerneceller for eksempel, nevroner, astrocytter oligodendrocytes, oligodendrocyte forløpere og microglia, kan bli hemmet av mangel på spesifikke primære eller sekundære antistoffer for immunfarging. Her beskriver vi en protokoll for å påvise ekspresjon av tre forskjellige gener i den samme hjernen delen ved å bruke dobbel fluorescens in situ hybridisering med to genspesifikke prober, etterfulgt av farging med et antistoff med høy spesifisitet rettet mot proteinet kodet for av en tredje genet. Den Aspartoacyclase (ASPA) genet, mutasjoner av noe som kan føre til en sjelden human hvit substans sykdom - Canavan sykdom - antas å bli uttrykt i oligodendrocytter og mikroglia, men ikke i astrocytter og nevroner. Har imidlertid ennå ikke etablert nøyaktig uttrykk mønster av ASPA i hjernen. Denne protokollen har tillatt oss å fastslå at Aspa er uttrykt i en undergruppe av moden oligodendrocytes ennd det kan generelt anvendes på et bredt spekter av genuttrykksmønstrene studier.
Introduction
Gliaceller, som er de mest tallrike cellene i sentralnervesystemet (CNS), omfatter oligodendrocytter (de myelinerende celler av CNS), oligodendrocytter forløpere (OPS, også kjent som "NG2 celler"), astrocytter og microglia. Det er økende interesse for funksjonene til gliacellene og deres potensielle roller i nevrologiske sykdommer 1. For eksempel Canavan sykdom (CD) er en arvelig nevrodegenerativ lidelse starter tidlig barndom med spongiform leukodystrophy og et progressivt tap av nerveceller, som fører til døden vanligvis før 10 års alder 2,3. Mutasjoner i Aspartoacyclase (ASPA) genet som fører til drastisk redusert aktivitet ASPA 4 i CD har blitt identifisert. ASPA er et enzymet som katalyserer deacetyleringen av N-acetylaspartate (NAA), et molekyl som sterkt konsentrert i hjernen, genererer acetat og aspartat 5-7. Mange CD-pasienter viser høyere nivåer av NAA grunn av mangel på Aspa activitet. Noen studier spekulerer i at NAA-avledet acetat kan være en viktig kilde av fettsyrer / lipider i hjernen under utvikling og CD kan være resultatet av redusert myelin syntese under utvikling som skyldes svikt i NAA å bli brutt ned 3,5,6.
ASPA hovedsakelig funnet i nyre, lever og hvit substans i hjernen, og gitt den viktige rollen ASPA i CD, har den cellulære ekspresjon av dette enzym i hjernen blitt studert av flere laboratorier. Ved å se på Aspa enzymatisk aktivitet i hjernen, tidligere studier har funnet at økningen i Aspa aktivitet under hjernens utvikling paralleller tidsforløpet av myelination 8-10. På cellenivå, analyser analyser for enzymatisk aktivitet, så vel som in situ hybridisering (ISH) og immunhistokjemi (IHC) antyder at ASPA er hovedsakelig uttrykt i oligodendrocytter i hjernen, men ikke i neuroner eller astrocytter 11-16. Noen studier har funnet at Aspa kanskje ogsåuttrykkes i mikroglia i sentralnervesystemet 12,14. Så langt data på Aspa uttrykk i OPS er begrenset. Ifølge en fersk studie der transcriptomes av ulike celletyper i musen hjernebarken inkludert nevroner, astrocytter, ops, nydannede oligodendrocytes, myelinerende oligodendrocytter, microglia, endotelceller, og pericytes ble analysert ved RNA sekvense 17, Aspa utelukkende uttrykt i oligodendrocytes , spesielt i myelinerende oligodendrocytter (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Til tross for disse studiene på Aspa uttrykk mønster i hjernen, en rekke usikkerheter forbli.
