Abstract
De Drosophila melanogaster larvale weglengte fenotype is een gevestigde methode om de genetische en omgevingsfactoren bijdragen aan gedragsvariatie bestuderen. De larvale weglengte test werd ontwikkeld om individuele verschillen in foerageergedrag die later werden gekoppeld aan het foerageren gen te meten. Larvale weglengte is een makkelijk scoorde eigenschap dat het verzamelen van grote steekproefomvang faciliteert, tegen minimale kosten, voor genetische screens. Hier hebben wij een gedetailleerde beschrijving van de huidige protocol voor larvale weglengte assay eerst door Sokolowski. Het protocol beschrijft hoe reproduceerbaar te behandelen proefdieren, voeren de gedrags-test en de gegevens te analyseren. Een voorbeeld van hoe de test kan worden gebruikt om gedrags plasticiteit in respons op omgevingsveranderingen te meten, door het toevoeren omgeving manipuleren voor het uitvoeren van de test, wordt ook voorzien. Tot slot, geschikte test design en milieu-factoren die kunnen wijzigenlarvale weglengte zoals de kwaliteit van het eten, ontwikkelingsleeftijd en dag effecten worden besproken.
Introduction
Sinds de ontdekking van het witte gen in het laboratorium Thomas Hunt Morgan in 1910, heeft de fruitvlieg Drosophila melanogaster (D. melanogaster), gebruikt als model voor de studie van de moleculaire en fysiologische onderbouwing van verschillende biologische processen. De populariteit van D. melanogaster grotendeels voort uit de aanzienlijke hoeveelheid en de verscheidenheid van genetische instrumenten. Drosophila kleine formaat, relatieve gemak van de behandeling en korte generatie tijd maken het een ideaal model voor genetische studies. Even belangrijk is Drosophila vermogen om veel van de fenotypes met meer complexe organismen zoals zoogdieren tot expressie te tonen. Dit omvat complexe fenotypen zoals gedrag die staan op het grensvlak tussen het organisme en zijn omgeving. Als zodanig, behavioral studies over de fruitvlieg aanzienlijk hebben bijgedragen aan ons begrip van hoe genen en het milieu te bemiddelen gedrag1.
Een van de eerste studies D. melanogaster larven gedrag onderzocht individuele verschillen in larvale foerageerstrategieën door het meten van het pad-lengtes van de larven 2 tijdens het voeden. Padlengte is gedefinieerd als de totale afstand die een larve op gist, binnen vijf minuten. Zowel laboratoriumstammen en vliegen van een natuurlijke populatie Toronto gevarieerd in hun gedrag voederen en er een genetische component aan individuele verschillen in weglengte. Twee larvale foerageren morphs werden beschreven vanuit de kwantitatieve weglengte distributies en ze waren rover en sitter genoemd. Rovers vertonen langere weg-lengtes, terwijl het doorkruisen van een groter gebied, terwijl op een voedingsmiddel substraat dan sitters. Met behulp van deze weglengte assay, de Belle et al. 3 in kaart gebracht het foerageren (voor) gen verantwoordelijk voor deze individuele gedragsverschillen een discrete locatie op chromosoom- 2 (24A3-24C5). De D. melanogaster voor gen werd later gekloneerd 4 en openbaarde een cGMP afhankelijke eiwitkinase 5, een modulator fysiologie en gedrag in Drosophila en andere organismen 6 zijn.
Hier schetsen we de huidige protocol voor de larvale weglengte assay oorspronkelijk ontwikkeld in Sokolowski 2. Hoewel bepaalde aspecten van de test loop der jaren veranderd, het concept achter het ontwerp niet. We bieden ook gegevens aan het potentieel van de test om genetische en omgevingsfactoren bijdragen aan individuele verschillen in het foerageergedrag van Drosophila larven te beoordelen te illustreren. Het larvale weglengte test is eenvoudig, efficiënt en toch robuust. Een enkele persoon kan testen tot 500 larven met gemak vier uur en de resultaten kunnen worden verkregen met een hoge reproduceerbaarheid. Oorspronkelijk ontwikkeld om te lokaliseren, kan worden gebruikt in genetische, quantitative trait locus in kaart brengen en in studiesvan gen-by-omgeving (GxE) interacties. Bovendien zijn de eenvoud en de reproduceerbaarheid maken het tot een geweldige bron voor undergraduate onderwijs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereid Grape Platen en Holding Flessen voor verzamelen van Larven
- Om die flessen te maken, knippen gaten in de ene kant van 6 oz fly cultuur flessen, groot genoeg om een vlieg flacon stekker voor luchttoevoer passen (Fig. 1D).
- Om druif platen te maken, voor te bereiden 250 ml van druivensap medium (1,8% agar, 45% druivensap, 2,5% azijnzuur, 2,5% ethanol) door het koken van de agar, druivensap en het grootste deel van het water, afkoelen tot 70 ºC ( roer tijdens het afkoelen), voeg dan azijnzuur en ethanol en aan tot de streep met water.
- Gebruik een spuit (zonder naald) tot 35 x 10 mm petrischaal deksels te vullen tot het oppervlak van het druivensap medium maakt een koepel boven de lip van het deksel (afb. 1A).
- WINKEL druif platen in een vochtige en luchtdichte houder bij 4 ° C tot gebruik (tot maximaal 2 weken).
2. bereiding van voedsel Plates
- Bereid standaard vlieg voedsel recept.
Opmerking: Om test opfokvoeder kwaliteit effecten op de weglengte gebruikten we lage voedingsstof vlieg voedsel: 10% sucrose, 1,3% agar, 0,8% kaliumnatriumtartraat, 0,1% monokaliumfosfaat, 0,05% natriumchloride, 0,05% calciumchloride, 0,05% magnesiumchloride, 0,05% ijzersulfaat, 5% gist en 0,5% propionzuur in water; en hoge nutriënten vlieg voedsel: 1,5% sucrose, 1,4% agar, 3% glucose, 1,5% maïsmeel, 1% tarwekiemen, 1% sojameel, 3% melasse, 3,5% gist, 0,5% propionzuur, 0,2% Tegosept en 1 % ethanol in water. Voor zowel voedingsmiddelen Autoclaveer de oplossing en laat afkoelen tot 50 o C voor het toevoegen van het propionzuur, Tegosept en ethanol. - Giet 40 ml vlieg voedsel in 100 x 15mm Petri gerechten.
- Bewaar voedsel platen in een vochtige en luchtdichte container bij 4 ° C tot gebruik (tot een maximum van 2 weken).
3. Bereid Test Plates
- Bereid 58 x 25 cm, 6 mm dikke zwarte plexiglas platen met 10, 1 mm diepe ronde putjes, 10 cm in diameter en aangebracht in een 2 x 5 design (Fig. 1C) larven testen.
Nb: Tot 30 larven kunnen worden getest om tegelijkertijd 3 of meer van bovenstaande plexiglas platen zijn. Als alternatief kunnen larven worden getest in petrischalen, 10 cm in diameter. Deze optie is veel omslachtiger en maakt lagere aantallen larven te testen. - Het verkrijgen van een zwarte 39 x 8 cm, 6 mm dik plexiglas verspreider voor het verspreiden van de gist pasta op het plexiglas testplaten.
- Bereid 100 x 15 mm petrischaal deksels voor het opnemen van larvale pad-lengtes door het scheiden van deksels van de bodems van tevoren.
4. Het opzetten van Parental Populaties
- Houd het grootbrengen voorwaarden constant gedurende de gehele test (bijvoorbeeld 25 ° C, 60% vochtigheid en een 12:12 licht: donker cyclus op standaard vlieg voedsel).
- Raise ouderlijke bevolking in dezelfde kweekomstandigheden.
- Verzamel 100-150 vrouwen en 50 - 75 mannen en ze rijpen 5 ± 1 dagen voor een optimale vruchtbaarheid.
- laat females en mannetjes paren 's nachts in een 6 oz fly cultuur fles met standaard vlieg voedsel.
- Transfer vliegt in een bedrijf fles en zet een druif plaat (een kleine hoeveelheid verse gist pasta op de druif plaat zal bevorderen eierleggende; fig. 1B) over de top met plakband (afb. 1E).
- Laat flessen stond op zijn kop (Fig. 1F), met de druif plaat aan de onderkant te laten volwassenen om eieren te leggen op de druif plaat.
- Gooi de eerste druif plaat na 24 uur en plaats een nieuwe druif plaat op het bedrijf fles. Dit zal de druif plaat waaruit larven de volgende dag worden verzameld zijn.
Opmerking: Grape platen zullen moeten worden vrijgesproken van larven 22 uur na opgezet, opgezet borden zodat ze begin volgende dag kan worden gewist (bijv., Het opzetten van plaat bij 12:00 en duidelijk om 10 uur de volgende dag). Het is raadzaam om de eerste druif plaat Negeren om niet-eieren die vrouwen kunnen zijn roerende en tha voorkoment kan worden voortbewogen in ontwikkeling.
5. Verzamel L1 (Eerste Instar) Larven van Grape Plates
- Verwijder druif platen uit flessen 22 uur nadat ze werden opgericht en plaats in een 60 x 15 mm petrischaal.
- Plaats een nieuwe druif plaat met verse gist plakken op het bedrijf fles.
- Duidelijke en gooi alle larven van de geënte druif plaat met behulp van een dissectie sonde.
- Incubate ontruimd druif platen voor 4 uur in normale omstandigheden.
- Na 4 uur, pick-100 L1 larven per soort uit de druif borden en leg op voedsel borden.
- Plaats larven op het voedsel voorzichtig (zonder perforeren het eten en het begraven van de larven) en verdringing te voorkomen door het verspreiden van de larven in de voedselverwerkende industrie plaat.
- Incubate voedsel platen tot proefdieren zijn ongeveer 10 uur voor de start van zwerven.
Opmerking: Bij 25 ºC, 10 uur voor het algemeen zwerven komt overeen met 72-96 uur na het uitkomen. de exact hoeveelheid incubatietijd dient te worden vastgesteld vóór het begin van het experiment door het verzamelen van een eerste reeks van larven voor elke stam en het registreren van het aantal uren tot de start van het zwerven (dwalen larven zal verhuizen van het voedsel op de zijkanten en het deksel van het voedsel platen).
Opmerking: Indien nodig, kan dezelfde ouders worden gebruikt om larven 3 verzamelen - 4 dagen van het testen door het herhalen van stappen 4,7-5,5. De volgorde waarin stammen worden opgezet en getest in dagen een testorde effect op weglengte voorkomen. Test dezelfde "control" stam / stammen elke dag van het testen om te controleren voor de dag effecten. - Als veel stammen worden getest, spreiden de opzet en ophaaltijden van de larven mogelijk maken het testen van elke stam op het juiste tijdstip later.
6. Larvale Path-length Test
- Ontbinden droge-actieve bakkersgist in water bij een 1: 2 verhouding (gewicht naar volume). De afgewerkte gistpasta moet dunner zijn dan pancake beslag, zodanig dat bij het optillen van een lepel uit de pasta, het druppelt en achterlaat linten op het oppervlak van de pasta die snel wegsmelten.
Opmerking: De consistentie van de gistpasta is belangrijk en moet constant gedurende het experiment. De exacte gist: water verhouding zou moeten worden aangepast afhankelijk van het merk en batch gist. - Voorzichtig plukken larven van de eerste stam te testen uit het voedsel plaat met behulp van een kwast.
- Verzamel larven in een petrischaal en voorzichtig te wassen met water om al het voedsel te verwijderen.
- Snel wassen larven met 1-2 ml water en voorzichtig deppen larven droog met een laboratorium af te vegen om te vermijden dat er geen water bij het plaatsen van de larven op de test plaat. Om stress te vermijden, houden larven vochtig maar niet ondergedompeld in water.
- Schik drie testplaten naast elkaar en ligt op 5 minuten timer voor elke test plaat.
- Toepassen gistpasta naar de top van de testplaten en met de spreider, een dunne layer gist pasta op elke testplaat zodat alle putjes een gelijkmatige laag van gist.
- Plaats voorzichtig een larve in het midden van elk putje starten van de timer 5 min na het plaatsen van de eerste larven op elke plaat. Opmerking: Drie platen kan tegelijk, waardoor een steekproefomvang van 30 / stam / testdag, tot een totaal van 500 larven.
- Plaats een petrischaal deksel bovenop elk putje.
- Wanneer de timer afloopt, zonder het verwijderen van de larven van de plaat, start het opsporen van de pad-lengtes achtergelaten in de gist met behulp van een permanent marker. Trace pad-lengte in dezelfde volgorde als larven werden op de testplaten.
- Voer traceren op dezelfde snelheid als larven op de platen werden geplaatst. Voor de consistentie in latere data-analyse, maken gebruik van dezelfde marker voor alle pad-lengtes. Permanent marker is aan te bevelen.
- Herhaal de stappen 6.2 tot 6.8.1 voor elke stam te testen. Pick elke stam uit het voedsel dat onmiddellijk voor het testen om de honger effecten op pa voorkomenth-length.
7. Levensmiddelen beroving
- Als larven zijn voedsel verstoken van de proef, verzamelen larven zoals beschreven in stap 6,2-6,3, maar de gewenste hoeveelheid voedselontbering tijd eerder (bijv., Wanneer larven worden waaraan voedsel is onthouden gedurende 4 uur, verzamel larven 4 uur voor testtijd).
- Verdeel gewassen larven in twee groepen en plaats het voedsel verstoken groep in een 60 x 15 mm petrischaal met 5 ml 1% agar en de controlegroep in een petrischaal met 5 ml standaard eten.
- Plaats een gewicht boven op het omgekeerde deksel van de petrischalen (anders larven kunnen kruipen bij het zoeken naar voedsel).
- Incubeer de eerder vastgestelde voedsel ontbering periode en ga verder met het testen zoals beschreven in de stappen 6,2-6,9.
- Als veel stammen worden getest, wankelen de voedselontbering starttijden om voor het testen van elke stam op het juiste tijdstip.
8. Data Analysis
Opmerking: Deze sectie beschrijft een werkwijze voor analyse met behulp ImageJ 7 of 8 Fiji verwerking van pad-lengte, hoewel andere software kan worden gebruikt.
- Gebruik een lichte tafel om alle getraceerd pad-lengtes van de petrischaal deksels over te dragen aan white paper (deksels kan worden gewassen met ethanol en hergebruikt voor verdere weglengte opname).
- Trace een 50 mm rechte referentielijn op een van de vellen papier.
- Scan de pad-lengtes met een resolutie van 300 dpi en opslaan als bitmap of tiff beeldbestanden.
- Open het image-bestand, selecteert u de "Process" tab> "Binary"> "Maak binary". Vervolgens onder het tabblad "Process", selecteer "Binary"> "schets maken". Dit levert een één pixel breedte lijn, ongeacht de dikte van het spoor.
- Zorg ervoor dat elke weglengte verschijnt als een continue enkele regel zonder crossovers.
- Scheid elke kruispunten met behulp van de "Straight line functie "en het inkleuren van de lijn wit (de continuïteit van het pad kan worden gecontroleerd met de" Wand "(tracing) tool, moet het hele pad geel gemarkeerd (afb. 2).
- Selecteer de "Analyse" tabblad> Set metingen en selecteer "Perimeter" en "display label".
- Selecteer de "Analyse"> tabblad "Stel schaal" en selecteer "schaal verwijderen".
- Op de afbeelding, selecteert u de verwijzing regel alleen, selecteert u het tabblad "Analyse"> "Analyse deeltjes" en selecteer "Show: Outlines", "Toon resultaten" en "Clear resultaten table". Let op: De uitgang zal het aantal pixels dat overeenkomt met de 50 mm schaal lijn laten zien.
- Selecteer "Analyse"> tabblad "Stel schaal" en in het aantal pixels in "Distance in pixels" en de bijbehorende afstand (50 mm) in de "bekende afstand" in te vullen.
- Tot slot, selecteert u alle weglengte tekeningen van een genotype eenta tijd, selecteer de "Analyse"> tabblad "Analyse deeltjes" en selecteer "Show: contouren", "Toon resultaten" en "Clear resultaten table".
- Verwijder eventuele schriftelijke labels of voor de hand liggende vreemde markeringen (ze zullen worden erkend als path-lengtes) binnen het geselecteerde gebied door het gebied te selecteren en vullen wit.
- Inspecteer de "Outlines" output file te zorgen voor de perimeters correct werden vastgesteld. De uitgang een weglengte in mm per weglengte tekening de selectie tonen. Dit kan gemakkelijk worden geëxporteerd naar een spreadsheet en geanalyseerd met statistische software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verschillen in weglengte van de rover en sitter voor stammen en het effect van voedsel op deprivatie weglengte zijn geïllustreerd in Fig. . 3 verzamelde gegevens gedurende drie opeenvolgende dagen testen toonde een significante stam effect (F (1,421) = 351,89, p <2,20 x 10 -16; fig. 3A), met rovers verder dan sitters reizen. Naast het effect stam, was er een significant behandelingseffect voedseleffect (F (1, 421) = 461,62, p <2,20 x 10 -16, fig. 3A), met larven die werden voedsel onthouden gedurende vier uur voor de test met aanzienlijk lagere pad-lengtes dan gevoed larven. Bovendien is de ANOVA toonde een significante stam door behandeling interactie (F (1,423) = 9.78, p = 2 x 10 -3), wat betekent dat rovers en sitters gereageerd op het onthouden van voedsel in verschillende mate.
"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> Hoewel de bovenstaande gegevens ook een significant effect van testdag (F (2,420) = 7,22, p = 8 x 10 -4, Figuur 3B - 3C.) Bleek er geen significante stam- per dag interactie (F (2,846) = 2,32, p = 0,10), wat betekent dat dag getroffen rovers en aanwezigen soortgelijke. Toch was er een significant dag behandelingsinteractie (F (2,420) = 8,07, p = 4,00 x 10 -4), waaruit blijkt dat het effect van de behandeling varieerde over dagen. het grootbrengen van de kwaliteit van het voedsel een significant effect op pad-lengtes (Fig. 4) had ook. over het algemeen pad-lengtes waren langer als larven van beide stammen werden gekweekt op onze hoge nutriënten eten in vergelijking met lage voedingsstoffen voedsel (F (1, 352) = 126,38, p <2,20 x 10 -16). Rover-sitter verschillen waren echter nog steeds onderhouden, ondanks de kwaliteit van het eten tijdens de opkweek van larven (F (1, 352) = 94,89, p <2,20 x 10 -16 ). Dag effecten die significant was (F (2, 351) = 3,77, p = 0,024) opgenomen in het statistische model. Bovendien was er een significante stam- per dag interactie (F (1704) = 7,15, p = 9,00 x 10 -4), evenals een significante voedsel door dag interactie (F (1704) = 5,06, p = 7,60 x 10 - 3).Ten slotte is het belangrijk op te merken dat de relatieve rover-sitter verschillen waren significant over de dag, de kwaliteit van levensmiddelen en ontbering effecten, maar dat de absolute weglengte metingen verschilden tussen dag en behandelingen. Deze resultaten niet alleen onderstrepen de robuustheid van de larvale weglengte test, maar ook het belang van de controle voor het kweken van omstandigheden, die elke stam / behandeling van de rente op iedere dag van het testen, en factoring in de dagen van effecten in de analyses.
1 "src =" / files / ftp_upload / 53980 / 53980fig1.jpg "/>
Figuur 1. Voorbereiding van de Holding Flessen en testen Platen. (A) Grape platen voor het leggen van eieren moet boven de rand gevuld worden tot een gladde koepel van media vormen. Toevoeging van een kleine hoeveelheid verse gist plakken (B) bevordert de eileg. (C) Plexiglas testen plaat met randen in putten en spreader. (D) De vlieg cultuur fles met gat gesneden voor luchttoevoer. Na de overdracht van ouderlijke bevolking om de cultuur fles, moet druif borden worden aangebracht over de opening met plakband (E) en de flessen moeten worden geplaatst met de druif plaat aan de onderkant (F). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .
g "/>
Figuur 2. Image Analysis van Ingewikkelde Path-lengte Traces. Path-lengtes, waar larven hebben gekruist over hun eigen weg moeten handmatig worden gescheiden bij de kruising om een enkele ononderbroken lijn te genereren. (A) toont een voorbeeld van drie gescande pad-lengtes, met een rode pijl op het snijpunt van de top weglengte. (B) toont hetzelfde weglengte bewerkt in ImageJ om het kruispunt te scheiden. (C) Toont de ImageJ perimeter uitgang van de kruisende weglengte, met onjuiste beoordeling van de perimeter van het pad 1 als gevolg van de kruising. (D) Toont de ImageJ omtrek output van de bewerkte bestand met het gesplitste kruising en juiste beoordeling van de perimeter van weglengte 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Fed en Voedselkwaliteit Beroofd Rover en Sitter Larvale Path-lengtes Mean larvale weglengte (millimeters ± SEM) voor rovers en zittenden, waaruit blijkt:. (A) samengevoegde pad-lengtes voor gevoed en 4 uur eten beroofd larven gedurende drie opeenvolgende testdagen, 105 <n <120; (B) Fed larvale pad-lengtes tot dag 38 <n <40 per dag; en (C) 4 uur voedsel onthouden larvale pad-lengte per dag, 38 <n <40, per dag. Alle larven en ouders werden gehouden op de lage voedingsstof eten bij 25 ° C, 60% vochtigheid en een 12:12 L: O-cyclus. Verschillen tussen proefgroepen en / of behandelingen werden door variantieanalyse (ANOVA) en Tukey's test voor post hoc paarsgewijze meerdere vergelijkingen. Voor (A) een blokkerende factor dag werd aan het model toegevoegd. Letters staan voor statistische groeperingen; betekent dat met dezelfde letter zijn niet significantly verschillend (p <0,05). Fed en FD staan voor gevoed en 4 uur eten beroofd omstandigheden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Voedselkwaliteit en larven Path-lengtes. Mean larvale weglengte (millimeters ± SEM) voor rovers en sitters, waaruit blijkt pad-lengtes van de larven groeien op hoge en lage voedingsstoffen voedsel. Data samengevoegd gedurende drie opeenvolgende dagen van het testen met een blokkerende factor van de dag toegevoegd aan het statistisch model, 75 <n <90. Alle larven en ouders werden gehouden op de lage of hoge voedingsstof eten bij 25 ° C, 60% vochtigheid en een 12:12 L: O-cyclus. Verschillen tussen testgroepen en / of behandelingen werden beoordeeld door analyse van de variantie (ANOVA) en test Tukey voor post-hoc paarsgewijze Multiple vergelijking. Letters staan voor statistische groeperingen; middelen met dezelfde letter zijn niet significant verschillend (p <0,05). Hoge en lage stand voor hoge nutriënten en lage kwaliteit voedingsstoffen eten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De weglengte assay hier geschetste biedt een robuuste en eenvoudige maatregel van het foerageergedrag van Drosophila larven. Het protocol volgt de algemene methodiek Sokolowski 2 beschreven, maar is sindsdien verbeterd met betrekking tot efficiëntie en experimentele controles. Voor zover wij weten is deze methode de enige beschikbare werkwijze voor het meten larvale weglengte. De oorspronkelijke versie van de weglengte protocol 2, 3, 15, 16 geteste larven op petrischalen met een dun laagje gistpasta aangebracht met een borstel, en later een glazen staaf verspreiden. Meer recente versies van het protocol 10, 17 overgestapt op het gebruik van de plexiglas platen hier beschreven. Het gebruik van petrischalen en glas strooier had het voordeel van een zeer dunne laag van gist, die zeer lange weg lengtes leverde en versterkt het verschil tussen de rover en sitter fenotypes. Het gebruik van plexiglas platen resulteerde in het algemeen kortere lengtes pad, maar rover-sitter verschillen werden onderhouden en even reproduceerbaar. Hoewel het gebruik van plexiglas platen minder bewerkelijk, de langere weg-lengten verkregen met de werkwijze Petrischaal geleid tot een betere scheiding van de rover en sitter fenotypes vergemakkelijken genetisch in kaart brengen van de rover-sitter verschil met de voor gen-3. Het gebruik van plexiglas testplaten in plaats van petrischaaltjes, en computationele analyses van weglengte sporen zijn de belangrijkste wijzigingen in het protocol, omdat de methode werd voor het eerst ontwikkeld, en hebben het aantal larven die kunnen worden getest door één persoon sterk toegenomen alsmede de snelheid van data-analyses. We hebben verbeterd onze kennis over verschillende experimentele en omgevingsfactoren die de uitkomst van de test, waarvan sommige hieronder beschreven kunnen beïnvloeden.
Ten eerste, deze test meet individuele verschillen in weglengte gedrag op een foerageersubstraat (een gist-water plakken). significant differences in deze test zou het gevolg zijn van defecten in het algemeen larvale motoriek. Dit kan voor worden gecontroleerd door gelijktijdig testen op larvale motoriek gedrag op niet-voedzame agarplaten. Als stam verschillen op agar platen worden gehandhaafd, is het veilig om te veronderstellen dat de verschillen gevonden op een gist-water substraat niet foerageergedrag specifiek. Het is eerder aangetoond dat terwijl de rover voor allel verleent significant langere pad-lengtes op gist, rovers en sitters verschillen niet in de afwezigheid van voedsel, omdat ze op dezelfde lange weg-lengtes vertonen op agar 9. Bovendien, omdat de larven gewoonlijk locomotie in afwezigheid van voedsel, vinden weinig of geen beweging op agarplaten verhogen waarschijnlijk indicatief voor defecten in de motoriek. Sinds food-onafhankelijke beweging gebreken kan fungeren als een verstorende variabele bij het onderzoek foerageergedrag, kan agar controle valse positieven te verminderen in genetische screens 10. Het is ook belangrijk om op te merken dat als LARvae werden beschadigd voordat testen, kunnen ze niet bewegen. Immobiel, dode of beschadigde larven kunnen worden onderscheiden van gezonde larven door het observeren van de mond haak beweging. Immobiel larven zonder mond haak bewegingen moet worden weggegooid.
In de tweede plaats met andere gedragingen, larvale weglengte kan worden beïnvloed door omgevingsfactoren die moeten worden onderzocht en gecontroleerd bij het uitvoeren van deze test. Omgevingsfactoren bekend om het pad lengte van invloed zijn onder andere het grootbrengen temperatuur, luchtvochtigheid, kwaliteit van het eten, het grootbrengen dichtheid, gist plakken dikte, toevallige verschillen tussen dagen, en de behandeling van de larven. Larvale ontwikkeling en de leeftijd op het moment van de test ook van invloed weglengte 11. Zoals getoond in Fig. 4, het verhogen van de larven in lagere kwaliteit voedsel vermindert weglengte. Het gebruik van een van de vlieg voedsel recepten in dit protocol of een andere dode gist recept dat gelijkwaardig is in zijn voedingswaarde beschreven wordt aanbevolen. Ook suggested aan hoge of lage dichtheid opfokken omgevingen te vermijden door altijd zaaien voedsel platen met 100 larven en spacing ze gelijkmatig over het voedsel. Grootbrengen larven bij hoge dichtheden beperkt de beschikbaarheid van voedsel en vertraagt larvale ontwikkeling die kan leiden tot ontwikkeling tussen larven aan het tijdstip van de test 12. Lage dichtheid kweekomstandigheden kan ook invloed hebben op de ontwikkeling sinds Drosophila larven sociale foerageergebied groepen kunnen vormen te breken voedsel en verhoging van foeragerende succes 13. Wanneer larven met mutaties die invloed larvale maat worden getest, moeten soms rekening houden met deze effecten door het berekenen weglengte als functie van larvale lichaamslengte of perimeter zijn. In alle gevallen is het belangrijk dat larven niet overgegaan tot dwalen fase waarin ze worden getest. Als larven omhoog naar de petrischaal deksel tijdens de test, is het waarschijnlijk dat ze dwalen en het experiment moet worden weggegooid en herhaald met jongere larvae.
Een andere factor die het vermelden waard is de consistentie van de gist pasta gebruikt in weglengte testen omdat het de kruipende snelheid van de larven beïnvloedt. Larven getest op een dikke gist pasta korter pad-lengtes dan larven getest op een meer waterige gist pasta te hebben. Bovendien stochastische verschillen tussen testdagen ook gevolgen absolute weglengte scores. Het is noodzakelijk om de volgorde waarin stammen / genotypes worden getest binnen enkele dagen en om ze tussen dagen te blokkeren willekeurig. Ten slotte moet erop worden gelet geen larven voorafgaand aan path-lengte testen benadrukken. Twee stressoren die vaak door middel van behandeling worden geïntroduceerd zijn honger en verdrinking. Zoals getoond in Fig. 3, uitgehongerde larven voorafgaand aan het testen afneemt path-lengte, en hoewel honger als een milieu manipulatie kan worden ingevoerd, moet de onbedoelde gebeurtenis worden vermeden. Benadrukkend larven moeten worden vermeden door zachtjes, maar al snel te werken, waardoor het beperken van de hoeveelheid tijd spent verzamelen, reinigen en overbrengen larven. Sinds tentoonstelling larven negatief phototaxis 14, kan intens licht ook fungeren als een stressor en de test moet worden gedaan in het kader van zelfs, diffuus licht. Ondanks de vele omgevingsfactoren die weglengte kan veranderen, is het belangrijk op te merken dat hoewel de absolute weglengte scores zijn gevoelig voor omgevingsomstandigheden, relatieve verschillen tussen stammen worden gehandhaafd wanneer alle personen gelijk worden behandeld.
Nauwkeurigheid, efficiëntie en robuustheid in kwantificatie vormen de kern van studies gericht op het begrijpen van de genetische en omgevingsfactoren die het gedrag bemiddelen. De Drosophila larven weglengte assay biedt al deze voordelen in aanvulling op lage kosten, hoge verwerkingscapaciteit en gemakkelijk uit te voeren. Als zodanig kan deze test wijd voor genetische screens de moleculaire en genetische pathways geassocieerd met gedragsreacties identificeren. Bovendien kan de test worden eenpplied aan het testen toxiciteit of farmacologische schermen, of aangepast voor het onderwijs in de klas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz fly culture bottles | Fisher Scientific | AS355 | |
| Fly vial plugs | Droso-Plugs | 59-201 | |
| 35 x 10 mm Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher | 875712 | |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-168 | |
| Dissecting probes | Almedic | 2325-58-5300 | |
| Yeast | Lab Scientific | FLY-8040-20F |
References
- Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster). Dubnau, J. , Cambridge University Press. New York. 173 (2014).
- Sokolowski, M. B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis. Behav Genet. 10, 291-302 (1980).
- de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 123, 157-164 (1989).
- Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila. Science. 277, 834-836 (1997).
- Kalderon, D., Rubin, G. cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila. J Biol Chem. 264 (18), 10739-10748 (1989).
- Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior. Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 140, 263-270 (1995).
- Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation. J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).
- Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time. Genetics. 82, 33-44 (1990).
- Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. Dynamics of social behavior in fruit fly larvae. PLoS One. 9 (4), e95495 (2014).
- Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae). J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster. Heredity. 59, 73-83 (1987).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster. Genome. 36, 94-101 (1993).
- Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection. PNAS. 94, 7373-7377 (1997).
