Abstract
Las células endoteliales revisten la pared interna de los vasos sanguíneos y juegan un papel importante en la regulación del tono vascular, la permeabilidad vascular y la formación de nuevos vascular. disfunción de la célula endotelial está implicada en el desarrollo y la progresión de muchas enfermedades cardiovasculares que incluyen la enfermedad cardíaca isquémica. Para examinar la función y caracterización de células endoteliales coronarias, aislamiento de células es el primer paso y requiere alta pureza y cantidad para llevar a cabo los experimentos posteriores. Este protocolo describe un método eficaz para aislar las células endoteliales coronarias de ratón adulto. El corazón de ratón se diseca y picada en trozos pequeños. Después de la digestión del corazón usando dispasa y colagenasa II, las células se lavaron y se incubaron con perlas magnéticas que están conjugados con el anticuerpo anti-CD31. Las perlas con las células endoteliales son lavados varias veces y están listos para usar en diversas aplicaciones, incluyendo formación de imágenes y EXPERIME biológica molecularNTS. Aislamiento eficaz rinde aproximadamente 10 4 células por un solo corazón con más del 90% de pureza.
Introduction
Los modelos de ratón de diversas enfermedades cardiovasculares y los trastornos metabólicos tienen cambios fisiológicos y moleculares que son similares a los encontrados en pacientes. Por otra parte, la alteración genética de los ratones es una poderosa herramienta que nos permite investigar el papel patogénico de genes específicos en el desarrollo y progresión de enfermedades. Hoy en día, gen-knock-in célula de tipo específico o ratones salida privado se generan fácilmente en muchos laboratorios y la medición de los niveles de ARNm y de proteína en tipos específicos de células es el primer paso en la determinación de si los ratones fueron verdaderamente genéticamente modificados.
El endotelio es una capa delgada única de las células endoteliales (EC) que recubre la pared vascular interior. Las células endoteliales juegan un papel crítico en la regulación de la tensión vascular, permeabilidad vascular, y la formación de nuevos vascular 1,2. La disfunción endotelial es una característica de muchas condiciones patológicas y los cambios en la función endotelial puede conducir a diversas cocheenfermedades cardiovascu- 3,4. Por tanto, es importante para estudiar la función de las células endoteliales en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas.
Hay varias maneras para aislar ECs 5-8 y el método de aislamiento tiene que ser optimizada en función de los cuales se utilizan tejidos y especies. Esto se debe a ECs de diferentes tejidos muestran un alto nivel de heterogeneidad con respecto a sus marcadores de superficie y la expresión de proteínas 9. éxito en el aislamiento de las células endoteliales a menudo puede ser difícil y requiere un cierto grado de entrenamiento y práctica. Una vez logrado, el método de aislamiento se propone en este protocolo resulta ser estable y eficiente.
El objetivo general de este método es la obtención de ratón EC coronaria (MCECs) de alta calidad y la cantidad. A pesar de que la cantidad de las células recogidas de un corazón es menor que las células recogidas de otros tejidos que utilizan otras técnicas, esta técnica todavía proporciona apuestater calidad. La pureza de las células endoteliales en la población resultante es mayor que 90%. Por lo tanto, esta técnica sería ideal para aplicaciones que dependen de las células endoteliales puramente aislados, como imágenes de células.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
La investigación en ratones fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Universidad de Arizona y se llevó a cabo de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud (NIH) Directrices.
NOTA: Las secciones 1, 2 y 3 deben llevarse a cabo el día antes del experimento como configuración.
1. Preparación de Soluciones
- tampón de CD31 (50 ml)
- Añadir 50 ml de 1 x tampón fosfato salino (PBS) a un tubo de 50 ml. Pesar 0,05 g Albúmina de suero bovino (BSA) y 0,037 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se añade al tubo de 50 ml y colocar el tubo de girar durante aproximadamente 1 h hasta que el polvo se disuelva. Ajustar el pH a 7,4, se filtra a través de un filtro de 0,2 micras en un nuevo tubo de 50 ml y se almacena a 4 ° C hasta su uso.
- Solución salina equilibrada de Hank (HBSS) con HEPES (500 ml)
- Añadir 1,1915 g de HEPES hacer HEPES 10 mM en solución HBSS y mezclar bien. Medir el pH y ajustar a 7,4. Se filtra y se almacena a 4DO.
- 1X solución de Kreb (1 L)
- Añadir 100 ml de solución de 10 × de Krebs [Tabla 1] para duplicar agua destilada en un matraz de 1 L. Pesar 2,1 g de bicarbonato de sodio y 2 g de D-glucosa y añadir al matraz. Mezclar y ajustar el volumen total a 1 L.
- Solución de la burbuja con un 95% de O2 / 5% de CO2 del gas durante 30 minutos y se filtra la solución dentro de la campana. Almacenar a 4 ° C y se mantiene en hielo durante el experimento.
2. Preparación de las perlas magnéticas
- Añadir 1 ml de tampón de CD31 en cada tubo 1,5 ml (un tubo por muestra). Mezclar las perlas de IgG anti-rata de oveja y añadir la cantidad apropiada para cada muestra [Tabla 1]. Agitar vigorosamente los tubos 30 veces y colocarlos en la placa magnética durante 1 min de agitación. Abrir los tubos mientras que en el plato y volcar las soluciones en un cubo.
- Añadir 1 ml de tampón de CD31 en cada tubo. Añadir 2 l de rata anti-ratón anti CD31cuerpo a cada tubo y girar tubos O / N a 4 ºC.
3. El tratamiento en autoclave
- Autoclave todas las herramientas de cirugía y puntas de pipeta. Cortar los extremos de las puntas de pipeta de manera que hay consejos con 4 diámetros diferentes, de mayor a más estrecho. diámetros aproximados de los consejos son de 3 mm, 2,5 mm, 2 mm y 1,5 mm, respectivamente. Cortar las puntas y autoclave el día anterior con 30 minutos de esterilización a una temperatura de 121 ºC.
NOTA: Secciones 4-11 deben llevarse a cabo en el día del experimento.
4. Preparación de Soluciones
- Preparar el tampón de lavado que contenía 2% enriquecida con hierro de suero de ternera (FISQ) en M199. Para imágenes, preparar 30 ml / ratón.
- Preparar la solución de enzima (10 ml / muestra). Pesar 0,6 unidad / ml de dispasa y 1 mg / ml de colagenasa de tipo II en un tubo de 50 ml. Añadir M199 y rotar el tubo a 4 ºC durante 15 minutos. Filtrar a través de filtro de 0,2 micras en un nuevo tubo de 50 ml inside la campana y mantener a 4 ° C hasta su uso.
- Preparar HBSS / HEPES con heparina. Añadir 10 ml de HBSS con HEPES 10 mM en 15 ml tubo. Añadir 100 ml de heparina al tubo y mantenerla en 4 ° C hasta su uso.
5. lavado de las perlas
- Sacar los tubos con los granos de la rotador a 4 ºC y llevar a la campana. Colocar los tubos en la placa magnética y agitar durante 1 min. Volcado de la solución y añadir tampón CD31 1 ml en cada tubo.
- Tomar los tubos de la placa magnética y agitar vigorosamente 30 veces. Poner los tubos de nuevo en la placa magnética y repetir para un total de 3 lavados. Después de la terminación, poner los tubos de nuevo a 4 ° C y mantener girando hasta su uso.
6. La disección
- Inyectar los ratones por vía intraperitoneal con 0,1 ml de heparina para prevenir la coagulación de la sangre. Espere 10 minutos y, a continuación anestesiar a los ratones utilizando la inyección intraperitoneal de 0,01 ml de pentobarbital. Compruebe si el ratón está sintiendodolor por pinzamiento del pie.
- Coloca el ratón sobre una placa de poliestireno con la cabeza hacia arriba y mantenga los brazos con alfileres. El uso de fórceps y duras cortadas tijeras para cortar la piel en la zona torácica superior hasta la garganta.
- Hacer un corte en el centro de la caja torácica justo por encima del diafragma. Cortar el hueso hacia los lados y hacia arriba, hacia la garganta para hacer un triángulo exponer el corazón y los pulmones. Cortar la aorta justo por encima del diafragma.
- Mantenga el timo con unas pinzas sin tirar y usar las tijeras para cortar cualquier tejido conectivo cuidadosamente para eliminar los pulmones y el corazón juntos. Coloque los tejidos en un vaso de precipitados con 1 × Krebs de, agitar con unas pinzas y se transfieren a placa de 6 cm con 1 × Krebs de.
- Retire los lóbulos pulmonares utilizando tijeras y pinzas. Insertar un catéter estéril 20 G en la aorta. Enjuague la sangre en el sistema circulatorio coronario con HBSS / heparina. Hacer un pequeño corte en el ventrículo, agitar el corazón y transferir a un tubo de muestra de M199. Mantenga los tubos en hielo.
- Transferir el corazón a una placa de 6 cm llena con 10 ml de solución de enzima y picar en trozos pequeños con tijeras. Colocar las cápsulas en la incubadora a 37 ° C durante 15 minutos. Agitar materiales digeridos por pipeteando arriba y abajo 30 veces a través de una punta con un extremo cortado para permitir que el tejido pase a través de más fácil.
- Poner de nuevo en la incubadora de 37 ° C durante otros 15 minutos. Repita la agitación tres veces, cada vez utilizando puntas de pipeta de grandes aberturas para más estrecho y 15 minutos de incubación entre cada uno.
- Después de la última incubación de 15 minutos, tomar muestras y en la campana. solución pipetear hacia arriba y hacia abajo 30 veces usando punta de la pipeta con la abertura más estrecha y pasar por un colador de 40 micras de células en un nuevo tubo de 50 ml.
- Lavar el plato con tampón de lavado de 10 ml con una pipeta de 10 ml y transferir a células colador. Poner los tubos de 50 ml en la centrífuga y centrifugado a 400 g durante 10 min a TA.
- Extraer el sobrenadante sin perturbar el sedimento. Lavar las células con tampón de lavado 5 ml dos veces.
- Consigue uno de los previamente preparados tubos de 1,5 ml con los granos y el trabajo sobre un tubo cada vez. Ponga un tubo de 1,5 ml en la placa magnética, agitar 3 veces y abrirlo.
- Después de la última centrífuga, eliminar la mayor cantidad sobrenadante como sea posible sin perturbar el sedimento. Disociar los grupos de células con un movimiento rápido con vigor.
- Añadir tampón de lavado 1 ml al tubo de 50 ml y mezclar las células con una pipeta de 1 ml. Volcado de la solución del tubo de 1,5 ml y se añade 1 ml de la suspensión celular del tubo de 50 ml a las perlas. Flick los tubos 30 veces y luego girar a 4 ºC durante 30 minutos.
9. Preparación de Cultivos Celulares / Imaging
- Preparar cámaras para el recubrimiento de las células. Añadir solución de gelatina (5% w / v, 300 l) a la cámara de bien para cubrir la superficie y se incuba durante 30 min a 37 ºC. Después de la incubación, remove gelatina y seca la superficie.
- Sacar los tubos con perlas / células después de 30 minutos de rotación y poner en el plato magnético en el interior de la campana. Agitar durante 2 min, volcado y añadir tampón de lavado 1 ml.
- Tome tubos fuera de la placa, agitar vigorosamente 30 veces y luego flick 30 veces. Ponerlos de nuevo en placa magnética y agitar durante 1 min. Repetir 4 veces para un total de 5 lavados, pero con 1 min agitando en el plato.
- Después del último lavado, saque un tubo y trabajar en cada uno de los tubos a la vez. Agite 30 veces y luego chasquear 30 veces. Póngalo en la placa magnética y agitar durante 1 min. Volcar y se añade 1 ml de 20% de medio IFCS CE (pre-calentado a 37 ºC).
- Agitar enérgicamente 30 veces y luego flick 30 veces. Ajustar la pipeta de 500 l y pipetear hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Transferir 500 l de cada cámara.
- Ponga a 37 ºC y dejar incubadora O / N. Al día siguiente, lavar las células con medio FBS 10% de la CE.
10. Preparación para la Blot Las muestras Western (WB)
- Take los tubos con perlas / células después de 1 h de rotación. Ponerlos en la placa magnética y agitar durante 2 min. Volcar sobrenadante y añadir 1 ml de HBSS frío. Agitar enérgicamente 30 veces y luego flick 30 veces. Repetir dos veces por 3 lavados, pero con 1 min agitando en el plato.
- Tras el último lavado, poner los tubos en la placa magnética y agitar durante 1 min. Eliminar el tampón usando la pipeta y lisar las células para WB utilizando un método descrito previamente 11,12. lisado recopilada por lo general contiene alrededor de 30 g de proteína.
11. Imaging
- Lavar las células 3 veces con medios de comunicación, con un volumen final de 250 l para una cámara. Añadir 1,5 l de Dil-acLDL a las células. A partir de este punto, mantener las células en la oscuridad.
- Incubar durante 3,5 horas a 37 ° C. Añadir 1,5 l de Hoechst, mezclar bien y se incuba durante 30 min a 37 células ˚C.Wash con PBS y fijar con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a RT.
- Lavar dos veces con PBS y bloquear con 5% BSA-PBS durante 30 min a TA. Lavar dos veces con 1% BSA-PBS. Diluir BS-lectina-FITC usando 1% BSA-PBS a una concentración de 2 mg / ml y añadir 300 l a cada cámara.
- Ponga la cámara en el agitador orbital a temperatura ambiente durante 30 min. Lavar con PBS 3 veces.
- Visualizar las células bajo el microscopio de fluorescencia con el tiempo de exposición de 200 ms para FITC (tinción de lectina, un marcador CE, excitación / emisión 488 nm / 519 nm), 30 ms para DAPI (Hoechst, una tinción, excitación / emisión nuclear a 358 nm / 461 nm), y 300 ms para TRITC (tinción acLDL, un marcador de la CE, excitación / emisión a 557 nm / 576 nm). Adquirir imágenes con una lente objetivo de 20X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El éxito en el aislamiento de las células endoteliales coronarias de un corazón de ratón produce normalmente alrededor de 10 4 células con más del 90% de pureza con una forma de adoquines. Para una población pura de células endoteliales, se debe tener cuidado durante todo el protocolo para asegurar un ambiente estéril libre de cualquier contaminación. La aparición de células alargadas o células ampliadas dentro de la población indica contaminación con otros tipos de células, células de músculo liso y fibroblastos. Ensayo de pureza de las células endoteliales se realiza mediante la tinción de células con un marcador de superficie celular endotelial, BS-lectina y acLDL (Figura 1). El porcentaje de células positivas que presentan ambos colores fue superior al 90% en MCEC. Tal resultado indica que la técnica se realizó con éxito.
| PBS (10x) (1 L) | </ Td> | ||
| Material | MW | Cantidad (g) | |
| NaCl | 58,44 | 80 | |
| KCl | 74.55 | 2 | |
| Na 2 HPO 4 | 141.96 | 6.1 | |
| KH 2 PO 4 | 136.08 | 2 | |
| Krebs (10x) (1 L) | |||
| Material | MW | Conc (mM) | Cantidad (g) |
| NaCl | 58,44 | 118 | 69 |
| KCl | 74.56 | 4.7 | 3.5 |
| CaCl 2 • 2H 2 O | 147 | 1.8 | 2.6 |
| MgSO4 • 7H 2 O | 246,5 | 1.2 | 2.96 </ Td> |
| NaH 2 PO 4 | 120 | 1.2 | 1.44 |
| EC Media (20%) (500 ml) | |||
| Material | Cantidad | ||
| M199 | 444,5 ml | ||
| 10 a 20 U / ml de heparina | 500 l | ||
| D-valina | 25 mg | ||
| IFCS | 100 ml | ||
| EGS | 10 mg | ||
| Penicilina / estreptomicina | 5 ml | ||
| Cantidad de perlas que se utilizará para un ratón | |||
| para imágenes | 5 l | ||
| Fo BM / PCR | 10 l | ||
Tabla 1. Las composiciones químicas de las soluciones utilizadas.
Figura 1. Imágenes representativas de imágenes MCECs. Fluorescencia muestran que ratón ECs coronaria (MCEC) aisladas de corazones exhiben una alta pureza de la población de las CE. La pureza se probó por tanto la absorción de acLDL del color rojo (A) y la tinción de lectina en color verde (B) en MCEC. El núcleo estaba manchada por Hoechst en color azul (C). El porcentaje de células positivas que presentan ambos colores fue superior al 90% en MCEC. Bar es representativa de 20 micras. Por favor, haga clic aquí para conocer el vers más grandesión de esta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Las células endoteliales más ampliamente utilizado en la investigación son células humanas endoteliales de vena umbilical (HUVEC) debido a su comodidad y facilidad de cultivo. Sin embargo, una gran cantidad de investigación requiere la disponibilidad de un modelo fisiológico alcanzado por el aislamiento de células endoteliales de otros órganos específicos 10. Las células endoteliales forman una población muy minoritaria de las células en el tejido del corazón; su aislamiento y el cultivo puede llegar a ser muy difícil.
Hay tres pasos críticos dentro de este protocolo. El primero es limpiar bien la sangre. Esto es necesario, ya que los leucocitos dentro de la sangre también expresan CD31 como un marcador de superficie celular, y competirán contra ECs para la unión del anticuerpo CD31. Como otras células endoteliales también pueden estar presentes en la sangre, el lavado es esencial para prevenir la contaminación por tales células. El segundo paso crítico es mantener un ambiente estéril en todo el proceso de aislamiento. Cualquier contaminación results en una disminución dramática en el número de células alcanzado. Por último, el tercer paso crítico es para ajustar el pH del tampón de CD31, como el no hacerlo disminuirá la eficiencia del aislamiento.
la calidad de la célula es más importante durante este aislamiento. el crecimiento de células del músculo liso puede ser inhibida por la adición de una cantidad apropiada de heparina al medio de cultivo. la proliferación de fibroblastos podría ralentizarse mediante la adición de D-valina a los medios de comunicación. Las células endoteliales se pueden caracterizar por la captación de Dil-AcLDL y co-tinción con BS-lectina con el fin de comprobar la pureza del fenotipo de células endoteliales población.La es inestable y su comportamiento puede cambiar rápidamente una vez sacado del tejido original y cultivadas. Una limitación de la técnica es que las células no se deben usar después de 5 días de cultivo para garantizar que se siguen manteniendo su fenotipo. Se recomienda encarecidamente no para pasar las células. Las células primarias proporcionarán un resu coherentelt.
En general, la técnica resulta en un buen número de células de pureza excepcional. Con las habilidades requeridas, el proceso de aislamiento puede ser completado dentro de 6 horas. Proporciona un gran método para obtener células endoteliales coronarias ratón, ya sea para el cultivo de células o el experimento de biología molecular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la subvención de los Institutos Nacionales de Salud (HL115578 de A. Makino).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| DynaBeads pan mouse IgG beads | Thermo Fisher Scientific | 11035 | |
| Rat anti-mouse CD31 Antibody | BD Biosciences | 550274 | |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | I3021-50 ml | |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | Corning | 356006 | |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-CI |
References
- Michiels, C. Endothelial cell functions. J Cell Physiol. 196, 430-443 (2003).
- Sumpio, B. E., Riley, J. T., Dardik, A. Cells in focus: endothelial cell. Int J Biochem Cell Biol. 34, 1508-1512 (2002).
- Cines, D. B., et al. Endothelial cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders. Blood. 91, 3527-3561 (1998).
- Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115, 1285-1295 (2007).
- Jin, Y., Liu, Y., Antonyak, M., Peng, X. Isolation and characterization of vascular endothelial cells from murine heart and lung. Methods Mol Biol. 843, 147-154 (2012).
- Makino, A., Platoshyn, O., Suarez, J., Yuan, J. X., Dillmann, W. H. Downregulation of connexin40 is associated with coronary endothelial cell dysfunction in streptozotocin-induced diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C221-C230 (2008).
- Marelli-Berg, F. M., Peek, E., Lidington, E. A., Stauss, H. J., Lechler, R. I. Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods. 244, 205-215 (2000).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat Protoc. 3, 1085-1091 (2008).
- Nolan, D. J., et al. Molecular signatures of tissue-specific microvascular endothelial cell heterogeneity in organ maintenance and regeneration. Dev Cell. 26, 204-219 (2013).
- Sobczak, M., Dargatz, J., Chrzanowska-Wodnicka, M. Isolation and culture of pulmonary endothelial cells from neonatal mice. J Vis Exp. , (2010).
- Makino, A., Dai, A., Han, Y., Youssef, K. D., Wang, W., Donthamsetty, R., Scott, B. T., Wang, H., Dillmann, W. H. O-GlcNAcase overexpression reverses coronary endothelial cell dysfunction in type 1 diabetic mice. Am J Physiol Cell Physiol. 309, C593-C599 (2015).
- Sasaki, K., Donthamsetty, R., Heldak, M., Cho, Y., Scott, B. T., Makino, A. VDAC: old protein with new roles in diabetes. Am J Physiol Cell Physiol. 303, C1055-C1060 (2012).