Forskjellige teknikker kan brukes til å studere genuttrykksmønster. IHC er en vanlig brukt metode for å påvise den funksjonelle produkt (dvs. protein) av en genekspresjon i vevssnitt. Til tross for sin flotte verktøyet, har denne teknikken begrensninger som sin søknad og spesifisitet er under to tilgjengeligheten og spesifisiteten av antistoffet er nødvendig. Til sammenligning har ISH fordelen av å være i stand til å avsløre ekspresjon av hvilket som helst gen på mRNA-nivå. Men det kan være teknisk vanskelig å benytte flere prober samtidig for å lokalisere en genekspresjon til spesifikke celletyper. I denne artikkelen beskriver vi en protokoll som kombinerer dobbel fluorescens RNA in situ hybridisering med fluorescens immunomerking av et protein. Vi har brukt dette sett av teknikker for å undersøke ekspresjon mønster av Aspa i musehjerne. Denne metoden gir den nøyaktige studier av genekspresjon ved hjelp av konfokal mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etikk Uttalelse:
Mus drifta og håndtering er i samsvar med britisk hjemmekontoret forskrifter og UCL etiske komité retningslinjer, i samsvar med de Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act 1986 av Storbritannia og dets endringsforskriften 2012.
MERK: Alle løsninger bør gjøres med dietylpyrokarbonat (DEPC) - behandlet vann for å ødelegge eventuelle gjenværende RNase. For DEPC behandling, legg DEPC (1 ml per liter), rist kraftig til alle DEPC kulene har forsvunnet da autoklaver å degradere DEPC.
1. RNA Probe Synthesis
- FORSIKTIG: Når du håndterer formamide, slitasje personlig verneutstyr (PVU) og bruke et sikkerhetskabinett. Forbered hybridiseringsbuffer: DEPC-behandlet deionisert vann med 50% (v / v) deionisert formamid, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 5 mM NaH 2PO 4, 5 mM Na2 HPO 4, 0,01 mg / ml gjær tRNA, 1 x Denhardts solution, og 10% vekt / volum dekstransulfat.
- Velge en DNA-klon som inneholder cDNA-sekvensen av genet av interesse i et plasmid med RNA polymerase promotorer. For dette eksempelet bruker en pCMV-SPORT6 klone, IRAVp968C0654D (Genbank accessionBC024934), med T7 og Sp6 RNA polymerase arrangører for Aspa (Supplementary figur 1).
- Forbered linearisert plasmid DNA som templat.
- Vokse DNA-klon, ekstrahere plasmid med en liten-skala plasmid rensing kit i henhold til produsentens protokoll og sekvens med T7 og SP6 universelle primere.
- Fordøye 1020 ug plasmid-DNA med et restriksjonsenzym som spalter ved 5'-enden av den forstand kjede av cDNA. For dette eksempelet bruker 100 enhet Sal jeg å fordøye pCMV-SPORT6- Aspa plasmid. Inkuber i 1,5 timer ved 37 o C
- Kjøre en liten alikvot på en agarosegel for å kontrollere at plasmidet er fullstendig linearisert.
- renselineariserte plasmid ved hjelp av fenol-kloroform.
- Legg 1/10 volum av 3 M natriumacetat, et volum av 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) - ekvilibrert fenol og en volum kloroform / isoamylalkohol (IAA) (24: 1).
- Sentrifuger ved 16000 x g i 1 minutt ved romtemperatur (20 - 25 ° C, RT) og ekstraher øvre vandige fase.
- Legg til en volum av kloroform / IAA, sentrifuger ved 16 000 xg i 1 min og ekstraher øvre vandige fase.
- Gjenta trinn 1.4.3.
- Tilsett 2 volumer etanol og gitt ved -20 ° C i 1 time eller O / N.
- Sentrifuger ved 16.000 xg ved 4 ° C i 10 min. Kast supernatanten.
- Vask pelleten med 70% kald etanol og re-suspen ved approximatively 1 ug cDNA per 2,5 pl i TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,5).
- Syntetisere de to probene, ett merket med Digoxigenin (DIG) og den andre med fluorescein-isotiocyanat (FITC).
- Velge den riktige RNA-polymerase for å gjøre den anti-sense probe (komplementær til mål-mRNA). For dette eksempelet bruker T7 RNA-polymerase for å gjøre Aspa probe.
- Forbered in vitro transkripsjon reaksjon: tilsett 1 mikrogram av det lineariserte DNA, 4,0 ul 5 x transkripsjon buffer, 6,0 mL 100 mM DTT, 2,0 mL av 10x DIG eller FITC RNA merking mix inneholder dNTP, 1 ul RNase inhibitor, og 20 - 40 enheter av RNA polymerase; gjøre det endelige volumet opp til 20 ml med DEPC-behandlet vann.
- Inkuber ved 37 ° C i 1,5 timer.
- Run1 ul av transkripsjonsreaksjon på en 1,0% agarosegel for å kontrollere at reaksjonen har virket. Gelen bør vise den lineære mal og en lysende bånd av sonden.
- Gjøre volumet opp til 100 pl med hybridiseringsbuffer og lagre 10 ul porsjoner ved -80 ° C.
2. Perfusjons, Fiksering og Tissue Collection
- FORSIKTIG: Når du håndterer Paraformaldehyde (PFA), både fast ogvandig, slitasje PPE og bruke et sikkerhetskabinett. Fremstille formaldehydoppløsning ved å oppløse 4% (w / v) PFA til 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) oppløsning ved hjelp av varme (55 ° C). Filtrer formaldehydoppløsning med filterpapir.
- Fremstille sukrose-oppløsning ved å oppløse 20% (vekt / volum) sukrose i destillert vann og tilsett 0,1% (v / v) DEPC løsning. La O / N ved RT med en løs lokk og deretter autoklav.
- Terminalt bedøver en mus av intra-peritoneal injeksjon av pentobarbiton (50 mg / kg). Vurdere anestesidybden ved tå klype og fravær av tilbaketrekking refleks indikerer dyp anestesi.
- Når mus er under dyp anestesi, gjør et innsnitt under brystkassen og skjære gjennom brystkassen på begge sider ved å løfte det å eksponere hjertet.
- Sette inn en 25 G nål inn i den venstre ventrikkel av hjertet. Lag et lite snitt i høyre atrium av hjertet.
- Perfuse dyret med 20 ml PBS og deretter 40 ml formaldehydoppløsning. For P30 og eldremus, bruk en perfusjon hastighet på 12 ml / min, men for yngre dyr bruker en lavere hastighet (7-10 ml / min).
- Dissekere hjernen.
- Sever musen hodet med kirurgisk saks ved å gjøre et kutt posterior fra ørene. Lag en halemidtlinjen snitt i huden og jobbe rostrally å fjerne huden fra skallen.
- Starter fra hale delen, skjære gjennom toppen av skallen langs midtlinjen og mellom øynene med Iris saks. Fjern parietal og frontale bein plater ved å vippe den ene siden av et bein plate hver gang og knipser den av med pinsett.
- Forsiktig vippe hjernen oppover fra fremre del med pinsett og kutte de optiske nervene og andre hjernenerver. Løft forsiktig hjernen ut av skallen.
- Plasser hjernen til en mus koronale hjernen matrise. Skjær hjernen til 3 ca 4 mm stykker med en fjær barberblad.
- Overfør skivene i 4% PFA-løsning og inkuberes O / N ved 4 ° C.
- Transfer hjernenskiver til DEPC-behandlet 20% sukrose-løsning og inkuberes O / N ved 4 ° C
- Plasser hver hjernen skive i en tørr cryomould, surround med optimal skjæring temperatur (OCT) medium og fryse på tørris. Oppbevar ved -80 ° C.
3. Cryosectioning
- Klipp 15 mikrometer deler av fryst vev i en cryostat og samle de delene på objektglass. Om nødvendig, våt seksjonene med DEPC behandlet PBS og flat dem med en fin pensel.
- La lysbilder tørke i ca 1 time for å sikre at vevet overholder lysbildet.
4. Hybridisering
- Forbered 65 ° C vaskebuffer: 150 mM NaCl, 15 mM Na 3 C 3 H 5 O (COO) 3 (= 1 x saltvann natriumcitrat), 50% (v / v) formamid og 0,1% (v / v) Tween- 20.
- Forbered MABT buffer: 100 mM maleinsyre, 150 mM NaCl, 0,1% (v / v) Tween-20, pH 7,5.
- Fortynn de to sondene (DIG-merket og FITC-Labelled) 1 / 1.000 i hybridiseringsbuffer forvarmes til 65 ° C og bland godt.
- Påfør rundt 300 mL av hybridisering blandingen på hvert lysbilde, coverslipwith ovnsbakte (200 o C) Dekk og inkuberes O / N ved 65 ° C i en fuktet kammer.
- Overfør lysbildene i en Coplin krukke inneholder forvarmet vaskebuffer. Vask objektglass i 30 minutter to ganger ved 65 ° C med vaskebuffer.
- Vask objektglass i 10 minutter tre ganger med MABT ved RT.
5. Visualisering av FITC Probe
- Forbered ISH blokkering buffer: MABT med 2% blokkering reagens og 10% varme-inaktivert sau serum.
- Valgfritt: Bruk en hydrofob penn til å tegne sirkler rundt vevssnitt på objektglasset for å redusere volumet av antistoff løsninger som kreves.
- Inkuber lysbilder for 1 time ved RT med ISH blokkeringsbuffer i et fuktet kammer.
- Inkuber objektglass O / N ved 4 ° C med et pepperrot-peroksidase (POD) - konjugatd anti-FITC-antistoff fortynnet 1/500 (v / v) i ISH blokkeringsbuffer.
- Plasser glir inn i en Coplin krukke inneholdende PBS med 0,1% (v / v) Tween-20 (PBST). Vask 3 ganger i 10 min i PBST og erstatte med frisk PBST hver gang.
- Umiddelbart før bruk, forberede fluorescerende tyramide ved å fortynne 100 ganger inn i Amplification fortynningsmiddel. For dette eksempelet bruker FITC-tyramide.
- Legg dette til lysbildene og la stå i 10 min ved RT.
- Plasser lysbildene i en Coplin krukke og vask 3 ganger i PBST i 10 min.
6. Visualisering av DIG Probe
- Forbered 0,1 M Tris HCl pH 8,2.
- Inkuber objektglassene med ISH blokkeringsbuffer i 1 time ved RT.
- Inkuber objektglass O / N ved 4 ° C med en alkalisk fosfatase (AP) -konjugert anti-DIG-antistoff fortynnet 1 / 1.500 (v / v) i ISH blokkeringsbuffer.
- Vask med MABT i 10 minutter tre ganger.
- Vask to ganger med 0,1 M Tris-HCl, pH 8,2 i 5 min ved RT.
- Umiddelbart før bruk, fremstille Fast Red oppløsning ved å oppløse tablettene i 0,1 M Tris pH 8,2. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 pM filter.
- Inkuber objektglass ved 37 ° C med Fast Red oppløsning i et fuktet kammer. Ettersom tiden for optimal utvikling varierer, sjekk lysbildene regelmessig med et fluorescerende mikroskop for å overvåke dannelsen av bunnfall. For dette eksempelet, stoppe reaksjonen etter 2-3 timer.
- Vask med PBST i 10 minutter tre ganger.
7. Immunohistokjemi
- Forbered IHC blokkeringsbuffer: 10% (v / v) serum (av en annen art til primære antistoff vert) i PBST.
- Inkuber objektglass med IHC blokkeringsbuffer i 1 time ved romtemperatur i et fuktet kammer.
- Fremstille primært antistoff: Fortynn det primære antistoff i en passende fortynning i PBST med 5% serum (fra en annen art til primære antistoffet vert). For dette eksempelet bruker en kanin anti-Olig2 antistoff på 1/400 (v / v) fortynning.
- Inkuber i den primære antistoffløsning ved 4 ° CO / N.
- Vask med PBST i 10 minutter tre ganger.
- Forbered sekundært antistoff: fortynne en fluorofor-konjugert sekundært antistoff ved en passende fortynning i PBST med 5% (v / v) serum (av en annen art til primære antistoff vert) og 0,1% (v / v) Hoechst 33258. For dette eksempelet bruke et esel anti-kanin Alexa647 sekundært antistoff på 1/1000 (v / v) fortynning.
- Inkuber i det sekundære antistoff løsningen ved RT i 1 time.
- Vask med PBST i 10 minutter tre ganger.
8. Montering
- Delvis tørke lysbilder på RT, og monter med en fluorescens monteringsmedium. La lysbilder tørke og deretter bilde i et konfokal mikroskop etter 10X, 20X og 63X mål ved hjelp av 4 forskjellige kanaler med følgende eksitasjonsbølgelengdene: 570 nm for Fast Red, 488 nm for FITC, 647 nm for Olig2 immunomerking og 350 nm for Hoechst .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikkelen beskriver en fremgangsmåte for en dobbel fluorescens ISH etterfulgt av immunomerking i musehjerneseksjoner. En kort beskrivelse av denne protokollen er vist i figur 1. Det første trinn var å syntetisere prober som er spesifikke for Aspa og MBP (myelin basisk protein). For å kontrollere at probene var blitt syntetisert, ble en liten alikvot fra hver reaksjon kjørt på en agarosegel. Svak lineære templat og en stor mengde RNA-probe kan bli sett (figur 2). Double fluorescens ISH for Aspa og MBP, etterfulgt av Olig2 immunomerking og Hoechst nukleær farging, ble utført på mus hjernen seksjoner. Vi skannet hjernen delene i en konfokalmikroskop og sydd bildene sammen for å avsløre fordelingen av genuttrykk signaler i hjernen. Aspa uttrykk i MBP -positivt (MBP +) celler ble observert i hele BH i (figur 3). Vi har også undersøkt Aspa uttrykk i ulike strukturer i hjernen ved hjelp av en høyere forstørrelse. Aspa uttrykk i oligodendrocytes i cortex og corpus callosum er vist i Figur 4. Samlokaliseringen av MBP, Olig2, og Aspa indikerer at Aspa er uttrykt i en undergruppe av modne oligodendrocytter i cortex og corpus callosum (figur 4). disse resultater viser at denne protokollen kan samtidig påvise ekspresjon av tre forskjellige gener i hjerneseksjoner.
Figur 1. Protokoll for Double Fluorescens In Situ Hybridisering Fulgt av Farging. Denne protokollen går over 5 dager og oppdager uttrykket av tre gener./files/ftp_upload/53976/53976fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Undersøkelse av Aspa RNA probe på agarosegel. Den lineære mal og en stor mengde av RNA probe av mindre molekylvekt kan observeres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Dobbelt Fluorescens in situ hybridisering for Aspa og MBP i mus hjernen paragrafer. Aspa (rød) og MBP (grønt) i hjernen. Skala:. 500 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Ekspresjon av Aspa i Oligodendrocytter i cortex og corpus callosum. Paneler viser representative bilder fra ISH for Aspa (rød) og MBP (grønn), etterfulgt av immunfarging av Olig2 (blå) kombinert med Hoechst farging. Aspa ble uttrykt i noen MBP + / Olig2 + celler i cortex (A og B) og i corpus callosum (C og D). M bp + / Olig2 + / Aspa + celler er merket med piler og MBP + / Olig2 + / Aspa - cellene er merket med pilspisser i forstørrede paneler (B og D). Skala barer: 100 mikrometer (A og C); 20 mikrometer (B og D). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende Figur 1. Sekvens av og kart til Aspa Clone (IRAVp968C0654D). 1,5 kb cDNA-sekvens av Aspa ble innsatt inn i pCMV-plasmid Sport6 (A). Kartet av pCMV-Sport6-Aspa plasmid er vist i (B).m / filer / ftp_upload / 53976 / 53976supfig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen gir en trinn-for-trinn fremgangsmåte for en dobbel RNA in situ-hybridisering, etterfulgt av immunfarging. Vi har brukt denne protokollen til å bekrefte at Aspa er uttrykt i modne oligodendrocytter i flere hjerneområder.
