Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Isolering av Mouse Coronary endotelceller

Published: July 3, 2016 doi: 10.3791/53985

Abstract

Endotelceller linje innerveggen av blodkar og spiller en viktig rolle ved regulering av vaskulær tone, vaskulær permeabilitet, vaskulær og ny formasjon. Endotelcelle dysfunksjon er implisert i utvikling og progresjon av mange kardiovaskulære sykdommer, inkludert iskemisk hjertesykdom. For å undersøke funksjonen og karakterisering av koronare endoteliale celler, er celleisolasjon det første trinnet og det kreves høy renhet og antall for å gjennomføre etterfølgende eksperimenter. Denne protokollen beskriver en effektiv metode for å isolere voksen muse koronare endoteliale celler. Musen hjerte dissekeres og hakket opp i små biter. Etter fordøyelse av hjertet ved hjelp av dispase og kollagenase II, blir cellene vasket og inkubert med magnetiske kuler som er konjugert med anti-CD31-antistoff. Perlene med endotelceller vaskes flere ganger og er klar til bruk i ulike applikasjoner, inkludert bildebehandling og molekylær biologisk experiments. Effektiv isolasjon gir ca 10 4 celler per ett hjerte med over 90% renhet.

Introduction

Musemodeller av forskjellige kardiovaskulære sykdommer og metabolske forstyrrelser bærer fysiologiske og molekylære forandringer som er tilsvarende de som finnes hos pasienter. Videre genetisk endring av mus er et kraftig verktøy som gjør det mulig for oss å undersøke patogen rolle spesifikke gener i utvikling og progresjon av sykdommer. I dag, celle-type-spesifikke gen-knock-in eller utsjekking mus enkelt ut i mange laboratorier og måling av mRNA og proteinnivåer i spesifikke celletyper er det første skrittet i å avgjøre om musene ble virkelig genmodifisert.

Endotel er et tynt enkelt lag av endoteliale celler (ECS) som linjer indre vaskulære veggen. Endoteliale celler spiller en viktig rolle ved regulering av vaskulær spenning, vaskulær permeabilitet, vaskulær og ny formasjon 1,2. Endotelial dysfunksjon er et kjennetegn på mange patologiske tilstander og endringer i endotelfunksjon kan føre til ulike bilendiovascular sykdommer 3,4. Det er således viktig å studere funksjonen av endotelceller under fysiologiske og patofysiologiske betingelser.

Det er flere måter å isolere ECS 5-8 og isoleringsmetoden må optimaliseres avhengig av hvilken vev og arter vil bli brukt. Dette er fordi ECS fra forskjellige vev vise en høy grad av heterogenitet med hensyn til sine overflatemarkører og proteinekspresjon 9. Vellykket isolering av endotelceller kan ofte være utfordrende og krever en viss grad av opplæring og praksis. Når oppnådd, fremgangsmåten for isolering foreslått i denne protokollen viser seg å være stabil og effektiv.

Det overordnede målet med denne metoden er å få mus koronar egenkapitalbevis (MCECs) av høy kvalitet og kvantitet. Selv om mengden av celler oppsamlet fra en hjerte er mindre enn celler oppsamlet fra andre vev ved hjelp av andre teknikker, gir denne teknikken likevel better kvalitet. Renheten av endoteliale celler i det resulterende populasjonen er større enn 90%. Dermed vil denne teknikken være ideelt for applikasjoner som er avhengige av rent isolerte endotelceller som celle bildebehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forskningen på mus ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved University of Arizona og ble utført i henhold til National Institute of Health (NIH) retningslinjer.

MERK: §§ 1, 2 og 3 skal gjennomføres dagen før forsøket som oppsett.

1. Klar Solutions

  1. CD31-buffer (50 ml)
    1. Tilsett 50 ml 1 x fosfatbuffer saltvann (PBS) til et 50 ml rør. Vei 0,05 g Bovine Serum Albumin (BSA) og 0,037 g Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) og legge til 50 ml tube og sette røret for å rotere i ca 1 time før pulveret er oppløst. Juster pH til 7,4, filtreres gjennom et 0,2 mikrometer filter inn i en ny 50 ml tube, og oppbevar ved 4 ˚C inntil bruk.
  2. Hanks balanserte saltløsning (HBSS) med HEPES (500 ml)
    1. Legg 1,1915 g HEPES å gjøre 10 mM HEPES i HBSS løsning og bland godt. Mål pH og juster til 7,4. Filter og oppbevares ved 4˚C.
  3. 1x Krebs-løsning (1 L)
    1. Tilsett 100 ml 10 x Krebs-løsning [Tabell 1] for å doble destillert vann i en 1-liters kolbe. Vei 2,1 g natriumhydrogenkarbonat og 2 g D-glukose og legge til kolben. Bland og justere det totale volum til 1 L.
    2. Boble-løsning med 95% O2 / 5% CO 2-gass i 30 minutter og filtrer løsningen inne i hetten. Oppbevar ved 4 ˚C og holde på is under forsøket.

2. Forberedelse av magnetiske kuler

  1. Tilsett 1 ml CD31-buffer i hver 1,5 ml rør (en tube per prøve). Bland sau anti-rotte IgG perler og legge til riktig mengde til hver prøve [Tabell 1]. Rist rørene kraftig 30 ganger og plassere dem i magnetplaten i 1 min av risting. Åpne rørene mens på platen og dumpe oppløsningene i en bøtte.
  2. Tilsett 1 ml CD31-buffer i hvert rør. Tilsett 2 ul rotte-anti-mus CD31 antiKroppen til hvert rør og rotere rørene O / N ved 4 ºC.

3. Autoklave

  1. Autoklav alle kirurgi og pipetter. Skjær endene av pipetter slik at det er tips med 4 forskjellige diametre, fra bredest til smalest. Omtrentlige diametre for spissene er 3 mm, 2,5 mm, 2 mm, og 1,5 mm henholdsvis. Skjær spissene og autoklaveres dagen før med 30 minutter for sterilisering ved en temperatur på 121 ° C.
    MERK: §§ 4-11 skal utføres på dagen for forsøket.

4. Forbereder Solutions

  1. Forbered vaskebuffer som inneholder 2% jern-forsterkede kalveserum (IFCS) i M199. For bildebehandling, forberede 30 ml / mus.
  2. Forbered enzymløsning (10 ml / prøve). Veie 0,6 enhet / ml av Dispase og 1 mg / ml Collagenase type II i et 50 ml rør. Legg M199 og rotere røret ved 4 ºC i 15 minutter. Filtrer gjennom 0,2 um filter inn i en ny 50 ml tube inside panseret og holde ved 4 ˚C inntil bruk.
  3. Forbered HBSS / HEPES med heparin. Tilsett 10 ml HBSS med 10 mM HEPES i 15 ml rør. Tilsett 100 ul av heparin til røret og holde ved 4 ° C inntil bruk.

5. Vask perlene

  1. Ta ut rørene med perler fra Rotator ved 4 ºC og bringe til panseret. Plasser rørene i magnetplaten og det hele rystes i 1 min. Dump løsningen og tilsett 1 ml CD31 buffer i hvert rør.
  2. Ta rørene ut av magnetplaten og rist kraftig 30 ganger. Sette rørene tilbake i magnetplaten og gjenta for totalt 3 vasker. Etter ferdigstillelse, sette rørene tilbake til 4 ° C og holde rotere inntil bruk.

6. Dissection

  1. Injisere musene intraperitonealt med 0,1 ml av heparin for å forhindre blodkoagulering. Vent 10 minutter, deretter anesthetize musene bruker intraperitoneal injeksjon av 0,01 ml Pentobarbital. Sjekk om musen er følelsensmerte ved å knipe foten.
  2. Plasser musen på en polystyren bord med hodet opp og hold armene med pinner. Bruk pinsett og tøffe-cut-saks til å klippe i huden på øvre thorax området opp til halsen.
  3. Et snitt i midten av brystkassen like over membranen. Skjær benet sidelengs og oppover mot halsen for å lage en trekant utsette hjertet og lungene. Skjær aorta like over membranen.
  4. Hold thymus med tang uten å trekke og bruke saks til å kutte noen bindevev nøye for å fjerne lungene og hjertet sammen. Plasser vev i et beger med en × Krebs, riste med pinsett og overføre til 6 cm parabolen med en × Krebs.
  5. Fjern lungelapper ved hjelp av saks og pinsett. Sett inn en 20 G sterilt kateter inn i aorta. Spyl blod i den koronare sirkulasjonssystemet med HBSS / heparin. Lag et lite kutt i ventrikkelen, riste hjerte og overføre til et prøverør av M199. Hold rørene på is.
class = "jove_title"> 7. tissue Fordøyelse

  1. Overfør hjerte til en 6 cm tallerken fylt med 10 ml enzymoppløsning og hakke det opp i små biter med saks. Plasser oppvasken i 37 ºC inkubator i 15 min. Agitere fordøyd materiale ved å pipettere opp og ned 30 ganger gjennom en spiss med et kutt enden slik at vevet til å passere gjennom enklere.
  2. Sett den tilbake i 37 ºC inkubator for en annen 15 min. Gjenta agitasjon tre ganger, hver gang du bruker pipetter fra største åpningene smaleste og 15 min inkubasjon mellom hver.
  3. Etter siste 15 min inkubasjon, ta prøver ut og inn i panseret. Pipet løsningen opp og ned 30 ganger med pipette spissen med den smaleste åpning og passerer gjennom en 40 mikrometer celle sil inn i en ny 50 ml tube.
  4. Vask formen med 10 ml vaskebuffer med 10 ml pipette og overføre til celle sil. Sett 50 ml rør i sentrifugen og sentrifugering ved 400 g i 10 min ved RT.
itle "> 8. Vasking og Bøyning med perler

  1. Fjern supernatanten uten å forstyrre pelleten. Vask cellene med 5 ml vaskebuffer to ganger.
  2. Få en av de tidligere fremstilte 1,5 ml rør med perler og arbeide på et rør på en gang. Sett en 1,5 ml tube i magnetplaten, riste 3 ganger og åpne den.
  3. Etter siste sentrifuge, fjerne så mye som mulig supernatanten uten å forstyrre pelleten. Angre celleklumper ved å dra kraftig.
  4. Tilsett 1 ml vaskebuffer i 50 ml rør og blande cellene med en 1 ml pipette. Dumpe oppløsning fra 1,5 ml rør og tilsett 1 ml cellesuspensjon fra 50 ml rør til kulene. Flick rørene 30 ganger roter på 4 ºC i 30 minutter.

9. Forbereder for Cell Kultur / Imaging

  1. Forbered kamre for plating celler. Legg gelatinoppløsning (5% vekt / volum, 300 pl) til kammeret vel for å belegge overflaten og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C. Etter inkubasjon remove gelatin og tørr overflate.
  2. Ta ut rørene med perler / celler etter 30 min rotasjons og satt i magnetplaten inne i hetten. Rist i 2 min, dump og tilsett 1 ml vaskebuffer.
  3. Ta rør ut av platen, rist kraftig 30 ganger deretter flick 30 ganger. Sett dem tilbake i magnetplate og rist i 1 min. Gjenta 4 ganger for totalt 5 vaskinger, men med 1 min risting på plate.
  4. Etter den siste vaskingen, ta ut en slange og arbeid på hvert rør en om gangen. Rist 30 ganger så flick 30 ganger. Sett det på magnetplate og rist i 1 min. Dump og tilsett 1 ml 20% IFCS EC media (forvarmet ved 37 ºC).
  5. Rist kraftig 30 ganger så flick 30 ganger. Juster pipette til 500 mL og pipettér opp og ned 10 ganger. Overfør 500 mL til hvert kammer.
  6. Sett på 37 ºC kuvøse og la O / N. Neste dag, vaske celler med 10% FBS EC medier.

10. Forberedelse til Western Blot (WB) Samples

  1. Take ut til rørene med perler / celler etter 1 time med rotasjon. Sett dem i magnetplaten og rist i 2 min. Dump supernatanten og tilsett 1 ml kald HBSS. Rist kraftig 30 ganger så flick 30 ganger. Gjenta to ganger for 3 vasker, men med 1 min rister på tallerkenen.
  2. Etter siste vask, legger rør på magnetplate og rist i 1 min. Fjern-buffer ved hjelp av pipette og lysere cellene for WB ved hjelp av en metode beskrevet tidligere 11,12. Innsamlet lysat inneholder vanligvis rundt 30 mikrogram av protein.

11. Imaging

  1. Vask cellene 3 ganger med medium, med sluttvolum på 250 ul i et kammer. Legg 1,5 mL av Dil-acLDL til cellene. Fra dette punkt, holde cellene i mørket.
  2. Inkuber i 3,5 timer ved 37 ° C. Tilsett 1,5 mL av Hoechst, bland godt og inkuber i 30 min ved 37 ˚C.Wash celler med PBS og feste med 4% paraformaldehyd (PFA) i 20 minutter ved RT.
  3. Vask to ganger med PBS og blokker med 5% BSA-PBS i 30 min ved RT. Vask to ganger med 1% BSA-PBS. Fortynn BS-lektin-FITC ved bruk av 1% BSA-PBS til en konsentrasjon på 2 ug / ml og tilsett 300 ul til hvert kammer.
  4. Sette kammeret på orbital risteapparat ved romtemperatur i 30 minutter. Vask med PBS 3 ganger.
  5. Visual celler under fluorescerende mikroskop med eksponeringstid på 200 msek for FITC (lektin flekker, en EC markør, eksitasjon / emisjon 488 nm / 519 nm), 30 msek for DAPI (Hoechst, en nukleær farging, eksitasjon / emisjon ved 358 nm / 461 nm), og 300 msek for TRITC (acLDL flekker, en EC markør, eksitasjon / emisjon på 557 nm / 576 nm). Acquire bilder med en 20X objektiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den vellykkede isolering av koronar endotelceller fra en mus hjerte gir vanligvis rundt 10 4 celler med over 90% renhet med en brostein form. For en ren populasjon av endotelceller, bør man vise forsiktighet gjennom hele protokollen for å sikre et sterilt miljø smuss. Utseendet av langstrakte celler, eller forstørrede celler i populasjonen indikerer forurensning med andre celletyper, glatte muskelceller og fibroblaster. Endotelcelle renhet Testen utføres ved å merke celler med en endotel-celleoverflatemarkør, BS-lektin og acLDL (figur 1). Prosentandelen av positive celler som utviser begge farger var over 90% i MCEC. Et slikt resultat indikerer at teknikken ble utført vellykket.

PBS (10x) (1 L) </ Td>
Materiale MW Beløp (g)
NaCl 58.44 80
KCl 74.55 2
Na 2 HPO 4 141,96 6.1
KH 2 PO 4 136,08 2
Krebs (10x) (1 L)
Materiale MW Kons (mM) Beløp (g)
NaCl 58.44 118 69
KCl 74,56 4.7 3,5
CaCl 2 • 2 H 2 O 147 1.8 2.6
MgSO4 • 7H 2 O 246,5 1.2 2,96 </ Td>
NaH 2 PO 4 120 1.2 1,44
EC-medier (20%) (500 ml)
Materiale Beløp
M199 444,5 ml
10-20 U / ml Heparin 500 mL
D-valin 25 mg
IFCS 100 ml
EGS 10 mg
Penicillin / streptomycin 5 ml
Mengden av perler som skal brukes for en mus
for bildebehandling 5 pl
Feller WB / PCR 10 ul

Tabell 1. kjemiske sammensetninger av løsninger som brukes.

Figur 1
Figur 1. Representative Bilder av MCECs. Fluorescens bilder viser at mus koronar egenkapitalbevis (MCEC) isolert fra hjerter utviser høy renhet av EF befolkningen. Purity ble testet av både acLDL opptak av rød farge (A) og lektin flekker i grønn farge (B) i MCEC. Kjernen var farget av Hoechst i blå farge (C). Prosentandelen av positive celler som utviser begge farger var over 90% i MCEC. Bar representerer 20 mikrometer. Klikk her for å se et større version av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De mest brukte endotelceller i forskning er menneskelige navlevene endotelceller (HUVECs) på grunn av deres bekvemmelighet og enkel dyrking. Imidlertid er en rekke undersøkelser krever tilgjengelighet av en fysiologisk modell oppnådd ved isolering av endotelceller fra andre spesifikke organer 10. Endotelceller utgjør en svært liten populasjon av celler i hjertet vev; sin isolasjon og dyrking kan vise seg å være svært vanskelig.

Det er tre viktige skritt i denne protokollen. Den første er å skylle godt blod. Dette er nødvendig, da leukocytter i blod også uttrykker CD31 som en celleoverflate markør, og vil konkurrere mot ECS for binding av CD31 antistoff. Som andre endoteliale celler kan også være til stede i blodet, spyling er viktig for å hindre forurensning av slike celler. Den andre kritiske trinnet er å opprettholde et sterilt miljø i hele isolasjonsprosess. Enhver forurensning results i en dramatisk reduksjon i antallet celler oppnådd. Endelig er den tredje kritiske trinn for å justere pH til CD31 buffer, som unnlatelse av å gjøre dette vil redusere effektiviteten av isolasjonen.

Cell kvalitet er det viktigste i denne isolasjon. Glatt muskelcellevekst kan bli hemmet ved tilsetning av en passende mengde av heparin til kulturmediet. Fibroblast spredning kan bli bremset ned ved å legge til D-valin til media. Endotelceller kan karakteriseres ved opptaket av Dil-AcLDL og ko-farging med BS-lektin for å teste for renheten av population.The endotelial celle-fenotype er ustabil, og deres oppførsel kan endre seg raskt en gang tatt ut av det opprinnelige vev og kultivert. En begrensning av teknikken er at cellene ikke kan brukes etter 5 dager med dyrking for å sikre at de fortsatt beholder deres fenotype. Det er sterkt anbefalt å ikke passere cellene. Den primære celler vil gi en konsistent result.

Totalt sett teknikken resulterer i en god del av celler av enestående renhet. Med de nødvendige ferdigheter, kan isolasjon prosessen være fullført innen seks timer. Det gir en god fremgangsmåte for å oppnå muse koronare endoteliale celler for enten cellekultur eller molekylær biologisk eksperiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskuddet fra National Institutes of Health (HL115578 til A. Makino).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Sigma A3311-10G
EDTA Fisher BP120-500
HBSS Fisher SH3026801
Hepes Sigma-Aldrich H4034-500G
Sodium Bicarbonate  Sigma S5761
D-(+)-Glucose  Sigma G7021-1KG
DynaBeads pan mouse IgG beads  Thermo Fisher Scientific 11035
Rat anti-mouse CD31 Antibody BD Biosciences 550274
IFCS  Fisher SH30072.04
M199 Fisher MT10060-CV
Dispase (Neutral Protease) Worthington Biochemical Corp./Fisher LS02109
Collagenase Type II  Worthington Biochemical Corp./Fisher LS004176
Glycerol  Fisher BP381-1
Igepal Sigma I3021-50 ml
Phosphatase inhibitor cocktail Sigma P0044-1ml
Protease inhibitor cocktail Sigma P8340-1 ml
Heparin  Sigma H3149-100KU
FBS  Fisher/Mediatech MT35010CV
D-Valine Sigma V1255-5G
EGS Corning 356006
Penicillin/Streptomycin Fisher/Mediatech MT-30-002-CI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
  3. Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
  4. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
  5. Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
  6. Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
  7. Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
  8. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
  9. Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
  10. Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
  11. Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
  12. Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).

Tags

Cellular Biology MCEC magnetiske kuler hjerter disseksjon CD31 enzymatisk fordøyelse
Isolering av Mouse Coronary endotelceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Luo, S., Truong, A. H., Makino, A.More

Luo, S., Truong, A. H., Makino, A. Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (113), e53985, doi:10.3791/53985 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter