Abstract
Drosophila melanogaster larva yol uzunluğu fenotip davranışsal değişim genetik ve çevresel katkılarını incelemek için kullanılan bir tesis ölçüsüdür. Larva yol uzunluğu tahlil sonra toplayıcı genin bağlantılı olduğunu toplayıcı davranış bireysel farklılıkları ölçmek için geliştirilmiştir. Larva yol uzunluğu genetik ekranlar için, en az maliyetle, büyük örneklem boyutlarının toplama kolaylaştıran bir kolay gol özelliktir. Burada ilk Sokolowski tarafından kullanılan larva yol uzunluğu tahlil için geçerli protokol ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. protokol tekrarlanabilir test hayvanları ele davranışsal tahlil gerçekleştirmek ve verileri analiz nasıl ayrıntıları. Deney ortamı besleme manipüle önce tahlil gerçekleştirerek çevresel değişikliğe yanıt olarak davranış plastisite ölçmek için nasıl kullanılabileceğini bir örneği, aynı zamanda temin edilmektedir. Son olarak, uygun test tasarımı yanı sıra çevresel faktörlerin değiştirebileceğinizBöyle gıda kalitesi, gelişimsel yaş ve gündüz etkileri gibi larva yol uzunluğu tartışılmıştır.
Introduction
1910 yılında Thomas Hunt Morgan laboratuvarında beyaz genin bulunmasından bu yana, meyve sineği, Drosophila melanogaster (D. melanogaster), çeşitli biyolojik süreçlerin moleküler ve fizyolojik temellerinin çalışma için bir model olarak kullanılmıştır. D. popülerlik melanogaster büyük ölçüde genetik araçları önemli miktarı ve çeşitliliği kaynaklanmaktadır. Drosophila en küçük boyutlu, taşıma ve kısa nesil süresi göreli kolaylığı o genetik çalışmalar için ideal bir model oluşturmak. Aynı derecede önemli olan memeliler dahil olmak üzere daha karmaşık organizmalar tarafından ifade fenotipleri birçok göstermek için Drosophila kapasitesidir. Bu organizma ve çevresi arasındaki arayüzde durmak böyle bir davranışa gibi karmaşık fenotipleri içerir. meyve sineği böyle, davranışsal çalışmalar genler ve çevre davranışı aracılık nasıl anlayışımıza önemli ölçüde katkıda bulunmuştur olarak1.
D. ilk çalışmalardan biri melanogaster larva davranış beslerken larva 2 yolu-uzunluklarını ölçerek larva toplayıcı stratejileri bireysel farklılıkları araştırıldı. Yol uzunluğu beş dakikalık bir süre içinde, maya tek bir larva tarafından katedilen toplam mesafe olarak tanımlanmıştır. Toronto'da bir doğal nüfus hem laboratuar suşları ve sinekler kendi toplayıcı davranışlarında farklılık ve yol uzunluğu bireysel farklılıklara genetik bir bileşeni oldu. İki larva toplayıcı morphs nicel yol uzunluğu dağıtımlarından tarif edildi ve onlar gezici ve bakıcısı çağrıldı. daha büyük bir alanı geçme sırasında Rovers ise oturabilenler daha gıda alt tabaka üzerinde uzun yol-uzunlukları sergilerler. Bu yol uzunluğu deneyi kullanılarak, de Belle ve ark., 3 chromosome- 2 (24A3-24C5) bir ayrık konuma bu bireysel davranış farklılıkları altında yatan toplayıcılık (için) genini eşleştirilmiş. D. mgen için elanogaster sonra 4 klonlanabilir ve bir cGMP bağımlı protein kinaz 5, fizyoloji ve davranış Drosophila ve diğer organizmaların 6 bir modülatörü olduğu ortaya çıkmıştır.
Burada aslında Sokolowski 2 geliştirilen larva yol uzunluğu tahlil için geçerli protokol özetlemektedir. testinin bazı yönleri yıllar içinde değişti olmasına rağmen, tasarımın arkasındaki kavram değildir vardır. Biz de Drosophila larva toplayıcı davranış bireysel farklılıklara genetik ve çevresel katkılarını değerlendirmek deney potansiyelini göstermek için veri sağlar. larva yol uzunluğu tahlil, basit, verimli ve henüz sağlam. Tek bir kişi, dört saat içinde kolaylıkla 500 larva kadar test ve sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde elde edilebilir. Başlangıçta çalışmalarda genetik ekranlar, niceliksel özellik lokusu haritalama kullanılan ve edilebilir için lokalize için geliştirilmişgen-by-çevre (GXE) etkileşimleri. Dahası, onun basitliği ve uyarlık o lisans öğretimi için büyük bir kaynaktır olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Larva Tahsil Üzüm Plakaları ve Holding Şişeler hazırlayın
- Tutan şişe yapmak için, hava temini için bir sinek flakon fiş sığacak kadar büyük 6 oz sinek kültürü şişeleri, (Şek. 1D) bir tarafında delikler kesti.
- (Ağar, üzüm suyu kaynatma ile üzüm suyu ortamında (% 1.8 ağar,% 45 üzüm suyu,% 2.5 asetik asit,% 2.5 etanol) 250 ml hazırlanması ve suyun büyük bölümü, 70 ° C kadar soğumaya, üzüm plakaları yapmak için ) soğutma sırasında, daha sonra asetik asit ve etanol ekleyin ve su ile hacme getirmek karıştırın.
- Üzüm suyu ortamının yüzey kapağının (Şek. 1A) dudak üzerinde bir kubbe edinceye kadar 35 x 10 mm Petri kabı kapaklarını doldurmak için (iğne olmadan) bir şırınga kullanın.
- 4 ° C'de nemli ve hava almayan kaplarda saklayın üzüm plakaları kullanıma kadar (2 hafta maksimum).
Gıda Tabaklar 2. Hazırlık
- Standart sinek gıda tarifi hazırlayın.
Not: t için% 10 sakroz,% 1.3 ağar,% 0.8 potasyum sodyum tartrat, 0.1% monopotasyum fosfat,% 0.05 sodyum klorür,% 0.05 kalsiyum klorid,% 0.05 magnezyum klorür: yol uzunluğu EST yetiştirme gıda kalitesi etkisi Bu düşük besin sinek gıda kullanılan % 0.05 su içinde demir sülfat,% 5 ve% 0.5 maya propionik asit; ve yüksek besin sinek gıda:% 1.5 sukroz,% 1.4 ağar,% 3 glükoz,% 1.5 mısır unu,% 1 buğday tohumu,% 1 soya unu,% 3 melas,% 3.5 maya,% 0.5 propionik asit,% 0.2 Tegosept 1 su içinde% etanol. Her iki yiyeceklerde propiyonik asit, Tegosept ve etanol eklemeden önce 50 o C 'çözüm ve serin otoklav. - 100 x 15mm Petri kapları içine sinek gıda 40 ml dökün.
- 4 ° C'de nemli ve hava almayan kaplarda saklayın gıda plakaları kullanıma kadar (2 hafta maksimum).
3. Test Plakaları hazırlayın
- çapı 58 x 25 cm, 10, 1 mm derinliğinde dairesel çukurlar 6 mm kalınlığında siyah Pleksiglas plakalar, 10 cm hazırlamak ve 2 x 5 gün içinde düzenlenmişlarva üzerinde test etmek esign (Şek. 1C).
Not: 3 ya da yukarıdaki pleksiglas plakaların daha mevcut olup olmadığını 30 larva kadar bir seferde test edilebilir. Seçenek olarak ise, larvalar petri kase çapı 10 cm test edilebilir. Bu seçenek daha zahmetlidir ve test edilecek larvaların düşük sayılar için izin verir. - Pleksiglas testi plakalar üzerinde maya macunu yaymak için bir siyah 39 x 8 cm, 6 mm kalınlığında pleksiglas serpme edinin.
- önceden dipleri kapaklarını ayırarak larva yol-uzunlukları kayıt için 100 x 15 mm Petri kabı kapaklarını hazırlayın.
4. Ebeveyn Populasyonlarında ayarlama
- Tüm tahlil boyunca sabit yetiştirme koşulları tutmak (örneğin, 25 ºC,% 60 nem ve 12:12 ışık: Standart sinek gıda karanlık döngüsü).
- Aynı yetiştirme koşullarında ebeveyn nüfusu kaldırın.
- 150 kadın ve 50 - - 100 toplayın 75 erkek ve optimum doğurganlık için 5 ± 1 gün boyunca onları yaş.
- f izinemales ve erkekler standart sinek gıda ile 6 oz sinek kültür şişe gecede çiftleşme.
- Maskeleme bandı (Şekil 1E.) Ile üst üzerinde, Transfer tutma şişenin içine uçar ve bir üzüm plakasını (Şekil 1B döşeme yumurta teşvik edecektir üzüm plaka üzerinde taze maya hamur küçük bir miktar.) Sabitleyin.
- Altındaki üzüm plaka ile, baş aşağı (Şek. 1F) ayakta şişeleri yetişkin üzüm plaka üzerinde yumurtalarını bırakmak için izin bırakın.
- 24 saat sonra ilk üzüm plaka atın ve tutma şişe yeni bir üzüm plakasını yerleştirin. Bu larvalar, ertesi gün toplanıp getirildiği, üzüm plaka olacaktır.
Not: Üzüm plakaları kurmak erken ertesi gün silinebilir, böylece plakaları kurmak sonra larva 22 saat temizlenecek gerekecektir (. Örneğin 12 pm plaka kurmak ve 10 net ertesi gün ben). Kadın stopaj ve tha olmuş olabilecek yumurta önlemek için ilk üzüm plaka atmak için tavsiye edilirt gelişiminde ileri olabilir.
5. Üzüm Tabaklar L1 (İlk Evre) Larva toplayın
- 60 x 15 mm Petri kabındaki onlar kuruldu 22 saat sonra şişe ve yerden üzüm plakaları çıkarın.
- tutma şişesi üzerinde taze maya macun ile yeni bir üzüm plaka koyun.
- Açık ve diseksiyon prob kullanılarak seri başı üzüm plaka tüm larvaların atın.
- Inkübe standart koşullarda 4 saat süreyle üzüm plakaları temizlenir.
- 4 saat sonra, üzüm plakalardan suş başına 100 L1 larvaları almak ve gıda plakaları üzerinde yerleştirin.
- (Larva gıda delme ve gömme olmadan) nazikçe gıda larvaları koyun ve gıda plaka üzerinde larvaları dağıtarak kalabalığı önlemek.
- Test hayvanları dolaşıp başlamadan önce yaklaşık 10 saat kadar gıda inkübe.
Not: - yumurtadan çıktıktan sonra 96 saat 25 ºC 'de, genel olarak dolaşıp 10 saat önce 72 karşılık gelir. exacinkübasyon süresi t miktarı her bir suş için larva bir başlangıç seti toplama ve göçebe başlangıcına kadar saat sayısını kaydederek deney başlamadan önce belirlenmelidir (dolaşıp larvalar gıda tarafına ve kapağın üzerine gıda dışında hareket edecek levha).
Not: Gerekirse, aynı anne 3 larva toplamak için kullanılabilir - 5.5 adımları 4.7 tekrarlayarak test 4 gün. suşları yol uzunluğu bir test sipariş etkisini önlemek için gün boyunca kurmak ve test edildiği sırasını değiştirin. Aynı "kontrol" gerginlik test / gün etkileri kontrol etmek için test her gün suşları. - Birçok suş test edilir ise, daha sonra, uygun bir zaman noktasında her bir suş test edilmesi için izin vermek için, larvaların kurmak ve toplama süreleri sersemleme.
6. Larva Yol boyu Testi
- 2 oranında (hacime göre ağırlık) bir 1: su içinde, kuru aktif fırıncı mayası içinde çözülür. bitmiş maya yapıştırmak pa daha ince olmalıdırncake meyilli, macun dışında bir kaşık kaldırma bir şekilde, o damlar ve hızlı bir şekilde eriyip hamur yüzeyinde şeritler geride bırakır.
Not: Maya macunun kıvamı önemlidir ve deney boyunca sabit olmalıdır. Tam maya: su oranı marka ve maya toplu bağlı ayarlanması gerekebilir. - Yavaşça ilk gerginlik larvaları bir boya fırçası kullanarak gıda plaka test edilecek seçin.
- Bir Petri kabındaki larvaları toplayın ve yavaşça tüm yiyecek çıkarmak için su ile yıkayın.
- bir laboratuvar ile 2 ml su ve hafifçe dab larva kuru test plakası üzerinde larvaları verirken suyun aktarılmasını engellemek için silin - Çabuk 1 ile larva yıkayın. , Stres önlemek nemli ama suya batırıldıktan değil larvaları tutmak için.
- yan üç test plakaları yan düzenleyin ve her bir test plakası için 5 dk zamanı ayarlayın.
- Test plakalarının üstüne maya macunu sürün ve serpme kullanarak, ince yatıyordu yayıldıtüm kuyuları maya düz bir tabaka var ki her test plakası üzerinde maya hamur er.
- Yavaşça her tabakta ilk larvaları yerleştirdikten sonra 5 dakika zamanlayıcı başlayarak her bir merkezi bir larva yerleştirin. Not: Üç tabak 500 larva toplam kadar 30 / suş / test günün bir örneklem büyüklüğü veren, bir defada yapılabilir.
- her bir üstüne bir Petri kabı kapağı yerleştirin.
- Zamanlayıcı bittiğinde, plakadan larvaları çıkarmadan, kalıcı bir kalem kullanarak maya geride bıraktığı yol-uzunlukları izleme başlar. larva aynı sırayla iz yolu uzunlukları testi plakalar üzerine yerleştirildi.
- Larvalar tabakalarına yerleştirildi ile aynı hızda izlemeyi gerçekleştirin. Daha sonra veri analizinde tutarlılık için, tüm yol-uzunlukları aynı işaretleyici kullanın. Kalıcı işaretleyici tavsiye edilir.
- Yineleyin her suş test edilecek için 6.8.1 için 6.2 adımları tekrarlayın. hemen pa üzerinde açlık etkilerini önlemek için test etmeden önce gıda her yük almakinci uzunlukta.
7. Gıda Yoksunluk
- Larvalar, gıda test edilmeden önce yoksun olması adım 6.2 6.3'e tarif edildiği gibi larvaları toplamak için, ancak gıda yoksunluğu zaman istenilen miktarda daha önce (örn., Larvalar eğer gıda 4 saat yoksun olması ise daha önce larva 4 saat toplama Test süresi).
- iki gruba yıkanmış larvaları bölün ve 5 ml standart gıda ile bir Petri kabındaki 5 ml% 1 agar ve kontrol grubu ile 60 x 15 mm Petri kabındaki gıda yoksun grubu yerleştirin.
- Petri yemekleri ters kapak (Aksi larva yiyecek ararken Sürünerek edebiliyoruz) üstüne bir ağırlık koyun.
- Daha önce kurulan gıda yoksunluğu dönemi boyunca inkübe ve adımları 6.9 6.2 tarif edildiği gibi test ile devam edin.
- Birçok suş test edilecek ise, aç bırakma, uygun bir zaman noktasında her bir suş test edilmesi için sürelerin başlangıç yalpalayarak.
8. Veri Analizi
Not: diğer yazılım kullanılabilir olmasına rağmen, bu bölümde, yol-uzunlukları işleme ImageJ 7 veya Fiji 8 kullanılarak veri analizi için bir yöntemi anlatmaktadır.
- (Kapaklar etanol ile yıkandı ve daha fazla yol uzunluğu kayıt için tekrar edilebilir) beyaz kağıda Petri kabı kapaklarının tüm takip yolu-uzunlukları aktarmak için bir ışık tabloyu kullanın.
- kağıt yaprak birinde 50 mm düz referans çizgisi çiziniz.
- 300 dpi çözünürlükte yol-uzunlukları tarayın ve bitmap veya TIFF görüntü dosyaları olarak kaydedin.
- "Süreç" sekmesine> "Binary"> "ikili olun" seçeneğini görüntü dosyasını açın. Sonra "Süreç" sekmesi altında,> "iskeletini" "İkili" seçeneğini seçin. Bu ne olursa olsun iz kalınlığı, bir piksel genişliği hattını oluşturur.
- Her yol uzunluğu hiçbir geçitler ile sürekli tek bir satır olarak göründüğünden emin olun.
- "Düz li kullanarak herhangi kavşakları ayırınne aracı Wand "(izleme) aracı" ve çizgi beyaz (yolun devamlılığını boyama ile kontrol edilebilir ", tüm yolu sarı vurgulanmış olmalıdır (Şek. 2).
- "Analiz" sekmesi> Set ölçümleri seçin ve "Çevre" ve "Ekran etiketi" seçeneğini seçin.
- "Analiz" sekmesi> "Set ölçeği" seçin ve "ölçek Kaldır" seçeneğini seçin.
- resmin üzerine,> "Analiz parçacıkları" "Analiz" sekmesini seçin, sadece referans satırı seçin ve "Göster: Anahatları", "sonuçlarını görüntüle" ve "Temizle sonuç tablosu". Not: Çıktı 50 mm çaplı hattına gelen piksel sayısını gösterir.
- "Analiz" sekmesi> "Set ölçeği" seçin ve "piksel uzaklığı" piksel sayısı ve "Bilinen mesafe" karşılık gelen mesafe (50 mm) doldurun.
- Son olarak, bir genotip a tüm yol uzunluğu çizimleri seçinta zaman, "Analiz" sekmesi> "Analiz parçacıkları" seçeneğini seçin "Göster: hatlarını", "sonuçlarını görüntüle" ve "Temizle sonuç tablosu".
- alanı seçerek ve beyaz doldurularak seçilen alanın içinde herhangi bir yazılı etiketleri veya bariz yabancı işaretleri (onlar yol-uzunlukları olarak kabul edilecektir) çıkarın.
- Görme perimeters doğru tespit emin olmak için "Ana Hatları" çıktı dosyası kontrol edin. çıkışı seçimi her yol uzunluğu çizim için mm cinsinden bir yol-uzunluğunu gösterecektir. Bu kolay bir elektronik tablo ihraç ve herhangi bir istatistik yazılımı ile analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gezici ve bakıcısı suşlar için ve yol uzunluğu gıda yoksunluk etkisi yolu uzunluğu farklılıklar Şekil l'de gösterilmiştir. . Rovers uzak oturabilenler daha yolculuk ile; (Şekil 3A. F (1,421) = 351,89, p <2.20 x 10 -16) 3 Veri test üç ardışık gün boyunca toplanan önemli bir gerilme etkisi gösterdi. Gıda, dört saat önce test için yoksun bırakıldı larvaları ile, suş etkisine ek olarak, aynı zamanda önemli bir gıda işleme etkisi (Şekil 3A. F (1, 421) = 461.62, p <2.20 x 10 -16) oldu beslenen larvaların önemli ölçüde daha düşük yol-uzunluklarına sahip. Ayrıca, ANOVA tedavi etkileşimi ile anlamlı bir gerginlik gösterdi (F (1,423) = 9.78, p = 2 x 10 -3), yani Rovers ve bakıcısı değişik derecelerde gıda yoksunluğu yanıt verdi.
"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> da Yukarıdaki veriler önemli bir test günün etkisini (F (2,420) = 7.22, p = 8 x 10 -4; Şekil 3B - 3C.) Gösterse de orada (= 2.32, p = 0.10 F (2846)), benzer şekilde o gün etkilenen Rovers ve bakıcılarını anlamına gelir. Bununla birlikte tedavi etkileşimi ile önemli bir gün (F (2,420) = 8.07, p = 4.00 x vardı gün etkileşimi ile anlamlı bir zorlanma oldu Her iki suşların larvaları üzerinde yetiştirilen zaman gün arasında farklılık tedavinin etkisi. gıda yetiştirme kalitesi de yol-uzunlukları (Şekil üzerinde önemli bir etkisi. 4) olduğunu gösteren 10 -4). Genel yol uzunlukları daha uzundu düşük besin gıda ile karşılaştırıldığında yüksek besin gıda (F (1, 352) = 126,38, p <2.20 x 10 -16). Rover bakıcısı farklılıklar ancak hala larva yetiştirme sırasında gıda kalitesine rağmen muhafaza edildi (F (1, 352) = 94,89, p <2.20 x 10 -16 ). Anlamlı bulundu Günü etkiler (F (2, 351) = 3.77, p = 0.024) istatistiksel modele dahil edildi. Bundan başka, günlük etkileşimi ile önemli bir suş (F (1,704) = 7.15, p = 9.00 x 10 -4), hem de günlük etkileşimi (F (1,704) = 5.06, p göre önemli gıda = 7.60 x 10 oldu - 3).Son olarak, göreceli gezici bakıcısı farklılıkları gün, gıda kalitesi ve gıda yoksunluğu etkileri arasında anlamlı olduğunu not etmek önemlidir, ancak mutlak yol uzunluğu ölçümleri günler ve tedaviler arasında farklılık olduğunu. Bu sonuçlar sadece analiz içine günlük etkileri larva yol uzunluğu testinin sağlamlığını değil, aynı zamanda, yetiştirme koşulları kontrol test her gün ilgi her suş / tedavi çalışan önemini ve faktoring altını değil.
1 "src =" / files / ftp_upload / 53980 / 53980fig1.jpg "/>
Holding, şişeler ve Test Plakalar Şekil 1. hazırlanması. (A) yumurtlama için Üzüm plakaları medyanın düzgün bir kubbe oluşturacak şekilde jant üzerinde doldurulmalıdır. Yaş maya macunu (B) küçük bir miktarının eklenmesi yumurtlama teşvik etmektedir. Kuyu ve serpme kenarlı ile (C) Pleksiglas test plakası. (D) hava temini için kesilmiş delik ile kültür şişe uçun. Kültür şişesine ebeveyn nüfusu aktardıktan sonra, üzüm plakaları maskeleme bandı (E) ile açılması üzerine monte edilmelidir ve şişeler alt (F) üzüm plaka ile yerleştirilmelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .
g "/>
Dolambaçlı yol uzunluğu İzler evi. Larvaları kendi yolunu geçtiklerine Yol-uzunlukları Şekil 2. Görüntü Analizi elle tek bir sürekli çizgi oluşturmak için kavşakta ayrılmalıdır. (A) üst yol uzunluğu kesişme noktasında kırmızı okun, üç taranan yol-uzunluklarda bir örnek gösterir. (B) kavşak ayırmak için ImageJ düzenlenebilir aynı yol-uzunluğunu gösterir. (C) nedeniyle kavşak yolu 1 çevresinin hatalı değerlendirme ile kesişen yol uzunluğu çıkışı, çevre ImageJ gösterir. (D) bölünmüş kavşak ve yol uzunluğu 1. çevresine doğru bir şekilde değerlendirilmesi ile düzenlenmiş dosyanın çıktısı çevre ImageJ gösterir bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Fed ve Gıda Rover ve Bakıcı Larva Yol-uzunlukları Yoksun Rovers ve oturabilenlerde için (± SEM milimetre) larva yol uzunlukta ortalama, gösteren. (A) ardışık üç üzerinde beslenen ve 4 saat yiyecek mahrum larvaları Pooled yol uzunlukları test günleri, 105 <n <120; Günün n 38 <günde <40 (B) Fed larva yol uzunlukları; ve (C) 4 saat yemek günde, n gün, 38 <<40 tarafından larva yol-uzunlukları yoksun. D döngüsü: Tüm larva ve veliler 25 ºC,% 60 nem ve 12:12 L düşük besin gıda yetiştirilen bulundu. Test grupları ve / veya tedaviler arasındaki farklılıklar, varyans analizi (ANOVA) ve çoklu karşılaştırma ikili çoklu karşılaştırmalar için Tukey testi ile değerlendirildi. (A) için günün bir engelleme faktörü modeli eklendi. Harfler istatistiksel gruplaşmaları temsil eder; Aynı harf ile ifade si değilgnificantly farklı (p <0.05). Fed ve FD beslenen ve 4 saat yiyecek mahrum koşullarda ayakta. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Gıda Kalitesi ve Larva Yol-uzunlukları. Yüksek ve düşük besin gıda yetiştirilen larvaların yolu-uzunlukları gösteren Rovers ve oturabilenler için larva yol uzunluğu (± SEM milimetre) ortalama. Veriler istatistiksel modele eklenen günün engelleme faktörü ile test üç ardışık gün boyunca toplanmış 75 <n <90. Tüm larva ve veliler 25 ºC,% 60 nem ve 12:12 de düşük veya yüksek besin gıda yetiştirilmiştir L: D çevrimi. Test grupları ve / veya tedaviler arasındaki farklılıklar, varyans analizi (ANOVA) ve çoklu karşılaştırma ikili multipl için Tukey testi ile değerlendirildie karşılaştırması. Harfler istatistiksel gruplaşmaları temsil eder; aynı harf ile nitelenen önemli ölçüde farklı (p <0.05) değildir. Yüksek besin ve düşük besin gıda kalitesi yüksek ve alçak standı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada özetlenen yol uzunluğu tahlil Drosophila larvaların toplayıcı davranış sağlam ve basit bir ölçü sunmaktadır. Protokol Sokolowski 2'de tarif edilen genel metodolojiyi takip eder, ancak bu yana verimlilik ve deneysel kontrol açısından iyileştirilmiştir. Bizim bilgimize göre bu yöntem larva yol-uzunluk ölçüm için mevcuttur yöntemdir. Yol uzunluğu protokol 2, 3, 15, bir fırça ile uygulanır maya hamur ince bir tabaka, ve çubuk yayılan, daha sonra bir bardak Petri 16 test larvalar orijinal versiyonu. Protokolün 10 daha yeni sürümleri, 17 burada açıklanan Pleksiglas plakaları kullanılarak geçişi. Petri kapları ve cam serpme makinelerinin kullanımı çok uzun bir yol-uzunlukları vermiştir ve gezici ve bakıcısı fenotipleri arasındaki farkları şiddetlenir maya çok ince bir tabaka, avantajı sundu. Pleksiglas plakalar kullanımı genel olarak daha kısa bir yol uzunlukları ile sonuçlandı ancak Rover-bakıcısı farklılıkları muhafaza ve eşit tekrarlanabilir. Pleksiglas plakaların kullanımı çok daha az zahmetli olmasına rağmen, Petri kabı yöntemi ile elde edilen uzun yol uzunlukları gen 3 için gezici bakıcısı farkı genetik haritalama kolaylaştırılması, gezici ve bakıcısı fenotipleri daha iyi ayrılması için izin verdi. Pleksiglas testi yerine Petri tabak ve yol uzunluğu izleri hesaplama analizlerin kullanımı ilk geliştirilen yönteme yana protokole yapılan önemli değişiklikler, büyük ölçüde tek bir kişi tarafından test edilebilir larva sayıları arttı veri hem de hızlı analiz eder. Biz de aşağıda özetlenmiştir bazıları tahlil, sonucunu etkileyebileceğini çeşitli deneysel ve çevresel faktörlere bilgilerimizi artırmıştır.
Öncelikle, bu deney bir toplayıcı substrat (maya-su yapıştır) üzerinde yol uzunluğu davranış bireysel farklılıkları ölçer. önemli dBu deneyde ifferences genel larva hareketin hatalarına yol açabilir. Bu aynı zamanda besleyici olmayan agar plakaları üzerinde larva hareket davranışı için tahlil tarafından kontrol edilebilir. gerilme farklılıkları agar plaklarına korunur, eğer bir maya-su yüzeye bulunan farklılıkların davranış özgü yiyecek arama olmadığını varsaymak güvenlidir. Onlar agar 9 benzer uzun yol boylarını sergiledikleri gibi, daha önce, alel için gezici maya üzerinde önemli ölçüde daha uzun yol-uzunlukları sağladığını ederken, rovers ve bakıcısı gıda yokluğunda farklılık olmadığı gösterilmiştir. larvaları, genel olarak gıda, agar plakaları üzerinde çok az veya hiç hareket bulma almaksızın lokomosyon geliştirmek için ayrıca, hareket hatası olası göstergesidir. Davranışı toplayıcılık araştırılırken gıda bağımsız hareket kusurları bir karıştırıcı değişken olarak hareket edebilir beri, ağar kontrol genetik ekranlarında 10 yanlış pozitif azaltabilir. Ayrıca şu da önemli olduğunu lar iseVAE Testten önce hasar gördü, hepsi de hareket etmeyebilir. Hareketsiz, ölü ya da hasarlı larvalar ağız kanca hareketi gözlemleyerek sağlıklı larva ayırt edilebilir. Herhangi bir ağız kanca hareketleri olmadan hareketsiz larvalar atılmalıdır.
İkincisi, diğer davranışlar gibi, larva yol uzunluğu bu testte yaparken dikkate ve kontrol edilmesi gereken çevresel faktörlerden etkilenebilir. yol uzunlukta etkilediği bilinen çevresel faktörlerin yetiştirme sıcaklık, nem, besin kalitesi, yetiştirme yoğunluğu, maya macun kalınlığı, gün arasında gelişigüzel farklılıkları ve larva kullanımını içerir. Test sırasında larva gelişimi ve yaşı da yol uzunlukta 11 etkiler. Şekil l'de gösterildiği gibi. 4, düşük kaliteli gıda larvaları yükselterek yol uzunlukta azaltır. Bu protokol veya besin içeriği eşdeğer başka bir ölü maya tarifi tarif sinek yemek tarifleri birinin kullanılması tavsiye edilir. Ayrıca Sugge olduğuHer zaman 100 larva ile gıda plakaları ekim ve gıda eşit onları aralık yüksek veya düşük yoğunluklu yetiştirme ortamları önlemek için sted. Yüksek yoğunluklarda larva yetiştirme gıda kullanılabilirliğini sınırlar ve test 12. sırasında larva arasındaki gelişmişlik farklılıkları neden olabilir larva gelişimi, geciktirir. Drosophila larvaları gıda yıkmak ve başarısını 13 kazarak artırmak için sosyal toplayıcı gruplar oluşturabilir beri Düşük yoğunluklu yetiştirme koşulları da gelişimini etkileyebilir. larva boyutunu etkiler mutasyonlar ile larvalar tahlil edildiğinde, larva vücut uzunluğu veya çevresinin bir fonksiyonu olarak yol uzunlukta hesaplayarak bu etkileri hesaba gerekebilir. Her durumda onlar test edilirken sahne dolaşıp içine geçmediğinizi larvaların sağlamak önemlidir. Larvalar test sırasında Petri kabı kapağı üzerine yukarı taşırsanız, onlar göçebe ve deney atılır ve genç la tekrarlanması gerekir olasıdırrvae.
bu larvaların tarama hızını etkiler beri kayda değer bir diğer faktör yol uzunluğu testlerinde kullanılan maya hamur tutarlılık. Larvalar daha sulu maya hamur üzerinde test larva daha kısa bir yol boylarını olacak kalın maya hamur test. Ayrıca, deney gün arasında stokastik farklılıklar da mutlak yol uzunluğu puanları etkileyebilir. Suşlar / genotip gün içinde test edilmiş ve gün arasında onları engellemek için hangi sırası rastgele zorunludur. Son olarak, bakım yolu uzunluğu testi öncesinde larva stres değil alınmalıdır. yaygın kullanım ile tanıtıldı iki streslerinin açlık ve boğulma vardır. Şekil l'de gösterildiği gibi. 3, testten önce larva açlıktan yolu uzunlukta azaltır, ve açlık çevresel manipülasyon olarak dahil edilebilir, ancak, istenmeyen bir olay kaçınılmalıdır. Vurgulayan larvalar böylece zaman sp miktarını sınırlayan, yavaşça ama hızlı bir şekilde çalışarak kaçınılmalıdırent, toplama, temizlik ve larvaları transfer. Larvalar sergi negatif phototaxis 14, yoğun ışık da bir stresör olarak hareket edebilir ve tahlil bile, yaygın ışık altında yapılmalıdır. yol uzunlukta değiştirebilir birden çevresel faktörler rağmen, mutlak yol uzunluğu puanları çevresel koşullara duyarlı olmasına rağmen tüm bireylerin eşit muamele edildiğinde, suşları arasındaki nispi farklar korunur dikkat etmek önemlidir.
Doğruluk, verimlilik ve nicelleştirmesinde sağlamlık davranışını aracılık genetik ve çevresel faktörlerin anlamaya yönelik çalışmaların merkezinde yer alıyor. Drosophila larva yol uzunluğu deneyi düşük maliyetli, yüksek verimlilik ve kolay uygulanabilir olmasının yanı sıra, bu tüm avantajlarını sunmaktadır. Bu nedenle, bu deney yaygın davranışsal tepkileri ile bağlantılı moleküler ve genetik yolları belirlemek için genetik ekranları için de kullanılabilir. Ayrıca, tahlil edilebilir birtoksisite testi veya farmakolojik ekranlara pplied veya sınıfta öğretim için uyarlanmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz fly culture bottles | Fisher Scientific | AS355 | |
| Fly vial plugs | Droso-Plugs | 59-201 | |
| 35 x 10 mm Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher | 875712 | |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-168 | |
| Dissecting probes | Almedic | 2325-58-5300 | |
| Yeast | Lab Scientific | FLY-8040-20F |
References
- Behavioral Genetics of the Fly (Drosophila melanogaster). Dubnau, J. , Cambridge University Press. New York. 173 (2014).
- Sokolowski, M. B. Foraging strategies of Drosophila melanogaster: a chromosomal analysis. Behav Genet. 10, 291-302 (1980).
- de Belle, J. S., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Genetic localization of foraging (for): A major gene for larval behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 123, 157-164 (1989).
- Osborne, K. A., Robichon, A., Burgess, E., Butland, S., Shaw, R. A., Coulthard, A., Pereira, H. S., Greenspan, R. J., Sokolowski, M. B. Natural behavior polymorphism due to a cGMP-dependent protein kinase of Drosophila. Science. 277, 834-836 (1997).
- Kalderon, D., Rubin, G. cGMP-dependent protein kinase genes in Drosophila. J Biol Chem. 264 (18), 10739-10748 (1989).
- Reaume, C. J., Sokolowski, M. B. cGMP-dependent protein kinase as a modifier of behavior. Handb Exp Pharmacol. 191, 423-443 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pereira, H. S., MacDonald, D. E., Hilliker, A. J., Sokolowski, M. B. Chaser (Csr), a new gene affecting larval foraging behavior in Drosophila melanogaster. Genetics. 140, 263-270 (1995).
- Shaver, S. A., Riedl, C. A. L., Parkes, T. L., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Isolation of larval behavioral mutants in Drosophila melanogaster. J Neurogenet. 14, 193-205 (2000).
- Graf, S. A., Sokolowski, M. B. The rover/sitter Drosophila foraging polymorphism as a function of larval development, food patch quality and starvation. J Insect Behav. 2, 301-313 (1989).
- Gonzalez-Candelas, F., Mensua, J. L., Moya, A. Larval competition in Drosophila melanogaster: effects on development time. Genetics. 82, 33-44 (1990).
- Durisko, Z., Kemp, R., Mubasher, R., Dukas, R. Dynamics of social behavior in fruit fly larvae. PLoS One. 9 (4), e95495 (2014).
- Sawin, E. P., Harris, L. R., Campos, A. R., Sokolowski, M. B. Sensorimotor transformation from light reception to phototactic behavior in Drosophila larvae (Diptera: Drosophilidae). J Insect Behav. 7, 553-567 (1994).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B. Heredity of rover/sitter: alternative foraging strategies of Drosophila melanogaster. Heredity. 59, 73-83 (1987).
- de Belle, J. S., Sokolowski, M. B., Hilliker, A. J. Genetic analysis of the foraging microregion of Drosophila melanogaster. Genome. 36, 94-101 (1993).
- Sokolowski, M. B., Pereira, H. S., Hughes, K. Evolution of foraging behavior in Drosophila by density dependent selection. PNAS. 94, 7373-7377 (1997).