Denne multi-trinns prosedyre har mange potensielle fallgruver som kan påvirke følsomhet og bør unngås. Først må alle løsninger og lagringsbuffere for transkripsjonsreaksjon må være RNase-fri. For det andre er valget av cDNA templates viktig, og vi foretrekker maler omtrent 1 kb i lengde. Det er nødvendig å rense opp cDNA-maler med fenol / kloroform-ekstraksjon og re-utfelle dem før in vitro transkripsjon. I tillegg transkripsjonen av sonden trenger å være optimal; Hvis sonden er ikke produsert i tilstrekkelig mengde, vil det redusere kvaliteten på ISH. Kvaliteten av sonden kan kontrolleres ved å undersøke den på en agarosegel og god kvalitet vil blivist ved den sterke lysstyrken av sonden båndet i forhold til malen båndet (figur 2). For dobbelt ISH, er to forskjellig merkede prober benyttes, vanligvis en som er merket med DIG og den andre med FITC. FITC-merkede probe er ansett for å være den minste detekterbare og bør velges når mål-mRNA antas å være høyest i vevet. Denne sonden er vanligvis utviklet først og den DIG-merkede probe er utviklet andre.
Et annet kritisk punkt er vevet forberedelse. Mus er dynket med DEPC-behandlet PBS etterfulgt av 4% PFA, post-fiksert i 4% PFA O / N og deretter cryoprotected i 20% sukrose løsninger som har blitt DEPC-behandlet for å ødelegge eventuelle gjenværende RNase. Fixation tid er ganske viktig; over- eller under-fiksering kan føre til en svakere signal, kanskje på grunn av redusert penetrasjon probe (over-fiksering), eller degradering av mRNA (under-fiksering). Vevet blir deretter cryosectioned og to prober hybridiseres O / N. den formamideanvendes i hybridiseringsbuffer må være de-ionisert. En svært viktig betraktning under O / N-hybridisering ved 65 ° C er for å forhindre fordampning og konsentrasjon av hybridiseringsblandingen som det kan kompromittere følsomhet. I forsøket beskrevet vi utført hybridisering ved 65 CO / N, men det kan være verdt å prøve lavere temperaturer for ulike prober hvis det viser seg å være vanskelig å oppdage målet mRNA.
Det er et valg av reagenser for detektering av de hybridiserte probene. Fast Red er et følsomt fluorescerende reagens, men ikke alle partier av Fast Red gi det samme resultat. Det er behov for AP for utvikling og gir fluorescens med rhodamine eksitasjon. I vår erfaring, er det viktig å gjøre det friskt med 0,1 M Tris-HCl pH 8,2 og filtrere det før bruk. Et ikke-fluoriserende alternativ er fargeutvikling med nitro-blått tetrazolium (NBT) og 5-brom-4-klor-3'-indolyphosphate (BCIP) som arbeider med det samme AP-konjugert antistoff. Another alternativ er å bruke fluorescerende tyramide for gjenkjenning. Selv om det fluorescerende tyramide systemer ikke er de mest følsomme metoder, det fremkallende reaksjon med pepperrot peroksidase er meget rask, og det er minst tre fluoriserende farger (FITC, cyanin 3 og cyanin 5) som kan brukes. En begrensning av denne protokollen er at noen mål antigener (eller epitoper), spesielt lav overflod proteiner, ikke kan påvises etter ISH prosessen og dermed er ikke egnet for IHC etter ISH. I vår farging, vises antistoff påvisning av Olig2 upåvirket. Brukeren må velge riktig antistoff for immunomerking følgende ISH.
IHC og ISH blir ofte brukt teknikker for genuttrykk mønster studier, og begge har fordeler og ulemper. IHC er en meget følsom metode for å detektere den cellulære ekspresjon av gener i hjerneseksjoner, men dens avhengighet av antistoffet påvirker dens spesifisitet og begrenser dens anvendelse. I motsetning til dette har ISH en høy specificity og sonden fra hvilket som helst gen lett kan bli syntetisert ved in vitro transkripsjon ved å bruke genet spesifikk cDNA som templat. Protokollen som vi utviklet utnytter begge metodene, og kombinerer dobbel ISH med IHC å oppnå trippel deteksjon av genuttrykk med høy spesifisitet.
Kort sagt, den protokollen vi beskriver her gir samtidig farging av to mRNA og ett protein, slik at det gir et nyttig verktøy for å illustrere samlokalisert genuttrykk. Til tross for at mRNA uttrykket ikke alltid korrelerer med protein uttrykk, er ISH en kraftig teknikk som tillater oss å undersøke genuttrykket med høy spesifisitet. Vår protokoll av dobbel fluorescens ISH kombinert med IHC har vist seg å være en suksess i å oppdage Aspa uttrykk i en undergruppe av oligodendrocytter i hjernevev fra voksne mus, og det kan lett tilpasses for en rekke vev av ulik opprinnelse og utviklingsstadier. I tillegg har denne protokollenkan også brukes for å påvise ekspresjon av små RNA slik som miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| QIAprep Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100 mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65 °C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1,500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22 µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1,000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
- Lobsiger, C. S., Cleveland, D. W. Glial cells as intrinsic components of non-cell-autonomous neurodegenerative disease. Nat Neurosci. 10 (11), 1355-1360 (2007).
- Baslow, M. H. N-acetylaspartate in the vertebrate brain: metabolism and function. Neurochem Res. 28 (6), 941-953 (2003).
- Hoshino, H., Kubota, M. Canavan disease: clinical features and recent advances in research. Pediatr Int. 56 (4), 477-483 (2014).
- Kaul, R., Gao, G. P., Balamurugan, K., Matalon, R. Cloning of the human aspartoacylase cDNA and a common missense mutation in Canavan disease. Nat Genet. 5 (2), 118-123 (1993).
- Divry, P., Mathieu, M. Aspartoacylase deficiency and N-acetylaspartic aciduria in patients with Canavan disease. Am J Med Genet. 32 (4), 550-551 (1989).
- Bartalini, G., et al. Biochemical diagnosis of Canavan disease. Childs Nerv Syst. 8 (8), 468-470 (1992).
- Moffett, J. R., Ross, B., Arun, P., Madhavarao, C. N., Namboodiri, A. M. N-Acetylaspartate in the CNS: from neurodiagnostics to neurobiology. Prog Neurobiol. 81 (2), 89-131 (2007).
- D'Adamo, A. F., Smith, J. C., Woiler, C. The occurrence of N-acetylaspartate amidohydrolase (aminoacylase II) in the developing rat. J Neurochem. 20 (4), 1275-1278 (1973).
- Bhakoo, K. K., Craig, T. J., Styles, P. Developmental and regional distribution of aspartoacylase in rat brain tissue. J Neurochem. 79 (1), 211-220 (2001).
- Sommer, A., Sass, J. O. Expression of aspartoacylase (ASPA) and Canavan. Gene. 505 (2), 206-210 (2012).
- Klugmann, M., et al. Identification and distribution of aspartoacylase in the postnatal rat brain. Neuroreport. 14 (14), 1837-1840 (2003).
- Madhavarao, C. N., et al. Immunohistochemical localization of aspartoacylase in the rat central nervous system. J Comp Neurol. 472 (3), 318-329 (2004).
- Hershfield, J. R., et al. Aspartoacylase is a regulated nuclear-cytoplasmic enzyme. Faseb J. 20 (12), 2139-2141 (2006).
- Moffett, J. R., et al. Extensive aspartoacylase expression in the rat central nervous system. Glia. 59 (10), 1414-1434 (2011).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Kallarakal, A. T., Namboodiri, M. A. Aspartoacylase is restricted primarily to myelin synthesizing cells in the CNS: therapeutic implications for Canavan disease. Brain Res Mol Brain Res. 107 (2), 176-182 (2002).
- Kirmani, B. F., Jacobowitz, D. M., Namboodiri, M. A. Developmental increase of aspartoacylase in oligodendrocytes parallels CNS myelination. Brain Res Dev Brain Res. 140 (1), 105-115 (2003).
- Zhang, Y., et al. An RNA-sequencing transcriptome and splicing database of glia, neurons, and vascular cells of the cerebral cortex. J Neurosci. 34 (36), 11929-11947 (2014).
