Abstract
cellules endothéliales tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins et jouent un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire. le dysfonctionnement des cellules endothéliales est impliquée dans le développement et la progression de nombreuses maladies cardiovasculaires, y compris une maladie cardiaque ischémique. Pour examiner la fonction et la caractérisation des cellules endothéliales coronaires, l'isolement des cellules est la première étape et elle nécessite une grande pureté et en quantité pour effectuer des expériences ultérieures. Ce protocole décrit une méthode efficace pour isoler les cellules endothéliales coronaires de souris adulte. Le cœur de la souris est disséquée et hachée en petits morceaux. Après la digestion du coeur en utilisant la dispase II et de la collagénase, les cellules sont lavées et incubées avec des billes magnétiques qui sont conjuguées avec un anticorps anti-CD31. Les billes avec les cellules endothéliales sont lavées plusieurs fois et sont prêts à utiliser dans diverses applications, y compris l'imagerie et de biologie moléculaire experiments. L' isolement efficace donne environ 10 4 cellules par un seul cœur avec plus de 90% de pureté.
Introduction
Des modèles de souris de diverses maladies cardio-vasculaires et des troubles métaboliques portent des changements physiologiques et moléculaires qui sont similaires à celles observées chez les patients. En outre, la modification génétique de la souris est un outil puissant qui nous permet d'étudier le rôle pathogène de gènes spécifiques dans le développement et la progression des maladies. De nos jours, le gène knock-in type de cellule spécifique ou souris -out sont facilement générés dans de nombreux laboratoires et la mesure de l'ARNm et les niveaux de protéines dans des types cellulaires spécifiques est la première étape pour déterminer si les souris ont été vraiment génétiquement modifiées.
Endothélium est une mince couche unique de cellules endothéliales (EC) qui lignées la paroi vasculaire intérieure. Les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la régulation de la tension vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire 1,2. La dysfonction endothéliale est une caractéristique de nombreuses conditions pathologiques et des changements dans la fonction endothéliale peut conduire à diverses voituremaladies cardio- 3,4. Il est donc important d'étudier la fonction des cellules endothéliales, dans des conditions physiologiques et physiopathologiques.
Il y a plusieurs façons d'isoler CEs 5-8 et la méthode d'isolement doit être optimisée en fonction de quels tissus et les espèces seront utilisées. En effet , CEs provenant de différents tissus présentent un degré élevé d'hétérogénéité par rapport à leurs marqueurs de surface et l' expression des protéines 9. l'isolement réussie des cellules endothéliales peut souvent être difficile et nécessite un certain degré de formation et de pratique. Une fois atteint, le procédé d'isolement proposé dans ce protocole se révèle être stable et efficace.
L'objectif global de cette méthode est d'obtenir la souris CEs coronaire (MCECs) de haute qualité et la quantité. Même si la quantité de cellules recueillies à partir d'un coeur est inférieure à cellules collectées à partir d'autres tissus en utilisant d'autres techniques, cette technique fournit encore pariqualité ter. La pureté des cellules endothéliales dans la population résultante est supérieure à 90%. Ainsi, cette technique serait idéal pour les applications qui reposent sur les cellules endothéliales purement isolées telles que l'imagerie cellulaire.
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Protocol
La recherche sur des souris a été approuvée par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Université de l'Arizona et a été réalisée selon l'Institut national de la santé (NIH) des lignes directrices.
NOTE: Les articles 1, 2 et 3 doivent être effectuées la veille de l'expérience que l'installation.
1. Solutions Préparation
- un tampon de CD31 (50 ml)
- Ajouter 50 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS) à un tube de 50 ml. Peser 0,05 g de sérum-albumine bovine (BSA) et 0,037 g d'acide éthylène diamine tétraacétique (EDTA) et les ajouter au tube de 50 ml et mettre le tube en rotation pendant environ 1 h jusqu'à dissolution de la poudre. Ajuster le pH à 7,4, filtrer à travers un filtre de 0,2 um dans un nouveau tube de 50 ml, et stocker à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) avec du HEPES (500 ml)
- Ajouter 1.1915 g de HEPES faire 10 HEPES mM dans une solution HBSS et bien mélanger. Mesurer le pH et ajuster à 7,4. Filtrer et conserver à 4˚C.
- 1x solution de Kreb (1 L)
- Ajouter 100 ml de solution de 10 × Kreb [Table 1] pour doubler l' eau distillée dans un ballon de 1 litre. Peser 2,1 g de bicarbonate de sodium et 2 g de D-glucose et ajouter au flacon. Mélanger et ajuster le volume total à 1 L.
- Solution à bulles avec 95% O 2/5% CO 2 gazeux pendant 30 min et une solution de filtre à l' intérieur du capot. Conserver à 4 ° C et garder sur la glace au cours de l'expérience.
2. Préparation des billes magnétiques
- Ajouter 1 ml de tampon de CD31 dans chaque tube de 1,5 ml (un tube par échantillon). Mélanger les moutons anti-rat perles de IgG et ajouter la quantité appropriée à chaque échantillon [Tableau 1]. Agiter les tubes vigoureusement 30 fois et les placer dans la plaque magnétique pendant 1 min d'agitation. Ouvrez les tubes tandis que sur la plaque et vider les solutions dans un seau.
- Ajouter 1 ml de tampon de CD31 dans chaque tube. Ajouter 2 ul Rat anti-souris CD31 anti-corps à chaque tube et tourner les tubes O / N à 4 ° C.
3. autoclavage
- Autoclave tous les outils de chirurgie et des embouts de pipette. Couper les extrémités des embouts de pipette de telle sorte que il y a des conseils avec 4 diamètres différents, de la plus large à la plus étroite. diamètres approximatifs pour les conseils sont de 3 mm, 2,5 mm, 2 mm et 1,5 mm respectivement. Couper les pointes et l'autoclave la veille avec 30 min de la stérilisation à une température de 121 ° C.
NOTE: Les articles 4-11 doivent être effectuées le jour de l'expérience.
4. Solutions Préparation
- Préparer un tampon de lavage contenant 2% Fer-Fortified sérum de veau (IFCS) dans M199. Pour l'imagerie, préparer 30 ml / souris.
- Préparer la solution enzymatique (10 ml / échantillon). Peser 0,6 unité / ml de dispase et 1 mg / ml de collagénase de type II dans un tube de 50 ml. Ajouter M199 et faire tourner le tube à 4 ° C pendant 15 min. Filtrer à travers filtre de 0,2 um dans un nouveau tube de 50 ml inside le capot et garder à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Préparer HBSS / HEPES avec Héparine. Ajouter 10 ml de HBSS avec 10 mM de HEPES dans 15 ml tube. Ajouter 100 pi de Heparin au tube et maintenir à 4 ° C jusqu'à utilisation.
5. laver les perles
- Sortez les tubes avec des perles du rotateur à 4 ºC et porter à la hotte. Placer les tubes dans la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Dump de la solution et ajouter un tampon de CD31 1 ml dans chaque tube.
- Prenez les tubes de la plaque magnétique et agiter vigoureusement 30 fois. Mettre les tubes de retour dans la plaque magnétique et répéter pour un total de 3 lavages. Après avoir terminé, mettre les tubes de retour à 4c et de garder la rotation jusqu'à utilisation.
6. Dissection
- Injecter les souris par voie intrapéritonéale avec 0,1 ml d'héparine pour empêcher la coagulation du sang. Attendre 10 minutes, puis anesthésier les souris en utilisant une injection intrapéritonéale de 0,01 ml de pentobarbital. Vérifiez si la souris se sentla douleur en pinçant le pied.
- Placez la souris sur un panneau de polystyrène avec la tête et tenir les bras avec des épingles. Utilisez des pinces et difficiles-coupe-ciseaux pour couper la peau à la région thoracique supérieure jusqu'à la gorge.
- Faire une coupe dans le centre de la cage thoracique juste au-dessus du diaphragme. Couper l'os sur le côté et vers le haut vers la gorge pour former un triangle d'exposer le cœur et les poumons. Couper l'aorte juste au-dessus du diaphragme.
- Tenez le thymus avec une pince sans tirer et utiliser des ciseaux pour couper tout tissu conjonctif soigneusement pour éliminer les poumons et le cœur ensemble. Placer les tissus dans un bécher avec 1 × Kreb de, secouer avec une pince et transfert à boîte de 6 cm avec 1 x Kreb de.
- Retirer les lobes du poumon à l'aide de ciseaux et des pinces. Insérer un cathéter stérile 20 G dans l'aorte. Rincer le sang dans le système circulatoire coronarien avec du HBSS / Héparine. Faire une petite incision dans le ventricule, secouer le cœur et transférer dans un tube de M199 de l'échantillon. Garder les tubes sur la glace.
- Transférer le coeur dans une boîte de 6 cm, rempli avec 10 ml de solution d'enzyme et de hacher en petits morceaux avec des ciseaux. Placez les plats dans l'incubateur à 37 ° C pendant 15 min. Agiter matériaux digérés par pipetage de haut en bas 30 fois à travers une pointe avec une extrémité coupée pour permettre au tissu de passer à travers plus facile.
- Remettez-le dans le 37 ºC incubateur pendant 15 min. Répétez l'agitation trois fois, chaque fois à l'aide des embouts de pipette de plus grandes ouvertures les plus étroites et 15 minutes d'incubation entre chaque.
- Après la dernière 15 minutes d'incubation, prélever des échantillons sur et dans la hotte. solution Pipet haut et en bas 30 fois en utilisant la pointe de la pipette avec l'ouverture la plus étroite et passer à travers un tamis de 40 um de la cellule dans un nouveau tube de 50 ml.
- Laver le plat avec un tampon de lavage de 10 ml en utilisant une pipette de 10 ml et transfert sur tamis cellulaire. Mettre les tubes de 50 ml dans la centrifugeuse et un essorage à 400 g pendant 10 min à température ambiante.
- Retirer le surnageant sans perturber le culot. Laver deux fois les cellules avec du tampon de lavage 5 ml.
- Obtenir un des préalablement préparé tubes de 1,5 ml avec des perles et des travaux sur un tube à la fois. Mettez un tube de 1,5 ml dans la plaque magnétique, secouez 3 fois et l'ouvrir.
- Après la dernière centrifugation, éliminer autant que possible surnageant sans perturber le culot. Dissocier les amas de cellules en tapotant vigoureusement.
- Ajouter un tampon de lavage de 1 ml dans le tube de 50 ml et mélanger les cellules avec une pipette de 1 ml. Vider la solution provenant du tube de 1,5 ml et ajouter 1 ml de suspension cellulaire dans le tube de 50 ml à billes. Feuilletez les tubes 30 fois puis tourner à 4 ° C pendant 30 min.
9. Préparation pour la culture cellulaire / Imagerie
- Préparer des chambres pour le placage des cellules. Ajouter une solution de gélatine (5% p / v, 300 ul) à la chambre pour enrober la surface et laisser incuber pendant 30 min à 37 ° C. Après incubation, remla gélatine ove et sécher la surface.
- Sortez les tubes avec billes / cellules après 30 min de rotation et de mettre dans la plaque magnétique à l'intérieur du capot. Agiter pendant 2 min, vidage et ajouter un tampon de lavage de 1 ml.
- Prenez des tubes de la plaque, agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Remettez-les dans la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Répétez 4 fois pour un total de 5 lavages, mais avec 1 min en secouant sur la plaque.
- Après le dernier lavage, prendre un tube et travailler sur chacun des tubes à la fois. Agiter 30 fois puis feuilletez 30 fois. Mettez-le sur la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Dump et ajouter 1 ml 20% des médias IFCS CE (préchauffé à 37 ° C).
- Agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Régler la pipette 500 pi et pipeter de haut en bas 10 fois. Transférer 500 ul à chaque chambre.
- Mettez à 37 ºC incubateur et laisser O / N. Le lendemain, laver les cellules avec 10% des médias FBS CE.
10. Préparation de blot (WB) Les échantillons occidentaux
- Take les tubes avec billes / cellules après 1 h de rotation. Mettez-les dans la plaque magnétique et agiter pendant 2 min. Dump surnageant et ajouter 1 ml de HBSS froid. Agiter vigoureusement 30 fois puis flick 30 fois. Répéter deux fois pour 3 lavages, mais avec 1 min en secouant sur la plaque.
- Après le dernier lavage, mettre des tubes sur la plaque magnétique et agiter pendant 1 min. Retirer le tampon en utilisant la pipette et lyser les cellules pour WB en utilisant une méthode décrite précédemment 11,12. lysat Collected contient habituellement environ 30 ug de protéine.
11. Imaging
- Laver les cellules 3 fois avec des milieux, avec un volume final de 250 pl pour une chambre. Ajouter 1,5 ul de Dil acLDL aux cellules. De ce point, maintenir les cellules dans l'obscurité.
- Incuber pendant 3,5 heures à 37 ° C. Ajouter 1,5 pi de Hoechst, bien mélanger et laisser incuber pendant 30 min à 37 cellules ˚C.Wash avec PBS et fixer avec 4% paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante.
- Laver deux fois avec du PBS et bloquer avec 5% de BSA-PBS pendant 30 min à la température ambiante. Laver deux fois avec 1% de BSA-PBS. Diluer BS-lectine-FITC en utilisant 1% de BSA-PBS à une concentration de 2 pg / ml et ajouter 300 pi à chaque chambre.
- Mettez la chambre sur l'agitateur orbital à température ambiante pendant 30 min. Laver avec du PBS 3 fois.
- Visualiser les cellules sous le microscope à fluorescence avec des temps d'exposition de 200 ms pour FITC (de coloration à la lectine, un marqueur CE excitation / émission à 488 nm / 519 nm), 30 ms pour le DAPI (Hoechst, une coloration, une excitation / émission nucléaire à 358 nm / 461 nm), et 300 msec pour TRITC (acLDL coloration, un marqueur CE, excitation / émission à 557 nm / 576 nm). Acquérir des images en utilisant un objectif 20X.
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Representative Results
L'isolement réussie des cellules endothéliales coronaires d'un coeur de la souris donne généralement autour de 10 4 cellules avec plus de 90% de pureté avec une forme de pavés. Pour une population pure de cellules endothéliales, des précautions doivent être prises tout au long du protocole afin d'assurer un environnement stérile exempt de toute contamination. L'apparition de cellules allongées ou des cellules agrandies dans la population indique une contamination avec d'autres types de cellules, des cellules et des fibroblastes musculaires lisses. Endothelial test de pureté cellulaire est réalisée par coloration des cellules avec un marqueur de surface de cellule endothéliale, BS-lectine et acLDL (figure 1). Le pourcentage de cellules positives, qui présentent à la fois des couleurs est supérieur à 90% en MCEC. Un tel résultat indique que la technique a été réalisée avec succès.
| PBS (10x) (1 L), | </ Td> | ||
| Matériel | MW | Montant (g) | |
| NaCl | 58.44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 L), | |||
| Matériel | MW | Conc (mM) | Montant (g) |
| NaCl | 58.44 | 118 | 69 |
| KCl | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 246,5 | 1.2 | 2,96 </ Td> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1,44 |
| CE médias (20%) (500 ml) | |||
| Matériel | Montant | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10 - 20 U / ml Héparine | 500 ul | ||
| D-Valine | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Pénicilline / Streptomycine | 5 ml | ||
| Quantité de billes à utiliser pour une souris | |||
| pour l'imagerie | 5 ul | ||
| Fou WB / PCR | 10 ul | ||
Tableau 1. Compositions chimiques des solutions utilisées.
Figure 1. Images représentatives des images MCECs. Fluorescence montrent que CEs coronaire de la souris (MCEC) isolé de cœur présentent une pureté élevée de la population CE. La pureté a été testé à la fois par acLDL absorption de la couleur rouge (A) et la lectine coloration dans la couleur verte (B) dans MCEC. Le noyau a été coloré par Hoechst en couleur bleue (C). Le pourcentage de cellules positives, qui présentent à la fois des couleurs est supérieur à 90% en MCEC. Bar est représentatif de 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir un plus grand version de ce chiffre.
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Discussion
Les cellules endothéliales les plus largement utilisés dans la recherche sont des cellules humaines de la veine ombilicale endothéliales (HUVEC) en raison de leur commodité et la facilité de culture. Cependant, beaucoup de recherches , il faut disposer d'un modèle physiologique atteint par l'isolement des cellules endothéliales provenant d' autres organes spécifiques 10. Les cellules endotheliales forment une population mineure de cellules dans le tissu cardiaque; leur isolement et leur culture peuvent se révéler très difficile.
Il y a trois étapes critiques dans ce protocole. La première consiste à rincer bien du sang. Cela est nécessaire, car les leucocytes du sang à l'intérieur expriment aussi CD31 en tant que marqueur de surface cellulaire, et seront en compétition contre CEs pour la liaison de l'anticorps CD31. Comme d'autres cellules endotheliales peuvent également être présents dans le sang, le rinçage est indispensable pour éviter une contamination par de telles cellules. La deuxième étape est cruciale pour maintenir un environnement stérile pendant tout le processus d'isolement. Toute contamination results une diminution spectaculaire du nombre de cellules atteintes. Enfin, la troisième étape critique consiste à ajuster le pH du tampon de CD31, que le défaut de le faire va diminuer l'efficacité de l'isolement.
la qualité de la cellule est le plus important au cours de cet isolement. la croissance des cellules lisses musculaires peut être inhibée par l'addition d'une quantité appropriée de l'héparine au milieu de culture. La prolifération des fibroblastes pourrait être ralentie par l'ajout de D-valine aux médias. Les cellules endotheliales peuvent être caractérisées par l'absorption de Dil AcLDL et la co-coloration avec BS-LECTIN dans le but de tester la pureté du phénotype population.L des cellules endothéliales est instable et son comportement peut changer rapidement une fois retiré du tissu originel et cultivées. Une limitation de la technique est que les cellules ne devraient pas être utilisées après 5 jours de culture afin qu'ils conservent leur phénotype. Il est fortement recommandé de ne pas passer les cellules. Les cellules primaires fourniront une resu cohérentelt.
Dans l'ensemble, la technique se traduit par un bon nombre de cellules de pureté exceptionnelle. Avec les compétences requises, le processus d'isolement peut être achevé dans les 6 heures. Il fournit une bonne méthode pour obtenir des cellules endothéliales coronaires souris pour chaque culture cellulaire ou d'une expérience de biologie moléculaire.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention du National Institutes of Health (HL115578 à A. Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
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