Abstract
Endothelzellen kleiden die Innenwand der Blutgefäße und eine wichtige Rolle bei der Regulation des Gefäßtonus, vaskuläre Permeabilität spielen und neue Gefäßbildung. Endothelzelldysfunktion ist in der Entwicklung und dem Fortschreiten vieler kardiovaskulärer Erkrankungen, einschließlich ischämischer Herzkrankheit beteiligt ist. Um die Funktion und Charakterisierung von koronaren Endothelzellen untersuchen, Zellisolierung ist der erste Schritt, und es erfordert eine hohe Reinheit und Menge zur nachfolgenden Experimenten durchzuführen. Dieses Protokoll beschreibt ein effizientes Verfahren adulten Maus-Koronar-Endothelzellen zu isolieren. Die Maus Herz wird in kleine Stücke zerschnitten und zerkleinert. Nach der Verdauung des Herzens unter Verwendung Dispase und Kollagenase II werden die Zellen gewaschen und mit magnetischen Kügelchen inkubiert, die mit Anti-CD31-Antikörper konjugiert sind. Die Kügelchen mit Endothelzellen sind mehrmals gewaschen und bereit sind, in verschiedenen Anwendungen zu verwenden, einschließlich Bildgebung und molekularbiologische Experiments. Effiziente Isolierung ergibt etwa 10 4 Zellen pro ein Herz mit über 90% Reinheit.
Introduction
Mausmodelle verschiedener kardiovaskulärer Erkrankungen und Stoffwechselstörungen tragen physiologischen und molekularen Veränderungen, die mit denen in Patienten gefunden ähnlich sind. Weiterhin ist die genetische Veränderung von Mäusen ein leistungsfähiges Werkzeug, das uns die pathogene Rolle spezifischer Gene bei der Entwicklung und dem Fortschreiten der Krankheiten zu untersuchen erlaubt. Heutzutage zelltypspezifische Gen-Knock-in oder -out Mäuse werden in vielen Labors und die Messung von mRNA und Protein-Ebene in spezifischen Zelltypen ist der erste Schritt bei der Bestimmung, ob die Mäuse wurden wirklich genetisch veränderten leicht erzeugt.
Das Endothel ist eine dünne einzelne Schicht aus Endothelzellen (ECs), die Linien der inneren Gefäßwand. Endothelial - Zellen spielen eine entscheidende Rolle 1,2 Gefäßspannung, die vaskuläre Permeabilität und neue Gefäßbildung bei der Regulierung. Endotheliale Dysfunktion ist ein Markenzeichen vieler pathologischer Zustände und Veränderungen in der Endothelfunktion zu verschiedenen Auto führen kannKreislauf- Erkrankungen 3,4. Es ist somit signifikant die Funktion von Endothelzellen unter physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen zu studieren.
Es gibt mehrere Möglichkeiten , um ECs isolieren 5-8 und die Isolierungsmethode muss optimiert werden , abhängig von dem Gewebe und Arten verwendet. Dies liegt daran , ECs aus verschiedenen Geweben hinsichtlich ihrer Oberflächenmarker und Proteinexpression 9 eine hohe Heterogenität anzuzeigen. Erfolgreiche Isolierung von Endothelzellen kann oft schwierig sein und erfordert ein gewisses Maß an Ausbildung und Praxis. Einmal erreicht, erweist sich die Methode der Isolierung in diesem Protokoll vorgeschlagen, stabil und effizient zu sein.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, Maus koronarer ECs (MCECs) von hoher Qualität und Quantität zu erhalten. Auch wenn die Menge der Zellen, die aus einem Herzen gesammelt weniger als aus anderen Geweben gesammelten Zellen unter Verwendung anderer Techniken, diese Technik bietet noch better Qualität. Die Reinheit von Endothelzellen in der resultierenden Population größer ist als 90%. Somit wäre diese Technik ideal für Anwendungen, die auf rein isolierten Endothelzellen verlassen wie Cell Imaging.
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Protocol
Die Forschung an Mäusen wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) von der University of Arizona genehmigt und wurde nach dem National Institute of Health (NIH) Richtlinien durchgeführt.
HINWEIS: Die Ziffern 1, 2 und 3 sollte am Tag vor dem Experiment als Setup durchgeführt werden.
1. Vorbereiten Lösungen
- CD31-Puffer (50 ml)
- 50 ml 1 × phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in ein 50 ml Röhrchen. Man wiegt 0,05 g Rinderserumalbumin (BSA) und 0,037 g Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und zu der 50-ml-Röhrchen und setzen Sie den Schlauch für etwa 1 h bis das Pulver löst sich zu drehen. PH-Wert auf 7,4, filtriert durch ein 0,2 um-Filter in ein neues 50 ml Rohr und lagern bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) mit HEPES (500 ml)
- In 1,1915 g HEPES bis 10 mM HEPES in HBSS-Lösung zu machen und gut mischen. Messung des pH-Wertes und Einstellen auf 7,4. Filter und lagern bei 4˚C.
- 1x Kreb-Lösung (1 l)
- In 100 ml 10 × Kreb-Lösung [Tabelle 1] destilliertem Wasser in einem 1 - Liter - Kolben zu verdoppeln. Man wiegt 2,1 g Natriumbikarbonat und 2 g D-Glucose und fügen Sie in den Kolben. Mischen Sie und passen Sie das Gesamtvolumen auf 1 L.
- Bubble - Lösung mit 95% O 2/5% CO & sub2 ; -Gas für 30 min und Filterlösung im Innern der Haube. Lagerung bei 4 ° C und halten auf dem Eis während Experiment.
2. Vorbereitung der Magnetic Beads
- 1 ml CD31-Puffer in jede 1,5-ml-Röhrchen (ein Röhrchen pro Probe). Mischen Sie die Schaf - Anti-Ratten - IgG - Perlen und fügen Sie die entsprechende Menge zu jeder Probe [Tabelle 1]. Schütteln Sie die Röhrchen kräftig 30 Mal und legen Sie sie in der magnetischen Platte für 1 min schütteln. Öffnen Sie die Rohre während auf der Platte und Dump-Lösungen in einen Eimer.
- 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen. Hinzufügen 2 & mgr; l Ratten-anti-Maus-CD31 AntiKörper in jedes Röhrchen und drehen Rohre O / N bei 4 ºC.
3. Autoklavierung
- Autoclave alle chirurgische Werkzeuge und Pipettenspitzen. Schneiden Sie die Enden der Pipettenspitzen, so dass es Spitzen mit 4 verschiedenen Durchmessern, von breitesten engste. Ungefähren Durchmesser für die Spitzen sind 3 mm, 2,5 mm, 2 mm und 1,5 mm. Schneiden Sie die Spitzen und Autoklaven am Tag vor der mit 30 Minuten der Sterilisation bei einer Temperatur von 121 ° C.
HINWEIS: Sections 4-11 sollte am Tag des Experiments durchgeführt werden.
4. Vorbereitung Lösungen
- Bereiten Waschpuffer mit 2% Eisen angereicherte Kälberserum (IFCS) in M199. Für die Bildgebung, Herstellung von 30 ml / Maus.
- Bereiten Enzymlösung (10 ml / Probe). Wiegen 0,6 Einheiten / ml Dispase und 1 mg / ml Kollagenase Typ II in ein 50 ml Röhrchen. In M199 und drehen Sie das Rohr bei 4 ° C für 15 min. Man filtriert durch 0,2 um Filter in eine neue 50-ml-Tube inside die Haube und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
- Bereiten Sie HBSS / HEPES mit Heparin. 10 ml HBSS mit 10 mM HEPES in 15-ml-Tube. 100 l Heparin auf das Rohr und halten bei 4 ° C bis zur Verwendung.
5. Waschen Sie die Perlen
- Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen aus dem Rotor bei 4 ° C und an der Haube zu bringen. Die Röhrchen in der magnetischen Platte und schütteln für 1 min. Sichern Sie die Lösung und 1 ml CD31 Puffer in jedes Röhrchen.
- Nehmen Sie die Rohre aus der Magnetplatte und kräftig schütteln, 30-mal. Setzen Sie die Rohre in der magnetischen Platte zurück und wiederholen Sie für insgesamt 3 Wäschen. Nach der Fertigstellung setzen die Rohre 4 ° C zurück und halten bis zur Verwendung drehen.
6. Dissection
- Injizieren die Mäuse intraperitoneal mit 0,1 ml Heparin Blutgerinnungs zu verhindern. Warten Sie 10 Minuten, dann betäuben die Mäuse intraperitoneale Injektion von 0,01 ml Pentobarbital verwendet. Überprüfen Sie, ob die Maus fühltSchmerzen, die durch den Fuß einklemmen.
- Platzieren Sie die Maus auf einer Polystyrolplatte mit Kopf nach oben und halten Sie die Arme mit Stiften. Verwenden einer Pinzette und zäh-cut-Schere die Haut an der oberen Brustbereich zu schneiden bis zum Hals.
- Machen Sie einen Schnitt in der Mitte des Brustkorbs knapp über der Membran. Schneiden Sie den Knochen seitlich und nach oben in Richtung der Kehle ein Dreieck zu machen Aussetzen des Herzens und der Lunge. Schneiden Sie die Aorta knapp über der Membran.
- Halten Sie die Thymusdrüse mit einer Pinzette, ohne zu ziehen und mit einer Schere jede Bindegewebe zu schneiden sorgfältig Lunge und Herz zusammen zu entfernen. Platz Gewebe in einem Becherglas mit 1 × Kreb, schütteln mit einer Pinzette und Transfer zu 6 cm Schale mit 1 × Kreb.
- Entfernen Sie die Lungenlappen mit einer Schere und Pinzette. Legen Sie eine 20 G sterile Katheter in die Aorta. Spülen Sie das Blut in das Herz-Kreislauf-System mit HBSS / Heparin. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Ventrikel, schütteln das Herz und Transfer in ein Probenröhrchen von M199. Halten Sie Röhrchen auf Eis.
- Übertragen Sie das Herz auf eine 6 cm Schale mit 10 ml Enzymlösung gefüllt und Hackfleisch in kleine Stücke mit einer Schere. Die Schalen werden in den 37 ° C Inkubator für 15 min. Rühre verdauten Materialien durch Auf- und Abpipettieren 30 mal durch eine Spitze mit einem abgeschnittenen Ende das Gewebe zu ermöglichen, durch leichter zu passieren.
- Legen Sie es für weitere 15 Minuten im 37 ° C-Inkubator zurück. Wiederholen Aufregung drei Mal, jedes Mal mit Pipettenspitzen von größten Öffnungen engste und 15 min Inkubation zwischen den einzelnen.
- Nach letzten 15 min Inkubation Proben zu nehmen und in die Haube. Pipettieren Lösung nach oben und unten 30-mal mit Pipettenspitze mit der engsten Öffnung und durch ein 40 & mgr; m Zelle Sieb in eine neue 50-ml-Tube.
- Waschen Sie die Schale mit 10 ml Waschpuffer eine 10 ml Pipette und übertragen auf Zellsieb verwenden. Stellen die 50-ml-Röhrchen in der Zentrifuge und Schleudern bei 400 g für 10 min bei RT.
- Überstand entfernen, ohne das Pellet zu stören. Wash-Zellen mit 5 ml Waschpuffer zweimal.
- Holen Sie sich eines der zuvor 1,5 ml Röhrchen hergestellt mit Perlen und die Arbeit an einem Rohr zu einem Zeitpunkt. Setzen Sie ein 1,5-ml-Röhrchen in der magnetischen Platte, schütteln 3-mal und öffnen.
- Nach dem letzten Zentrifuge, entfernen Sie so viel Überstand wie möglich, ohne das Pellet zu stören. Distanziere die Zellklumpen durch kräftiges Ausklopfen.
- 1 ml Waschpuffer zu den 50-ml-Röhrchen und Mischen der Zellen mit einer 1 ml Pipette. Sichern Sie die Lösung aus dem 1,5-ml-Röhrchen und 1 ml Zellsuspension aus dem 50-ml-Röhrchen an die Kügelchen. Flick die Rohre 30-mal drehen dann bei 4 ° C für 30 min.
9. Vorbereitung für Zellkultur / Imaging
- Bereiten Kammern für Zellen Plattierung. In Gelatinelösung (5% w / v, 300 & mgr; l) in die Kammer und die Oberfläche zu beschichten und Inkubation bei 37 ° C für 30 min. Nach der Inkubation remove Gelatine und trocken die Oberfläche.
- Nehmen Sie die Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 30 min Dreh und in der Magnetplatte im Inneren der Kapuze setzen. Schütteln für 2 min, dump und 1 ml Waschpuffer.
- Nehmen Sie Rohre aus der Platte, kräftig schütteln, 30-mal dann flick 30 mal. Setzen Sie sie in Magnetplatte zurück und schütteln für 1 min. Wiederholen 4 mal für insgesamt 5 Wäschen, jedoch mit 1 min auf der Platte ausgeschüttelt.
- Nach der letzten Waschung, nehmen Sie einen Schlauch heraus und zu einer Zeit, an jedem Rohr ein arbeiten. Schütteln Sie 30-mal dann 30-mal Flick. Legen Sie es auf der Magnetplatte und schütteln für 1 min. Dump und 1 ml 20% IFCS EG-Medien (vorgewärmt auf 37 ° C).
- Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Stellen Sie pipettieren bis 500 & mgr; l und pipettieren nach oben und unten 10-mal. Übertragen Sie 500 ul zu jeder Kammer.
- Setzen Sie bei 37 ºC-Inkubator und lassen O / N. Am nächsten Tag, waschen Sie die Zellen mit 10% FBS EG-Medien.
10. Vorbereitungen für die Western Blot (WB) Proben
- Take aus der Röhrchen mit Perlen / Zellen nach 1 Stunde der Rotation. Setzen Sie sie in der magnetischen Platte und schütteln für 2 min. Dump Überstand und 1 ml kaltem HBSS. Kräftig schütteln 30 mal Flick dann 30-mal. Wiederholen Sie zweimal für 3 Waschungen, aber mit 1 min auf der Platte schütteln.
- Nach dem letzten Waschen, legen Rohre auf Magnetplatte und schütteln für 1 min. Entfernen Pufferpipette und Lyse der Zellen für WB unter Verwendung eines Verfahrens zuvor 11,12 beschrieben. Gesammelte Lysat enthält in der Regel etwa 30 ug Protein.
11. Imaging
- Waschen Sie die Zellen 3 mal mit Medien, mit der endgültigen Volumen von 250 & mgr; l für eine Kammer. Fügen 1,5 ul Dil-acLDL zu den Zellen. Von diesem Punkt halten die Zellen im Dunkeln.
- Inkubieren für 3,5 Stunden bei 37 ° C. In 1,5 ul Hoechst, gut mischen und Inkubation für 30 min bei 37 ˚C.Wash Zellen mit PBS und fixieren mit 4% Paraformaldehyd (PFA) für 20 min bei RT.
- Zweimal waschen mit PBS und Block mit 5% BSA-PBS für 30 min bei RT. Wasche zweimal mit 1% BSA-PBS. Verdünnte BS-Lectin-FITC unter Verwendung von 1% BSA-PBS auf eine Konzentration von 2 ug / ml und 300 & mgr; l zu jeder Kammer.
- Setzen Sie die Kammer auf dem Orbitalschüttler bei RT für 30 min. Waschen mit PBS 3 mal.
- Visualisieren Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop mit Belichtungszeit von 200 ms für FITC (Lektin-Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission 488 nm / 519 nm), 30 ms für DAPI (Hoechst, eine Kernfärbung, Anregung / Emission bei 358 nm / 461 nm) und 300 ms für TRITC (acLDL Färbung, eine EG-Marker, Anregung / Emission bei 557 nm / 576 nm). Erwerben Sie Bilder mit einem 20X Objektiv verwendet wird.
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Representative Results
Die erfolgreiche Isolierung von koronaren Endothelzellen aus einer Maus Herz ergibt typischerweise etwa 10 4 Zellen mit über 90% Reinheit mit einer gepflasterten Form. Für eine reine Population von Endothelzellen, Vorsicht sollte im gesamten Protokoll genommen werden, um eine sterile Umgebung, die frei von jeglicher Verunreinigung zu gewährleisten. Das Auftreten von länglichen Zellen oder vergrößerten Zellen innerhalb der Population zeigt an Kontamination mit anderen Zelltypen, glatten Muskelzellen und Fibroblasten. Endothelzell-Reinheitstest wird durch Anfärben der Zellen mit einer endothelialen Zelloberflächenmarker, BS-Lectin und acLDL (Bild 1) durchgeführt. Der Anteil der positiven Zellen, die beide Farben aufweisen war mehr als 90% in MCEC. Ein solches Ergebnis zeigt, daß die Technik erfolgreich durchgeführt wurde.
| PBS (10x) (1 l) | </ Td> | ||
| Stoff | MW | Menge (g) | |
| NaCl | 58,44 | 80 | |
| KCl | 74,55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136,08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 l) | |||
| Stoff | MW | Conc (mM) | Menge (g) |
| NaCl | 58,44 | 118 | 69 |
| KCl | 74,56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 246,5 | 1.2 | 2,96 </ Td> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1,44 |
| EC Medien (20%) (500 ml) | |||
| Stoff | Menge | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10 - 20 U / ml Heparin | 500 ul | ||
| D-Valin | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Penicillin / Streptomycin | 5 ml | ||
| Anzahl der Perlen für eine Maus verwendet werden | |||
| Für die Bildgebung | 5 ul | ||
| Foder WB / PCR | 10 ul | ||
Tabelle 1 Chemische Zusammensetzung von Lösungen eingesetzt.
Abbildung 1. Repräsentative Bilder von MCECs. Fluoreszenzbilder zeigen , dass Maus koronarer ECs (MCEC) , isoliert aus Herzen hoher Reinheit der Bevölkerung EG aufweisen. Reinheit wurde sowohl acLDL Aufnahme der roten Farbe (A) und Lektin - Färbung in der grünen Farbe (B) in MCEC getestet. Der Kern wurde von Hoechst in der blauen Farbe (C) gefärbt. Der Anteil der positiven Zellen, die beide Farben aufweisen war mehr als 90% in MCEC. Bar ist repräsentativ für 20 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier um einen größeren vers anzuzeigenIon dieser Figur.
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Discussion
Die am häufigsten verwendeten Endothelzellen in Forschung sind menschliche Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVECs) wegen ihrer Bequemlichkeit und Leichtigkeit der Kultivierung. Jedoch erfordert eine Menge Forschung die Verfügbarkeit eines physiologischen Modells durch die Isolierung von Endothelzellen aus anderen spezifischen Organen 10 erreicht. Endothelial-Zellen machen einen sehr geringen Population von Zellen in dem Herzgewebe auf; ihre Isolation und Kultivierung kann sich als sehr schwierig erwiesen.
Es gibt drei wichtige Schritte innerhalb dieses Protokolls. Die erste ist, Blut gut zu spülen. Dies ist notwendig, da Leukozyten im Blut auch CD31 als ein Zelloberflächenmarker exprimieren, und wird im Wettbewerb gegen ECs für die Bindung des CD31-Antikörper. Als andere Endothelzellen auch in dem Blut vorhanden sein können, ist Spülung wesentliche Verunreinigung durch solche Zellen zu verhindern. Der zweite entscheidende Schritt ist eine sterile Umgebung während des gesamten Isolationsprozess aufrecht zu erhalten. Jede Verunreinigung results in einer dramatischen Abnahme in der Anzahl der Zellen erreicht. Schließlich ist der dritte kritische Schritt des pH des CD31-Puffer, wie Versagen einzustellen, so zu tun, wird die Effizienz der Isolierung zu verringern.
Zellqualität ist sehr wichtig, während dieser Isolation. Glattmuskelzellwachstum kann durch Zugabe einer geeigneten Menge an Heparin zu dem Kulturmedium inhibiert werden. Fibroblastproliferation konnte durch Zugabe von D-Valin zu den Medien verlangsamt werden. Endotheliale Zellen kann durch die Aufnahme von Dil-AcLDL und Co-Färbung mit BS-Lectin zu testen, um die Reinheit des population.The endothelialen Zell-Phänotyp charakterisiert werden instabil und ihr Verhalten schnell ändern kann, wenn aus dem ursprünglichen Gewebe entnommen und kultiviert. Eine Begrenzung der Technik ist, dass die Zellen nicht nach 5 Tagen der Kultivierung verwendet werden, um sicherzustellen, dass sie noch ihren Phänotyp beibehalten. Es wird dringend nicht passieren die Zellen empfohlen. Die primären Zellen wird eine konsistente resu liefernlt.
Insgesamt ergibt sich die Technik in einer guten Anzahl von Zellen hervorragender Reinheit. Mit den erforderlichen Fähigkeiten kann der Isolationsprozess innerhalb von 6 Stunden abgeschlossen sein. Es bietet eine großartige Methode für entweder für Zellkultur oder molekularbiologischen Experiment Maus-Koronar-Endothelzellen zu erhalten.
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Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die Gewährung von den National Institutes of Health (HL115578 A. Makino) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
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