Abstract
果蝇幼虫路径长度的表型是用来研究行为变化的遗传和环境的贡献建立措施。幼虫路径长度法的开发是为了衡量后来被链接到觅食基因觅食行为的个体差异。幼虫路径长度是易攻入性状便于大样本的收集，以最低的成本，为遗传筛选。在这里，我们提供当前协议的用于第一使用Sokolowski幼虫路径长度测定的详细描述。该协议详细介绍了如何处理重复性试验动物，进行行为测定和分析数据。的测定法可如何用于测量响应于环境变化行为可塑性，通过操纵进给环境之前，执行测定的例子中，还提供。最后，合适的测试设计以及环境因素，可以修改幼虫路径长度如食品质量，发育年龄和一天的效果进行了讨论。
Introduction
由于白基因在托马斯亨特摩根的实验室在1910年发现，果蝇， 黑腹果蝇 （ 果蝇 ），已被用作各种生物过程的分子和生理基础的研究的模型。 D的普及果蝇很大程度上从遗传工具的相当数量和品种茎。 果蝇的体积小，相对易于处理和短代时间使其为遗传学研究的理想模型。同样重要的是果蝇表现出许多由更复杂的生物，包括哺乳动物表达的表型的能力。这包括复杂的表型，如行为站在生物体和其环境之间的接口。由于对果蝇这样，行为学研究作出了重大贡献我们的基因和环境如何调解行为的理解1。
其中D的第一研究果蝇幼虫的行为通过测量幼虫2路长度而喂养调查幼虫取食策略个体差异。路径长度被定义为通过在酵母单个幼虫行进的总距离，五分钟内。在多伦多这两个实验室株和苍蝇从人口自然在他们的觅食行为的变化，并有遗传因素在路径长度的个体差异。两个幼虫取食摇身一变，从定量路径长度分布描述他们被称为月球车和保姆。流动站表现出更长的路径长度而穿过较大的区域，而不是保姆食品基物上。使用此路径长度分析，百丽德等 3所映射的觅食（对于）基因基本以分散的区域，这些个体行为差异对chromosome- 2（24A3-24C5）。 D.在米elanogaster 用于基因稍后克隆4和显露是一个的cGMP依赖性蛋白激酶5，在果蝇生理和行为和其他生物6的调节剂。
在这里，我们列出了最初在Sokolowski 2开发的幼虫路径长度分析当前协议。虽然该试验的某些方面已经改变多年来，设计背后的概念还没有。我们还提供数据来说明分析的潜力，以评估在果蝇幼虫觅食行为的个体差异的遗传和环境的贡献。幼虫路径长度测定法是简单，有效，但健壮。单人可以测试高达500幼虫容易在四小时的结果可以具有高水平的再现性来获得。最初开发本地化为 ，它可以在遗传筛选，数量性状基因座的映射被使用，并且在研究基因逐环境（GXE）的相互作用。此外，它的简单性和可重复性使其成为本科教学的重要资源。
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Protocol
1.准备葡萄板和控股瓶的幼虫采集
- 为了使持有瓶，切孔的6盎司飞培养瓶，大到足以适合供气苍蝇小瓶插头（ 图1D）的一面。
- 使葡萄板，通过煮沸琼脂，葡萄汁制备250毫升葡萄汁培养基（1.8％琼脂，45％葡萄汁，2.5％乙酸，2.5％的乙醇）和大部分的水，降温至70℃（搅拌，同时冷却），然后添加乙酸和乙醇，并把最多体积水。
- 使用注射器（没有针）来填充35×10毫米的培养皿的盖子，直至葡萄汁介质的表面，使盖（ 图1A）的唇部上方的圆顶。
- 在潮湿和气密容器商店葡萄板在4ºC直到使用（最多2周）。
2.食品板的制备
- 标准的准备飞食品的配方。
注意：给T在路径长度EST饲养食品品质的影响，我们使用低营养飞食品：10％蔗糖，1.3％琼脂，0.8％酒石酸钠钾，0.1％磷酸二氢钾，0.05％氯化钠，0.05％氯化钙，0.05％氯化镁， 0.05％硫酸铁，5％酵母和0.5％的丙酸水溶液;和高营养飞食品：1.5％蔗糖，1.4％琼脂，3％葡萄糖，1.5％玉米粉，1％小麦胚芽，1％大豆粉，3％糖蜜，3.5％酵母，0.5％的丙酸，0.2％Tegosept和1 ％乙醇在水中。对于这两种食品中添加丙酸，Tegosept和乙醇前高压灭菌的解决方案，并冷却至50℃。 - 倒加入40ml飞食品为100×15毫米的培养皿。
- 在潮湿和密闭容器储存食品板块在4ºC直到使用（最多2周）。
3.准备测试板
- 制备58×25厘米，厚6毫米的黑色有机玻璃板10，1mm深的圆形的孔，直径10厘米和布置在2×5天ESIGN（图1C）中测试幼虫上。
注：最多30幼虫可以一次如果3个或更多的上述树脂玻璃板的可进行测试。可替代地，幼虫可在培养皿中，在10厘米直径的测试。该选项是更费力的，并允许幼虫较低的数字进行测试。 - 得到黑色39×8厘米，厚6毫米的有机玻璃吊具上的有机玻璃试验板扩频酵母膏。
- 制备100×15毫米的培养皿盖子用于通过预先分离塔底罐盖记录幼虫路长度。
4.设置家长人群
- 保持饲养条件在整个实验常数（ 例如 ，25ºC，60％湿度和12:12光：对标飞食品暗周期）。
- 提高相同的饲养条件的家长群体。
- 收集100 - 150名女性和50 - 75男性，年龄为他们5±1天为最佳的生育能力。
- 允许˚Females和男性在一个6盎司苍蝇培养瓶与标准的飞食品交配过夜。
- 转飞入控股瓶和安全葡萄板（在葡萄板少量鲜酵母膏将促进产蛋;图1B）在用胶带（ 图1E）的顶部。
- 离开瓶底部倒立（图1F），与葡萄板以允许成年人的葡萄板产卵。
- 弃去前葡萄板后24小时，并放置一个新的葡萄板在保持瓶子。这将是从幼虫收集第二天葡萄板。
注：葡萄板块将有正在组建，成立了板，使他们能够早日第二天被清除后，幼虫22小时的清除（ 例如 ，在12日下午成立了板，并在10清楚次日上午）。明智的做法是放弃的第一个葡萄板，以避免女性可能已经隐瞒和Tha任何鸡蛋ŧ可能在发展中前进。
5.葡萄板收集L1（一龄）幼虫
- 在一个60×15毫米的培养皿取下瓶子，他们建立了22个小时后发生葡萄板。
- 将与控股瓶鲜酵母膏新的葡萄板。
- 清除并丢弃使用解剖探头种子葡萄板上的所有幼虫。
- 清除孵育葡萄板在标准条件下4小时。
- 4小时后，挑每株100的L1幼虫从葡萄板和放置在食品板。
- 广场上轻轻食物的幼虫（不穿孔食品和埋葬的幼虫），并通过分发整个食品板块幼虫避免拥挤。
- 孵育食品板块，直到实验动物是流浪开始前约10小时。
注： - 孵化后96小时在25ºC，通常徘徊10小时之前，对应于72。该EXAC孵育时间t用量应通过收集一组初始的幼虫对每个菌株和记录的时间数，直到徘徊的开始开始实验之前确定（游荡幼虫将食品搬出到食品的侧面和盖板）。
注意：如果需要的话，同样的父母可用于收集3幼虫 - 通过重复步骤4.7至5.5的测试4天。改变在其中菌株建立和测试跨天，以避免在路径长度的测试顺序效应的顺序。测试相同的“控制权”株/株测试的每一天，以控制天的影响。 - 如果许多菌株被测试，错开幼虫的设置和收集时间，以允许各菌株在适当的时间点测试以后。
6.幼虫路径长度测试
- 溶于水干活性面包酵母以1：2的比例（重量比体积）。成品酵母膏应该比巴薄ncake面糊，在起重勺子出糊剂时的一种方式，它滴落和叶迅速融化的糊的表面上带的后面。
注意：酵母膏的稠度是重要的，应是在整个实验常数。确切的酵母：水的比例可能会根据不同的品牌和批次的酵母进行调整。 - 轻轻一挑第一株幼虫从使用画笔食品板块进行测试。
- 收集幼虫在培养皿中，用水轻轻洗涤以除去所有的食品。
- 快速洗幼虫用1 - 2毫升水，轻轻地轻拍幼虫干燥用实验室擦拭避免将在测试板上的幼虫时传输任何水。为了避免精神紧张，保持湿润的幼虫，但水不沉。
- 排列并排三个测试板侧，并设置一个5分钟计时器为每个测试板。
- 应用酵母膏到测试板的顶部，并使用吊具，扩散薄捻在每个测试板，使得所有的孔中有酵母的偶数层的酵母膏的呃。
- 轻轻将一个幼虫在每个的中心孔，将第一幼虫上每个板之后开始的5分钟的定时器。注：三个板可在同一时间内完成，得到30 /应变/测试一天中的样本大小，最多共500幼虫。
- 放置在每个顶部培养皿盖好。
- 当计时器用完，无需从板取出幼虫，开始使用永久性标记追查酵母留下的路径长度。在相同的顺序幼虫迹路长度被放置在测试板上。
- 执行以相同的速度跟踪作为幼虫放置在平板上。在以后的数据分析的一致性，用于所有路径长度相同的标记。建议永久性标记。
- 重复步骤6.2至6.8.1对于每个要测试的菌株。立即进行测试，以避免对PA饥饿效应前拾取从食物中每一株TH-长度。
7.食品剥夺
- 如果幼虫是在试验前禁食，如在步骤6.2至6.3中所述收集幼虫，但食物剥夺时所需量的早期（ 例如 ，如果幼虫要禁食4小时，收集幼虫4小时前测试时间）。
- 划分洗涤幼虫分为两组，并放置食物剥夺组中的60×15毫米的培养皿用5毫升1％琼脂和对照组在培养皿用5毫升标准食物。
- 将重量上的培养皿倒盖（否则幼虫都能够为食搜索时爬出来）的顶部。
- 孵育先前建立的食物匮乏时期和步骤6.2到6.9描述的测试继续进行。
- 如果许多菌株进行测试，错开剥夺食物开始时间，以允许在适当的时间点每种菌株的检测。
8.数据分析
注意：本节描述了使用ImageJ 7或斐济8对于路径长度的处理的数据分析的方法，尽管其他软件可以被使用。
- 使用一个光表来从培养皿盖所有跟踪路长度转移到白纸（盖可以用乙醇洗涤，并为进一步路径长度记录重复使用）。
- 跟踪在纸张的片材之一50mm的直参考线。
- 扫描路径长度在300 dpi的分辨率，并保存为位图或TIFF图像文件。
- 打开图像文件，选择“进程”选项卡>“二进制”>“使二进制”。那么“进程”选项卡下选择“二进制”>“缩略”。这产生的无论迹线的厚度的一个像素宽度线。
- 确保每个路径的长度显示为无交叉连续一行。
- 单独使用“直立任何交集NE工具棒“（跟踪）工具”和着色线白色（路径的连续性可以与被检查“时，整个路径应当强调黄色（ 图2）。
- 选择“分析”选项卡>设置测量，然后选择“雷池”和“显示标签”。
- 选择“分析”选项卡>“设置规模”，选择“清除水垢”。
- 在图像，只能选择参考线，选择“分析”选项卡>“分析粒子”，并选择“显示：大纲”，“显示结果”和“清除成绩表”。注意：输出将显示对应于50毫米标线的像素数。
- 选择“分析”标签>“设置规模”，并在“以像素为单位的距离”中的像素数和在“已知距离”对应的距离（50毫米）填充。
- 最后，选择都是一个基因型的路径长度图纸TA的时候，选择“分析”选项卡>“分析粒子”，并选择“显示：大纲”，“显示结果”和“清除成绩表”。
- 通过选择区域并填充它白色移除所选区域内的任何书面标签或明显外来标记（它们将被识别为路径长度）。
- 目测“纲要”的输出文件，以确保周边被正确确定。输出将显示一个路径长度在毫米为在选择的每个路径长度图。这很容易被导出到电子表格，并与任何统计软件进行分析。
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Representative Results
在流动站和保姆为菌株和食物剥夺对路径长度的影响的路径长度的差异在图中示出。 3.数据收集测试连续三天呈现显著应变效应（F（1,421）= 351.89，P <2.20×10 -16;图3A），与流浪旅行比保姆更远。除了 应变的效果，也有一个显著食物治疗效果（F（1，421）= 461.62，P <2.20×10 -16;图3A），与幼虫被食物剥夺测试前4小时有显著较低路长度比喂养幼虫。此外，方差分析显示一个显著应变由治疗相互作用（F（1423）= 9.78，P = 2×10 -3），意思是流动站和保姆响应食物剥夺到不同的程度。
“FO：保持-together.within页=”1“>尽管上面还数据显示试验日的一个显著效应（F（2420）= 7.22，P = 8×10 -4; 图3B - 3C。）有是由天相互作用无显著株（F（2846）= 2.32，p = 0.10），这意味着每天影响流动站和保姆类似。然而有由治疗相互作用显著天（F（2420）= 8.07，p = 4.00× 10 -4），这表明治疗的跨越天不等的效果。食物的饲养质量也对路长度（ 图一显著效果4）。总体路长度分别为较长时两种菌株的幼虫饲养我们的高营养的食物相比，低营养的食物（F（1，352）= 126.38，p <2.20×10 -16）。罗孚发车的差异但是仍然保持，尽管苗种培育过程中的食品质量（F（1，352） = 94.89，p <2.20×10 -16 ）。其中有显著日效应（F（2，351）= 3.77，P = 0.024）被列入统计模型。此外，没有由天相互作用显著株（F（1704）= 7.15，P = 9.00×10 -4），以及由天相互作用（F（1704）= 5.06，第一个显著食品= 7.60×10 - 3）。最后，需要注意的是，相对月球车发车的差异跨天，食品质量和食品匮乏的效果显著是很重要的，但是这绝对路径长度测量天，治疗之间的差异。这些结果不仅强调幼虫路径长度测定在一天影响到分析的鲁棒性，同时也控制了饲养条件下，在试验的每天运行的每个应变/治疗利益的重要性，和保。
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图1.控股瓶和测试板的准备。（A）为产蛋葡萄板应该在篮筐之上进行填充以形成媒体光滑的圆顶。鲜酵母膏（B）的量小的加成促进产蛋。 （C）有机玻璃测试板的井和吊具边。 （D）飞培养瓶与供气削减孔。父母的人口转移到培养瓶后，葡萄板应装在有遮蔽胶带（E）的开瓶应定位在底部（F）葡萄板。 请点击此处查看该图的放大版本。
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图2.图像 ，其中幼虫越过自己走路径的长度的盘旋的路径长度轨迹。分析应在交叉路口手动分开以产生一个单一的连续线。 （a）表示三个扫描路长度，例如，在顶部路径长度的交叉点红色箭头指向。 （B）表示相同的路径长度中的ImageJ编辑以交点分离。 （C）表示的ImageJ周长的交叉路径长度的输出，与路径1的周边的错误评估由于交点。 （D）显示ImageJ的周长在切割的交叉点和路径长度为1的周边的正确评估编辑文件的输出请点击此处查看该图的放大版本。
图3.美联储和禁食罗孚和保姆仔路长度幼虫平均路径长度流动站和保姆（毫米±SEM），证明：（A）汇集路长度美联储和4小时禁食幼虫过三连冠测试的日子里，105 <N <120; （ 二 ）美联储幼虫路长度由38 <N <40，每天天;和（C）4小时禁食一天，38的<n <40幼虫路长度，每一天。研发周期：所有的幼虫和家长在25ºC，60％湿度和12:12大号养着低营养的食物。试验组及/或治疗方法之间的差异通过方差分析（ANOVA）和Tukey检验用于事后成对多重比较评估。为（A）的一天中的某个块因子加入到模型中。字母代表分组统计;用相同的字母表示不州市gnificantly差异（P <0.05）。美联储和FD代表美联储和4小时禁食条件。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.食品质量及苗种路径的长度。意味着火星车和保姆，表明生长在高，低营养的食物的幼虫路长度幼虫路径长度（毫米±SEM）。数据集中测试过连续三天与加入到统计模型一天中的阻塞因素，75 <N <90.所有的幼虫和家长在25ºC，60％湿度和12:12分别饲养在低或高营养的食物L：研发周期。试验组及/或治疗方法之间的差异通过方差分析（ANOVA）和Tukey检验用于事后成对含多处评估Ë比较。字母代表分组统计;用相同字母表示没有显著差异（p <0.05）。高，低立场高营养，低营养的食物质量。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里列出的路径长度的测定提供了果蝇幼虫觅食行为一个强大的和简单的措施。协议遵循Sokolowski 2中描述的一般方法，但一直以来在问候效率和实验对照得到改善。据我们所知，这方法是测量幼虫路径长度的唯一可用的方法。原始版本的路径长度协议2，3，15上的培养皿16测试幼虫酵母膏的薄层用刷子施加，后来的玻璃扩散杆。更近的所述协议10的版本中，17过渡到使用此处描述的有机玻璃板上。使用培养皿和玻璃吊具提出了一个非常薄的酵母层，产生了很长的路长度，加剧流动站和保姆表型之间的差异的优势。使用有机玻璃板导致整体较短的路径的长度，但ロVER-保姆差异，维护和平等地重现性。虽然使用有机玻璃板是费力的要少得多，用培养皿方法得到的长的路径长度允许流动站和保姆表型的更好的分离，促进流动站保姆差的遗传图谱的基因 3。采用有机玻璃试验板代替培养皿中，并且路径长度痕迹计算分析的是首先被开发到由于该方法的协议所做的重大变化，并大大提高了幼虫的数目，可以由一个人进行测试以及数据的速度分析。我们还改进了几个实验和环境因素我们的知识，可以影响测定，其中一些如下所述的结果。
首先，此法衡量一个觅食基板（酵母水贴）对路径长度行为的个体差异。显著ð在该测定中ifferences可能导致从一般幼虫运动缺陷。这可以通过同时测定幼虫运动行为上非营养琼脂平板加以控制。如果应变差异被维持在琼脂平板上，它是安全的假设，酵母水基片上发现的差异不会觅食行为具体。先前已表明，虽然对于等位基因流动站显著赋予酵母较长路径长度，流动站和保姆不在没有食物的不同，因为它们表现出在琼脂9同样长的路径长度。此外，由于幼虫通常会增加在没有食物，发现琼脂平板上很少或没有运动的运动他们是在运动的缺陷可能指示。由于食品独立运动缺陷调查觅食行为时，作为一个混杂变量行动，琼脂控制可以减少遗传筛选10误报。同样重要的是要注意，如果拉尔VAE测试前被损坏，他们可能不会动弹。不动，死亡或受损的幼虫可以从健康的幼虫，通过观察口钩运动区分开来。没有任何的嘴钩动作不动的幼虫应该被丢弃。
第二，与其他行为，幼虫路径长度可以由需要考虑和控制进行这种测定时对环境因素的影响。已知影响路径长度环境因素包括饲养温度，湿度，食品质量，饲养密度，酵母膏的厚度，天之间偶然的差异，和幼虫的处理。幼虫发育和年龄在测试的时候还影响路径长度为11。如示于图4，在低质量的提高食物的幼虫减少路径长度。推荐使用这个协议或其他死酵母食谱，在它的营养成分相当于描述的飞食品的食谱之一。它也是suggeSTED通过始终播种食品板100幼虫和对食品均匀间距出来，以避免高密度或低密度的饲养环境。在高密度饲养幼虫限制粮食供应并延迟幼虫发育，这可能导致在测试12时幼虫发育之间的差异。低密度饲养条件也能影响发展，因为果蝇幼虫可能会形成社会群体觅食分解食物，并增加觅食成功13。当与影响幼虫大小突变幼虫被测定，可能有必要考虑到这些影响通过计算路径长度作为幼虫体长度或周长的函数。在所有的情况下，重要的是确保幼虫尚未转换成被测试时，他们徘徊的阶段。如果幼虫在测试过程中向上移动到培养皿盖，它很可能是它们徘徊和实验应丢弃并与年轻拉重复rvae。
另一个值得一提的因素是路径长度的测试中使用的酵母泥的一致性，因为它影响幼虫爬行速度。幼虫在厚厚的酵母泥测试将有更短的路径长度比在多种水性酵母泥测试幼虫。此外，测试天之间的随机差异也影响绝对路径长度的分数。当务之急是随机在该株/基因型天进行测试，并以天之间阻止他们的顺序。最后，应注意不要强调之前的路径长度测试幼虫。那些通过处理常用推出两款压力是饥饿和溺水。如示于图3，在试验前饥饿幼虫减少路径长度，虽然饥饿可以引入作为环境操纵，其无意发生应该避免。强调幼虫应轻轻但迅速工作，从而限制时间SP的量可避免耳鼻喉科收集，清洁和转移幼虫。因为幼虫表现出负趋光14，强烈的光也可以作为一个压力源，并在测定应在连，漫射照明来完成。尽管可以改变路径长度的多个环境因素，值得注意的是，虽然绝对路径长度的分数很容易受到环境条件，菌株之间的相对差异，当所有的个人都一视同仁保持是重要的。
精度，效率和量化鲁棒性在旨在了解调解行为遗传和环境因素研究的心脏。 果蝇幼虫路径长度的测定提供所有此外，这些优势是低成本，高吞吐量和易于操作。正因为如此，该测定法可广泛用于遗传筛选以识别与行为反应相关的分子和遗传途径。此外，该测定可以是一个pplied毒性测试或药物的屏幕，或适合于课堂教学。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 oz fly culture bottles | Fisher Scientific | AS355 | |
| Fly vial plugs | Droso-Plugs | 59-201 | |
| 35 x 10 mm Petri dishes | Falcon | 351008 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher | 875712 | |
| 60 x 15 mm Petri dishes | VWR | 25384-168 | |
| Dissecting probes | Almedic | 2325-58-5300 | |
| Yeast | Lab Scientific | FLY-8040-20F |
References
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