Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)

Published: May 10, 2016 doi: 10.3791/53987
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological System Research (BSR), Philip Morris International R&D

Abstract

עשן סיגריות (CS) הוא גורם סיכון עיקרי למחלות לב וכלי דם וסרטן הריאות. בגלל CS הוא תרסיס מורכב המכיל יותר מ -7,000 כימיקלים 1 זה אתגר להעריך את התרומה של מרכיבים בודדים לרעילות הכוללת שלה. פרופילים טוקסיקולוגי של מרכיבים בודדים, כמו גם תערובות ניתן לקבוע זאת במבחנה, על ידי החלת גבוהה דרך-לשים כלי האיתור, המאפשרים יצירת פרופיל של מרכיבים מזיקים מזיקים (HPHCs) של עשן טבק, כפי שהוגדר על ידי המזון והתרופות מנהל (FDA). 2

לקבלת הערכה ראשונית, מכשיר עכבה המבוססת שמש הערכה בזמן אמת, ללא תווית של הרעילות המתחמת. על צג המכשיר מסתמך על הידבקות תא, כדאיות ומורפולוגיה שכל יחד לספק סקירה של מצב התא. פרמטר מימדים, בשם מדד תא, משמש כימות. סט של DIFפרוטוקולים מכתים ferent פותחה עבור חקירה מבוסס דימות פלואורסצנטי ופלטפורמה HCS שימש כדי לקבל מידע מעמיק יותר על סוג של רעילות שהושרו על-ידי כל HPHC.

של 15 המרכיבים שנבדקו, רק חמישה נבחרו לניתוח מבוססי HCS כפי שהם רשמו LD חשיב 50 (<20 מ"מ). אלה כללו 1-aminonaphtalene, ארסן (V), כרום (VI), Crotonaldehyde ו פנול. בהתבסס על והשפעתם HCS, 1-aminonaphtalene ו פנול ניתן היה לזהות לגרום תפקוד המיטוכונדריה, ויחד עם כרום (VI) כמו genotoxic מבוסס על זירחון H2AX היסטון מוגברת. Crotonaldehyde זוהה כקובץ inducer סטרס חמצוני ארסן בתור מפעיל מסלול קינאז מתח.

מחקר זה מוכיח כי שילוב של טכנולוגיות HCS מבוססי עכבה מספק כלי חזק להערכה במבחנה של מרכיבי CS.

Introduction

הערכת סיכוני טוקסיקולוגי הסתמכה הסטורית על השימוש במודלים של בעלי חיים אשר, אם כי יסוד בתחום מדעי החיים, מקושר גם עם מכשולים כגון translatability העקבי לבני אדם עלות גבוהה. יתר על כן, חל במאמץ להגדיל למצוא חלופות לניסויים בבעלי חיים ברוח של "3Rs" 2 (תחליף, הפחתה, ועידון). מאמץ זה הואץ במהלך השנים האחרונות, לא רק הודות לפיתוחים חדשים כגון טכניקות תפוקה גבוהה וגישות ביולוגיה של מערכות, אלא גם בגלל החקיקה להגביל את השימוש של ניסויים בבעלי חיים, במיוחד באיחוד האירופי.

המורכבות של מסלולים הסלולר איתות הסדרה בתגובת עלבונות רעילים עושות את זה ברור כי באמצעות נקודות קצה טוקסיקולוגית יחידות לא יספיק כדי לתאר את הבסיס טוקסיקולוגית של תרכובות מסוימות. לשם כך, את יחסי הגומלין של מאות אינטראקציה proteins תורם לרשת ביולוגית גם צריך להילקח בחשבון. כדי לחקור את ההשפעה של toxicants ברשתות אלה, גישת טוקסיקולוגיה מערכת בשילוב עם גוף בינוני פנוטיפי מבחני תפוקה גבוהה הקרנה כדאי להסיק חוזקים ובאותו הזמן לספק מידע נוסף על מנגנון הפעולה של toxicants פרט.

במחקר זה, אנחנו עובדים HCS ככלי מיון עצמה, אשר מורכב של מיקרוסקופ אוטומטית יישום תוכנה ביולוגי, שיכול לרכוש, לעבד ולנתח נתוני תמונה נגזרו מבחני הסלולר קרינה מבוססת ספציפיים. זה מאפשר שינויים חזותיים בתוך תא שיש לכמת, בכל תא בודד או ברמת subcellular, ופרמטרים רבים להיות מנותח בו זמנית. 3 לדוגמה, הדנ"א הכפול גדיל הפסקות הוערכו באמצעות זיהוי מבוסס נוגדן של זירחון H2AX היסטון ו (reactive oxygen species ROS) היה לכמת באמצעות א-פרם תאלצבוע eable דיסמוטאז רגיש.

מכיוון שתאי האפיתל ריאות לייצג את המחסום הביולוגי הראשון נגד toxicants בשאיפה, כוללים עשן סיגריות, השתמשנו תאי אפיתל סימפונות עיקריים כמודל במבחנה לפרופיל השפעת HPHCs שפורסם על ידי מנהל המזון והתרופות בארצות הברית. 4 כתב יד זה הוא המשך -up על מחקר קודם 5 שבו הערכנו את ההשפעה הביולוגית של קבוצת משנה שונה של HPHCs.

במסגרת העבודה שלנו להעריך cytotoxicity במבחנה, בתחילה החוקרים העריכו את החוזקים של מבחר של 15 HPHC של, באמצעות ניתוח הסלולר עכבה מבוססת בזמן אמת (RTCA) מערכת אשר אפשרה לנו להקים מנה-טווחים, מתאימים עוקבת HCS ניתוח (איור 1). הערכה HCS טוקסיקולוגית נערך מכן באמצעות תשע נקודות קצה רב-פרמטרית של רעילות הסלולר, כל פיקוח בשתי נקודות זמן (4 ו -24 שעות). סמני השתמשו היו מעיד על רעילות המיטוכונדריה, נזק לדנ"א, קינאז מתח, (reactive oxygen species ROS), גלוטתיון (GSH) תוכן, caspase 3 - פעילות 7, שחרור C ציטוכרום וחדירות קרום התא, כמתואר בטבלה 1.

הגישה המופעלת שלנו זיהוי ואפיון של השפעת המרכיבים עשן סיגריות דרך דגימת dose- וזמן תלוי. בסופו של דבר, זה מיוצר פרופיל במבחנה טוקסיקולוגית לכל HPHC. גישות רב-omics יכול לשמש גם כדי להשלים את ניתוח HCS נוספת. זה היה סוף סוף גם לספק הבנה עמוקה יותר של תופעות על איתות התאים ו / או רמת תעתיק.

