Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו Published: April 23, 2016 doi: 10.3791/53980
Automatic Translation
1, 1, 2, 1,3
1Department of Ecology and Evolutionary Biology, University of Toronto, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Child and Brain Development Program, Canadian Institute for Advanced Research

Abstract

פנוטיפ באורך נתיב הזחל תסיסנית הוא צעד הוקם לשמש כדי לחקור את התרומות הגנטיות וסביבתיות וריאציה התנהגותי. את assay נתיב באורך הזחל פותח כדי למדוד הבדלים אישיים התנהגות שיחור מזון, שחוברו ביניהם מאוחר יותר אל הגן מחפש מזון. נתיב באורך זחל הוא תכונה בקיע המאפשר גביית מדגמים גדולים, בעלות מינימאלית, עבור מסך גנטי. כאן אנו מספקים תיאור מפורט של הפרוטוקול הנוכחי עבור assay נתיב באורך הזחל בשימוש לראשונה על ידי סוקולובסקי. הפרוטוקול מפרט כיצד לטפל reproducibly חיות הבדיקה, לבצע את assay התנהגותיים ולנתח את הנתונים. דוגמה לאופן שבו assay יכול לשמש כדי למדוד פלסטיות התנהגותית בתגובה שינוי סביבתי, על ידי מניפולציה האכלה הסביבה לפני ביצוע assay, הוא גם סיפק. לבסוף, עיצוב הבדיקה המתאימה, כמו גם גורמים סביבתיים שיכולים לשנותנתיב באורך זחל כגון איכות מזון, גיל התפתחותית ואפקטי יום נדון.

Introduction

מאז גילוי הגן הלבן במעבדתו של תומאס הנט מורגן בשנת 1910, זבוב הפרות, תסיסנית (ד melanogaster), נעשה שימוש כמודל לחקר את הבסיס המולקולרי ופיסיולוגי של תהליכים ביולוגיים שונים. הפופולריות של ד melanogaster נובעת במידה רבה את כמות מגוון רב של כלים גנטיים. גודלו הקטן של תסיסנית, הקלות היחסית של זמן טיפול קצר הדור להבהיר את זה מודל אידיאלי עבור מחקרים בגנטיקה. לא פחות חשוב הוא היכולת של תסיסנית להפגין רב של פנוטיפים שהביעו אורגניזמים מורכבים יותר כולל יונקים. זה כולל פנוטיפים מורכבים כגון התנהגות העומדים בקו התפר שבין האורגניזם וסביבתו. כפי מחקרים כאלה, התנהגותיים על זבוב הפירות תרמו משמעותית להבנתנו כיצד גנים ואיכות הסביבה מתווכים התנהגות1.

אחד המחקרים הראשונים של ד התנהגות זחל melanogaster נחקרה הבדלים אינדיבידואליים אסטרטגיות ליקוט זחל על ידי מדידת הנתיב-האורכים של זחלים 2 בזמן ההאכלה. נתיב באורך הוגדר כמרחק הכולל נסע ידי זחל אחד על השמרים, תוך פרק זמן של חמש דקות. שני זני המעבדה וזבובים מאוכלוסייה טבעית בטורונטו מגוונות בהתנהגויות הליקוט שלהם ולא היה מרכיב גנטי להבדלים אינדיבידואליים-אורך דרך. שני morphs ליקוט הזחל תואר מן הפצות נתיב באורך כמותית והם נקראו רובר ודוגמנית. רוברס להפגין נתיב-אורכים כבר בעוד חוצי שטח גדול יותר ואילו על מצע מזון מאשר יושבים. שימוש assay הנתיב הארוך הזה, דה בל ואח '. 3 מיפה את ליקוט (עבור) הגן שבבסיס ההבדלים ההתנהגותיים הנפרדים כדי במיקום דיסקרטי על chromosome- 2 (24A3-24C5). ד Melanogaster עבור הגן שובט מאוחר 4 וגילה להיות חלבון קינאז תלוי cGMP 5, מאפנן של הפיזיולוגיה וההתנהגות תסיסנית ואורגניזמים אחרים 6.

כאן נתאר את הפרוטוקול הנוכחי עבור assay נתיב באורך הזחל פותח במקור סוקולובסקי 2. למרות היבטים מסוימים של assay השתנו לאורך השנים, הרעיון מאחורי העיצוב לא. כמו כן אנו מספקים נתונים כדי להמחיש את הפוטנציאל של assay להעריך תרומות גנטיות וסביבתיות להבדלים אינדיבידואליים התנהגות השיחור של זחלים תסיסנית. את assay נתיב באורך הזחל הוא פשוט, יעיל עדיין חזקים. אדם יחיד יכול לבדוק עד 500 זחלים בקלות בארבע שעות ניתן להשיג תוצאות עם רמה גבוהה של שחזור. פותח במקור כדי לבצע לוקליזציה עבור, זה יכול לשמש מסך גנטי, מיפוי מוקד תכונה כמותית, ובמחקריםשל גן אחר בסביבה אינטראקציות (GxE). יתר על כן, פשטות השחזור שלו הופכים אותו משאב נהדר עבור הוראה לתואר ראשונה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכינו צלחות ענבים בקבוקים Holding לגביית הזחלים

  1. כדי להפוך בקבוקים מחזיקים, לחתוך חורים בצד אחד של בקבוקי תרבות 6 עוז לטוס, גדולים מספיק כדי להתאים תקע בקבוקון זבוב לאספקת אוויר (איור. 1D).
  2. כדי להפוך צלחות ענבים, להכין 250 מ"ל של מדיום מיץ ענבים (אגר 1.8%, 45% מיץ ענבים, 2.5% חומצה אצטית, 2.5% אתנול) על ידי הרתחת אגר, מיץ ענבים רוב המים, להתקרר עד 70 ºC ( מערבבים תוך צינון), ולאחר מכן להוסיף חומצה אצטית ואתנול ולהביא עד נפח עם מים.
  3. השתמש מזרק (בלי מחט) כדי למלא 35 x 10 מ"מ מכסים בצלחת פטרי עד פני השטח של המדיום מיץ ענבים עושה כיפה מעל השפה של המכסה (איור. 1A).
  4. חנות צלחות ענבים במיכל לח אטום ב 4 ºC עד השימוש (עד למקסימום של 2 שבועות).

2. הכנת צלחות מזון

  1. כן מתכון אוכל לטוס סטנדרטי.
    הערה: ל- Test גידול מזון אפקטים באיכות על-אורך הדרך השתמשנו אוכל לטוס מזין נמוך: 10% סוכרוז, 1.3% אגרו, 0.8% tartrate אשלגן נתרן, 0.1% פוספט monopotassium, 0.05% נתרן כלורי, 0.05% סידן כלורי, 0.05% מגנזיום כלוריד, 0.05% סולפט ferric, 5% שמרים 0.5% חומצה propionic במים; ואוכל לטוס תזונתי גבוה: 1.5% סוכרוז, 1.4% אגר, 3% גלוקוז, 1.5% קמח תירס, 1% נבט חיטה, 1% קמח סויה, 3 מולסה%, שמרים 3.5%, 0.5% חומצה propionic, 0.2% Tegosept ו 1 אתנול% במים. עבור שני מזונות חיטוי הפתרון ומצנן עד 50 מעלות צלסיוס לפני הוספת חומצת propionic, Tegosept ואתנול.
  2. יוצקים 40 מ"ל של אוכל לטוס לתוך 100 x 15mm צלחות פטרי.
  3. מזון חנות צלחות במיכל לח אטום ב 4 ºC עד השימוש (עד למקסימום של 2 שבועות).

3. להכין צלחות מבחן

  1. כן 58 x 25 סנטימטר, 6 מ"מ צלחות פרספקס שחור עבות עם 10, בארות עגולות עמוקות 1 מ"מ, 10 סנטימטרי קוטר ומסודר ד 2 x 5esign (איור. 1C) כדי לבדוק על הזחלים.
    הערה: עד 30 זחלים ניתן לבדוק בכל פעם אם 3 או יותר של צלחות פרספקס לעיל זמינים. לחלופין, הזחלים ניתן לבדוק בצלחות פטרי, 10 ס"מ קוטר. אפשרות זו היא הרבה יותר מייגעת ומאפשרת מספרים נמוכים יותר של זחלים להיבדק.
  2. השג מפזר 8 ס"מ שחור 39 x, 6 מ"מ פרספקס עבה להפצת להדביק שמרים על צלחות מבחן פרספקס.
  3. הכן 100 x 15 מ"מ מכסים בצלחת פטרי להקלטת אורכי נתיב הזחל על ידי הפרדת מכסים מ תחתית מראש.

4. הגדרת אוכלוסיות הורים

  1. שמור תנאי גידול קבועים לאורך כל assay כולו (למשל, 25 ºC, לחות 60% ואור 00:12: מחזור כהה על אוכל לטוס סטנדרטי).
  2. תרי אוכלוסיית הורים באותו תנאי גידול.
  3. אסוף 100 - 150 נשים ו 50 - 75 זכרים מתבגרים אותם במשך 5 ± 1 ימים עבור פוריות אופטימלית.
  4. אפשר females וזכרים להזדווג לילה בבקבוק תרבות זבוב 6 גר עם אוכל לטוס סטנדרטי.
  5. העברת זבובים לתוך בקבוק האחזקה ולאבטח צלחת ענבים (כמות קטנה של רסק שמרים טריים על צלחת ענבים תקדם ההטלה;. איור 1B) מעל בנייר דבק (. איור 1E).
  6. השאירו בקבוקי עומד במהופך (איור. 1F), עם צלחת ענבים בתחתית לאפשר מבוגרים להטיל ביצים על צלחת ענבים.
  7. מחק את צלחת הענבים הראשונה לאחר 24 שעות ומניח צלחת ענבים חדשה בבקבוק ההחזקה. זו תהיה צלחת הענבים שממנו הזחלים נאספים למחרת.
    הערה: צלחות ענבים תצטרכנה להיות מסומנות של זחלי 22 שעות לאחר בשלבי קמה, להגדיר צלחות כדי שיוכלו להיות מסומנים מוקדם למחרת (. למשל, להגדיר צלחת בשעה 12 וברורות בשעה 10 בבוקר למחרת). רצוי לבטל את צלחת הענבים הראשונה, כדי למנוע כל ביצים שנקבות שאולי היו הלנה ו that אולי קודם בפיתוח.

5. איסוף L1 (ראשון Instar) הזחלים מן צלחות ענבים

  1. סר צלחות ענבים מהבקבוקים 22 שעות אחרי שהם הוקמו ומניחים בצלחת 60 x 15 מ"מ פטרי.
  2. מניח צלחת ענבים חדשה עם רסק שמרים טרי על בקבוק ההחזקה.
  3. נקה וזורק כל הזחלים מהצלחת הענבים זרע באמצעות בדיקה לנתח.
  4. דגירת פינת צלחות ענבים עבור 4 שעות בתנאים סטנדרטיים.
  5. לאחר 4 שעות, לאסוף 100 זחלי L1 לכל זן מהצלחות הענבים ומניחים על צלחות אוכל.
    1. מניח זחלים על המזון בעדינות (ללא ניקוב המזון לקבור את הזחלים) ולהימנע צפיפות על ידי הפצת הזחלים פני הצלחת מזון.
  6. דגירת צלחות אוכל עד חי בדיקה כ 10 שעות לפני תחילת נדודים.
    הערה: בגיל 25 ºC, 10 שעות לפני נדודים מתאים בדרך כלל עד 72 - 96 שעות לאחר הבקיעה. exacסכום t זמן דגירה צריך להיקבע לפני תחילת הניסוי על ידי איסוף קבוצה ראשונית של זחלים עבור כל זן והקלטת מספר השעות עד תחילת נדודים (זחלי נדודים יעברו מתוך האוכל על הצדדים ואת המכסה של המזון צלחות).
    הערה: במידת הצורך, אותם הורים יכולים לשמש כדי לאסוף הזחלים 3 - 4 ימים של בדיקות על ידי חזרה על שלבים 4.7 עד 5.5. שנה את הסדר שבו זנים מוגדרים ונבדקו על פני ימים, כדי למנוע השפעה כדי הבדיקה על-אורך הדרך. בדוק את אותו זן "שליטה" / זנים בכל יום של בדיקות כדי לשלוט על תופעות יום.
  7. אם זנים רבים נבדקים, להתנודד פעמים להגדיר אוסף של הזחלים כדי לאפשר בדיקה של כל זן בנקודת הזמן המתאים בהמשך.

6. מבחן נתיב באורך זחל

  1. ממסי שמרי אופה יבשים פעילים במים ביחס של 1: יחס 2 (משקל והנפח). המשחה שמרים סיימה צריכה להיות רזה יותר paבלילת ncake, באופן שכאשר הרמת כף מתוך העיסה, מטפטף ומשאיר מאחורי סרטים על פני השטח של הדבק כי במהירות להתמוסס.
    הערה: העקביות של רסק שהמרים חשובה וצריכה להיות קבוע לאורך כל הניסוי. השמרים המדויק: יחס המים כאמור עלול צריך להיות מותאם בהתאם למותג ו אצווה של שמרים.
  2. בעדינות להרים זחלים של המתח הראשון להיבדק מהצלחת המזון באמצעות מברשת צבע.
  3. אסוף זחלים בצלחת פטרי לשטוף בעדינות עם מים כדי להסיר את כל האוכל.
    1. במהירות לשטוף זחלים עם 1 - 2 מיליליטר של מים ויבשת זחלי טיפה בעדינות עם מעבדה לנגב כדי למנוע העברה של מים בעת ביצוע הזחלים על צלחת הבדיקה. כדי למנוע לחץ, לשמור זחלים לחים אך לא טבל במים.
  4. מסדרים שלושה לוחות מבחן זה לצד זה להגדיר טיימר 5 דקות עבור כל צלחת הבדיקה.
  5. החל שמרי משחה זו על גבי צלחות הבדיקה באמצעות המפזר, מורח עליו שכבה דקהאה של רסק שמרים על כל צלחת בדיקה, כך שכל יש הבארות אפילו שכבה של שמרים.
  6. בעדינות במקום זחל אחד במרכז כל טוב, החל טיימר 5 דקות לאחר צבת הזחלים הראשונים על כל צלחת. הערה: שלוש צלחות יכול להיעשות בכל פעם, מניב גודל מדגם של יום 30 / זן / בדיקה, עד לסך של 500 זחלים.
  7. מניחי מכסת צלחת פטרי על גבי כל טוב.
  8. כאשר שעון העצר שנגמר, מבלי להסיר את הזחלים מהצלחת, להתחיל לעקוב אחר נתיב האורכים שהושארו השמרים באמצעות סמן קבע. נתיב-אורכי עקבות באותו סדר כמו זחלים הונחו על צלחות הבדיקה.
    1. בצע מעקב באותה המהירות כמו זחלים הונחו על הצלחות. לקבלת עקביות ניתוח נתונים מאוחר יותר, להשתמש באותו סמן את כל אורכי הנתיב. סמן קבוע מומלץ.
  9. חזור על שלבים 6.2 ל 6.8.1 עבור כל זן להיבדק. פיק כל זן מהמזון מייד לפני הבדיקות כדי למנוע תופעות רעבות על רשותבאורך ה.

7. מניעת מזון

  1. אם זחלים להיות מקופח מזון לפני הבדיקה, לאסוף זחלים כמתוארים בשלבי 6.2 ל 6.3, אבל פרק הזמן הרצוי מזון חסך מוקדם (למשל., אם זחלים הוא להיות משולל מזון עבור 4 שעות, לאסוף זחלי 4 שעות לפני בזמן הבדיקה).
  2. מחלקי זחלים שטפו לשתי קבוצות ומקום הקבוצה מקופח מזון בצלחת 60 x 15 מ"מ פטרי עם אגר 5 מיליליטר 1% לבין קבוצת הביקורת בצלחת פטרי עם 5 מיליליטר מזון רגיל.
  3. מניחי משקל על גבי המכסה ההפוכה של צלחות פטרי (זחלים אחרת מסוגלים לזחול החוצה כאשר הוא מחפש מזון).
  4. דגירה לתקופה מניעת מזון הוקמה בעבר והמשך עם בדיקה כמתואר בשלבים 6.2 כדי 6.9.
  5. אם זנים רבים להיבדק, להתנודד מניעת מזון להתחיל פעמים כדי לאפשר בדיקה של כל זן בנקודת הזמן המתאים.

ניתוח 8. נתונים

הערה: סעיף זה מתאר שיטה לניתוח נתונים באמצעות ImageJ 7 או 8 פיג'י לעיבוד של אורכי נתיב, למרות שניתן להשתמש בהם תוכנות אחרות.

  1. השתמש שולחן האור כדי להעביר את כל נתיב-אורכי לייחס מן מכסים בצלחת פטרי נייר לבן (העפעפיים ניתן לכבס עם אתנול ולעשות בהם שימוש חוזר עבור הקלטה נתיב באורך נוספת).
  2. עקוב אחר קו הפניה ישר 50 מ"מ על אחד גיליונות נייר.
  3. סרוק את אורכי הנתיב ברזולוציה של 300 dpi ולשמור כמו קבצי תמונת מפה סיביים או TIFF.
  4. פתח את קובץ התמונה, בחר את הכרטיסייה "תהליך"> "בינארי"> "הפוך בינארי". ואז תחת הלשונית "תהליך", בחר "בינארי"> "Skeletonize". זה מייצר קו רוחב פיקסל אחד, ללא תלות בעובי של עקבות.
  5. ודא שכל באורך נתיב מופיע בשורה האחת רציפה ללא הצלבות.
  6. הפרד כל הצמתים באמצעות "li ישרכלי ne "וצביעה לבנת קו (להמשך קיומו של הנתיב ניתן לבדוק עם" כלי מטה "(התחקות), השביל כולו צריך להיות מודגש בצהוב (איור. 2).
  7. בחר בכרטיסייה "נתח"> מדידות סט ובחר "היקפית" ו "תווית תצוגה".
  8. בחר בכרטיסייה "נתח"> "סולם הגדר" ובחר "הסר סולם".
  9. על התמונה, בחר את שורת העיון בלבד, בחר את הכרטיסייה "הנתח"> "חלקיקי נתח" ובחר "צג: מתאר", "צג תוצאות" ו "טבלת תוצאות מנקות". הערה: התפוקה תציג את מספר הפיקסלים התואמים את קו מידת 50 מ"מימ.
  10. בחר "נתח" הכרטיסייה> "סולם הגדר" ומלא את מספר הפיקסלים "מרחק בפיקסלים" ואת המרחק המתאים (50 מ"מ) ב "המרחק ידוע".
  11. לבסוף, בחר את כל הציורים באורך נתיב של גנוטיפ אחדזמן ת"א, בחר את הכרטיסייה "הנתח"> "חלקיקי נתח" ובחר "תכנית: קווי מתאר", "צג תוצאות" ו "טבלת תוצאות מנקות".
    1. הסר את כל תוויות בכתב או סימונים זרים ברורים (הם יוכרו-אורכי נתיב) בתוך האזור הנבחר על ידי בחירת האזור וממלא אותו לבן.
  12. ראייה לבדוק את קובץ הפלט "מתאר" כדי להבטיח את היקפה היו הוברר כראוי. התפוקה תציג אורך נתיב במ"מ לכל ציור נתיב באורך בבחירה. זה ניתן לייצא בקלות גיליון אלקטרוני לנתח אותם באמצעות כל תוכנה סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הבדלים נתיב באורך של רובר והדוגמנית עבור זנים והשפעת מניעת מזון על-אורך הדרך מומחשים באיור. . 3 נתונים שנאספו במשך שלושה ימים רצופים של בדיקות הראתה שפעת זן משמעותית (F (1,421) = 351.89, p <2.20 x 10 -16;. איור 3 א), עם רכבים נוסעים רחוקים יותר מאשר יושבים. בנוסף לאפקט הזן, היו גם אפקט טיפול מזון משמעותי (F (1, 421) = 461.62, p <2.20 x 10 -16;. איור 3 א), עם זחלים כי נשלל מזון במשך ארבע שעות לפני הבדיקה מכך שדרכה אורכים נמוכים משמעותי מאשר זחלים ניזונים. יתר על כן, ANOVA הראה זן משמעותי על ידי אינטראקצית טיפול (F (1,423) = 9.78, p = 2 x 10 -3), כלומר רוברס יושבי הגיבו מניעת מזון ובמידות שונות.

"FO: keep-together.within-page =" 1 "> למרות הנתונים הנ"ל גם הראה השפעה משמעותית של יום המבחן (F (2,420) = 7.22, p = 8 x 10 -4; איור 3B - 3C.) שם לא היה זן משמעותי על ידי אינטראקציה יום (F (2846) = 2.32, p = 0.10), כלומר מושפע יום רוברס יושבי דומה. אף על פי כן היה יום משמעותי על ידי אינטראקציה טיפול (F (2,420) = 8.07, p = 4.00 x 10 -4), מראים כי שפעת הטיפול המגוונת ברחבי ימים. איכות הגידול של המזון הייתה השפעה משמעותית על אורכי נתיב (איור. 4). נתיב-אורכים בסך הכל היו יותר כאשר הזחלים של שני הזנים שגדלו על מזון המזין הגבוה שלנו לעומת מזון מזין נמוך (F (1, 352) = 126.38, p <2.20 x 10 -16). הבדלי רובר-סיטר עם זאת עדיין היו מתוחזקים למרות איכות המזון במהלך גידול זחל (F (1, 352) = 94.89, p <2.20 x 10 -16 ). יום השפעות שהיו משמעותיים (F (2, 351) = 3.77, p = 0.024) נכללו במודל הסטטיסטי. כמו כן, חל זן משמעותי על ידי אינטראקצית יום (F (1,704) = 7.15, p = 9.00 x 10 -4), כמו גם מזון משמעותי על ידי אינטראקצית יום (F (1,704) = 5.06, p = 7.60 x 10 - 3).

לבסוף, חשוב לציין כי הבדלי רובר-סיטר ביחס היו משמעותיים ברחבי יום, איכות מזון ואפקטי מזון קיפוח, אך כי מדידות אורך-נתיב המוחלטים שונות בין ימים וטיפולים. תוצאות אלו לא רק להדגיש את חוסנו של assay נתיב באורך הזחל, אלא גם את החשיבות של פיקוח על תנאי גידול, פועלים כל זן / טיפול ריבית על כל יום של בדיקות, ופקטורינג אפקטי יום לתוך הניתוחים.

1 "src =" / files / ftp_upload / 53,980 / 53980fig1.jpg "/>
הכנה איור 1. של בקבוקים חזקים צלחות בדיקה. (א) צלחות ענבים עבור הטלה צריך להיות מלאות מעל השולים כדי ליצור כיפת חלקה של תקשורת. תוספת של כמות קטנה של רסק שמרים טרי (ב) מקדמת הטלת ביצים. (C) פרספקס צלחת בדיקות עם קצוות לבארות מפזרות. (ד) לטוס בקבוק תרבות עם חור לחתוך לאספקת אוויר. לאחר העברת אוכלוסיית הורי בקבוק התרבות, צלחות ענבים צריכים להיות מצוידים על הפתיחה בנייר דבק (E) ובקבוקים יש למקם עם צלחת הענבים בתחתית (F). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .

ז "/>
ניתוח תמונת איור 2. עקבות נתיב באורך מפותלות. נתיב-אורכים שבו זחלים חצו על נתיב ההתפתחות שלהם יש להפריד באופן ידני בצומת כדי ליצור קו רציף אחד. (א) מציג דוגמא של שלושה סרוקי נתיב-אורכים, עם חץ אדום בנקודת החיתוך של הנתיב באורך העליון. (ב) מציג את נתיב באורך זהה נערך ב ImageJ להפריד את הצומת. (ג) מציג את ImageJ היקפית פלט של נתיב באורך מצטלבים, עם הערכה מוטעית של המערכת של נתיב 1 עקב הצומת. (ד) מציג את ImageJ היקפית פלט של הקובץ נערך עם לצומת בקעה והערכה נכונה של המערכת של נתיב באורך 1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ithin-page = "1"> איור 3
איור 3. הפד מזון לאחר שנשללו רובר ישבן זחל נתיב-אורכי Mean נתיב באורך זחל (מילימטרי ± SEM) עבור רכבים ואת יושבים, הוכחה:. (א) נתיב-אורכי Pooled עבור זחלים חסרי מזון הפד ו -4 שעות מעל שלוש רצופים ימים של בדיקות, 105 <n <120; (ב) זחל הפד נתיב-אורכים ליום 38 <n <40 ליום; ו- (ג) 4 hr מזון מקופח נתיב-אורכי זחל על ידי היום, 38 <n <40, ליום. כל הזחלים והורים שגדלו על מזון מזין נמוך ב 25 ºC, לחות 60% ו 00:12 L: מחזור ד. הבדלים בין קבוצות בדיקה ו / או טיפולים הוערכו על ידי ניתוח שונה (ANOVA) ולבדוק של Tukey להשוואות פוסט הוק pairwise מרובות. עבור (א) גורם חוסם של יום נוסף למודל. מכתבים מייצגים קבוצות סטטיסטיות; פירושו עם באותו המכתב אינו significantly השונה (p <0.05). הפד FD לעמוד בתנאים חסרי מזון הפד ו -4 שעות. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4. מזון ואיכות נתיב-אורכי זחל. Mean זחל נתיב באורך (מילימטרים ± SEM) עבור רכבים ואת יושבים, הוכחת נתיב-אורכי הזחלים גדלו על מזון מזין גבוה ונמוך. נתונים ויקוו במשך שלושה ימים רצופים של בדיקות עם מקדם של יום חסימה הוסיף למודל הסטטיסטי, 75 <n <90. כל הזחלים וההורים שגדלו על מזון מזין נמוך או גבוה ב 25 ºC, 60% לחות ו 00:12 L: מחזור ד. הבדלים בין קבוצות בדיקה ו / או טיפולים הוערכו על ידי ניתוח שונה (ANOVA) ולבדוק של Tukey עבור פוסט הוק pairwise multiplהשוואת דואר. מכתבים מייצגים קבוצות סטטיסטיות; פירושו עם באותו המכתב אינו שונה באופן משמעותי (p <0.05). גבוהה עמדה נמוכה תזונתי גבוהות ואיכות מזון מזין נמוכה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

את assay-אורך הדרך המפורט כאן מציע מידה חזקה ופשוט של התנהגות שיחור מזון של זחלים תסיסנית. הפרוטוקול כדלקמן המתודולוגיה הכללית המתוארת סוקולובסקי 2, אבל מאז שופר ביחס ליעילות ובקרות ניסיוני. למיטב ידיעתנו שיטה זו היא השיטה הזמינה רק למדידת נתיב באורך זחל. הנוסח המקורי של השביל באורך הפרוטוקול 2, 3, 15, 16 זחלים נבדקו על צלחות פטרי עם שכבה דקה של ממרח שמרים מיושמת עם מברשת, ולאחר מכן כוס מתפשטת מוט. עוד בגירסאות האחרונות של פרוטוקול 10, 17 המעבר באמצעות צלחות פרספקס המתואר כאן. השימוש מפזר זכוכית צלחות פטרי הציג את היתרון של שכבה דקה מאוד של שמרים, אשר הניב אורכי דרך ארוכה מאוד, חידדו את ההבדלים בין פנוטיפים רובר והדוגמנית. שימוש לוחות פרספקס הביא אורכים הכוללים נתיב קצרים יותר, אבל roVer-סיטר ההבדלים היו מתוחזקים לשחזור באותה מידה. למרות שימוש צלחות פרספקס הוא הרבה פחות מייגע, נתיב האורכים כבר שהושגו עם שיטת צלחת פטרי מותר להפרדה טובה יותר של פנוטיפים רובר והדוגמנית, הקלת המיפוי הגנטי של ההבדל-סיטר רובר אל עבור גן 3. השימוש צלחות מבחן פרספקס במקום צלחות פטרי, וניתוחים חישובית של עקבות-אורך הדרך הם השינויים העיקריים שנעשו בפרוטוקול מאז השיטה פותחה לראשונה, ו מאוד גדלו המספרים של הזחלים כי ניתן לבדוק על ידי אדם אחד , כמו גם את מהירות נתונים וניתוחים. גם שפרנו את הידע שלנו על מספר גורמים ניסיוניים וסביבתיים אשר יכול להשפיע על התוצאה של assay, שחלקם הם מפורטים להלן.

ראשית, assay זה מודד הבדלים אישיים בהתנהגות נתיב באורך על מצע ליקוט (משחת שמרים-מים). ד משמעותיifferences assay זה יכול לנבוע פגמי תנועת זחל בכלל. זה יכול להיות נשלט על ידי מנסה לאמוד במקביל להתנהגות תנועת זחל על צלחות אגרו שאינם תזונתיות. אם הבדלי זן נשמרים על צלחות אגרו, זה בטוח להניח כי הבדלים שנמצאו על מצע שמרים-מים אינם ליקוט ספציפי התנהגות. הוכח בעבר כי בעוד רובר עבור אלל מקנה משמעותי יותר נתיב-אורכים על שמרים, רכבים ואת יושבים אינם שונים בהיעדר מזון, כפי שהם מציגים ארוכים דומים נתיב-אורכים על אגרת 9. יתר על כן, כי זחלים בדרך כלל להגדיל התנועה שלהם בהיעדר מזון, מציאת תנועה קטנה או לא על צלחות אגרו מעיד סביר של פגמי תנועה. מאז פגמי תנועת מזון-עצמאי יכולים לפעול כמשתנת בלבול כאשר חוקרים ליקוט התנהגות, שליטה אגרה יכולה להפחית חיוביות שגויות מסך גנטי 10. כמו כן, חשוב לציין כי אם Larvae נפגע לפני הבדיקה, הם עלולים לא לזוז בכלל. זחלים נייחים, מתים או פגומים ניתן להבחין בין זחלים בריאים על ידי התבוננות תנועת וו פה. זחלים נייחים ללא כל תנועות וו פה אמורים להיות מושלכים.

שנית, כפי עם התנהגויות אחרות, באורך נתיב הזחל יכול להיות מושפע מגורמים סביבתיים שצריכים להיחשב ומבוקר עבור בעת ביצוע assay זה. גורמים סביבתיים הידועים כבעלי השפעה באורך נתיב כוללים טמפרטורת גידול, לחות, איכות מזון, צפיפות גידול, עובי הדבק שמרים, הבדלים אקראיים בין ימים, ואת הטיפול של זחלים. פיתוח וגיל זחל בשלב של בדיקות גם להשפיע נתיב באורך 11. כפי שניתן לראות באיור. 4, העלאת הזחלים במזון באיכות נמוכה יותר מקטין-אורך הדרך. השימוש אחד המתכונים אוכל לטוס המתואר בפרוטוקול זה או אחר מתכון שמרים מת כי הוא שווה ערך בתוכן התזונתי שלה מומלץ. כמו כן Suggested להימנע סביבות גידול צפיפות גבוהות או נמוכות תמיד על ידי זריעת צלחות מזון עם 100 זחלים לרווח ביניהם באופן שווה על האוכל. גידול זחלים בצפיפויות גבוהות מגביל את הזמינות של מזון ומעכב התפתחות זחל, אשר עלול לגרום בדלים התפתחותיים בין זחלים בעת הבדיקה 12. תנאי גידול בצפיפות נמוכים יכולים גם להשפיע על התפתחות מאז תסיסנית זחלים עלולים להיוצר קבוצות ליקוט חברתיות לפירוק מזון ולהגדיל ליקוט הצלחה 13. כאשר זחלים עם מוטציות משפיעות גודל זחל הם assayed, זה עשוי להיות נחוץ כדי לחשב השפעות אלו על ידי חישוב נתיב באורך כפונקציה של אורך או היקפי גוף זחל. בכל המקרים חשוב להבטיח זחלים שלא עברו לתוך נדודים הבמה כשהם נבדקים. אם זחלים יעלו על מכסת צלחת פטרי במהלך הבדיקה, סביר להניח כי הם נדודי הניסוי אמור להיות מושלך וחזר עם צעיר larvae.

גורם נוסף ראוי להזכיר הוא העקביות של רסק שמרים בשימוש בדיקות נתיב באורך שכן היא משפיעה על מהירות הסריקה של הזחלים. הזחלים נבדקו על משחת שמרים עבה יהיו נתיב-אורכים קצרים יותר מאשר זחלים נבדקו על משחת שמרים מימית יותר. יתר על כן, הבדלים בין סטוכסטיים ימי בדיקה גם להשפיע ציוני נתיב באורך מוחלטים. זה הכרחי כדי לבחור באקראי את הסדר שבו זנים / גנוטיפים נבדקים בתוך ימים לחסום אותם בין ימים. לבסוף, יש להקפיד לא להדגיש זחלים לפני בדיקת נתיב באורך. שני גורמים לחץ כי הם הציגו בדרך כלל באמצעות וטיפול הם מרעב טביעה. כפי שניתן לראות באיור. 3, מורעבי זחלים לפני הבדיקה יורד באורך שביל, ולמרות רעב יכול להיות מוצג בתור מניפולציה סביבתית, התרחשות בשוגג שלה יש להימנע. והדגשנו זחלים יש להימנע על ידי עובד בעדינות אך במהירות, ובכך להגביל את הכמות sp הזמןאף אוזן גרון איסוף, ניקוי, והעברת זחלים. מאז תערוכת זחלים השלילי phototaxis 14, אור חזק יכול לשמש גם גורם לחץ ואת assay צריך להיעשות תחת אפילו, תאורה מפוזרת. למרות הגורמים המרובים הסביבתיים שיכול לשנות באורך נתיב, חשוב לציין כי למרות עשרות נתיב באורך מוחלט רגישים לתנאי סביבה, הבדלים ביחס בין הזנים נשמרים כשכל האנשים זוכים ליחס שווה.

דיוק, יעילות וחוסנם כימות הם בלב של מחקרים להבנת הגורמים הגנטיים והסביבתיים אשר מתווכים התנהגות. את assay נתיב באורך הזחל תסיסנית מציעה את כל היתרונות האלה בנוסף להיותו בעלות נמוכה, קצב העברת נתונים גבוה, וקל לביצוע. ככזה, assay זה יכול להיות בשימוש נרחב עבור מסכי גנטי לזהות מסלולים מולקולריים וגנטיים הקשורים תגובות התנהגותיות. יתר על כן, assay יכול להיותpplied בדיקות רעילות או מסכים תרופתיים, או מותאם ללמד בכיתה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 oz fly culture bottles  Fisher Scientific  AS355 
Fly vial plugs Droso-Plugs 59-201
35 x 10 mm Petri dishes  Falcon 351008
100 x 15 mm Petri dishes  Fisher 875712
60 x 15 mm Petri dishes VWR 25384-168 
Dissecting probes Almedic 2325-58-5300 
Yeast Lab Scientific FLY-8040-20F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster). Dubnau, J. , Cambridge University Press. New York. 173 (2014).
  2. Sokolowski, M. B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis. Behav Genet. 10, 291-302 (1980).
  3. de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 123, 157-164 (1989).
  4. Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila. Science. 277, 834-836 (1997).
  5. Kalderon, D., Rubin, G. cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila. J Biol Chem. 264 (18), 10739-10748 (1989).
  6. Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior. Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).
  7. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
  8. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  9. Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 140, 263-270 (1995).
  10. Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).
  11. Graf, S. A., Sokolowski, M. B. The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation. J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).
  12. Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time. Genetics. 82, 33-44 (1990).
  13. Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. Dynamics of social behavior in fruit fly larvae. PLoS One. 9 (4), e95495 (2014).
  14. Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae). J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).
  15. de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster. Heredity. 59, 73-83 (1987).
  16. de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster. Genome. 36, 94-101 (1993).
  17. Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection. PNAS. 94, 7373-7377 (1997).

Tags

Neuroscience גיליון 110, גנטיקה התנהגותית זחלים ליקוט מזון תנועה תלויה מזינה פלסטיות
פרוטוקול נתיב באורך שארגן לעצמו<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, … More

Anreiter, I., Vasquez, O. E., Allen, A. M., Sokolowski, M. B. Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae. J. Vis. Exp. (110), e53980, doi:10.3791/53980 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter