Abstract
Il fumo di sigaretta (CS) è un importante fattore di rischio per malattie cardiovascolari e polmonari. Perché CS è un aerosol complesso contenente più di 7.000 sostanze chimiche 1 è impegnativo per valutare i contributi delle singole componenti della sua tossicità generale. Profili tossicologici dei singoli costituenti, nonché le miscele possono essere comunque stabilita in vitro, mediante l'applicazione di alto through-put strumenti di screening, che consentono la profilatura di componenti nocivi e potenzialmente dannoso (HPHCs) del fumo di tabacco, così come definito dalla Food and Drug statunitense Administration (FDA). 2
Per una valutazione iniziale, uno strumento impedenza-based è stato utilizzato per un tempo reale, la valutazione priva di etichetta di tossicità del composto. La lettura dello strumento si basa su adesione cellulare, la vitalità e la morfologia che tutti insieme forniscono una panoramica dello stato della cella. Un parametro adimensionale, chiamato index cella, viene utilizzato per la quantificazione. Un insieme di difprotocolli di colorazione di- stato sviluppato per un'indagine basata su imaging di fluorescenza e una piattaforma di HCS è stato utilizzato per ottenere informazioni più approfondite sul tipo di citotossicità suscitato da ogni HPHC.
Dei 15 componenti testati, sono stati selezionati solo cinque per l'analisi HCS-based come hanno registrato una LD calcolabile 50 (<20 mm). Questi hanno incluso 1-aminonaphtalene, arsenico (V), cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo. Sulla base del loro effetto nel HCS, 1-aminonaphtalene e fenolo potrebbero essere identificati per indurre disfunzione mitocondriale, e, insieme con cromo (VI) come genotossico sulla base della maggiore fosforilazione dell'istone H2AX. Crotonaldehyde è stato identificato come un induttore di stress ossidativo e arsenico come un percorso attivatore di stress chinasi.
Questo studio dimostra che una combinazione di tecnologie impedenza-based e HCS fornisce uno strumento robusto per la valutazione in vitro dei componenti CS.
Introduction
Valutazione del rischio tossicologico ha storicamente fatto affidamento su l'uso di modelli animali che, pur fondamentale nelle scienze della vita, sono anche collegati con carenze come traducibilità incoerente per l'uomo e costo elevato. Inoltre, vi è stato uno sforzo crescente per trovare alternative alla sperimentazione animale nello spirito di "The 3R" 2 (sostituzione, riduzione e affinamento). Questo sforzo è stato accelerato nel corso degli ultimi anni, non solo a causa dei recenti progressi, come le tecniche high-throughput e approcci biologia dei sistemi, ma anche a causa della legislazione limitare l'impiego di sperimentazione animale, in particolare nell'Unione europea.
La complessità dei percorsi di segnalazione cellulare che regolano la risposta agli insulti tossici rende evidente che utilizzando singoli parametri tossicologici non sarà sufficiente a descrivere la base tossicologica di alcuni composti. Per questo, l'interazione tra centinaia di interazione pdovranno anche essere presi in considerazione roteins che contribuiscono a una rete biologica. Per studiare l'effetto dei tossici su tali reti, un approccio di sistema tossicologia combinato con medio fenotipici e saggi di screening ad elevata capacità è utile per inferire potenze e allo stesso tempo fornire ulteriori informazioni sul meccanismo di azione delle singole sostanze tossiche.
In questo studio, abbiamo impiegato HCS come un potente strumento di screening, che si compone di un microscopio automatico e un'applicazione software biologica, che può acquisire, elaborare e analizzare i dati di immagine ottenuti da specifiche analisi cellulari basate sulla fluorescenza. Questo permette di cambiamenti visivi all'interno di una cella da quantificare, in una singola cella o livello subcellulare, e molti parametri da analizzare simultaneamente. 3, ad esempio, il DNA rotture del doppio filamento sono stati valutati utilizzando un documento d'identità a base di anticorpi dell'istone H2AX fosforilazione e specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono stati quantificati utilizzando una cella-permsuperossido eable colorante sensibile.
Poiché le cellule epiteliali polmonari rappresentano la prima barriera biologica contro sostanze tossiche inalate, tra cui il fumo di sigaretta, abbiamo utilizzato cellule epiteliali bronchiali primarie come un modello in vitro al profilo l'effetto di HPHCs pubblicati dagli Stati Uniti Food and Drug Administration. 4 Questo manoscritto è un follow -up su uno studio precedente 5 in cui abbiamo valutato l'impatto biologico di un diverso sottoinsieme di HPHCs.
Come parte del nostro flusso di lavoro per valutare la citotossicità in vitro, inizialmente abbiamo valutato le potenze di una selezione di 15 HPHC di, con un tempo reale analisi cellulare impedenza basato sul sistema (RTCA) che ci ha permesso di stabilire la dose-range, adatto per la successiva HCS analisi (Figura 1). Una valutazione tossicologica HCS è stata poi condotta utilizzando nove punti finali multi-parametriche di tossicità cellulare, ogni effettuato a due punti di tempo (4 e 24 ore). I marcatori utilizzati erano indicativi di tossicità mitocondriale, danno al DNA, stress chinasi, specie reattive dell'ossigeno (ROS), contenuto di glutatione (GSH), caspasi 3 - 7 attività, il rilascio del citocromo C e permeabilità della membrana cellulare, come descritto nella Tabella 1.
Il nostro approccio abilitato identificazione e caratterizzazione dell'effetto dei componenti del fumo di sigaretta attraverso campionamento dose e tempo dipendente. In definitiva, questo ha prodotto un profilo tossicologico in vitro per ogni HPHC. approcci multi-omiche possono anche essere utilizzati per integrare ulteriormente l'analisi HCS. Ciò avrebbe finalmente anche fornire una più profonda comprensione degli effetti al segnalazione cellulare e / o livello trascrizionale.
Protocol
1. La raccolta umane normali cellule epiteliali bronchiali (NHBEs)
- Pre-riscaldare il mezzo di coltura cellulare (bronchiali crescita delle cellule epiteliali medio medio integrato), il HEPES, tripsina, e la soluzione di tripsina neutralizzante (TNS) in bagno d'acqua a 37 ° C.
- Raccogliere le cellule quando viene raggiunto l'80% di confluenza.
NOTA: Le seguenti coltura cellulare NHBE condizioni semina può essere usato per ottenere confluenza ottimale in fiasche T75 rivestiti con 20 ml di mezzo:- Seed 1 x 10 6 cellule per la cultura di 3 giorni, 0,5 x 10 6 cellule per la cultura di 4 giorni e 0,25 x 10 6 cellule per la cultura 5 giorni. Cambiare media ogni 2 giorni quando le cellule sono in coltura per aggiornare le sostanze nutritive. Cellule di coltura a 37 ° C e 5% di CO 2.
- Rimuovere il surnatante dal pallone (s) e aggiungere HEPES per lavare le cellule (ad es., 3 ml per 2 pallone 75 cm). Ruotare ciascun pallone per coprire il monostrato cellulare con il sol HEPESution.
- Rimuovere la soluzione HEPES e aggiungere la soluzione tripsina (ad es., 3 ml per un 2 pallone 75 cm). Ruotare il pallone per coprire il monostrato cellulare con la soluzione tripsina.
- Incubare la beuta per 5 minuti a 37 ± 2 ° C. Monitorare il distacco delle cellule sotto il microscopio e, se necessario, incubare più a lungo e delicatamente toccare il pallone per rilasciare eventuali cellule attaccate rimanenti.
- Aggiungere TNS per arrestare la reazione (ad es., 3 ml per un 2 pallone 75 cm) e trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 10 ml di mezzo fresco, mescolando delicatamente per ottenere una sospensione omogenea.
- Filtrare la sospensione cellulare attraverso un colino cella 100 pM per rimuovere aggregati e contare le cellule. Nota: Nel nostro laboratorio un sistema di conteggio delle cellule multicanale campo elettrico è stato utilizzato per precisione e costantemente valutare la viablil numero e le cellule.
2. Tempo reale Cell Analyzer (RTCA) a base di Dose Gamma Finding (DRF)
NOTA: Un sistema di misurazione dell'impedenza-based è stato utilizzato per: 1) valutare la tossicità composto, 2) selezionare i composti di essere ulteriormente indagati da HCS e 3) selezionare dosi appropriate per HCS. Le cellule NHBE nelle piastre RCTA vengono dosati con l'aggiunta di 25 ml di diluizioni composto in esame a 100 ml presenti medie ciascun pozzetto. Pertanto, tutte le soluzioni di prova sono preparate a 5 volte (5x) la concentrazione finale desiderata.
- Cellule NHBE semina
- Programmare lo strumento per definire il numero e la durata delle misure di impedenza. In questo studio, sono stati registrati dati ogni 15 min per 48 ore (da 24 ore ± 2 ore prima e 24 ore dopo la somministrazione delle cellule con agenti di test).
- Misurare il fondo piatto pipettando 50 ml di media pre-riscaldato in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti RTCA. Nota: Questo passo rappresenta un requisito tecnicoper lo strumento per calcolare la resistenza elettrica media che viene poi utilizzato come riferimento di base per il calcolo base cellulare.
- Preparare una sospensione cellulare ad una concentrazione di 144.000 cellule / ml (± 5%) e aggiungere sospensione cellulare 50 microlitri (7.200 cellule / pozzetto) in ciascun pozzetto della piastra RTCA in cui 50 ul / pozzetto di media è già stato aggiunto per sfondo strumento misurazione.
- Lasciare le cellule aderiscono per 30 minuti a temperatura ambiente prima di posizionarli nella culla RTCA (per migliorare la distribuzione omogenea delle celle). Incubare le piastre RTCA nella culla RTCA in incubatrice (37 ° C e 5% CO 2) e avviare la registrazione dei dati per il successivo 24 ± 2 ore prima della somministrazione.
- Le diluizioni di HPHCs e di controllo positivo
- Positive Control diluizione
- Diluire la soluzione staurosporine magazzino (10 mm) 1:10 in DMSO (vedi tabella 3) e aggiungere 5 ml di Dilution a 195 ml di mezzo per ottenere una soluzione di lavoro 5x.
- HPHC diluizione
- Sciogliere / diluire ciascun HPHC nel veicolo (Tabella 2) per generare un 1 M soluzione madre. Diluire ogni soluzione madre HPHC 1:10 in media per generare una soluzione di 100 mm.
- Generare il "compound piastra master" effettuando un cinque fasi 1:10 seriale utilizzando medie veicolo + 10% per ottenere le soluzioni di lavoro 5x (Figura 2). Nota: In definitiva, le dosi finali saranno: 0,2 mM, 2 mM, 20 mM, 0,2 mM, 2 mM, 20 mM. Anche preparare la dose 0, corrispondente al solo veicolo, in questo passo.
- dosaggio
- Pausa lo strumento RTCA e aprire la culla per rimuovere la piastra.
- Rimuovere la piastra e posizionarlo nello strumento temperatura della piastra RTCA (progettato per stabilizzare la temperatura della piastra RTCA durante le procedure sperimentali fuori del RTCAstation) per evitare il raffreddamento delle celle, che possono influire la misura di impedenza.
- Aggiungere 25 microlitri 5x soluzione dal "piatto compound master" per le cellule in triplice copia mantenendo lo stesso ordine di dosaggio come nella piastra maestro composto (dose massima nella parte superiore di controllo riga e veicolo nel numero di riga 7) (Figura 2). Non rimuovere la (100 ml) terreno di coltura cellulare esistente.
- Aggiungere 25 ml 5x soluzione di controllo positivo alle celle della riga in basso (la metà a destra) senza rimuovere terreno di coltura esistente. Aggiungere 25 microlitri mezzo alle celle della riga inferiore (metà sinistra) senza rimuovere terreno di coltura cellulare esistente.
- Sigillare la piastra con la pellicola sigillante. Posizionare la piastra posteriore nella culla RTCA e bloccarlo. Dati riavviare la registrazione per il tempo di esposizione desiderato (ad es., 24 ore). Nota: L'uso di questa pellicola sigillante si raccomanda di evitare la contaminazione potenziale, compreso well-to-ben contaminazione incrociata.
- <strong> Data Analysis RTCA e LD 50 Calcolo
- Esportazione dati grezzi come file Excel (.xls) testo (.txt) o. Nota: Il file conterrà tutte le informazioni riguardanti il layout della piastra (composti, le dosi e la posizione ben). valori di indice di cella Raw sono organizzati in un (distribuzione pozzetti mirroring) 96 formato bene e sono forniti per ogni punti di tempo in cui si è verificato la registrazione. Il valore alla posizione i nella piastra ben 96 al tempo t è indicato con CI t (i).
- Identificare come una normalizzazione riferimento l'ultimo punto di tempo prima che il dosaggio per ciascuna posizione i della piastra da 96 pozzetti (ad esempio, indice cellulare a 23 h 50 min 00 sec alla posizione i, CI t (i) = 23: 50: 00 = CI Ref (i)). Nota: Queste informazioni devono essere annotato quando si esegue il dosaggio.
- Divide, su una base ben, ogni volta valori del punto di riferimento normalizzazione normalizzare tutti i valori al tempo di dosaggio. Il valore normalizzato a positioni in pozzetti 96 al tempo t è indicato con NSC t (i) ed è pertanto definita dai NCI t (i) = CI t (i) / CI Ref (i) per ogni t.
- Calcolare l'area sotto la curva (AUC) a 24 ore dopo la somministrazione per ogni campione i (posizione i della piastra da 96 pozzetti), comprese le posizioni di controllo positivo e del veicolo.
- Ottenere l'AUC alla posizione i si ottiene sommando le aree di ciascun rettangolo, ogni rettangolo essendo tra due intervalli di tempo indicato con t k e t l (t k <t l); calcolare ciascuna area rettangolo utilizzando x * y con x = t l - t k è la distanza tra due punti temporali e y essendo la media della attività dei due punti temporali (y = (tk NSC (i) + NCI tl (i)) / 2).
Nota: L'AUC a 24 ore dopo la somministrazione per la posizione i è indicata con AUC (i). Poiché tutte le condizioni sono piastrate in pozzetti in triplicato viene utilizzata la media dei tre valori.
<li> normalizzare i valori utilizzando la seguente equazione: - Ottenere l'AUC alla posizione i si ottiene sommando le aree di ciascun rettangolo, ogni rettangolo essendo tra due intervalli di tempo indicato con t k e t l (t k <t l); calcolare ciascuna area rettangolo utilizzando x * y con x = t l - t k è la distanza tra due punti temporali e y essendo la media della attività dei due punti temporali (y = (tk NSC (i) + NCI tl (i)) / 2).
dove i è la posizione nella piastra ben 96 per i quali è stato calcolato l'AUC a 24 ore dalla somministrazione,
Veicolo è la mediana dei valori di AUC per i pozzi di veicoli su una piastra a 24 ore dalla somministrazione,
Controllo positivo è la mediana dei valori di AUC per i pozzetti di controllo positivo su una piastra a 24 ore dalla somministrazione,
CR è il valore normalizzato mediana desiderato per il veicolo (0%), e
SC è il valore normalizzato mediana desiderato per i controlli positivi (-100%)
NOTA: Al termine di questa fase, un insieme di dati si ottiene che contiene, per ciascuna posizione i della piastra da 96 pozzetti, un ci concentrazione (in unità logaritmiche) che viene applicato al campione contenuto in posizione / pozzetto i e il suo corrispondente AUC normalizzato a 24 ore dopo la somministrazione AUC_normalized (i). - Trama e montare il (c i, AUC_normalized (i)) -Valori con un 4-parametri Hill equazione. Quando possibile, calcolare anche DL 50.
dove Y = AUC_normalized,
Zero Attività S livello 0 = attività a zero concentrazione del composto in esame,
Livello di inf = Activity S Infinite a concentrazioni infinita,
AC50 = concentrazione alla quale l'attività raggiunge il 50% del livello massimo,
Coefficiente Hill n = Misura della pendenza a AC50, e
c = concentrazione in unità logaritmiche corrispondenti ai valori delle ascisse del grafico della curva dose-risposta.
NOTA: AC50 corrisponde LD 50 (saggi di citotossicità). Si tratta di una misura di potenza in cui i valori bassi indicano un'elevata potenza.
- Positive Control diluizione
3. Misurazione tossicologici Effetti di HCS
NOTA: Un totale di nove marcatori multi-parametriche di tossicità, raggruppati in sei differenti dosaggi, sono misurate utilizzando la piattaforma HCS (Tabella 1). Sulla base dell'analisi vitalità cellulare RTCA (sezione 2) nell'intervallo di dosi di ciascun componente è definito e una dose di riferimento 3R4F è anche incluso. La dose di riferimento è equivalente alla quantità di HPHC presenti nel fumo di uno stick dalla 3R4F sigarette riferimento.
- Cellule NHBE semina
- Preparare una sospensione cellulare a 120.000 cellule / ml (± 5%) e aggiungere sospensione cellulare 100 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti HCS (12.000 cellule / pozzetto). Preparare abbastanza piatti per la valutazione di tutti i saggi di citotossicità (, danni al DNA, stress chinasi, ROS, contenuto di GSH e apoptosi) e intervalli di tempo (4 e 24 ore).
- Lasciare le piastre HCS a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire alle cellule di allegare ai pozzi e poi incubare a 37 ° C e 5% CO 2 per 24 ± 2 ore prima della somministrazione.
- La diluizione di HCHPs e di controllo positivo
NOTA: Le cellule NHBE nelle piastre HCS sarà dosato con l'aggiunta di 25 ml di soluzioni campione di prova per 100 ml di media già presenti in ciascun pozzetto. Pertanto, tutte le dosi sono preparati a 5x la concentrazione finale desiderata.- I controlli positivi diluizione (controllo positivo Plate)
- Dispensare 40 ml di soluzione madre di ogni controllo positivo (vedi tabella 3) nella colonna # 2 (figura 4a, pozzi d'ombra in rosso). Dispensare 20 ml di veicolo in colonne # 3 e # 5 (Figura 4a, pozzi ombreggiate in azzurro) e 40 microlitri di veicoli in colonna # 4 (figura 4a, pozzi ombreggiate in azzurro).
- Prelevare 12 ml dai pozzi nella colonna # 2, a meno che ai pozzetti nella colonna # 3 e mescolare (figura 4b), Continuare fino una diluizione seriale finale con 3 dosi (d1, d2 e d3) e il veicolo (V) per ciascun composto controllo positivo si ottiene (figura 4c). Per generare la piastra di controllo positivo, preparare una diluizione 1:40 di composti nei media (Figura 4d).
- HPHC diluizione (Composto master Plate)
NOTA: Gli intervalli di dose selezionate HPHCs per HCS sono elencati nella Tabella 2.- Diluire ogni soluzione stock HPHC (1 M) 1:10 in media per una concentrazione di 100 mm. Eseguire diluizioni usando media con il 10% dei veicoli per ottenere le dosi 5x selezionati per ciascun HPHC.
- I controlli positivi diluizione (controllo positivo Plate)
- dosaggio
- Aggiungere 25 ml di soluzioni 5x dalla piastra maestro compound alle cellule in triplicato mantenendo lo stesso ordine di dosaggio come nella piastra maestro composto (dose massima nella parte superiore di controllo riga e veicolo nel numero di riga 7) (Figura 5). Non rimuovere la postaEsistenti (100 ml) terreno di coltura cellulare.
- Aggiungere 25 ml di soluzione 5x dalla piastra controllo positivo alle celle nella riga inferiore mantenendo lo stesso ordine di dosaggio come nella piastra di controllo positivo (Figura 5). Non rimuovere la (100 ml) terreno di coltura cellulare esistente. Nota: Ogni test ha un controllo specifico positivo; vedi Tabella 3. Incubare la piastra a 37 ° C e 5% CO 2 per il tempo di esposizione desiderato (4 o 24 ore).
- colorazione
- La preparazione per tutte le analisi
- Pre-riscaldare il tampone di lavaggio (PBS) soluzioni a 37 ° C.
- Preparare la soluzione di fissaggio (4% soluzione di formaldeide) l'aggiunta di 10.81 ml di formaldeide al 37% a 89.19 ml di tampone di lavaggio e pre-caldo a 37 ° C.
- Preparare il buffer di permeabilizzazione con l'aggiunta di 10 ml di 10x tampone permeabilizzazione a 90 ml di tampone di lavaggio e pre-caldo a 37 ° C.
- Preparare il Blotampone cking con l'aggiunta di 10 ml di 10x tampone di bloccaggio a 90 ml di tampone di lavaggio e pre-caldo a 37 ° C.
- Pre-riscaldare il terreno di coltura cellulare a 37 ° C.
- Rimuovere le piastre HCS dal termostato una volta i tempi di 4 e 24 ore di esposizione vengono raggiunti ed eseguire le seguenti protocolli specifici per ciascun test.
- citotossicità Assay
- Preparare un volume sufficiente (V) di Live Cell colorazione Soluzione secondo la seguente formula: Volume del mezzo (ml) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi)
- Diluire il colorante mitocondri nel Live soluzione di cellule colorazione secondo le istruzioni del fornitore. Diluire il colorante membrana permeabilità nel vivo soluzione di cellule colorazione secondo le istruzioni del fornitore.
- Aggiungere 50 ml Soluzione colorante cellulare dal vivo in ciascun pozzetto della piastra (s) definita "test di citotossicità". NON rimuovere mezzo di coltura cellulare e incubare per 30 min a 37 ° C, 5% CO
- Aspirare delicatamente la soluzione medio e colorazione e aggiungere 100 ml / pozzetto di soluzione di fissaggio a ciascun pozzetto, incubare piastra (s) per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Aspirare delicatamente la soluzione di fissaggio e lavare una volta con 100 pl / pozzetto tampone di lavaggio.
- Rimuovere il tampone di lavaggio e aggiungere 100 microlitri di buffer permeabilizzazione / pozzetto 1x a ciascun pozzetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Aspirare buffer di permeabilizzazione e la piastra di lavare due volte con 100 ml / pozzetto di tampone di lavaggio.
- Aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 100 ml di 1x tampone bloccante in ciascun pozzetto e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Preparare un volume sufficiente (V) di Soluzione Anticorpi primario secondo la seguente formula: Volume di tampone di bloccaggio (microlitri) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi). Diluire l'anticorpo anti-citocromo C (mouse) 1: 250 in soluzione anticorpale primaria.
- Aspirare un tampone di bloccaggiod aggiungere 50 ul / pozzetto Soluzione Anticorpi primari ad ogni pozzetto e incubare per 60 min a temperatura ambiente al buio.
- Preparare un volume sufficiente (V) di anticorpo secondario e soluzione nucleare secondo la seguente formula: Volume di tampone di bloccaggio (microlitri) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi). Diluire l'anticorpo anti-topo 1: 500 in anticorpo secondario e soluzione nucleare. Diluire il colorante nucleare 1: 1.000 in anticorpo secondario e soluzione nucleare.
- Aspirare primario Soluzione anticorpo e la piastra di lavare tre volte con 100 ml / pozzetto di tampone di lavaggio utilizzando la rondella piatto.
- Aspirare il tampone di lavaggio e aggiungere 50 ul / pozzetto di anticorpo secondario e soluzione nucleare a ciascun pozzetto della piastra (s) e incubare per 60 min a temperatura ambiente al buio.
- Aspirare secondaria anticorpale e soluzione nucleare e la piastra di lavare tre volte con 100 ml / pozzetto di tampone di lavaggio utilizzando la rondella piatto. Aggiungere 100 ml / pozzetto di tampone di lavaggio. Piastra (s) è (sono) orapronto per essere valutati sul lettore HCS.
- DNA Damage Assay
- Aspirare delicatamente il supporto dalle piastre designati "danni al DNA".
- Eseguire la stessa procedura descritta in sequenza: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Si noti che in questo caso, unico mezzo viene rimosso durante la fase 3.4.2.4.
- Preparare un volume sufficiente (V) di Soluzione Anticorpi primario secondo la seguente formula: Volume di tampone di bloccaggio (microlitri) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi)
- Diluire l'anticorpo anti-fosfo H2AX (mouse) 1: 2.000 in anticorpo soluzione primaria.
- Eseguire la stessa fase come descritto nella 3.4.2.10.
- Preparare un volume sufficiente (V) di anticorpo secondario e nucleare Soluzione secondo la seguente formula: Volume di tampone di bloccaggio (microlitri) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi)
- Diluire l'anticorpo anti-topo 1: 500 in anticorpo secondario e soluzione nucleare.
- Diluire il NucleaR tintura 1: 1.000 in anticorpo secondario e soluzione nucleare.
- Eseguire la stessa procedura descritta in sequenza: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- Lo stress chinasi Assay
- Aspirare delicatamente il mezzo da ciascuna delle piastre designati "stress chinasi".
- Eseguire la stessa procedura descritta in sequenza: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Si noti che in questo caso, unico mezzo viene rimosso durante la fase 3.4.2.4.
- Preparare un volume sufficiente (V) di Soluzione Anticorpi primario secondo la seguente formula: Volume di tampone di bloccaggio (microlitri) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi)
- Diluire il cJun anticorpo anti-fosfo (coniglio) 1: 200 in soluzione primaria di anticorpi.
- Eseguire la stessa fase come descritto nella 3.4.2.10.
- Preparare un volume sufficiente (V) di anticorpo secondario e nucleare Soluzione secondo la seguente formula: Volume di tampone di bloccaggio (microlitri) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi)
- Diluire l'anticorpo anti-coniglio 1: 500 in anticorpo secondario e soluzione nucleare.
- Diluire il colorante nucleare 1: 1.000 in anticorpo secondario e soluzione nucleare.
- Eseguire la stessa procedura descritta in sequenza: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- ROS Assay
- Preparare un volume sufficiente (V) Live Solution cellulare colorazione secondo la seguente formula: Volume del mezzo (ml) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi).
- Diluire il colorante ROS in vivo delle cellule colorazione Soluzione secondo le istruzioni del fornitore
- Diluire il colorante nucleare 1: 1.000 in Live Cell colorazione Solution.3.4.5.4) Aggiungere 50 ml cellulare dal vivo colorazione Solution ad ogni pozzetti designati "ROS"; NON rimuovere terreni di coltura delle cellule e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Aspirare delicatamente la soluzione medio e colorante e lavare piatto tre volte con 100 microlitri / pozzetto medie.
- Aspirare il terreno, aggiungere 100 _6; l / pozzetto soluzione di fissaggio a ciascun pozzetto ed incubare piastra per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Aspirare delicatamente la soluzione di fissaggio e lavare piatto tre volte con 100 ml / pozzetto tampone di lavaggio.
- Aggiungere 100 ml / pozzetto tampone di lavaggio. Piastra (s) è (sono) pronto.
- Valutare la piastra sul lettore HCS entro 1 ora.
- GSH Tenore
- Preparare un volume sufficiente (V) di Live Cell Nuclear colorazione Soluzione secondo la seguente formula: Volume del mezzo (ml) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi).
- Diluire il colorante nucleare (Far Rosso) 1: 1.000 in Live Cell Nuclear colorazione Solution.3.4.6.3). Aggiungere 50 ml di Live Cell Nuclear colorazione Solution ad ogni pozzetto delle piastre designati "contenuto di GSH". NON rimuovere terreni di coltura delle cellule e incubare per 30 minuti a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Preparare un volume sufficiente (V) di Live Cell GSH colorazione Soluzione secondo laseguente formula: Volume di HBSS (ml) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi)
- Diluire il colorante GSH in Live cellulare GSH colorazione Soluzione secondo le istruzioni del fornitore.
- Aspirare delicatamente la soluzione colorazione nucleare di medie e e lavare piatto tre volte con 100 pl / pozzetto di media.
- media Aspirare e aggiungere 100 ml / pozzetto di cellule vive GSH colorazione Solution ad ogni pozzetto della piastra (s).
- Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Piastra (s) è (sono) pronto.
- Valutare piastra (s) sul HCS Reader entro 1 ora.
- L'apoptosi Assay
- Preparare un volume sufficiente (V) Live Solution cellulare colorazione secondo la seguente formula: Volume del mezzo (ml) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi).
- Diluire il colorante caspasi 1: 300 in Live cellulare colorazione Solution.
- Rimuovere terreni di coltura delle cellule, aggiungere 50 ml cellulare dal vivo colorazione Solution ad ogni pozzetto di tegli piastra (s) denominato "Apoptosis" e incubare per 30 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- Preparare un volume sufficiente (V) del cellulare dal vivo nucleare colorazione soluzione secondo la seguente formula: Volume della soluzione Fix (ml) V = 50 x W x 1.2 (W Numero di pozzi).
- Diluire il colorante nucleare 1: 1.000 in Live Cell Nuclear colorazione Solution.
- Rimuovere la soluzione colorante cellule vive, aggiungere 100 ml / pozzetto di cellule vive nucleare Staining Solution ad ogni pozzetto della piastra (s) e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
- Aspirare il / soluzione colorante nucleare fissativo e lavare piastra (s) tre volte con 100 l / pozzetto tampone di lavaggio.
- Aggiungere 100 ml / pozzetto tampone di lavaggio. Piastra (s) è (sono) pronto.
- Valutare piastra (s) sul lettore HCS.
- La preparazione per tutte le analisi
- Data Analysis HCS
- Esportazione dati grezzi come file Excel (.xls). Nota: i valori di indice cella prime sono organizzati in una forma ben 96a (mirroring piastra ben distribuzione) e sono previsti per ogni punti finali in un dato punto di tempo dopo la somministrazione.
- Normalizzare i valori usando la seguente equazione:
dove i è il valore del segnale grezzo misurata di un pozzo,
Veicolo è la mediana dei valori dei segnali misurati per i pozzi di veicoli su una piastra,
CR è il valore normalizzato mediana desiderato per il veicolo (0%), e
SC è il valore normalizzato mediana desiderato per i controlli positivi (100),
NOTA: Al termine di questa fase, un insieme di dati si ottiene che contiene, per ciascuna posizione i della piastra da 96 pozzetti, una concentrazione c i (in unità logaritmiche) che è stato applicato al campione contenuto in posizione / pozzetto ie sua corrispondente segnale normalizzato N (i). - Trama e montare il (C I, N (I)) - valori utilizzando un 4-parametri Hill equazione.
dove Zero Attività S livello 0 = attività a zero concentrazione del composto in esame,
Livello di inf = Activity S Infinite a concentrazioni infinita,
AC50 = concentrazione alla quale l'attività raggiunge il 50% del livello massimo,
Coefficiente Hill n = Misura della pendenza a AC50, e
c = concentrazione in unità logaritmiche corrispondenti ai valori delle ascisse del grafico della curva dose-risposta.
NOTA: AC50 è una misura di potenza in cui i valori bassi indicano un'elevata potenza.
Representative Results
RTCA
Poiché gli endpoint HCS non sarà informativo quando non viene rilevato alcun effetto tossico, quei composti non mostrano diminuita vitalità cellulare fino alla più alta concentrazione nella RCTA non sono testati da HCS (Figura 3b, c, d, g, k, l, m , p). Composti mostravano un calo della vitalità cellulare al solo la più alta concentrazione (figura 3e, o) sono anche deselezionata per HCS. Infine, solo i componenti con LD computabile 50 (<20 mM) sono selezionati per ulteriore analisi HCS (figura 3a, f, h, j, n). HPHCs che soddisfano i criteri di cui sopra sono: 1-aminonaphtalene, arsenico (V), cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo.
HCS
Come un controllo di qualità (QC), controlli positivi sono fiprima analizzato per assicurare che procedura di colorazione in modo corretto. Quadri rappresentativi di cellule di controllo trattate positivi sono mostrati in Figura 6. I valori di dati sono normalizzati a veicolo come descritto in precedenza. Nessun curve dose-risposta sono riportati in grafico solo tre dosi sono testati e non tutte le tre dosi sono considerate in ogni time-point. dosi dei controlli positivi sono selezionati (sulla base di esperimenti precedenti, dati non mostrati) in modo che le risposte adeguate sono osservati per ciascun endpoint sia a 4 ore e 24 ore. In particolare dosi 1 e 2 sono utilizzati per valutare l'effetto a 4 ore mentre dosi 2 e 3 vengono utilizzati per valutare l'effetto a 24 ore. Le piastre sono scartati se nessuna risposta si osserva per le dosi di controllo positivo. Si noti che per tutti gli endpoint, ad eccezione di potenziale di membrana mitocondriale e contenuto di GSH, si prevede un aumento della intensità del segnale.
Tutti i composti, ad eccezione di fenolo, ha indotto un fenotipo necrotico tipo, basata su una maggiore permeabilità della membrana cellulare (Figura 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, cromo (VI), Crotonaldehyde e fenolo sono stati identificati come essere genotossico sulla base di una maggiore fosforilazione della H2AX istone (Figura 7e, j, n, p). Fenolo e 1-aminonaphtalene sono stati trovati a causare una grave disfunzione mitocondriale (Figura 7b, o) che, con 1-aminonaphtalene, ha portato ad un aumento del rilascio di citocromo C (Figura 7c). Rilevamento di una maggiore attività delle caspasi 3/7 fornito la prova di evento apoptotico in seguito all'esposizione al cromo. Ossidativo induzione dello stress (ROS o GSH) è stata anche rilevata in seguito al trattamento con 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyde e fenolo (Figura 7d, m, q). Infine, Arsenico induce lo stress cellulare come dimostrato dalla maggiore fosforilazione del fattore di trascrizione cJun (figura 7g).
carico / 53.987 / 53987fig1.jpg "/>
Figura 1. Composto Tox-Profiler flusso di lavoro. A) Schema del flusso di lavoro ha seguito in questo studio. In primo luogo, un risultato dose gamma è stata effettuata utilizzando la piattaforma RTCA per selezionare dosi appropriate per la successiva HCS per caratterizzare i profili di tossicità specifici composti. B) progettazione sperimentale dello studio. 24 ore dopo la semina, le cellule sono state dosate e valori di impedenza costantemente monitorata nel corso dei seguenti 24 ore, mentre gli endpoint HCS sono stati studiati 4 e 24 ore dopo la somministrazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. RTCA Piastra di esposizione. Piatto principale composto in primo luogo è generato eseguendo un cinque fasi diluizione 1:10 di serie. Ogni composto,incluso il controllo del veicolo (dose 0) viene aggiunto in triplice copia alla piastra di esposizione insieme medio e staurosporina come controlli. Si noti che le dosi sequenza è mantenuta al momento del trasferimento, le dosi più alte sono in numero di riga 1 mentre comandi del veicolo sono in numero di riga 7. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rappresentante RTCA della vitalità cellulare risultati. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropano, c) Acetamide, d) Acetone, e) acrilamide, f) Arsenico (V), g) Benzene, h) Cromo (VI) , j) Crotonaldehyde, k) Metiletilchetone, l) Nickel (II), m) nitrobenzene, n) fenolo, o) chinolina, p) Toluene. A 24 ore dopo la somministrazione, l'area sotto la curva (AUC) è stata calcolata per ogni dose (incluso il controllo positivo e veicolo) e normalizzati in una gamma da 0 a -100 attività% (asse y), dove 0 riflette l'attività di il veicolo e -100 del controllo positivo. I valori sono stati poi tracciati e montate con una equazione Hill quattro parametri e, quando possibile, DL 50 è stato calcolato. Le concentrazioni sono espresse su una scala logaritmica (asse x). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Schema di diluizione per il controllo positivo Composti per HCS Assays. A) Aggiunta di controlli positivi e vevei- alla diluizione di serie targa. b) la diluizione seriale dei controlli positivi. c) 200X controlli positivi dosi. de) diluizione dei controlli 200X dosi positivi nel medio (01:40) per generare la piastra di controllo positivo contenente le dosi 5x. Si noti che ogni dose viene diluito in triplicato per riflettere il layout finale nella piastra di esposizione). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. HCS Piastra di esposizione. Piatto principale composto in primo luogo è generato effettuando una diluizione in cinque fasi. Ogni composto, compreso il controllo del veicolo (dose 0) viene aggiunto in triplice copia alla piastra di esposizione ei controlli positivi. Si noti che l'ordine dosi viene mantenuto al momento del trasferimento,dosi più alte sono in numero di riga 1 mentre comandi del veicolo sono in numero di riga 7. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 6. Rappresentante fluorescenti Foto di anticorpi o di Dye-macchiati Cells a) Parametri nucleari - colorante nucleare: un colorante. Permeabili, che si lega al DNA in cellule vive o fissi. Questa macchia è utilizzato per identificare le cellule singole etichettatura regione nucleare b) Necrosi - colorante permeabilità della membrana cellulare. Rilevamento Dye a base di integrità della membrana cellulare. Il reagente è intrinsecamente impermeabili alla membrana cellulare. Durante necrosi, la membrana diventa permeabile e il colorante entra nella cellula e si lega al DNA producendo una forte fluorescenza s. ignal c) L'apoptosi - citocromo C: Individuazione di anticorpi a base del rilascio di citocromo C, un marchio di garanzia ben noto di apoptosi precoce. Su induzione di apoptosi, citocromo c viene rilasciato dai mitocondri e diffonde nel nucleo d) danno del DNA - pH2AX:.. Individuazione di anticorpi a base di fosforilazione dell'istone H2AX, un marchio di garanzia ben noto di doppie rotture del DNA e) Lo stress chinasi - cJun:. individuazione di anticorpi a base di fosforilazione in Ser-73 di cJun, un marchio di garanzia ben noto di stress cellulare f) lo stress ossidativo - DHE: rilevazione Dye a base di radicali superossido. Dihydroethidium stessa fluorescente blu nel citoplasma mentre la forma ossidata etidio reagisce in rosso su DNA intercalazione g) GSH - mBcl:. Rilevamento basata Dye di molecole libere GSH. mBcl reagisce con GSH agenerare un prodotto altamente fluorescente h) apoptosi - caspasi 3/7 di attivazione:. rilevamento Dye a base di caspasi 3/7 attività. Il reagente è non fluorescente con un peptide di quattro amminico che inibisce il legame del DNA. Dopo l'attivazione della caspasi-3/7, il peptide viene scisso consentire al colorante di legarsi a DNA e produrre un luminoso risposta fluorogenica. Pannelli BH mostrano cellule di controllo trattate positivi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Rappresentante HCS Risultati. 1-aminonaphtalene (ae), arsenico (V) (F e G), cromo (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) e fenolo (OQ). 4 ore (linea blu) e24 hr segnali (linea arancione) sono stati calcolati per ogni dosi e normalizzati all'attività veicolo (0%). I valori che non sono inclusi in curva calcoli di montaggio sono mostrati in grigio. Le concentrazioni sono espresse su una scala logaritmica (asse x). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| saggio | Endpoint # | endpoint biologica | compartimento cellulare | funzione di uscita |
| citotossicità | 1 | Massa mitocondriale 6 | Citoplasma | superficie media Spot |
| 2 | Potenziale di membrana mitocondriale 6 | Citoplasma | intensità media Spot | |
| 3 | rilascio del citocromo C | Nucleo | intensità media | | |
| 4 | Permeabilità della membrana cellulare 8 | Nucleo | intensità media | |
| I danni del DNA | 5 | fosfo-H2AX 9 | Nucleo | intensità media |
| Lo stress chinasi | 6 | fosfo-cJun 10 | Nucleo | intensità media |
| ROS | 7 | ROS 11 | Nucleo | intensità media |
| contenuto di GSH | 8 | GSH 12 | Citoplasma | intensità media Spot |
| L'apoptosi | 9 | Caspasi 3 13 | Citoplasma | intensità media Spot |
Tabella 1. Elenco delle HCS unssays ed endpoint.
| Veicolo | dosi RTCA (micron) | LD 50 | dosi HCS | |||||||||||
| La vitalità cellulare-selezionati (micron) | 3R4F (nm) | |||||||||||||
| 1-Aminonaphtalene | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 280 micron | 2.000 | 500 | 200 | 150 | 0,27 | |
| 2-nitropropano | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| acetamide | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Acetone | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| L'acrilamide | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Arsenico (V) | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 160 micron | 200 | 100 | 50 | 25 | <td> 0,17||
| Benzene | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Il cromo (VI) | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 20 micron | 100 | 50 | 20 | 10 | 0.06 | |
| Crotonaldehyde | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 200 pM | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2.000 | |
| Metil etil chetone | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mm | ||||||
| Nichel | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| nitrobenzene | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Fenolo | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 2.300 micron | 5.000 | 2.000 | 1.000 | 500 | 240 | |
| chinolina | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 0.2 | > 20 mM | |||||||
| toluene | acqua | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
Tabella 2. Elenco dei composti HPHC testati con LD relativa 50 a 24 ore di trattamento. I composti selezionati per l'analisi HCS sono evidenziate in arancio e dosi testate sono anche dato. La dose 3R4F è equivalente alla quantità di componente presente nel fumo di uno stick dalla 3R4F sigarette riferimento.
| saggio | Composto | Soluzione madre | Solvente Dose (s) (micron) | |||
| La vitalità cellulare | staurosporine | 10 mM | DMSO | 50 | ||
| citotossicità | valinomicina | 10 mM | DMSO | 50 | 20 | 5 |
| I danni del DNA | Il paraquat | 100 mM | DMSO | 500 | 200 | 50 |
| Lo stress chinasi | anisomycin | 2 mm | DMSO | 10 | 4 | 1 |
| ROS | rotenone | 200 mM | DMSO | 1.000 | 400 | 100 |
| contenuto di GSH | acido etacrinico | 200 mM | DMSO | 1.000 | 400 | 100 |
| L'apoptosi | staurosporine | 40 mM | DMSO | 200 </ Td> | 50 | 20 |
Tabella 3. Elenco dei controlli positivi e le concentrazioni usate per ogni test.
Discussion
Il fabbisogno di alternative alla sperimentazione animale e per i nuovi metodi di analisi ad alto rendimento sono stati ampiamente discussi nel corso degli ultimi anni. Questo ha portato gli scienziati e le autorità di regolamentazione per studiare metodi alternativi per i test di tossicità di serie, utilizzando saggi cellulari che simulano da vicino la fisiologia dei tessuti bersaglio. In questo studio, abbiamo dimostrato l'applicabilità di combinare un analizzatore di cellule in tempo reale (RTCA) con una piattaforma alta schermatura contenuto (HCS) per valutare l'impatto dell'esposizione a singoli costituenti CS sulle cellule epiteliali del polmone umano. Questa configurazione potrebbe essere analogamente applicata per valutare la citotossicità indotta da vari altri inquinanti atmosferici, particelle sospese nell'aria, e nanoparticelle. Inoltre, i risultati ottenuti possono essere abbinati con quelli di trascrittomica intero genoma e metodi di calcolo basati su reti biologiche causali. Come riportato in precedenza, questo approccio ci ha permesso di corroborare i dati sul percorso molecolareperturbazione in seguito all'esposizione CS 5 con punti finali HCS, affrontare queste perturbazioni pathway anche fenotipicamente.
Come un saggio di diagramma di flusso, analisi delle cellule in tempo reale fornisce informazioni relative redditività a cellule in una risoluzione dose e dipendente dal tempo, che permette di migliorare il processo decisionale che la dose e il punto di tempo di esposizione possono essere favorevoli per l'analisi a valle 14. Il principio dell'analizzatore si basa sulle variazioni di impedenza elettrica generata dalle celle come si attaccano e diffusione su una superficie di coltura ben coperto con un microelettrodo oro. L'impedenza viene convertito in un parametro adimensionale chiamato cella-index, che può essere utilizzato per monitorare l'adesione cellulare, diffusione, morfologia e infine vitalità cellulare. Sebbene questa tecnica non fornisce informazioni sui meccanismi citotossici, la sua sensibilità permette di rilevare cambiamenti morfologici cellulari anche a dosi molto basse in cui il HCS non è informativo (dati non mostrati). Sulla base di previesperimenti OU, abbiamo notato che la metodologia RTCA è in grado di rilevare i cambiamenti morfologici a dosi inferiori rispetto agli endpoint HCS.
A seguito di screening iniziale con l'analizzatore di cellule in tempo reale, una piattaforma HCS è stato utilizzato per ottenere informazioni più approfondite sul tipo di citotossicità suscitato da ogni HPHC. Il pannello di test HCS permesso al profilo HPHCs verso il loro potenziale impatto sulla compartimenti cellulari / organelli, nonché per identificare quelli scatenanti la genotossicità o stress ossidativo. L'analisi ha rivelato i profili distinti per cui i HPHCs selezionati inducono citotossicità in cellule NHBE. In generale, tutti i composti, tranne fenolo, sono stati trovati per indurre necrosi alle dosi più alte testate. In accordo con un ruolo potenziale nello sviluppo del cancro 1-aminonaphtalene fosforilazione indotta di H2AX come marker per la genotossicità, però il pannello HCS anche l'attività scoperta di questo HPHC nella lettura tossicità mitocondriale (massa aumentata e citocromo C ReleaSE) e lo stress ossidativo (GSH esaurimento). Allo stesso modo, come precedentemente descritto, fenolo è stato identificato per indurre disfunzione mitocondriale e causare danni al DNA e deplezione di GSH. Il cromo (VI), uno dei composti classificati come cancerogeni di gruppo I, e Crotonaldehyde sono stati anche identificati come sia genotossico, in particolare cromo (VI) l'apoptosi indotta anche (attivazione a cascata caspasi) e Crotonaldehyde causato aumentata produzione di ROS. Infine arsenico (V), è stato trovato per indurre cJun fosforilazione, che è un marker di attivazione della via dello stress chinasi.
In questo studio, abbiamo utilizzato le cellule NHBE come modello per le cellule epiteliali polmonari in vitro. Utilizzando queste cellule in un ambiente HCS è senza precedenti e ha permesso l'indagine di una più ampia gamma di endpoint, inclusi gli indicatori di genotossicità e lo stress ossidativo. Sia cellule vive e approcci di colorazione delle cellule fissi sono stati descritti nei nostri protocolli, che dimostra la flessibilità della tecnica complessiva. in fatto, gli stessi protocolli può essere applicato ad un'ampia gamma di obiettivi, che può essere affrontato mediante l'uso di qualsiasi colorante fluorescente o anticorpi. Per il buon esito dei protocolli di colorazione vivi, è importante rispettare il tempo di incubazione, come alcuni dei coloranti hanno una limitata emivita e il segnale di fluorescenza può diminuire prima dell'acquisizione dell'immagine è completata. E 'anche importante considerare che se viene usato un tipo cella diversa, tutte le condizioni colorante deve essere rivalutati, come la concentrazione ottimale di colorante e il tempo di incubazione possono essere diverse.
Nella carta corrente abbiamo descritto uno scenario in cui solo cinque composti in cui vagliati con la metodologia HCS. Considerando il layout di piastra precedentemente descritto, sono stati dosati oltre 2 diversi set piastre per un totale di 24 piastre (6 saggi e 2 punti temporali) .Il numero delle piastre potrebbe anche essere aumentata, consentendo per lo screening simultaneo di più composti o gli invesdell'inchiesta di più endpoint. Prima di ciò, tuttavia, si dovrebbe prendere in considerazione che taluni punti finali (GSH e ROS) richiedono immediata acquisizione, e di conseguenza, il dosaggio delle piastre devono essere eseguite in maniera sfalsata per permettere l'acquisizione del piatto precedente. D'altra parte, utilizzando un protocollo di colorazione cellulare fissa rappresenta un vantaggio in quanto le piastre possono essere impilati, interrompendo il protocollo in qualsiasi fase dopo la fissazione, per il completamento della procedura di colorazione in una fase successiva. Questo approccio, per esempio, potrebbe fornire all'operatore il tempo per completare tutte le piastre di marcatura cellulare vivi senza compromettere la qualità dei dati.
Per ottimizzare ulteriormente il flusso di lavoro riducendo il numero di piastre, sarebbe anche possibile multiplare più endpoint insieme. Ad esempio in questo contesto danni del DNA e lo stress chinasi potrebbe essere indagato insieme semplicemente utilizzando due anticorpo secondario con fluorocromi che emettono in diversi channels. Il continuo sviluppo della piattaforma HCS, compresi semina completamente automatizzato cellule, diluizione composto, dosaggio e colorazione, così come l'aggiunta di nuovi endpoint si espanderà ulteriormente la capacità della piattaforma HCS come un potente strumento di profilatura per HPHCs su epiteliale e altri tipi cellulari .
Disclosures
Tutti gli autori sono dipendenti di Philip Morris International. Philip Morris International è l'unica fonte di finanziamento e sponsor di questo progetto.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Karsta Luettich e Grégory Vuillaume per la loro revisione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75 cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10x permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10x blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
