Abstract
Le cellule endoteliali linea la parete interna dei vasi sanguigni e svolgono un ruolo importante nella regolazione del tono vascolare, la permeabilità vascolare, e la formazione di nuovi vasi. La disfunzione delle cellule endoteliali è implicato nello sviluppo e nella progressione di molte malattie cardiovascolari, tra cui cardiopatia ischemica. Per esaminare la funzione e caratterizzazione di cellule endoteliali coronariche, isolamento delle cellule è il primo passo e richiede elevata purezza e quantità di condurre esperimenti successivi. Questo protocollo descrive un metodo efficiente per isolare topo adulto coronarie cellule endoteliali. Il cuore del mouse è sezionato e tritata in piccoli pezzi. Dopo la digestione del cuore utilizzando dispasi e collagenasi II, le cellule vengono lavate e incubate con perline magnetiche che sono coniugate con anticorpi anti-CD31. Le perle con le cellule endoteliali vengono lavati diverse volte e sono pronti per l'uso in varie applicazioni, tra cui l'imaging molecolare e biologica experimenti. Isolamento efficiente produce circa 10 4 cellule per un cuore con oltre il 90% di purezza.
Introduction
modelli murini di varie malattie cardiovascolari e disturbi metabolici portano cambiamenti fisiologici e molecolari che sono simili a quelli riscontrati in pazienti. Inoltre, l'alterazione genetica dei topi è un potente strumento che ci permette di indagare il ruolo patogenetico di geni specifici nello sviluppo e nella progressione delle malattie. Al giorno d'oggi,-specifica delle cellule di tipo gene-knock-in o topi -out si generino facilmente in molti laboratori e la misurazione di mRNA e livelli di proteine in specifici tipi di cellule è il primo passo per determinare se i topi sono stati veramente geneticamente modificati.
Endotelio è un sottile strato singolo di cellule endoteliali (ECS) che riveste la parete vascolare interno. Le cellule endoteliali giocano un ruolo critico nella regolazione della tensione vascolare, la permeabilità vascolare, e la formazione di nuovi vasi 1,2. La disfunzione endoteliale è un segno distintivo di molte condizioni patologiche e cambiamenti nella funzione endoteliale può portare a diverse automalattie cardiovasco- 3,4. È quindi significativo per studiare la funzione delle cellule endoteliali in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche.
Ci sono diversi modi per isolare EC 5-8 e il metodo di isolamento deve essere ottimizzato a seconda di quale verranno utilizzati i tessuti e le specie. Questo perché EC da tessuti differenti di un elevato livello di eterogeneità rispetto ai marcatori di superficie e proteica 9. isolamento di successo di cellule endoteliali spesso può essere difficile e richiede un certo grado di formazione e la pratica. Una volta ottenuto, il metodo di isolamento proposto in questo protocollo rivela stabile ed efficiente.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di ottenere il mouse coronarica ECS (MCECs) di alta qualità e quantità. Anche se la quantità di cellule raccolte da un cuore è meno di cellule raccolte da altri tessuti mediante altre tecniche, questa tecnica fornisce ancora betqualità ter. La purezza delle cellule endoteliali nella popolazione risultante è superiore al 90%. Così, questa tecnica sarebbe l'ideale per le applicazioni che si basano su cellule endoteliali puramente isolate come l'imaging cellulare.
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Protocol
La ricerca sui topi è stato approvato dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) della University of Arizona ed è stata eseguita secondo il National Institute of Health (NIH) le linee guida.
NOTA: Le sezioni 1, 2 e 3 devono essere effettuate il giorno prima l'esperimento come impostazione.
1. Soluzioni Preparazione
- buffer di CD31 (50 ml)
- Aggiungere 50 ml 1 × Tampone fosfato salino (PBS) ad un tubo 50 ml. Pesare 0,05 g albumina sierica bovina (BSA) e 0,037 g di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e aggiungere al tubo da 50 ml e mettere il tubo di ruotare per circa 1 ora fino a quando si dissolve in polvere. Regolare il pH a 7,4, filtrare attraverso un filtro da 0,2 micron in un nuovo tubo da 50 ml, e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) con HEPES (500 ml)
- Aggiungere 1,1915 g di HEPES per fare 10 mM HEPES in soluzione HBSS e mescolare bene. Misurare il pH e regolare a 7,4. Filtro e conservare a 4˚C.
- La soluzione di 1x Krebs (1 L)
- Aggiungere 100 ml di soluzione di 10 × di Krebs [Tabella 1] per raddoppiare acqua distillata in un pallone da 1 L. Pesare 2,1 g di sodio bicarbonato e 2 g di D-glucosio e aggiungere al pallone. Mescolare e regolare il volume totale di 1 L.
- Soluzione Bubble con 95% O 2/5% CO 2 gas per 30 min e filtro soluzione all'interno della cappa. Conservare a 4 ° C e tenere in ghiaccio durante l'esperimento.
2. Preparare le biglie magnetiche
- Aggiungere 1 ml di tampone CD31 in ogni provetta 1,5 ml (un tubo per campione). Mescolare le perline IgG anti-ratto pecore e aggiungere la giusta quantità di ogni campione [Tabella 1]. Agitare vigorosamente le provette 30 volte e metterli nella piastra magnetica per 1 min di agitazione. Aprire i tubi, mentre sul piatto e scaricare le soluzioni in un secchio.
- Aggiungere 1 ml di tampone CD31 in ogni provetta. Aggiungere 2 ml Rat anti-topo CD31 anti-corpo ad ogni provetta e ruotare i tubi O / N a 4 ° C.
3. autoclave
- Autoclavare tutti gli strumenti di chirurgia e punte per pipette. Tagliare le estremità delle punte per pipette in modo che non ci sono punte con 4 diametri diversi, dal più largo a stretto. diametri approssimativi per le punte sono di 3 mm, 2,5 mm, 2 mm e di 1,5 mm, rispettivamente. Tagliare le punte e autoclave il giorno prima con 30 min di sterilizzazione ad una temperatura di 121 ° C.
NOTA: Sezioni 4 - 11 dovrebbero essere eseguite il giorno dell'esperimento.
4. Soluzioni Preparazione
- Preparare il tampone di lavaggio contenente il 2% di ferro-fortificato Calf Serum (FISC) in M199. Per l'imaging, preparare 30 ml / mouse.
- Preparare la soluzione enzimatica (10 ml / campione). Pesare 0,6 unità / ml di dispasi e 1 mg / ml di Collagenasi tipo II in un tubo da 50 ml. Aggiungere M199 e ruotare il tubo a 4 ° C per 15 min. Filtrare 0,2 micron filtro in un nuovo tubo da 50 ml inside il cofano e mantenere a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- Preparare HBSS / HEPES con eparina. Aggiungere 10 ml di HBSS con 10 mM HEPES in 15 ml tubo. Aggiungere 100 ml di eparina al tubo e mantenere a 4 ° C fino all'utilizzo.
5. Lavare le perline
- Estrarre i tubi con perline del rotatore a 4 ° C e portare alla cappa. Posizionare i tubi nella piastra magnetica e agitare per 1 min. Dump la soluzione tampone e aggiungere CD31 1 ml in ogni provetta.
- Prendere i tubi fuori dalla piastra magnetica e agitare vigorosamente 30 volte. Mettere i tubi indietro nella piastra magnetica e ripetere per un totale di 3 lavaggi. Dopo il completamento, mettere i tubi di nuovo a 4C e mantenere la rotazione fino al momento dell'uso.
6. Dissection
- Iniettare topi per via intraperitoneale con 0,1 ml di eparina per prevenire la coagulazione del sangue. Attendere 10 minuti, quindi anestetizzare i topi con iniezione intraperitoneale di 0,01 ml di pentobarbital. Controllare se il mouse si senteil dolore da pizzicare il piede.
- Posizionare il mouse su una tavola di polistirolo con la testa e tenere le braccia con perni. Utilizzare pinze e forbici-cut-duri per tagliare la pelle nella zona toracica superiore fino alla gola.
- Effettuare un taglio nel centro della gabbia toracica appena sopra il diaframma. Tagliare l'osso lateralmente e verso l'alto verso la gola per fare un triangolo esponendo il cuore e polmoni. Tagliare l'aorta appena sopra il diaframma.
- Tenere il timo con una pinza senza tirare e usare le forbici per tagliare con attenzione qualsiasi tessuto connettivo per rimuovere polmoni e il cuore insieme. Posizionare i tessuti in un bicchiere con 1 × Kreb di, agitare con una pinza e trasferimento a 6 centimetri piatto con 1 × Kreb di.
- Rimuovere i lobi polmonari con le forbici e pinze. Inserire un catetere sterile 20 G nell'aorta. Lavare il sangue nel sistema circolatorio coronarico con HBSS / eparina. Fare un piccolo taglio nel ventricolo, agitare il cuore e trasferirli in una provetta di M199. Mantenere i tubi in ghiaccio.
- Trasferire il cuore di un 6 centimetri piatto riempito con 10 ml di soluzione enzimatica e tritare in piccoli pezzi con le forbici. Porre le capsule in incubatore a 37 ° C per 15 min. Agitare materiali digeriti pipettando su e giù 30 volte attraverso una punta con una estremità tagliata per permettere al tessuto di passare attraverso più facile.
- Rimetterlo nel 37 ° C incubatore per altri 15 min. Ripetere l'agitazione per tre volte, ogni volta con punte per pipette da grandi aperture a più stretto e 15 min di incubazione tra ciascuna.
- Dopo l'ultimo 15 minuti di incubazione, prelevare campioni fuori e dentro il cofano. soluzione Pipettare su e giù per 30 volte utilizzando punta della pipetta con l'apertura più stretto e passare attraverso un colino 40 micron cella in un nuovo tubo da 50 ml.
- Lavare il piatto con tampone di lavaggio 10 ml con una pipetta 10 ml e trasferire su colino cella. Mettere 50 ml provette nella centrifuga e centrifugare a 400 g per 10 minuti a RT.
- Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Lavare le cellule con tampone di lavaggio 5 ml due volte.
- Ottenere una delle precedentemente preparato provette da 1,5 ml con perline e lavorare su un tubo alla volta. Mettere una provetta da 1,5 ml nella piastra magnetica, agitare per 3 volte e aprirlo.
- Dopo l'ultima centrifugazione, rimuovere il più surnatante possibile senza disturbare il pellet. Dissociare i grumi di cellule muovendo vigorosamente.
- Aggiungere tampone di lavaggio 1 ml al tubo 50 ml e mescolare le cellule con una pipetta 1 ml. Dump la soluzione dalla provetta da 1,5 ml e aggiungere 1 ml di sospensione cellulare dal tubo 50 ml ai talloni. Flick i tubi 30 volte poi ruotare a 4 ° C per 30 minuti.
9. Preparazione della coltura cellulare / Imaging
- Preparare le camere per la placcatura cellule. Aggiungere la soluzione di gelatina (5% w / v, 300 microlitri) alla camera bene per rivestire la superficie e incubare per 30 min a 37 ° C. Dopo l'incubazione, remgelatina ove e asciugare la superficie.
- Estrarre i tubi con perline / cellule dopo 30 minuti di rotazione e mettere nel piatto magnetico all'interno della cappa. Agitare per 2 minuti, discarica e aggiungere tampone di lavaggio 1 ml.
- Prendere tubi dalla piastra, agitare energicamente 30 volte poi flick 30 volte. Metteteli nel piastra magnetica e agitare per 1 min. Ripetere 4 volte per un totale di 5 lavaggi, ma con 1 min agitando sulla piastra.
- Dopo l'ultimo lavaggio, estrarre un tubo e lavorare su ciascun tubo uno alla volta. Agitare 30 volte poi scorri 30 volte. Mettere sul piatto magnetico e agitare per 1 min. Dump e aggiungere 1 ml di 20% dei media IFCS CE (pre-riscaldato a 37 ° C).
- Agitare vigorosamente 30 volte poi flick 30 volte. Regolare pipetta a 500 microlitri e pipettare su e giù per 10 volte. Trasferire 500 microlitri di ciascuna camera.
- Mettere a 37 ° C incubatore e lasciare O / N. Il giorno dopo, lavare le cellule con il 10% dei media FBS CE.
10. Preparazione per Western Blot (WB) Campioni
- Takuna e le provette con perline / cellule dopo 1 ora di rotazione. Metteteli nella piastra magnetica e agitare per 2 min. Dump surnatante e aggiungere 1 ml HBSS freddo. Agitare vigorosamente 30 volte poi flick 30 volte. Ripetere due volte per 3 lavaggi, ma con 1 min agitando sulla piastra.
- Dopo l'ultimo lavaggio, mettere i tubi sulla piastra magnetica e agitare per 1 min. Rimuovere tampone utilizzando pipetta e lisare le cellule per WB utilizzando un metodo descritto in precedenza 11,12. lisato raccolte di solito contiene circa 30 mg di proteina.
11. Imaging
- Lavare le cellule 3 volte con supporti, con volume finale di 250 microlitri di una camera. Aggiungere 1,5 ml di Dil-acLDL alle cellule. Da questo punto, mantenere le cellule nel buio.
- Incubare per 3,5 ore a 37 ° C. Aggiungere 1,5 ml di Hoechst, mescolare bene e incubare per 30 minuti a 37 celle ˚C.Wash con PBS e fissare con 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare due volte con PBS e bloccare con il 5% di BSA-PBS per 30 min a temperatura ambiente. Lavare due volte con 1% BSA-PBS. Diluire BS-lectina-FITC usando 1% BSA-PBS ad una concentrazione di 2 mg / ml e aggiungere 300 microlitri di ciascuna camera.
- Mettere la camera sul agitatore orbitale a temperatura ambiente per 30 min. Lavare con PBS 3 volte.
- Visualizzare le cellule sotto il microscopio a fluorescenza con il tempo di esposizione di 200 msec per FITC (colorazione lectina, un marker CE, di eccitazione / emissione di 488 nm / 519 nm), 30 msec per DAPI (Hoechst, una colorazione, di eccitazione / emissione nucleare a 358 nm / 461 nm), e 300 msec per TRITC (acLDL colorazione, un marker CE, di eccitazione / emissione a 557 nm / 576 nm). Acquisire le immagini utilizzando una lente obiettivo 20X.
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Representative Results
L'isolamento di successo delle cellule endoteliali coronariche da un cuore del mouse si ottiene in genere circa 10 4 cellule con oltre il 90% di purezza con una forma di ciottoli. Per una popolazione pura di cellule endoteliali, si deve usare cautela in tutto il protocollo al fine di garantire un ambiente sterile priva di qualsiasi contaminazione. La comparsa di cellule allungate o allargate cellule all'interno della popolazione indica contaminazione con altri tipi di cellule, cellule muscolari lisce e fibroblasti. Test di purezza delle cellule endoteliali è effettuata colorando le cellule con un marcatore di superficie delle cellule endoteliali, BS-lectina e acLDL (Figura 1). La percentuale di cellule positive che presentano entrambi i colori supera il 90% in MCEC. Tale risultato indica che la tecnica è stata eseguita con successo.
| PBS (10x) (1 L) | </ Td> | ||
| Materiale | MW | Importo (g) | |
| NaCl | 58,44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141,96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 L) | |||
| Materiale | MW | Conc (mm) | Importo (g) |
| NaCl | 58,44 | 118 | 69 |
| KCl | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl 2 2H 2 O • | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO 4 • 7H 2 O | 246.5 | 1.2 | 2.96 </ Td> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1.44 |
| CE supporti (20%) (500 ml) | |||
| Materiale | Quantità | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10 - 20 U / ml di eparina | 500 microlitri | ||
| D-Valina | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Penicillina / streptomicina | 5 ml | ||
| Quantità di perline per essere utilizzato per un mouse | |||
| per l'imaging | 5 ml | ||
| Fo WB / PCR | 10 microlitri | ||
Tabella 1. composizioni chimiche delle soluzioni utilizzate.
Figura 1. rappresentativi Immagini di immagini MCECs. Fluorescenza mostrano che il mouse coronarica ECS (MCEC) isolato dai cuori presentano elevata purezza della popolazione CE. Purezza è stato testato sia acLDL assorbimento di colore rosso (A) e lectina colorazione di colore verde (B) in MCEC. Il nucleo è stato macchiato dalla Hoechst in colore blu (C). La percentuale di cellule positive che presentano entrambi i colori supera il 90% in MCEC. Bar è rappresentativo di 20 micron. Clicca qui per visualizzare un vers più grandiione di questa figura.
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Discussion
Le cellule endoteliali più utilizzati nella ricerca sono cellule umane endoteliali della vena ombelicale (HUVEC) a causa della loro praticità e facilità di coltura. Tuttavia, molte ricerche richiede la disponibilità di un modello fisiologico raggiunto con l'isolamento delle cellule endoteliali da altri organi specifici 10. Le cellule endoteliali formano una popolazione molto minore di cellule nel tessuto cardiaco; il loro isolamento e la coltura grado di dimostrare di essere molto difficile.
Ci sono tre fasi critiche all'interno di questo protocollo. Il primo è quello di lavare bene il sangue. Ciò è necessario, come i leucociti del sangue all'interno esprimono anche CD31 come marcatore superficie cellulare, e gareggeranno contro EC per il legame dell'anticorpo CD31. Come altre cellule endoteliali può essere presente anche nel sangue, vampate è essenziale per impedire la contaminazione da tali cellule. Il secondo passo fondamentale è quello di mantenere un ambiente sterile durante tutto il processo di isolamento. Ogni contaminazione resuLTS in una drastica riduzione del numero di cellule raggiunti. Infine, il terzo passo critico è quello di regolare il pH del tampone CD31, come in caso contrario si diminuirà l'efficienza dell'isolamento.
qualità cellulare è più importante durante questo isolamento. la crescita delle cellule muscolari lisce può essere inibita mediante aggiunta di una quantità appropriata di eparina al terreno di coltura. Fibroblasti proliferazione potrebbe essere rallentato con l'aggiunta di D-Valina ai media. Le cellule endoteliali possono essere caratterizzati dalla diffusione di Dil-AcLDL e co-colorazione con BS-Lectin per verificare la purezza del fenotipo population.The cellule endoteliali è instabile e il loro comportamento può cambiare rapidamente una volta tolto tessuto originale e colta. Una limitazione di questa tecnica è che le cellule non devono essere utilizzati dopo 5 giorni di coltura per assicurare che ancora mantengono la loro fenotipo. Si raccomanda vivamente di non passare le cellule. Le cellule primarie forniranno un consistente result.
Nel complesso, la tecnica comporta un buon numero di celle di straordinaria purezza. Con le competenze richieste, il processo di isolamento può essere completata entro 6 ore. Esso fornisce un ottimo metodo per l'ottenimento del mouse coronarici cellule endoteliali sia per coltura cellulare o molecolare esperimento biologico.
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Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione da parte del National Institutes of Health (HL115578 ad A. Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
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