Protocol

1. תאי אפיתל סימפונות קציר רגילת אדם (NHBEs)

  1. טרום לחמם את תרבית תאים בינוניים (צמיחת תאים אפיתל הסימפונות-השלימו בינוני בינוני), את HEPES, טריפסין, והפתרון מנטרל טריפסין (TNS) באמבט מים ב 37 ° C.
  2. קציר התאים כאשר 80% של מפגש הוא הגיע.
    הערה: תרבית תאי NHBE הבאה זריעת תנאים ניתן להשתמש כדי להשיג מפגש אופטימלי ב T75 צלוחיות ציפוי עם 20 מיליליטר בינוני:
    1. זרעים 1 x 10 6 תאים לתרבות 3 ימים, 0.5 x 10 6 תאים לתרבות 4 ימים ו 0.25 x 10 6 תאים לתרבות 5 ימים. שנה בינונית כל 2 ימים כאשר תאים נמצאים בתרבות לרענן חומרים מזינים. התרבות תאים על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  3. הסר את supernatant מהבקבוק (ים) ולהוסיף HEPES כדי לשטוף את התאים (למשל., 3 מ"ל בבקבוק 2 75 ס"מ). סובב כל בקבוק כדי לכסות את monolayer תא עם סול HEPESution.
  4. הסר את הפתרון HEPES ולהוסיף פתרון טריפסין (למשל., 3 מ"ל בבקבוק 2 75 ס"מ). סובב את הבקבוק כדי לכסות את monolayer תא עם פתרון טריפסין.
  5. דגירה את הבקבוק למשך 5 דקות ב 37 ± 2 ° C. צג ניתוק תא מתחת למיקרוסקופ במידת צורך, דגירה ארוכה לטפוח בעדינות את הבקבוק כדי לשחרר את כל תאים מצורפים נותרים.
  6. להוסיף TNS כדי לעצור את התגובה (למשל., 3 מ"ל בבקבוק 2 75 ס"מ) ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל.
  7. צנטריפוגה השעית התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
  8. בטל supernatant מחדש להשעות את התא גלולה ב 10 מ"ל של מדיום חדש, ערבוב בעדינות להניב ההשעיה תא הומוגנית.
  9. סנן את השעית התא דרך מסננת תא 100 מיקרומטר להסיר אגרגטים לספור את התאים. הערה: במעבדה שלנו מערכת ספירת תאים חשמלי בשדה רב ערוצית שמשה בדיוק ובעקביות להעריך את viablמספר תאי דואר.

2. Analyzer הנייד בזמן אמת (RTCA) מבוסס מציאת טווח מינון (DRF)

הערה: מערכת מדידה מבוססי עכבה שימש: 1) להעריך רעילות מתחם, 2) תרכובות בחר להיחקר עוד יותר על ידי HCS ו -3) לבחור מינונים מתאימים עבור HCS. התאים NHBE בלוחות RCTA הם במינון ידי הוספת 25 μl של דילולים מתחם הבדיקה עד 100 הנוכחי בינוני μl היטב כל אחד. לכן, כל פתרונות בדיקה מוכנים בשעה 5 פעמים (5x) לריכוז הסופי הרצוי.

  1. תאי NHBE מתזמנים
    1. לתכנת את המכשיר כדי להגדיר את המספר ומשך מדידות עכבה. במחקר זה, נתונים נרשמו כל 15 דקות במשך 48 שעות (מ -24 שעות ± 2 שעות לפני ו -24 שעות לאחר מינון את התאים עם סוכני בדיקה).
    2. מדוד את הרקע צלחת ידי pipetting 50 μl של המדיום מראש חימם לבאר כל צלחת 96-היטב RTCA. הערה: שלב זה מייצג דרישה טכניתעבור המכשיר לחשב את ההתנגדות החשמלית בינוני אשר משמש כנקודת התייחסות הבסיס לחישוב מבוססי תאים.
    3. כן השעית תא בריכוז של 144,000 תאים / מיליליטר (± 5%) ולהוסיף 50 השעית תא μl (7,200 תאים / טוב) היטב בכל צלחת RTCA שבו 50 μl / היטב בינוני נוספו כבר רקע מכשיר מדידה.
    4. בואו התאים לדבוק במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר לפני הצבת לתוך תושבת RTCA (כדי לשפר את ההתפלגות הומוגנית של התאים). דגירה צלחות RTCA בעריסה RTCA בחממה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) ולהתחיל להקליט את הנתונים עבור hr 24 ± 2 הבא לפני המינון.
  2. דילולים של HPHCs ובקרות חיוביות
    1. חיובי בקרת דילול
      1. לדלל את הפתרון המניות Staurosporine (10 מ"מ) 1:10 DMSO (ראה טבלה 3) ולהוסיף 5 μl של דilution 195 μl של המדיום כדי להשיג פתרון עובד 5x.
    2. דילול HPHC
      1. ממיסים / לדלל כל HPHC ברכב (לוח 2) כדי ליצור פתרון המניות 1 M. לדלל כל פתרון המניות HPHC 1:10 ב בינוני לייצר פתרון 100 מ"מ.
      2. צור את "צלחת אב למתחם" על ידי ביצוע דילול סדרתי חמישה שלבים 01:10 באמצעות המדיום + 10% הרכב כדי להשיג את פתרונות עובד 5x (איור 2). הערה: בסופו של דבר, את המינון הסופי יהיה: 0.2 מיקרומטר, 2 מיקרומטר, 20 מיקרומטר, 0.2 מ"מ, 2 מ"מ, 20 מ"מ. כמו כן להכין את המנה 0, המתאימים לרכב בלבד, בשלב זה.
    3. מינון
      1. השהה מכשיר RTCA ולפתוח הערש להסיר את הצלחת.
      2. הסר את הצלחת ומניח אותו בכלי טמפרטורת צלחת RTCA (שנועד לייצב את הטמפרטורה של צלחת RTCA במהלך פרוצדורות מחוץ RTCAתחנה), כדי למנוע קירור התאים, אשר יכול להשפיע על מדידת העכבה.
      3. הוסף 25 μl 5x פתרון מן "צלחת אב למתחם" לתאים בשלושה עותקים שמירה באותו סדר מינון כמו צלחת אב מתחם (המינון הגבוה ביותר בבקרה בשורה ורכב העליון בשורה מספר 7) (איור 2). אל תסיר את תרבית תאים בינוניים הקיימים (100 μl).
      4. הוסף 25 μl 5x פתרון בקרה חיובית על התאים בשורה התחתונה (חצי צודק) מבלי להסיר בינוני התרבות הקיימת. הוסף 25 μl בינוני אל התאים בשורה התחתונה (חצי שמאל) מבלי להסיר בינוני תרבית תאים קיימים.
      5. חותם את הצלחת עם אוטם צלחת. מניחים את הצלחת בחזרה בעריסה RTCA ונעל אותו. נתונים מחדש הקלטה בפעם החשיפה הרצויה (למשל., 24 שעות). הערה: השימוש בסרט איטום זה מומלץ כדי למנוע זיהום פוטנציאלי, כולל גם ל-גם זיהום צולב.
    4. <חישוב strong> RTCA ניתוח נתונים ו- LD 50
      1. נתוני יצוא גלם כטקסט (.txt) או Excel (.xls) קובץ. הערה: הקובץ יכיל את כל המידע לגבי פריסת הצלחת (תרכובות, מינונים ומצבה טובה). ערכי מדד תא גלם מאורגנים בתבנית 96 באר (הפצת גם צלחת שיקוף) ו מסופקים בכל נקודות זמן שבו ההקלטה התרחשה. הערך במיקום i ב 96 את הצלחת היטב בזמן t הוא כונה על ידי CI t (i).
      2. זהה כמו נורמליזציה התייחסות לנקודת זמן מסוימת האחרונה לפני המינון לכל תפקיד i ב 96 את הצלחת היטב (למשל, תא מדד 23 שעות 50 דקות 00 שניות במיקום i, CI t (i) = 23: 50: 00 = CI Ref (i)). הערה: מידע זה חייב להיות מבואר כאשר המינון מבוצע.
      3. פרד, על בסיס טוב, כל ערכי נקודת זמן על ידי התייחסות הנורמליזציה לנרמל את כל הערכים בזמן המינון. הערך המנורמל ב positioni ב 96 את הצלחת היטב בזמן t הוא כונה על ידי NCI t (i) ובכך מוגדר על ידי NCI t (i) = CI t (i) / CI Ref (i) עבור כל t.
      4. ולחשב את השטח מתחת לעקומה (AUC) ב 24 שעות שלאחר מינון עבור כל דגימה i (מיקום i ב 96 את הצלחת היטב), כולל משרות לבקרת הרכב חיוביות.
        1. השג את AUC במיקום אני מתקבל מסיכום בתחומי כל מלבן, כל מלבן להיות בין שני timepoints כונה על ידי k T ו- T l (t k <t l); לחשב כל אזור מלבן באמצעות y * x עם x = t L - t k להיות המרחק בין שני timepoints ו- y להיות הממוצע של הפעילות של שני timepoints (y = (tk NCI (i) + NCI TL (i)) / 2).
          הערה: AUC ב 24 שעות שלאחר מינון עבור העמדה שאני הוא כונה על ידי AUC (i). כמו כל התנאים הם מצופה בבארות בשלושה עותקים החציון של שלושת הערכים משמש.
        5. <li> לנרמל את הערכים באמצעות המשוואה הבאה:
        משוואה 1
        איפה אני הוא המיקום 96 את הצלחת היטב עבורו AUC חושבה לפי 24 שעות שלאחר המינון,
        רכב הוא החציון של ערכי AUC עבור בארות הרכב על צלחת ב 24 hr-מינון פוסט,
        בקרה חיובית היא החציון של ערכי AUC עבור בארות שליטה החיוביות על צלחת ב 24 hr-מינון פוסט,
        CR הוא הערך המנורמל החציוני הרצוי עבור הרכב (0%), ו
        SC הוא הערך המנורמל החציוני הרצוי עבור הבקרות החיוביות (100%)
        הערה: בסוף שלב זה, ערכת נתונים מתקבלת המכילה עבור כל עמדת i בצלחת 96 באר, ריכוז CI (ביחידות לוגריתמים) כי מוחלת על המדגם כלול עמדה / גם אני ו המתאימה לו AUC מנורמל ב 24 שעות שלאחר מינון AUC_normalized (i).
      5. עלילה מתאימה (c i, AUC_normalized (i)) -values ​​באמצעות משוואת היל 4 פרמטרים. במידת האפשר, גם לחשב LD 50.
        משוואה 2
        היכן Y = AUC_normalized,
        אפס פעילות S 0 = רמת פעילות באפס ריכוז של הבדיקה במתחם,
        פעילות S Infinite INF = פעילות ברמה בריכוז אינסופי,
        AC50 = ריכוז שבו פעילות יגיע ל -50% של לרמה המקסימלית,
        היל מקדם n = מדוד של המדרון AC50, ו
        ריכוז c = ביחידות לוגריתמי תואמות לערכיות על ציר x של העלילה העקומה מנת התגובה.
        הערה: AC50 תואמת LD 50 (מבחני רעילות). זוהי מידה של עוצמה שבה ערכים נמוכים מצביעים על עוצמה גבוהה.

3. מדידת טוקסיקולוגי אפקטים ידי HCS

הערה: סך של תשעה סמנים רבים פרמטרית של רעילות, מקובצים בשישה מבחנים שונים, נמדדת באמצעות פלטפורמת HCS (טבלת 1). בהתבסס על ניתוח כדאיות התא RTCA (סעיף 2) טווח המינון של כל המרכיבים מוגדר ו מנה התייחסות 3R4F גם כלול. מינון ההתייחסות שווה לסכום של הווה HPHC בעשן מקל אחד מן 3R4F סיגרית התייחסות.

  1. תאי NHBE מתזמנים
    1. כן השעית תא ב 120,000 תאים / מיליליטר (± 5%) ולהוסיף 100 השעית תא μl היטב בכל צלחת HCS 96-היטב (12,000 תאים / טוב). הכינו מספיק צלחות להערכת כל מבחני (Cytotoxicity, נזק לדנ"א, קינאז מתח, ROS, התוכן GSH אפופטוזיס) ו timepoints (4 ו -24 שעות).
    2. השאירו את הצלחות HCS בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי לאפשר לתאים לצרף בארות ולאחר מכן לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 ± 2 שעות לפני המינון.
  2. דילול של HCHPs ובקרות חיוביות
    הערה: התאים NHBE בלוחות HCS יהיה במינון ידי הוספת 25 μl של פתרונות מדגם הבדיקה עד 100 μl של המדיום כבר כיום בכל טוב. לכן, בכל המינונים ערוכים ב 5x לריכוז הסופי הרצוי.
    1. דילול בקרות חיובי (בקרה החיובית פלייט)
      1. לוותר 40 μl של פתרון מניות של כל בקרה חיובית (ראה טבלה 3) בטור # 2 (איור 4 א, ​​הבארות מוצלות באדום). לוותר 20 μl של הרכב בעמודות 3 # ו # 5 (איור 4 א, ​​בארות צבועות בכחול בהיר) ו -40 μl של הרכב בטור # 4 (איור 4 א, ​​בארות צבועות בכחול בהיר).
      2. משיכת 12 μl מבאר בטור # 2, ומוציא אותו אל הבארות בטור # 3 ומערבבים (איור 4 ב), להמשיך עד דילול סדרה סופי עם 3 מנות (D1, D2 ו- D3) והרכב (V) עבור כל מתחם בקרה חיובי מתקבל (איור 4C). כדי ליצור את צלחת בקרה חיובית, להכין 01:40 דילול של תרכובות בתקשורת (איור 4D).
    2. דילול HPHC (פלייט מאסטר המתחם)
      הערה: טווחי המינון הנבחרים HPHCs עבור HCS מפורטים בטבלה 2.
      1. לדלל כל פתרון המניות HPHC (1 M) 1:10 ב בינוני ריכוז של 100 מ"מ. בצע דילולים באמצעות מדיום עם הרכב של 10% לקבל את המינון 5x שנבחר עבור כל HPHC.
  3. מינון
    1. הוסף 25 μl של פתרונות 5x מהצלחת אמן במתחם אל התאים בשלושה עותקים שמירה באותו סדר מינון כמו צלחת אב מתחם (המינון הגבוה ביותר בבקרה בשורה ורכב העליון בשורה מספר 7) (איור 5). אל תסיר את הדוארxisting (100 μl) תרבית תאים בינוניים.
    2. הוסף 25 μl של פתרון 5x מהצלחת הבקרה החיובית אל התאים בשורה התחתונה שמירה באותו סדר המינון כמו צלחת בקרה החיובית (איור 5). אל תסיר את תרבית תאים בינוניים הקיימים (100 μl). הערה: assay לכל אחד יש שליטה חיובית ספציפית; לוח לראות 3. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 בפעם החשיפה הרצויה (4 או 24 שעות).
  4. הַכתָמָה
    1. הכנה לכל המבחנים
      1. טרום לחמם את החיץ לשטוף (PBS) פתרונות על 37 מעלות צלזיוס.
      2. הכן את הפתרון קיבוע (בתמיסת פורמלדהיד 4%) הוספת 10.81 מ"ל של 37% פורמלדהיד 89.19 מ"ל של חיץ לשטוף וזה טרום חמים על 37 מעלות צלזיוס.
      3. הכן את החיץ Permeabilization על ידי הוספת 10 מ"ל של 10x חיץ permeabilization 90 מ"ל של חיץ לשטוף וזה טרום חמים על 37 מעלות צלזיוס.
      4. הכן את Bloחיץ cking על ידי הוספת 10 מ"ל של 10x חסימת חיץ 90 מ"ל של חיץ לשטוף וזה טרום חמים על 37 מעלות צלזיוס.
      5. טרום לחמם את תרבית תאים בינוניים על 37 מעלות צלזיוס.
      6. הסר את צלחות HCS מן החממה לאחר זמני חשיפת hr 4 ו -24 הם הגיעו ולבצע הפרוטוקולים הספציפיים הבאים עבור כל assay.
    2. Assay cytotoxicity
      1. הכן נפח מספיק (V) של פתרון מכתים תא חי על פי הנוסחה הבאה: נפח בינוני (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות)
      2. לדלל את הצבע במיטוכונדריה של הפתרון המכתים תא חי על פי ההוראה של הספק. לדלל את צבע חדירות ממברנה בפתרון מכתים תא חי על פי הוראה של הספק.
      3. הוסף 50 μl חי Cell פתרון מכתים היטב בכל צלחת (ים) המיועד "assay Cytotoxicity". אין להסיר תאים בינוני תרבות דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO
      4. בעדינות לשאוב את הפתרון בינוני מכתים ולהוסיף 100 μl / טוב של פתרון קיבעון היטב כל, ואז דגירה צלחת (ים) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      5. לשאוב בעדינות פתרון קיבעון ולשטוף פעם עם 100 μl / טוב לשטוף חיץ.
      6. הסר חוצץ לשטוף ולהוסיף 100 μl / היטב חיץ permeabilization 1x היטב כל דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      7. לשאוב חיץ permeabilization צלחת לשטוף פעמיים עם 100 μl / היטב חיץ לשטוף.
      8. לשאוב לשטוף חיץ ולהוסיף 100 μl של חיץ חסימת 1x היטב כל דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      9. הכן נפח מספיק (V) של פתרון נוגדן ראשוני על פי הנוסחה הבאה: כרך של חסימת חיץ (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות). לדלל את הנוגדן C אנטי ציטוכרום (עכבר) 1: 250 פתרון נוגדן ראשוני.
      10. לשאוב חיץ חסימהd להוסיף 50 μl / גם פתרון נוגדן ראשוני לכל היטב דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      11. כן נפח מספיק (V) של נוגדנים משני פתרון גרעיני פי הנוסחא הבאה: כרך של חסימת חיץ (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות). לדלל את הנוגדן אנטי עכבר 1: 500 ב נוגדנים משני פתרון גרעיני. לדלל את צבע גרעיני 1: 1,000 ב נוגדנים משני פתרון גרעיני.
      12. לשאוב ראשי פתרון נוגדן לשטוף צלחת שלוש פעמים עם 100 μl / היטב חיץ לשטוף באמצעות מכונת כביסה צלחת.
      13. לשאוב לשטוף חיץ ולהוסיף 50 μl / טוב של נוגדנים משני פתרון גרעיני היטב בכל צלחת (ים) ו דגירה במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      14. לשאוב נוגדנים משני פתרון גרעיני לשטוף צלחת שלוש פעמים עם 100 μl / היטב חיץ לשטוף באמצעות מכונת כביסת הצלחת. הוספת 100 μl / היטב חיץ לשטוף. פלייט (ים) הוא (הם) החברהמוכן להיבדק על הקורא HCS.
    3. Assay נזק לדנ"א
      1. בעדינות לשאוב את המדיום מהצלחות המיועד "נזק לדנ"א".
      2. בצע אותם שלבים כמתואר ברצף: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. יש לשים לב כי במקרה זה, רק בינוני יוסר במהלך שלב 3.4.2.4.
      3. הכן נפח מספיק (V) של פתרון נוגדן ראשוני על פי הנוסחה הבאה: כרך של חסימת חיץ (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות)
      4. לדלל את הנוגדן H2AX אנטי phospho (עכבר) 1: 2,000 פתרון נוגדן ראשוני.
      5. בצע את הצעד אותו כמתואר 3.4.2.10.
      6. כן נפח מספיק (V) של נוגדנים משני גרעיני פתרון על פי הנוסחא הבאה: כרך של חסימת חיץ (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות)
      7. לדלל את הנוגדן אנטי עכבר 1: 500 ב נוגדנים משני פתרון גרעיני.
      8. לדלל את Nuclear לצבוע 1: 1,000 ב נוגדנים משני פתרון גרעיני.
      9. בצע אותם שלבים כמתואר ברצף: 3.4.2.12-3.4.2.14.
    4. מתח Assay קינאז
      1. בעדינות לשאוב את המדיום מכל אחד הלוחות המיועדים "קינאז מתח".
      2. בצע אותם שלבים כמתואר ברצף: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. יש לשים לב כי במקרה זה, רק בינוני יוסר במהלך שלב 3.4.2.4.
      3. הכן נפח מספיק (V) של פתרון נוגדן ראשוני על פי הנוסחה הבאה: כרך של חסימת חיץ (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות)
      4. לדלל את הנוגדן cJun אנטי phospho (ארנב) 1: 200 פתרון נוגדן ראשוני.
      5. בצע את הצעד אותו כמתואר 3.4.2.10.
      6. כן נפח מספיק (V) של נוגדנים משני גרעיני פתרון על פי הנוסחא הבאה: כרך של חסימת חיץ (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות)
      7. לדלל את הנוגדן נגד ארנב 1: 500 ב נוגדנים משני פתרון גרעיני.
      8. לדלל את צבע גרעיני 1: 1,000 ב נוגדנים משני פתרון גרעיני.
      9. בצע אותם שלבים כמתואר ברצף: 3.4.2.12-3.4.2.14.
    5. Assay ROS
      1. הכן נפח מספיק (V) של פתרון מכתים תא חי על פי הנוסחה הבאה: נפח בינוני (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות).
      2. לדלל את צבע ROS ב תא חי פתרון מכתים פי הוראת ספק
      3. לדלל את צבע גרעיני 1: 1,000 ב תא חי Solution.3.4.5.4 מכתים) הוסף 50 μl פתרון חי Cell מכתים לכל צלחות היטב המיועד "ROS"; אין להסיר תאי תקשורת בתרבות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר בחושך.
      4. בעדינות לשאוב את הפתרון בינוני מכתים ולשטוף צלחת שלוש פעמים עם 100 μl / טוב בינוני.
      5. לשאוב בינונית, מוסיפים 100 _6; l / גם פתרון קיבעון היטב כל דגירה צלחת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      6. לשאוב בעדינות פתרון קיבעון לשטוף צלחת שלוש פעמים עם 100 μl / טוב לשטוף חיץ.
      7. הוספת 100 μl / טוב לשטוף חיץ. פלייט (ים) הוא (הם) מוכן כעת.
      8. להעריך את הצלחת על הקורא HCS בתוך שעה 1.
    6. Assay תוכן GSH
      1. הכן נפח מספיק (V) של פתרון מכתים גרעיני תא חי על פי הנוסחה הבאה: נפח בינוני (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות).
      2. לדלל את הצבע הגרעיני (אדום רחוק) 1: 1,000 ב התא חי הגרעיני מכתים Solution.3.4.6.3). הוסף 50 μl של פתרון המכתים גרעיני תא חי היטב בכל הלוחות המיועדים "תוכן GSH". אין להסיר תאי תקשורת בתרבות דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
      3. כן נפח מספיק (V) של הפתרון המכתים GSH תא חי על פיבעקבות הנוסחה: כרך של HBSS (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות)
      4. לדלל את צבע GSH ב תא חי פתרון GSH מכתים פי הוראות של הספק.
      5. בעדינות לשאוב את המדיום ואת פתרון מכתים הגרעין ולשטוף צלחת שלוש פעמים עם 100 μl / טוב בינוני.
      6. לשאוב בינוני ומוסיפים 100 μl / טוב של תא חי פתרון מכתים GSH היטב בכל צלחת (ים).
      7. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. פלייט (ים) הוא (הם) מוכן כעת.
      8. הערכת צלחת (ים) על מקראת HCS בתוך השעה 1.
    7. Assay אפופטוזיס
      1. הכן נפח מספיק (V) של פתרון מכתים תא חי על פי הנוסחה הבאה: נפח בינוני (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות).
      2. לדלל את צבע caspase 1: 300 ב תא חי פתרון מכתים.
      3. סר מדיה תרבית תאים, להוסיף 50 μl חי Cell מכתים פתרון היטב כל tהוא צלחת (ים) מיועד "אפופטוזיס" דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
      4. הכן נפח מספיק (V) של פתרון מכתים גרעיני תא חי על פי הנוסחה הבאה: כרך של פתרון תקן (μl) V = 50 x W x 1.2 (מספר W בארות).
      5. לדלל את צבע גרעיני 1: 1,000 ב תא חי פתרון מכתים גרעיני.
      6. הסר את הפתרון מכתים תא חי, להוסיף 100 μl / טוב של תא חי פתרון מכתים גרעיני היטב בכל צלחת (ים) ו דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.
      7. לשאוב מקבע / פתרון צבע גרעיני ולשטוף צלחת (ים) שלוש פעמים עם 100 μl / טוב לשטוף חיץ.
      8. הוספת 100 μl / טוב לשטוף חיץ. פלייט (ים) הוא (הם) מוכן כעת.
      9. הערכת הצלחת (ים) על הקורא HCS.
  5. HCS ניתוח נתונים
    1. נתוני יצוא גלם כמו Excel (.xls) קובץ. הערה: ערכי מדד תא גלם מאורגנים בצורה היטב 96ב (הפצה גם צלחת שיקוף) ו מסופקים כל נקודות קצה בעמדת מינון בנקודת זמן נתונה.
    2. לנרמל את הערכים באמצעות המשוואה הבאה:
      משוואה 3
      כאשר i הוא ערך אות הגלם הנמדד של באר,
      רכב הוא החציון של ערכי האות הנמדד עבור בארות הרכב על צלחת,
      CR הוא הערך המנורמל החציוני הרצוי עבור הרכב (0%), ו
      SC הוא הערך המנורמל החציוני הרצוי עבור הבקרות החיוביות (100),
      הערה: בסוף שלב זה, ערכת נתונים מתקבלת המכילה עבור כל עמדה i ב ​​96 את הצלחת היטב, ג ריכוז i (ביחידות לוגריתמים) כי היה מוחלת על המדגם כלול עמדה / גם אני ו שלה מקביל N אות המנורמל (i).
    3. העלילה מתאים (c i, N (i)) - ערכים באמצעות משוואה 4 פרמטרים היל.
      משוואה 4
      שם רמת S 0 = פעילות אפס אפס ריכוז של מתחם בדיקה,
      פעילות S Infinite INF = פעילות ברמה בריכוז אינסופי,
      AC50 = ריכוז שבו פעילות יגיע ל -50% של לרמה המקסימלית,
      היל מקדם n = מדוד של המדרון AC50, ו
      ריכוז c = ביחידות לוגריתמי תואמות לערכיות על ציר x של העלילה העקומה מנת התגובה.
      הערה: AC50 הוא מדד העוצמה שבה ערכים נמוכים מצביעים על עוצמה גבוהה.

Representative Results

RTCA

מאחר נקודות קצה HCS לא יהיה אינפורמטיבי כשאף מזוהה השפעה רעילה, תרכובות אלה לא מראה ירידה עד כדאיות התא לריכוז הגבוה ביותר RCTA אינם נבדקים על ידי HCS (איור 3 ב, ג, ד, ז, K, L, מ ' , עמ '). מראה תרכובות ירד כדאיות התא בלבד הריכוז הגבוה ביותר (איור 3E, טו) הם לא נבחרה גם עבור HCS. לבסוף, רק מרכיבי עם LD חשיב 50 (<20 מ"מ) נבחרו לניתוח HCS נוסף (איור 3 א, F, H, J, n). HPHCs בעמידה בקריטריונים הנ"ל הם: 1-aminonaphtalene, ארסן (V), כרום (VI), Crotonaldehyde ו פנול.

HCS

כבדיקת איכות (QC), בקרות חיוביות הם fiראשון נותח כדי להבטיח כי הליך מכתים מבוצע כהלכה. תמונות נציג של תאים מלאים שטופל חיובים מוצגות באיור 6. ערכי נתונים הם מנורמלים רכב כפי שתואר לעיל. לא עקום מנת תגובה הם זממו כמו רק שלוש מנות נבדקות ולא כל שלוש המנות נחשבות בכל נקודת זמן. מינוני בקרה חיוביים נבחרים (מבוסס על ניסויים קודמים, מידע לא מוצג), כך תגובות מתאימות הם נצפו עבור כל נקודת קצה בשניית hr 4 ו -24 שעות. במינונים בפרט 1 ו -2 משמשים כדי להעריך את ההשפעה על 4 שעות ואילו מינונים 2 ו -3 משמשים כדי להעריך את ההשפעה על 24 שעות. צלחות מבוטלות אם אין תגובה הוא ציינה עבור מינוני בקרה החיוביים. שים לב שעבור כל נקודות הקצה, למעט פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה ותוכן GSH, גידול של עוצמת האות צפויה.

כל התרכובות, למעט פנול, מושרה pheno נימקים סוג, מבוסס על חדירות קרום התא גדל (איור 7 א, ו, ח, יב). 1-aminonaphtalene, כרום (VI), Crotonaldehyde ו פנול היו שתזוהה genotoxic מבוסס על זירחון מוגבר של H2AX היסטון (איור 7E, j, n, p). פנול 1-aminonaphtalene נמצאו להשרות תפקוד המיטוכונדריה חמור (7b איור, טו) אשר, עם 1-aminonaphtalene, הוביל לשחרור C ציטוכרום מוגבר (7c איור). איתור פעילות caspase 3/7 עלה ספק ראיות אירוע אפופטוטיים בחשיפת כרום. אינדוקציה סטרס חמצוני (ROS או GSH) זוהה גם על טיפול עם 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyde ו פנול (איור 7D, מ ', יז). לבסוף, ארסן גורם מתח תא כפי שהודגם על ידי זירחון המוגבר של גורם השעתוק cJun (7G איור).

עומס / 53,987 / 53987fig1.jpg "/>
איור 1. מתחם Tox-Profiler Workflow. א) סכמטי של זרימת העבודה המיושמת במחקר זה. ראשית, ממצא מגוון במינון בוצע באמצעות פלטפורמת RTCA לבחור מינונים מתאימים עבור עוקבות HCS לאפיין את הפרופילים רעילים ספציפי מתחם. ב) עיצוב ניסיוני של המחקר. 24 שעות לאחר הזריעה, תאים היו עצומים וערכי עכבת פיקוח ברציפות במשך 24 השעות הבאות, ואילו קצה HCS נחקרו 4 ו -24 שעות לאחר המינון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. פלייט חשיפה RTCA. צלחת אב מתחם מופק הראשון על ידי ביצוע דילול סדרתי חמישה שלבים 1:10. לכל תרכובת,כולל שליטה ברכב (מנה 0) מתווסף אז בשלושה עותקים לצלחת חשיפה יחד עם בינוניים Staurosporine כקבוצת ביקורת. ראוי לציין, כי מינוני רצף מתוחזק על העברה, המינון הגבוה ביותר נמצאים בשורת מספר 1 ואילו פקדי רכב נמצאים בשורת מספר 7. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תוצאות Cell הכדאיות נציג RTCA. א) 1-aminonaphtalene, ב) 2-nitropropane, ג) Acetamide, ד) אצטון, ה) Acrylamide, ו) ארסן (V), ז) בנזן, ח) כרום (VI) , j) Crotonaldehyde, יא) קטון אתיל מתיל, יב) Nickel (II), מ ') Nitrobenzene, n) פנול, טו) Quinoline, p) טולואן. בגיל 24 שעות שלאחר-מינון, שטח מתחת לעקומה (AUC) חושב עבור כל מנה (כולל בקרה חיוביות רכב) מנורמל ב טווח בין 0 ל -100 פעילות% (ציר y), כאשר 0 מבטאות את הפעילות של הרכב -100 של השליטה החיובית. ערכים אז היו זממו ותאים באמצעות משוואת ארבעה פרמטר היל, כאשר הדבר אפשרי, LD 50 חושב. ריכוזים מבוטאים בסולם יומן (ציר x). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
תוספת איור 4. תוכנית דילול עבור תרכובות בקרה חיובית עבור מבחני HCS. א) בקרות חיוביות vehicle אל דילול סדרתי צלחת. ב) דילול סדרתי של בקרות חיוביות. ג) במינונים בקרות חיוביות 200X. דה) דילול של מינונים 200x בקרות חיוביות במדיום (01:40) כדי ליצור את צלחת בקרה חיובית המכיל מינונים 5x. שים לב שכל מינונים הם מדוללים triplicates על מנת לשקף את הפריסה הסופית בצלחת החשיפה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5. פלייט חשיפת HCS. צלחת אב מתחם המופק ראשונה על ידי ביצוע דילול חמישה שלבים. כל המתחם, כולל שליטה ברכב (מנה 0) מתווסף אז בשלושה עותקים לצלחת חשיפה יחד עם בקרות חיוביות. ראוי לציין, כי כדי המינונים מתוחזק על העברה,המינון הגבוה ביותר נמצא בשורת מספר 1 ואילו פקדי רכב נמצאים מספר שורת 7. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6
איור 6. תמונות פלורסנט הנציג של Antibody- או צבען ויטראז תאי א) פרמטרים גרעיניים - לצבוע גרעיני:. לצבוע חדיר אשר נקשר ל- DNA בתאים חיים או קבועים. כתם זה משמש לזיהוי תאים בודדים תיוג איזור הליבה ב) נימק - תא לצבוע חדירות הממברנה:. זיהוי מבוסס צבען של שלמות קרום תא. מגיב הוא בלתי חדיר באופן מהותי על קרום התא. במהלך נמק, הממברנה הופך חדיר לצבוע נכנס לתא ונקשר DNA הפקת ים ניאון חזק. ignal ג) אפופטוזיס - ציטוכרום C: זיהוי מבוסס נוגדן של שחרור C ציטוכרום, סימן היכר ידוע של אפופטוזיס מוקדם. עם האינדוקציה של אפופטוזיס, ציטוכרום C הוא שוחרר מן מיטוכונדריה מתמוסס לתוך הגרעין ד) ניזק לדנ"א - pH2AX:.. נוגדן מבוסס זיהוי של זירחון של H2AX היסטון, סימן היכר ידוע של הפסקות הגדיל DNA כפולות ה) קינאז מתח - cJun:. זיהוי מבוסס נוגדן של זירחון ב שרתי-73 של cJun, סימן היכר ידוע של מתח הסלולר ו) סטרס חמצונים - DHE: זיהוי מבוסס צבען של רדיקלים דיסמוטאז. Dihydroethidium עצמו מאיר כחול בציטופלסמה בעוד ethidium טופס החמצון מאיר אדום על עיבור DNA ז) GSH - mBcl:. זיהוי מבוסס צבען של מולקולות GSH בחינם. mBcl מגיב עם GSH כדיליצור מוצר ניאון מאוד ח) אפופטוזיס - caspase 3/7 הפעלה:. זיהוי מבוססי צבען של פעילות caspase 3/7. מגיב הוא לא פלורסנט עם פפטיד חומצה ארבעה אמינו אשר מעכב DNA מחייב. עם הפעלת caspase-3/7, הפפטיד הוא בקע המאפשר לצבוע נקשרים ל- DNA, לייצר תגובת fluorogenic, בהירה. לוחות BH להראות לתאי קבוצה שטופלה חיוביים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7
איור 7. נציג תוצאות HCS. 1-aminonaphtalene (AE), ארסן (V) (F ו- G), כרום (VI) (hk), Crotonaldehyde (LN) ו פנול (OQ). 4 שע '(קו כחול)אותות 24 שעות (קו כתום) חושבו לכל מינונים מנורמלים לפעילות הרכב (0%). ערכים שאינם כלולים בחישובים הולמים עקומים מוצגים באפור. ריכוזים מבוטאים בסולם יומן (ציר x). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

assay # Endpoint נקודת סיום ביולוגית תא נייד תכונת פלט
cytotoxicity 1 המוני מיטוכונדריאלי 6 הציטופלסמה שטח ממוצע ספוט
2 פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה 6 הציטופלסמה עצמה ממוצעת ספוט
3 שחרור ציטוכרום C גַרעִין עוצמת ממוצע
4 קרום תא חדיר 8 גַרעִין עוצמת ממוצע
נזק לדנ"א 5 phospho-H2AX 9 גַרעִין עוצמת ממוצע
קינאז מתח 6 phospho-cJun 10 גַרעִין עוצמת ממוצע
ROS 7 ROS 11 גַרעִין עוצמת ממוצע
תוכן GSH 8 GSH 12 הציטופלסמה עצמה ממוצעת ספוט
אפופטוזיס 9 Caspase 3 13 הציטופלסמה עצמה ממוצעת ספוט

רשימת טבלת 1. של HCSssays ונקודות קצה.

<td> 0.17
רכב מינוני RTCA (מיקרומטר) LD 50 מינוני HCS
הכדאיות שנבחרו Cell (מיקרומטר) 3R4F (ננומטר)
1-Aminonaphtalene EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 280 מיקרומטר 2,000 500 200 150 0.27
2-Nitropropane EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
Acetamide EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
אֲצֵטוֹן מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
acrylamide מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
ארסן (V) מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 160 מיקרומטר 200 100 50 25
בֶּנזִין EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
כרום (VI) מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 20 מיקרומטר 100 50 20 10 0.06
Crotonaldehyde מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 200 מיקרומטר 20,000 2,000 200 20 2,000
מתיל אתיל קטון מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 >20 מ"מ
ניקל מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
Nitrobenzene EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
פנול EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 2,300 מיקרומטר 5,000 2,000 1,000 500 240
Quinoline EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ
טולואן מַיִם 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 מ"מ

רשימה טבלה 2. של נבדק תרכובות HPHC עם LD יחסית 50 ב 24 שעות של טיפול. תרכובות שנבחרו לניתוח HCS מודגשים בכתום המינונים שנבדקו גם מקבלים. מינון 3R4F הוא שווה ערך לכמות של הווה מכונן בעשן מקל אחד מן 3R4F סיגרית התייחסות.

assay מתחם פתרון במלאי מֵמֵס מנה (ים) (מיקרומטר)
כדאיות התא Staurosporine 10 מ"מ DMSO 50
cytotoxicity Valinomycin 10 מ"מ DMSO 50 20 5
נזק לדנ"א Paraquat 100 מ"מ DMSO 500 200 50
קינאז מתח Anisomycin 2 מ"מ DMSO 10 4 1
ROS Rotenone 200 מ"מ DMSO 1,000 400 100
תוכן GSH חומצת Ethacrynic 200 מ"מ DMSO 1,000 400 100
אפופטוזיס Staurosporine 40 מ"מ DMSO 200 </ Td> 50 20

רשימת טבלה 3. של בקרות חיוביות ריכוזים משמשות Assay כל.

Discussion

הצרכים חלופות לניסויים בבעלי חיים ועל המבחן המתקרב תפוקה גבוהה חדש ניתנת הדעת למכביר במהלך השנים האחרונות. זו הובילה מדענים ורשויות רגולטוריות לחקור שיטות חלופיות לבדיקות רעילות סטנדרטיות, ניצול מבחני הסלולר כי מחקו את הפיסיולוגיה של רקמות יעד. במחקר זה, אנו הוכחנו את הישימות של שילוב מנתח תא בזמן אמת (RTCA) בהקרנה תכולה גבוהה פלטפורמה (HCS) כדי להעריך את ההשפעה של חשיפה לבוחרי CS יחידים על תאי אפיתל הריאה אנושיים. התקנה זו יכולה להיות מיושמת באופן אנלוגי להעריך cytotoxicity המושרה על ידי מזהמים באוויר שונים אחרים, חלקיקים הנישאים באוויר, חלקיקים. יתר על כן, התוצאות שהתקבלו ניתן להתאים עם אלה transcriptomics כולו הגנום ושיטות חישוביות מבוססים על רשתות ביולוגיות סיבתי. כפי שדווח בעבר, גישה זו אפשרה לנו לאשש נתונים על מסלול מולקולריהפרעות בחשיפת CS 5 עם נקודות קצה HCS, פונה הפרעות מסלול אלה גם phenotypically.

כתוצאת assay תרשים זרימה, ניתוח תא בזמן האמת מספק מידע הקשורות כדאי תא בהחלטה dose- וזמן תלוי, המאפשר קבלת החלטות טובה יותר אשר מנה ונקודת זמן חשיפה עשויים להיות חיוביים עבור ניתוח במורד זרם 14. העיקרון של הנתח מסתמך על שינויי העכבה חשמלית שנוצרה על ידי התאים כמו שהם מייחסים ולהתפשט על משטח גם תרבות המכוסה microelectrode זהב. העכבה מומר פרמטר מימדים בשם-מדד תא, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לפקח על הידבקות התא, להפיץ, המורפולוגיה כדאיות התא בסופו של דבר. למרות טכניקה זו אינה מספקת מידע על מנגנוני ציטוטוקסיות, רגישותו מאפשרת זיהוי של שינויים הסלולר מורפולוגיים אפילו במינונים נמוכים מאוד שבו HCS אינו אינפורמטיבי (מידע לא מוצג). בהתבסס על previניסויי יחידות ארגוניים, שציינו כי המתודולוגיה RTCA היא מסוגלת לזהות שינויים מורפולוגיים במינונים נמוכים לעומת קצה HCS.

בעקבות סינון ראשוני עם מנתח התא בזמן אמת, פלטפורמה HCS שימש לצבור מעמיק יותר מידע על סוג של רעילות שהושרו על-ידי כל HPHC. הפאנל assay HCS מותר פרופיל HPHCs כלפי והשפעתם האפשרית על תאים סלולריים / אברונים כמו גם לזהות את אלו לעורר מתח עקה גנטוקסית או חמצוני. הניתוח חשף פרופילים שונים לפיה HPHCs שנבחר לגרום cytotoxicity בתאי NHBE. באופן כללי, כל המתחמים, למעט פנול, נמצאו לגרום נמק בבית המינונים שנבדקו הגבוהה ביותר. עקבי עם תפקיד פוטנציאלי בזירחון מושרה 1-aminonaphtalene התפתחות הסרטן של H2AX כסמן עקה גנטוקסית, אולם בלוח HCS גם הפעילות הלא מכוסה של HPHC זה את ההודעה הרעילה המיטוכונדריה (גדל מונית relea ציטוכרום Cse) ו סטרס חמצוני (דלדול GSH). באופן דומה, כפי שתואר לעיל, זוהה פנול לגרום תפקוד המיטוכונדריה, ולגרום נזק ל- DNA וכן דלדול GSH. כרום (VI), אחד המתחמים המסווגים הקבוצה שאני מסרטן, וכן Crotonaldehyde גם זוהו הן genotoxic, בפרט כרום (VI) גם לאפופטוזיס (הפעלת מפל caspase) ו Crotonaldehyde שנגרמו גדלו דור ROS. לבסוף ארסן (V), נמצא לגרום זירחון cJun אשר מהווה סמן של הפעלת מסלול קינאז המתח.

במחקר זה, השתמשנו תאי NHBE כמודל תאי אפיתל ריאות במבחנה. באמצעות תאים אלה בסביבת HCS הוא חסר תקדים ואפשר חקירת מגוון רחב של נקודות קצה, כוללים סמני עקה גנטוקסית חמצוני לחץ. שני תא חי וגישות מכתים תא קבועות תוארו בתוך הפרוטוקולים שלנו, מדגימים את הגמישות של הטכניקה הכללית. ב fמעשה, הפרוטוקולים עצמו יכול להיות מיושם על מגוון רחב יותר של מטרות, אשר ניתן לטפל על ידי שימוש בכל צבע או נוגדן פלואורסצנטי. עבור הביצוע המוצלח של הפרוטוקולים המכתימים החיים, חשוב לכבד את זמן הדגירה, כמו כמה הצבעים יש זמן מחצית חיים מוגבלים אות הקרינה עלול לגרום לירידה לפני רכישת התמונה הושלמה. כמו כן, חשוב לקחת בחשבון כי אם סוג תאים שונה משמש, כל התנאים המכתימים צריכים להיות הערכה מחדש, כמו הריכוז לצבוע אופטימלית זמן הדגירה עשוי להיות שונה.

במאמר הנוכחי שתיארנו תרחיש שבו רק חמישה מתחמים שבהם הוקרן למתודולוגיה HCS. בהתחשב פריסת הצלחת שתוארה לעיל, הם היו במינון מעל 2 סטי צלחת שונים עבור סכום כולל של 24 צלחות (6 מבחנים ו -2 נקודות זמן) .the מספר הצלחות יכול גם להיות מוגבר, ובכך לאפשר להקרנה סימולטני של תרכובות או יותר investigation של נקודות קצה יותר. לפני שתעשה זאת, אולם יש לקחת בחשבון כי נקודות קצה מסוימות (GSH ו ROS) דורשים לרכישה מיידית, וכתוצאה מכך, את המינון של הצלחות צריכה להתבצע בצורה מדורגת להתיר רכישת הצלחת הקודמת. מצד השני, באמצעות פרוטוקול מכתים תא קבוע מהווה יתרון כמו הצלחות יכולות להיערם, לקטוע את הפרוטוקול בשלב כלשהו לאחר הקיבוע, להשלמת ההליך מכתים בשלב מאוחר יותר. גישה זו, למשל, תספק המפעיל עם הזמן להשלים את כל הצלחות מכתימות תא החיים מבלי להתפשר על איכות הנתונים.

כדי להמשיך לייעל את העבודה על ידי הפחתת מספר הצלחות, זה יהיה גם אפשר זמנית יותר נקודות קצה יחד. כך למשל בשנת נזק ומתח DNA בהקשר זה קינאז יכול להיחקר יחד פשוט באמצעות שני נוגדנים משני עם fluorochromes פולטות ג שוניםhannels. פיתוח מתמשך של פלטפורמת HCS, כולל זריעת תאים אוטומטי לחלוטין, דילול המתחם, מינון והכתים, כמו גם תוספת של נקודות קצה חדשה יהיה להרחיב עוד יותר את היכולת של פלטפורמת HCS ככלי פרופיל רב עוצמה עבור HPHCs על אפיתל סוגי תאים אחרים .

Disclosures

כל הכותבים הם עובדי פיליפ מוריס אינטרנשיונל. פיליפ מוריס אינטרנשיונל הוא המקור היחיד של מימון חסות לפרויקט הזה.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות Karsta Luettich וגרגורי Vuillaume לבדיקה שלהם של כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader Thermo N01-0002B
xCelligence RTCA MP ACEA 05331625001
Screener (HCS) Genedata NA
CASY counter TTC Roche 05 651 719 001
e-Plates VIEW 96 ACEA 06 472 451 001
RTCA Frame 96 ACEA 05232392001
RTCA Cardio Temperature Tool ACEA 2801171
Plate sealer breathseal Greiner bio-one 676051
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) Lonza CC-2540 non-smoking 60-year-old Caucasian male donor 
BEGM BulletKit Lonza CC-3170 Warm at 37 °C before use
ReagentPack Subculture Reagents kit Lonza CC-5034 Warm at 37 °C before use
Penicillin/Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
Easy Flask filter cap 75 cm2 Thermo Scientific 12-565-349
96 well assay plate  black  Corning 3603
Hoechst 33342  Fisher Scientific PI-62249
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) Biostatus DR50200
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos Life technologies M-7512
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos Life technologies M-7513
ROS Dye: Dihydroethidium Sigma D7008
ROS Dye: CellROX Life technologies C10422
ROS Dye: MitoSOX Life technologies M36008
GSH Dye: Monochlorobimane Sigma 69899 Toxic
GSH Dye: Monobromobimane Life technologies M-1378 Toxic
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1  Life technologies Y3603 Irritating 
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1  Life technologies T3602 Irritating 
Membrane permeability Dye: TOTO-1  Life technologies T3600 Irritating 
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green Life technologies C10423 Irritating 
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) Thermo MA5-11823
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) Thermo MA5-15889
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) Thermo MA1-2022
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650  Abcam ab96878
10x permeabilization buffer Fisher 8408400
4% Formaldehyde solution Sigma F1635 Toxic
10x blocking buffer Fisher 8408500
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Sigma D8537
Hanks' Balanced Salt solution Sigma H8264
Staurosporine Sigma S4400 Toxic
Valinomycin Sigma V0627 Toxic
Paraquat Sigma 36541 Toxic
Anisomycin Sigma A9789 Toxic
Ethacrynic acid Sigma E4754 Toxic
1-Aminonaphthalene Sigma 34390 Toxic
2-Nitropropane Sigma 130265 Toxic
Acetamide Sigma 695122 Toxic
Acetone Sigma 650501 Toxic
Acrylamide Sigma A9099 Toxic
Arsenic (V) Sigma A6756 Toxic
Benzene Sigma 12540 Toxic
Chromium (VI) Sigma 216623 Toxic
Crotonaldehyde Sigma 262668 Toxic
Methyl ethyl ketone Sigma 34861 Toxic
Nickel  Sigma 203866 Toxic
Nitrobenzene Sigma 48547 Toxic
Phenol Sigma P5566 Toxic
Quinoline Sigma 241571 Toxic
Toluene Sigma 34866 Toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
  3. Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
  4. US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
  5. Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
  6. Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
  7. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
  10. Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
  11. Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
  12. Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
  13. Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
  14. Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).

Tags

ביולוגיה מולקולרית גיליון 111 גבוהה תוכן ההקרנה מערכות טוקסיקולוגיה רגילה תאים אנושיים אפיתל הסימפונות נזק לדנ"א מתח התא מרכיבים עשן
ניתוח הקרנת תכולה גבוהה כדי להעריך את ההשפעות טוקסיקולוגי של מזיקים מזיקים מרכיבים (HPHC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., … More

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., Acali, S., Johne, S., Laurent, A., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC). J. Vis. Exp. (111), e53987, doi:10.3791/53987 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter