Abstract
Sigara dumanı (CS), kardiyovasküler ve akciğer hastalıkları için önemli bir risk faktörüdür. CS onun genel toksisite bireysel bileşenlerin katkıları değerlendirmek için zorlu 1 7.000 'den fazla kimyasal madde içeren karmaşık bir aerosol olduğu için. ABD Gıda ve İlaç tarafından tanımlanan tek tek bileşenlerin yanı sıra karışımların toksikolojik profilleri, ancak verimlilikte bir tütün dumanının zararlı ve Potansiyel Zararlı Bileşenlerinin (HPHCs) ve profil oluşturma özelliği sağlar tarama araçları, yüksek uygulayarak, in vitro kurulabilir İdaresi (FDA). 2
Bir ilk değerlendirmenin, bir empedans tabanlı enstrüman bileşiğin toksisite gerçek zamanlı, etiket ücretsiz değerlendirme için kullanıldı. alet okuması hep birlikte hücre durumuna genel bir bakış sağlamak hücre yapışması, canlılığı ve morfolojisi dayanır. Hücre indeksi adında bir boyutsuz parametre, ölçümü için kullanılır. dif kümesiferent boyama protokolleri bir floresan görüntüleme bazlı soruşturma için geliştirilmiştir ve bir HCS platformu her HPHC tarafından ortaya sitotoksisite tür daha derinlemesine bilgi elde etmek için kullanıldı.
Onlar hesaplanabilir LD 50 (<20 mM) kayıtlı olarak test edilen 15 bileşenlerin, sadece beş HCS tabanlı analiz için seçilmiştir. Bu 1-aminonaphtalene, Arsenik (V), Krom (VI), Crotonaldehyde ve Fenol dahil. HCS'de etkilerini esas alarak, 1-aminonaphtalene ve Fenol artan histon H2AX fosforilasyonuna dayanan genotoksik krom (VI) ile birlikte, mitokondriyal disfonksiyon indüklemek için tespit edilebilir ve. Krotonaldehit stres kinaz yolu aktivatörü gibi bir oksidatif stres indükleyici ve arsenik olarak tespit edilmiştir.
Bu çalışma, empedansı bazlı ve HCS teknolojilerinin bir kombinasyonu CS bileşenlerin in vitro değerlendirilmesi için sağlam bir araç sağlar göstermektedir.
Introduction
Toksikolojik risk değerlendirmesi tarihsel yaşam bilimlerindeki temel olsa da, aynı zamanda insanlar ve yüksek maliyet tutarsız çevirilebilirlik olarak eksiklikleri ile bağlantılıdır, hayvan modellerinin kullanımı dayanmıştır. Ayrıca, "3R" 2 (değiştirme, azaltma ve arıtma) ruhu hayvan testlerine alternatifler bulmak için giderek artan bir çaba olmuştur. Bu çaba, son birkaç yıl içinde ivme kazanmıştır çünkü sadece özellikle Avrupa Birliği'nde bu tür yüksek verimlilik teknikleri ve aynı zamanda, çünkü hayvanlar üzerinde test kullanımını kısıtlayan mevzuat sistem biyolojisi yaklaşımları olarak son gelişmeler, evi.
Toksik hakaretlere tepki düzenleyen hücresel sinyal yollarının karmaşıklığı tek toksikolojik son noktalar kullanılarak bazı bileşiklerin toksikolojik temelini açıklamak için yeterli olmayacaktır o belli yapar. Bunun için, etkileşen p yüzlerce etkileşimibiyolojik ağa katkıda roteinler de dikkate alınması gerekir. Bu ağlarda Toksik maddelerin etkisini araştırmak için, fenotipik orta ve yüksek verimli tarama deneyleri ile kombine bir sistem toksikoloji yaklaşımı güçlerini anlaması ve aynı zamanda bireysel toksik maddelerin etki mekanizması hakkında daha fazla bilgi sağlamak için yararlıdır.
Bu çalışmada elde süreç ve spesifik flüoresan bazlı hücresel analizlerden elde edilen görüntü verilerini analiz otomatik bir mikroskop ve bir biyolojik yazılım uygulaması oluşan güçlü bir tarama aracı, yanı HCS kullanılabilir. Bu, tek bir hücre ya da hücre-altı seviyede, sayısal olarak bir hücre içinde görsel değişiklikler sağlar ve birçok parametre eş zamanlı olarak analiz edilmesi. 3, örneğin, DNA, iki iplikçikli kırılmalar histon H2AX fosforilasyon bir antikor bazlı kimlik kullanılarak değerlendirildi ve reaktif oksijen türleri (ROS), bir hücre-Perm kullanılarak ölçüldüEable süperoksit duyarlı boya.
Akciğer epitel hücreleri sigara dumanı olmak üzere solunan toksik maddelerin, karşı ilk biyolojik bariyer temsil çünkü, biz Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi tarafından yayınlanan HPHCs etkisini profil bir in vitro model olarak primer bronş epitel hücreleri kullanılmaktadır. 4 Bu el yazması bir takip olduğunu biz HPHCs farklı bir alt kümesi biyolojik etkilerini değerlendirdi olan önceki bir çalışmada 5 üzerinde -up.
In vitro sitotoksisite değerlendirmek için bizim iş akışının bir parçası olarak, başlangıçta bize sonraki HCS için uygun doz aralıkları, kurmalarına izin (RTCA) sistemi, bir empedans tabanlı gerçek zamanlı hücre analiz kullanılarak, 15 HPHC en bir seçim potenslerine değerlendirdi analiz (Şekil 1). Daha sonra hücresel toksisite dokuz çok parametrik son noktalar kullanılarak gerçekleştirilmiştir bir toksikolojik HCS değerlendirme, her iki zaman noktalarında (4 ve 24 saat) izlenir. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi, 7 aktivitesi, sitokrom C salınımı ve hücre membran geçirgenliği - kullanılan belirteçler mitokondriyal toksisite, DNA hasarı, stres kinaz, reaktif oksijen türlerinin (ROS), glutatyon (GSH) içeriği, kaspaz 3'ün göstermekteydi.
Bizim yaklaşım etkin kimlik ve doza ve zamana bağımlı örnekleme yoluyla sigara duman bileşenlerinin etkisi karakterizasyonu. Sonuç olarak, bu durum, her HPHC için bir in vitro toksikolojik profil üretilmektedir. Çok omik yaklaşımlar da daha HCS analizi tamamlamak için kullanılabilir. Bu nihayet hücre haberleşmesi ve / veya transkripsiyon seviyesinde etkileri daha derin bir anlayış sağlayacaktır.
Protocol
1. Hasat Normal İnsan Bronş Epitel Hücreleri (NHBEs)
- Ön sıcak hücre kültür ortamı (bronşiyal epitel hücre büyüme ortamı ile desteklenmiş aracı madde), 37 ° C'de su banyosu içinde HEPES, tripsin ve tripsin nötrleştirme çözeltisi (TNS).
- izdiham% 80'i ulaşıldığında hücreler hasat.
Not: koşulları Tohumlanmayı takiben NHBE hücre kültürü, 20 ml ortam ile kaplanmamış T75 şişelerinde uygun izdiham elde etmek için kullanılabilir:- 3 günlük kültürü için 1 x 10 6 hücre, 4 günlük kültürü için 0,5 x 10 6 hücre ve 5 günlük kültür için 0.25 x 10 6 hücre Tohum. Hücreler besin yenilemek için kültüründe zaman 2 günde orta değiştirin. Kültür, 37 ° C'de hücre ve% 5 CO2.
- Şişeye (ler) süpernatantı ve hücreleri yıkamak için HEPES ilave (örneğin., 75 cm 2 şişeye 3 ml) eklenmiştir. HEPES sol ile hücre mono tabakasının örtecek şekilde her şişeye döndürerekKatkı.
- HEPES çözeltisini çıkarın ve tripsin solüsyonu (örn., 75 cm 2 şişeye 3 ml) eklenmiştir. Tripsin çözeltisi hücre tek tabaka kapak şişeye döndürün.
- 37 ± 2 ° C 'de 5 dakika süre ile bir balon inkübe edin. mikroskop altında hücre ayrışması izlenmesi ve gerekirse, daha inkübe ve yavaşça geri kalan bağlı hücreler serbest bırakmak için şişeyi dokunun.
- Reaksiyonu durdurmak için TNS ekleyin (örn., 75 cm 2 şişeye 3 mi) ve 15 ml'lik bir tüp hücre süspansiyonu aktarın.
- 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj.
- Süpernatant atılır ve homojen bir hücre süspansiyonu elde etmek için hafifçe karıştırılarak, taze ortam 10 ml hücre pelletini yeniden askıya.
- hücreler agrega kaldırmak ve saymak için 100 mcM hücre süzgecinden hücre süspansiyonu Filtre. Not: laboratuvarımızda bir elektrik alanı çok kanallı hücresi sayma sistemi hassas ve tutarlı bir viabl değerlendirmek için kullanıldıe hücre sayısı.
2. Gerçek Zamanlı Hücre Analiz (RTCA) Doz Aralığı Bulma (DRF) tabanlı
NOT: 1) 2) seçin bileşikler ayrıca HCS tarafından araştırılması gereken, bileşik toksisitesini değerlendirmek ve 3) HCS için uygun dozlar seçin: Bir empedans tabanlı ölçüm sistemi kullanıldı. RCTA plakalarda NHBE hücreleri her bir 100 ul ortam mevcut test bileşiği dilüsyonları 25 ul eklenmesi ile dozlanmıştır. Bu nedenle, tüm test solüsyonları 5 kez (5x), istenen nihai konsantrasyonda hazırlanır.
- Yayımlama NHBE Hücreler
- empedans ölçüm sayısını ve süresini tanımlamak için enstrüman Program. Bu çalışmada, veriler 48 saat boyunca her 15 dakikada bir kaydedilmiştir (24 saat ila ± 2 saat önce ve test maddeleri ile hücrelerin dozlamadan sonra 24 saat).
- 96 oyuklu bir RTCA plakanın her oyuğuna önceden ısıtılmış sıvının 50 ul pipetleme plaka arka ölçün. Not: Bu adım, bir teknik gereklilik temsilalet daha sonra hücre bazlı hesaplama için bir temel referans olarak kullanılan, orta elektrik direncini hesaplamak için kullanılır.
- 50 ul / oyuk ortamın zaten aracı arka planı için ilave edildiği RTCA plakanın her oyuğuna (7200 hücre / oyuk) 144,000 hücre / ml (±% 5) bir konsantrasyonda bir hücre süspansiyonu ve 50 ul hücre süspansiyonu ekleyin ölçüm.
- Hücreler (hücrelerin homojen dağılımını iyileştirmek için) RTCA yuvasının içine yerleştirmeden önce, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca uygun olsun. Inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2) 'de RTCA beşiği RTCA inkübe edin ve dozlamadan önce önümüzdeki 24 ± 2 saat süre ile veri kayıt başlar.
- HPHCs ve Pozitif Kontroller çözeltiler
- Pozitif Kontrol Sulandırma
- Staurosporin stok solüsyonu, DMSO içinde (10 mM) 1:10 d 5 ul (bakınız Tablo 3) ile seyreltilirortamın 195 ul ilution 5x çalışma çözeltisi elde edildi.
- HPHC Sulandırma
- / Çözülür 1 M stok çözelti oluşturmak için araç (Tablo 2), her HPHC seyreltin. 100 mM'lik çözelti oluşturmak için bir ortam içinde, her HPHC stok solüsyonu 1:10 seyreltilir.
- 5x çalışma çözümleri (Şekil 2) elde etmek için orta +% 10 araç kullanırken bir beş adım 1:10 seri seyreltme yapılarak "bileşik ana plaka" oluşturun. Not: Son olarak, son dozlar: 0.2 uM, 2 uM, 20 uM, 0.2 mM, 2 mM, 20 mM. Ayrıca, bu aşamada, sadece aracın karşılık gelen dozu 0 hazırlanması.
- Doz
- RTCA enstrüman Pause ve plakayı çıkarmak için beşik açın.
- plaka çıkarın ve RTCA dışında deneysel işlemler sırasında RTCA plakanın ısısını dengelemek için tasarlanmış RTCA plaka sıcaklığı aracı (koyunistasyonu) empedans ölçümü etkileyebilecek hücreleri, soğutma önlemek için.
- (Şekil 2) (satır sayısı 7 üst satır ve araç kontrolü en yüksek doz) Bileşik ana plakası aynı doz düzeni sağlamak üç kopya halinde hücrelere "bileşik ana plaka" 25 ul 5x çözüm ekleyin. Mevcut (100 ul) hücre kültür ortamı çıkarmayın.
- Mevcut kültür ortamı çıkarmadan alt satırda (yarım-sağ) hücrelere 25 ul 5x pozitif kontrol çözüm ekleyin. Mevcut hücre kültür ortamı çıkarmadan alt satır (yarı sol) hücrelere 25 ul ortam ekleyin.
- Plaka patı ile plaka mühür. geri RTCA beşiğinde plaka koyun ve kilitleyin. İstenen maruz kalma süresi için kayıt Yeniden veriler (örneğin., 24 saat). Not: Bu sızdırmazlık filmin kullanılması iyi-iyi çapraz kontaminasyon dahil olmak üzere potansiyel kontaminasyonu önlemek için tavsiye edilir.
- <strong> Veri Analizi RTCA ve LD 50 Hesaplama
- Bir metin (.txt) veya excel (.xls) dosyası olarak ihracat ham veriler. Not: Dosya plaka düzeni (Bileşikler, dozlar ve iyi pozisyonu) ile ilgili tüm bilgileri içerir. Ham hücre endeks değerleri 96 kuyu biçimi (yansıtma plaka kuyu dağılımı) düzenlenmiştir ve kayıt meydana geldiği her zaman noktalarında verilmektedir. T zamanında 96 oyuklu bir plaka içerisinde pozisyonda I, Cl değerinin T (I) ile gösterilir.
- Bir normalleşme olarak tanımlamak 96 plaka her pozisyon i (doz öncesi son zaman noktası referans örneğin, Hücre Endeksi 23 saat 50 dakika pozisyon i CI t (i) = 23 ° C'de 00 sn: 50: 00 = CI Referans (I) '). Not: dozajlama gerçekleştirildiğinde Bu bilgiler açıklamalı gerekir.
- Bölme, iyi bazında, normalizasyon referans olarak her zaman nokta değerleri dozlama anda tüm değerlerini normalize. positio normalize değeriNi t zamanında 96 oyuklu bir plaka içerisinde, NCI t (i) ile ifade edilir ve bu nedenle tüm t NCI T (I) '= Cl T (I) / CI Referans: (i) ile tanımlanır.
- 24 saat sonra, eğri (AUC) altındaki alanı hesaplayın pozitif kontrol ve araç için pozisyonlar da dahil olmak üzere, (96 oyuklu bir plaka içerisinde konumu I), her bir numune bir post-dozlama.
- Ben her dikdörtgenin alanları toplanmasıyla elde edilir pozisyonda AUC elde, iki timepoints arasında olmak her dikdörtgen t k ve t l (t k <t l) ile gösterilir; X = T l x * y kullanılarak her bir dikdörtgen alanı hesaplamak - T K, iki zaman noktalarında ve Y, iki zaman noktalarında (y = (NCI TK, (i) + NCI TP (I) ') aktivitesi ortalama olarak arasındaki mesafe olarak / 2).
Not: AUC 24 saat sonra I AUC (I) 'ile gösterilir pozisyon için kan örnekleri alındı. Tüm koşullar üçlü kuyucuklara plakalanır gibi üç değerlerinin ortalaması kullanılmaktadır.
<li> Aşağıdaki denklemi kullanarak değerleri normalize: - Ben her dikdörtgenin alanları toplanmasıyla elde edilir pozisyonda AUC elde, iki timepoints arasında olmak her dikdörtgen t k ve t l (t k <t l) ile gösterilir; X = T l x * y kullanılarak her bir dikdörtgen alanı hesaplamak - T K, iki zaman noktalarında ve Y, iki zaman noktalarında (y = (NCI TK, (i) + NCI TP (I) ') aktivitesi ortalama olarak arasındaki mesafe olarak / 2).
burada i AUC 24 saat sonra-dozlama hesaplandı olan 96 oyuklu bir plaka içerisinde konumu,
Araç, 24 saat sonra-dozlama bir plaka aracın kuyuları için AUC değerlerinin ortalama olduğu
Pozitif kontrol, 24 saat sonra-dozlama bir plaka pozitif kontrol kuyuları için AUC değerlerinin ortalama olduğu
Veya aracı (% 0) için arzu edilen ortalama normalize değeri, ve
SC pozitif kontroller için istenen medyan normalleştirilmiş değeri (-100%)
NOT: Bu aşamanın sonunda, bir veri kümesi de I ve karşılık gelen / konumunda yer alan örnek uygulandığı (logaritmik birimi olarak) 96 oyuklu bir plaka, bir toplama CI her konum i, içeren elde edilen 24 saat AUC_normaliz sonrası dozlama normalize AUCEd (i). - Arsa ve uyum (i AUC_normalized (i) c) 4-parametreleri Tepesi denklem kullanılarak -Değerler. Mümkün olduğunda, aynı zamanda LD 50 hesaplayın.
burada Y = AUC_normalized,
Test bileşiği sıfır konsantrasyonunda sıfır Etkinlik S 0 = Etkinlik düzeyi,
Sonsuz konsantrasyonda sonsuz Etkinlik S inf = Etkinlik düzeyi,
Etkinlik maksimum seviyenin% 50 ulaştığı AC50 = Konsantrasyon,
Hill katsayısı n = AC50 de yamaç Tedbir ve
Doz-tepki eğrisi çizilir x-ekseni üzerindeki değerler karşılık gelen logaritmik birimleri c = konsantrasyon.
NOT: AC50 LD 50 (sitotoksisite deneyleri) karşılık gelir. Düşük değerler, yüksek kuvvetini gösterir tesirliliğinin bir ölçüsüdür.
- Pozitif Kontrol Sulandırma
3. HCS tarafından Toksikolojik Etkilerinin Ölçülmesi
NOT: Altı farklı deneylerde gruplandırılmış toksisite dokuz çok parametrik belirteçlerin, toplam, HCS platformu (Tablo 1) kullanılarak ölçülür. RTCA hücre canlılığı analizine göre (Bölüm 2), her bir bileşenin doz aralığı tanımlanır ve 3R4F referans dozunun da dahildir. Referans doz referans sigara 3R4F itibaren bir sopa duman HPHC miktarına eşdeğerdir.
- Yayımlama NHBE Hücreler
- (12,000 hücre / oyuk) 120,000 hücre / ml (±% 5) bir hücre süspansiyonu hazırlamak ve 96 oyuklu HCS plakanın her oyuğuna 100 ul hücre süspansiyonu ekleyin. Tüm tahliller (Sitotoksisite, DNA hasarı, Stres kinaz, ROS, GSH içeriği ve Apoptozis) ve zaman noktalarında (4 ve 24 saat) değerlendirilmesi için yeterli tabak hazırlayın.
- Hücreler oyuklara ekleyin ve daha sonra 3 inkübe izin 30 dakika boyunca oda sıcaklığında HCS plakaları boş7 ° C ve dozlamadan önce 24 ± 2 saat süre ile% 5 CO2.
- HCHPs ve Pozitif Kontroller seyreltilmesi
Not: HCS plakalarda NHBE hücreleri her bir zaten mevcut ortamın 100 ul test numunesi çözeltilerin 25 ul ekleyerek dozlanacaktır. Bu nedenle, tüm dozlar 5x arzu edilen nihai konsantrasyonu hazırlanır.- Pozitif Kontroller Sulandırma (Pozitif Kontrol Plaka)
- Her bir pozitif kontrol stok çözeltisi 40 ul koyun Sütun # 2 (Şekil 4a, kırmızı gölgeli Wells) (Tablo 3). Sütun 3. ve 5. (Şekil 4a, açık mavi gölgeli kuyu) ve sütun # 4 aracın 40 ul (Şekil 4a, açık mavi gölgeli kuyu) aracın 20 ul koyun.
- Sütun # 2 kuyulardan 12 ul çekilme sütun # 3 kuyulara onu dağıtmak ve karıştırın (Şekil 4b)Elde edilir ve her pozitif kontrol bileşiği (Şekil 4c) 3 doz (D1, D2 ve D3) ve araç (V) ile son bir seri seyreltme kadar devam eder. Pozitif kontrol plakası üretmek için, ortam (Şekil 4d) bileşiklerin bir 1:40 seyreltme hazırlar.
- HPHC Sulandırma (Bileşik Master Plaka)
Not: HCS HPHCs seçilen doz aralıkları Tablo 2'de listelenmiştir.- 100 mM'lik bir konsantrasyon için bir ortam içinde, her HPHC stok solüsyonu (1 M) 1:10 seyreltilir. Her HPHC için seçilen 5x dozları elde etmek için% 10 araç ile orta kullanarak dilüsyonları gerçekleştirin.
- Pozitif Kontroller Sulandırma (Pozitif Kontrol Plaka)
- Doz
- (Şekil 5) (satır sayısı 7 üst satır ve taşıyıcı kontrol içinde yüksek doz) Bileşik ana plaka ile aynı dozaj düzeni sağlamak üç kopya halinde hücrelere bileşiği, ana plakadan 5x çözeltiler 25 ul ekle. e çıkarmayınxisting (100 ul), hücre kültürü ortamı.
- Pozitif kontrol plakası (Şekil 5) ile aynı dozaj düzeni sağlamak alt satırında hücrelere pozitif kontrol plakasından 5x çözeltisi 25 ul ekle. Mevcut (100 ul) hücre kültür ortamı çıkarmayın. Not: Her deney belirli pozitif kontrole sahip olması; Tablo 3. İstenilen pozlama süresi (4 veya 24 saat) 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübe plakası bakın.
- boyanma
- Tüm deneyler için hazırlık
- Yıkama tamponu (PBS) ile 37 ° C'de çözeltiler önceden ısıtın.
- 37 ° C'de yıkama tamponu ve önceden sıcak bunun 89,19 ml 10.81 mi formaldehid% 37 eklenmesi sabitleme çözeltisi (% 4 formaldehid çözeltisi) hazırlayın.
- 37 ° C'de yıkama tamponu ve önceden sıcak bunu 90 ml 10x permeabilizasyon tampon maddesi 10 ml ekleyerek permeabilizasyon tamponu hazırlayın.
- Blo hazırlayın37 ° C'de yıkama tamponu ve önceden sıcak bunun 90 ml bloklama tamponu 10x, 10 ml ekleyerek cking tamponu.
- 37 ° C'de hücre kültürü ortamı önceden ısıtın.
- 4 ve 24 saat pozlama süreleri ulaşıldığında kez inkübatör HCS plakaları çıkarın ve her bir deney için aşağıdaki özel protokoller gerçekleştirin.
- Sitotoksisite Deneyi
- aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta Hacmi (ul) V = 50 x 1.2 x (kuyuların W sayısı) W
- satıcının talimatlarına uygun olarak Canlı Hücre Boyama Çözüm Mitokondri boya sulandırmak. satıcının talimatlarına uygun olarak Canlı Hücre Boyama Çözüm Membran Geçirgenlik boya sulandırmak.
- "Sitotoksisite deneyi" olarak belirlenmiş plaka (lar) her bir çukuruna 50 ul canlı hücre boyama solüsyonu ekleyin. Hücre kültür ortamı çıkarın ve 37 ° C'de,% 5 CO C'de 30 dakika boyunca inkübe DEĞİL
- daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında 20 dakika boyunca plaka (lar) inkübe yavaşça orta ve boyama çözeltisi aspire ve her bir sabitleme çözeltisi 100 ul / yuva ekleyin.
- Yavaşça sabitleme çözüm aspirat ve iyi yıkama tamponu / 100 ul ile bir kez yıkayın.
- Yıkama tamponu çıkarın ve her bir 100 ul / göz 1X permeabilizasyon tamponu ekleyebilir ve karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir.
- Aspire permeabilizasyon tamponu ve yıkama tabaka iki kez 100 ul / oyuk yıkama tamponu.
- Aspire tampon ve her bir 1 x bloke edici tampon 100 ul ve karanlıkta, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe yıkama.
- aşağıdaki formüle göre birincil antibodi çözeltisinin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: tampon (ul) V engelleme hacmi = 50 x G 1.2 (kuyu B sayısı) x. Anti-sitokrom C antikoru (fare) 1. seyreltilir: 250 birincil antibodi çözeltisinin içine.
- Aspire bir bloke edici tamponHer bir oyuğa 50 ul / göz birincil antikor solüsyonu eklenir ve oda sıcaklığında karanlıkta 60 dakika süreyle inkübe d.
- aşağıdaki formüle göre ikincil Antikor ve Nükleer Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: tamponu (ul) V Engelleme Hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x. anti-fare antikoru 1 seyreltin: 500 sekonder antikor ve Nükleer Çözüm. Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 İkincil Antikor ve Nükleer Çözüm.
- Aspire primer antikor çözeltisi ve yıkama plakası 100 | il / göz yıkama tamponu plaka yıkayıcı kullanılarak üç defa.
- Aspire tamponu ve 50 ul / oyuk sekonder antikor ekleyin ve plaka (lar) her bir oyuğuna Nükleer Çözelti ve karanlıkta, oda sıcaklığında 60 dakika inkübe yıkama.
- Aspire sekonder antikor ve Nükleer çözümü ve Plakayı 100 | il / göz yıkama tamponu plaka yıkayıcı kullanılarak üç defa. 100 ul / yıkama tamponu da ekleyin. şimdi plaka (lar) (vardır)hazır HCS okuyucu üzerinde değerlendirilmek üzere.
- DNA Hasarı Testi
- Yavaşça "DNA hasarını" belirlenen levhalardan orta aspire.
- - 3.4.2.8 3.4.2.4: izah edildiği gibi aynı aşamaları yerine getirmektedirler. Bu durumda, yalnızca orta aşama 3.4.2.4 sırasında çıkarılan unutmayın.
- aşağıdaki formüle göre birincil antibodi çözeltisinin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W,
- Anti-fosfo H2AX antikoru (fare) 1. seyreltilir: Primer antikor çözeltisi 2.000.
- 3.4.2.10 tarif edildiği gibi aynı adımı gerçekleştirir.
- aşağıdaki formüle göre ikincil antikor Nükleer eriyiğin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W,
- anti-fare antikoru 1 seyreltin: 500 sekonder antikor ve Nükleer Çözüm.
- Nuclea seyreltinr boya 1: İkincil Antikor ve Nükleer Çözüm 1.000.
- dizisinde tarif edildiği gibi aynı adımları: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- Stres Kinaz Deneyi
- Yavaşça "Stres Kinaz" belirlenen plakaların her birinden orta aspire.
- - 3.4.2.8 3.4.2.4: izah edildiği gibi aynı aşamaları yerine getirmektedirler. Bu durumda, yalnızca orta aşama 3.4.2.4 sırasında çıkarılan unutmayın.
- aşağıdaki formüle göre birincil antibodi çözeltisinin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W,
- Anti-fosfo antikoru, cJun (tavşan) 1 seyreltin: 200 birincil antibodi çözeltisinin içine.
- 3.4.2.10 tarif edildiği gibi aynı adımı gerçekleştirir.
- aşağıdaki formüle göre ikincil antikor Nükleer eriyiğin yeterli bir hacmi (V) hazırlanması: Bloklama Tamponu hacmi (ul), V = 50 x 1.2 x (kuyu B sayısı) W,
- anti-tavşan antikoru 1 seyreltin: 500 sekonder antikor ve Nükleer Çözüm.
- Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 İkincil Antikor ve Nükleer Çözüm.
- dizisinde tarif edildiği gibi aynı adımları: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- ROS Deneyi
- aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x.
- satıcı talimatına göre Canlı Hücre Boyama Çözüm ROS boya seyreltin
- Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 Canlı Hücre Boyama Solution.3.4.5.4 olarak) "ROS" belirlenen her kuyucuğu 50 ul Canlı Hücre Boyama Çözüm ekleyin; hücre kültürü ortamını çıkarın ve karanlıkta, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe DEĞİL.
- Yavaşça orta ve boyama çözeltisi aspire ve 100 ul / oyuk, orta plaka, üç kez yıkayın.
- _ 100 eklemek, orta aspire6 L / oyuk sabitleme her oyuğa çözeltisi ve karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dakika boyunca plaka inkübe edin.
- Yavaşça sabitleme çözüm aspirat ve iyi yıkama tamponu / 100 ul plaka üç kez yıkayın.
- 100 ul / yuva yıkama tamponu ilave edin. Plakası (ler) artık hazır (vardır).
- 1 saat içinde HCS okuyucu üzerinde plaka değerlendirin.
- GSH miktar tayini
- aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x.
- 1000 Canlı Hücre Nükleer Boyama Solution.3.4.6.3 olarak): Nükleer boya (Uzak Kırmızı) 1 seyreltin. "GSH içeriği" belirlenen plakaların her kuyuya Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm 50 ul ekleyin. Hücre kültürü ortamını çıkarın ve 37 ° C'de,% 5 CO2 seviyesinde 30 dakika inkübe DEĞİL.
- göre Canlı Hücre GSH Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayınAşağıdaki formül: HBSS hacmi (ul) V = 50 x 1.2 x (kuyuların W sayısı) W
- satıcının talimatlarına göre Canlı Hücre GSH Boyama Çözüm GSH boya sulandırmak.
- Yavaşça orta ve nükleer boyama çözeltisi aspire ve 100 ul / oyuk, orta plaka, üç kez yıkayın.
- Aspire orta ve plaka (lar) her bir 100 ul / oyuk canlı hücre GSH boyama solüsyonu ekleyin.
- karanlıkta, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Plakası (ler) artık hazır (vardır).
- 1 saat içinde HCS Reader plaka (lar) değerlendirin.
- Apoptosis denemesi
- aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Orta (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x.
- Kaspaz boya 1 seyreltin: 300 Canlı Hücre Boyama Çözüm.
- Hücre kültürü ortamları çıkarın t, her sıra için 50 ul canlı hücre boyama çözeltisini ekleyino plaka (lar) "Apoptoz" belirlenmiş ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir,% 5 CO2.
- aşağıdaki formüle göre Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm yeterli hacmi (V) hazırlayın: Fix çözümü (ul) V hacmi = 50 x G 1.2 (kuyuların W Sayısı) x.
- Nükleer boya 1 seyreltin: 1,000 Canlı Hücre Nükleer Boyama Çözüm.
- Canlı hücre boyama çözeltisini çıkarın plaka (lar) her bir kuyu için 100 ul / oyuk canlı hücre nükleer boyama solüsyonu eklenir ve oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin.
- sabitleyici / çekirdek boya çözeltisini aspire ve yıkama plakası (ler), 100 ul / yuva yıkama tamponu ile üç kez.
- 100 ul / yuva yıkama tamponu ilave edin. Plakası (ler) artık hazır (vardır).
- HCS okuyucusu üzerinde plaka (lar) değerlendirin.
- Tüm deneyler için hazırlık
- Veri Analizi HCS
- excel (.xls) dosyası olarak ihracat ham veriler. Not: Ham hücre endeks değerleri, 96 gözlü bir biçimde düzenlenir(Yansıtma plaka kuyu dağılımı) de ve belirli bir zaman noktası sonrası dozlama her uç noktaları verilmektedir.
- aşağıdaki denklem kullanılarak değerlerini normalize:
nerede ben bir kuyunun ölçülen ham sinyal değeri,
Araç, bir plaka üzerinde, araç kuyuları için ölçülen sinyal değerlerinin ortanca olan
Veya aracı (% 0) için arzu edilen ortalama normalize değeri, ve
SC, pozitif kontroller (100) için istenen medyan normalleştirilmiş değeri
NOT: Bu aşamanın sonunda, bir veri kümesi pozisyonda yer alan örnek uygulanmıştır 96 oyuklu bir plaka içerisinde her bir pozisyonda I, (logaritmik birimi olarak) konsantrasyon Cı için, içeren elde edilen / oyuk I ve onun normalize sinyal N (I) 'e karşılık gelir. - Arsa ve uygun (c I, n (i)) - 4-parametreleri Hill denklemi kullanılarak değerler.
nerede test bileşiği sıfır konsantrasyonunda Sıfır Etkinlik S 0 = Etkinlik düzeyi,
Sonsuz konsantrasyonda sonsuz Etkinlik S inf = Etkinlik düzeyi,
Etkinlik maksimum seviyenin% 50 ulaştığı AC50 = Konsantrasyon,
Hill katsayısı n = AC50 de yamaç Tedbir ve
Doz-tepki eğrisi çizilir x-ekseni üzerindeki değerler karşılık gelen logaritmik birimleri c = konsantrasyon.
Not: AC50 düşük değerler, yüksek kuvvetini gösterir tesirliliğinin bir ölçüsüdür.
Representative Results
Rtca
Hiçbir toksik etki tespit edildiğinde HCS bitiş noktaları bilgilendirici olmayacaktır, çünkü görünmüyor bileşiklerdir HCS (Şekil 3b, c, d, g, k, l, m tarafından test edilmez RCTA en yüksek konsantrasyon hücre canlılığı kadar azaldı p). Bileşikler gösteren sadece en yüksek konsantrasyonda hücre canlılığı azalmıştır (Şekil 3e, o) da HCS için seçimi kaldırılır. Son olarak, bir hesaplanabilir LD 50 (<20 mm) tek bileşeni daha HCS analizi (Şekil 3a, f, h, j, n) seçilir. yukarıda bahsi geçen HPHCs şunlardır: 1-aminonaphtalene, Arsenik (V), krom (VI) 'ya, krotonaldehit'in ve fenol yer alır.
HCS
Kalite Kontrolü (QC) gibi, pozitif kontrol fi vardırilk doğru gerçekleştirildiğini boyama işlemini sağlamak için analiz edilmiştir. Pozitif kontrol ile muamele edilmiş hücrelerin Örnek Resimlerde Şekil 6 'da gösterilmiştir. Veriler değerleri, daha önce tarif edildiği gibi araca normalleştirilir. Doz-yanıt eğrileri, sadece üç doz test edilir olarak çizilir ve üç doz, her bir zaman noktasında kabul edilir değildir. uygun yanıtlar 4 saat, 24 saat, her iki her nokta için gözlenir, böylece pozitif kontrol dozlar seçilir (önceki deneylere dayanarak, veriler gösterilmemiştir). Özellikle dozlarda 1 ve 2 doz 2 ve 3 24 saat sonra etkisini değerlendirmek için kullanılır ise 4 saat sonra etkisini değerlendirmek için kullanılır. cevap yok pozitif kontrol dozları gözlenmesi halinde Tabaklar atılır. mitokondrial membran potansiyeli ve GSH içeriği dışındaki tüm uç noktalar için, sinyal yoğunluğunda bir artış beklendiğini unutmayın.
Fenol hariç tüm bileşikler, bir nekrotik fenoksi neden türü, artan hücre membran geçirgenliği (Şekil 7a, f, h, i) göre. 1-aminonaphtalene, krom (VI), krotonaldehid ve Fenol artan histon H2AX fosforilasyonu (Şekil 7E, j, n, p) göre genotoksik olarak tespit edilmiştir. Fenol ve 1-aminonaphtalene ciddi mitokondriyal disfonksiyon 1-aminonaphtalene ile artan bir sitokrom C salınımı (Şekil 7c) yol açtı (Şekil 7b, o) neden olduğu bulunmuştur. artan kaspaz 3/7 aktivitesinin tespiti krom maruz kaldığında apoptotik olayın kanıt sağladı. Oksidatif stres indüksiyonlu (TSH veya GSH) ayrıca 1-aminonaphtalene, krotonaldehit'in ve fenol (Şekil 7d, m, q,) ile muamele edilerek tespit edildi. Transkripsiyon faktörü cJun (Şekil 7G) artmış fosforilasyon ile gösterildiği gibi son olarak, arsenik, hücre gerilimi indükler.
yük / 53987 / 53987fig1.jpg "/>
Şekil 1. Bileşik Tox-Profiler İş Akışı a.) Iş akışının şematik Bu çalışmada izledi. İlk olarak, bir doz oranı bulma sonra HCS bileşiği özgü toksisite profillerinin b.) Çalışma deneysel tasarım karakterize etmek için uygun dozlar seçmek için RTCA platformu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. HCS uç noktalar 4 incelenmiş ve 24 saat dozlama sonra. Grubunda ise, 24 saat tohumlama sonrası, hücreler ilave edildi ve empedans değerleri sürekli takip eden 24 saat boyunca izlenen bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. RTCA Pozlama Plate. Bileşik ana plakası ilk beş adım 1:10 seri seyreltme yapılarak üretilir. Her bir bileşik,(Doz 0) araç kontrolü dahil olmak üzere, daha sonra kontrol olarak orta ve staurosporin ile birlikte maruz plakasına üç kopya halinde ilave edilir. Araç kontrolleri sıra numarası 7. iken dizisi transferi üzerine korunur dozlar, en yüksek doz sıra numarası 1 unutmayın bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Örnek RTCA Hücre Canlılığı Sonuçlar a.) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, Cı) asetamid, d) Aseton, e) akrilamid, f) Arsenik (V), g), benzen, lH) Krom (VI) j) krotonaldehid, k) metil etil keton, L) Nickel (II) ', m) nitrobenzen, n) fenol, o) kinolin, s) Toluen. 24 saat sonra-dozlama, eğri (AUC) altındaki alan, 0 ila 0 aktivitesini yansıtır -100% aktivitesi (y-ekseni), aralığında ve normalize (pozitif kontrol ve araç da dahil olmak üzere), her doz için hesaplanmış araç ve pozitif kontrol -100. Değerler daha sonra çizilen ve dört parametreli bir Hill denklemine ve mümkün olduğu LD50 hesaplandı kullanılarak monte edildi. Konsantrasyonları bir günlük ölçeğinde (x-ekseni) ifade edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4'te HCS Tahliller için pozitif kontrol bileşikleri için seyreltme cetveli. Pozitif kontroller) Toplama ve ziyaretindeseri seyreltme plakası. b) pozitif kontroller seri seyreltme. c) 200X pozitif kontroller dozlar. de) orta (01:40 içinde 200x pozitif kontrol dozlarda seyreltilmesi) için hicle 5x dozları içeren pozitif kontrol plaka üretmek için. ) Her doz maruziyet plakada son düzenini yansıtmak için üç kez seyreltilmiş unutmayın. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. HCS Pozlama Plate. Bileşik ana plakası ilk beş adımlı bir seyreltme yapılarak üretilir. araç kontrol de dahil olmak üzere her bir bileşik olup, (doz 0) daha sonra pozitif kontroller ile birlikte maruz plakasına üç kopya halinde ilave edilir. , Dozlar sipariş transferi üzerine muhafaza unutmayınAraç kontrolleri sıra numarası 7. iken yüksek doz sıra numarası 1 olan bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Antikor ya da boya-boyalı hücrelerin Şekil 6. Örnek Floresan Resimler: a) Nükleer parametreler - Nükleer boya. Canlı veya sabit hücrelerde DNA bağlanan bir geçirgen bir boya. Bu leke çekirdek bölge etiketleme tek tek hücrelerin tanımlamak için kullanılır b) Nekroz - Hücre membran geçirgenliği boya. Hücre membran bütünlüğünün Boya bazlı tespiti. Reaktif hücre membranına özünde geçirimsizdir. nekroz Membran, geçirgen hale gelir ve boya hücre girer ve güçlü bir floresan s üretiminde DNA'ya bağlanan. ignal c) apoptozun - Sitokrom C: sitokrom C salınımı erken apoptoz iyi bilinen bir ayar damgası antikor bazlı tespiti. Apoptoz indüksiyonu üzerine, sitokrom C mitokondri salınır ve çekirdeği D) DNA hasarına difüze - pH2AX.:. Histon H2AX fosforilasyon antikor bazlı tespiti, çift sarmal DNA kırılmalarının iyi bilinen bir özelliğidir, e) Gerilme Kinaz - cJun. Ser-73, cJun bölgesinin hücre stres iyi bilinen bir ayar damgası de fosforilasyonu antikor bazlı algılama f) Oksidatif stres - DHE: süperoksit radikallerinin Boya bazlı tespiti. . Ücretsiz GSH moleküllerinin Boya bazlı algılama: mBcl - okside formu etidyum DNA ardalanması g üzerine kırmızı fluoresces ise Dihydroethidium kendisi GSH) sitoplazmada mavi fluoresces. mBcl için GSH ile reaksiyona giren. kaspaz 3/7 aktivitesinin Boya bazlı algılama: Kaspaz 3/7 aktivasyon - yüksek floresan ürünü h) Apoptoz üretir. Reaktif DNA bağlama inhibe eden bir dört amino asit peptidi olmayan floresan. kaspaz-3/7 aktivasyonu üzerine, peptid DNA'ya bağlanan ve aydınlık, florojenik tepkisi üretmek için boya sağlayan bölünmektedir. Paneller pozitif kontrol ile tedavi edilen hücreler gösterir BH. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. Temsilcisi HCS Sonuçları. 1-aminonaphtalene (ae), Arsenik (V) (f ve g), Krom (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) ve Fenol (oq). 4 saat (mavi çizgi) ve24 saat (turuncu çizgi) sinyaller her bir doz için hesaplanmış ve araç aktivitesi (% 0) normalize edilmiştir. eğri uydurma hesaplamaları dahil değildir Değerler gri renkle gösterilir. Konsantrasyonları bir günlük ölçeğinde (x-ekseni) ifade edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| tahlil | Endpoint # | biyolojik son nokta | Hücresel bölmesi | çıkış özelliği |
| sitotoksisite | 1 | Mitokondriyal kütle 6 | sitoplazma | Nokta ortalama alan |
| 2 | Mitokondrial membran potansiyeli 6 | sitoplazma | Nokta ortalama yoğunluk | |
| 3 | Sitokrom C bırakma | çekirdek | Ortalama yoğunluk | | |
| 4 | Hücre zarı geçirgenliği 8 | çekirdek | Ortalama yoğunluk | |
| DNA Hasarı | 5 | fosfo-H2AX 9 | çekirdek | Ortalama yoğunluk |
| stres Kinaz | 6 | fosfo-cJun 10 | çekirdek | Ortalama yoğunluk |
| ROS | 7 | ROS 11 | çekirdek | Ortalama yoğunluk |
| GSH içeriği | 8 | GSH 12 | sitoplazma | Nokta ortalama yoğunluk |
| apoptoz | 9 | Kaspaz 3 13 | sitoplazma | Nokta ortalama yoğunluk |
HCS a Tablo 1. listesissays ve bitiş noktaları.
| araç | RTCA dozlar (uM) | LD 50 | HCS dozları | |||||||||||
| Hücre canlılığı, seçilen (uM) | 3R4F (nM) | |||||||||||||
| 1-Aminonaphtalene | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 280 uM | 2.000 | 500 | 200 | 150 | 0.27 | |
| 2-nitro- | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| acetamide | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| aseton | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| akrilamid | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Arsenik (V) | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 160 uM | 200 | 100 | 50 | 25 | <td> 0.17||
| Benzen | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Krom (VI) | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 20 uM | 100 | 50 | 20 | 10 | 0.06 | |
| krotonaldehit | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 200 uM | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2.000 | |
| Metil etil keton | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| Nikel | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| nitrobenzen | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Fenol | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 2.300 uM | 5000 | 2.000 | 1000 | 500 | 240 | |
| kinolin | EtOH | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 0.2 | > 20 mM | |||||||
| tolüen | Su | 20.000 | 2.000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
Tablo 2. Tedavi 24 saat sonra Bağıl LD 50 ile test edilmiştir HPHC Bileşiklerin listesi. HCS analizi için seçilen bileşikler turuncu vurgulanır ve test dozları da verilmiştir. 3R4F doz referans sigara 3R4F itibaren bir sopa duman oluşturucu miktarına eşdeğerdir.
| tahlil | bileşik | Ana çözelti | çözücü Doz (ler) (uM) | |||
| Hücre canlılığı | staurosporin | 10 mM | DMSO | 50 | ||
| sitotoksisite | Valinomycin | 10 mM | DMSO | 50 | 20 | 5 |
| DNA Hasarı | parakuat | 100 mM | DMSO | 500 | 200 | 50 |
| stres Kinaz | Anisomycin | 2 mM | DMSO | 10 | 4 | 1 |
| ROS | rotenone | 200 mM | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
| GSH içeriği | etakrinik asit | 200 mM | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
| apoptoz | staurosporin | 40 mM | DMSO | 200 </ Td> | 50 | 20 |
Her Testi için kullanılır Olumlu Kontroller ve Konsantrasyonlarına Tablo 3. listesi.
Discussion
Hayvan deneyleri alternatifler için ve yeni yüksek kapasiteli test yaklaşımları için ihtiyaçları yaygın olarak son yıllarda ele alınmıştır. Bu yakından hedef dokuların fizyolojisini taklit hücresel deneyleri kullanılarak standart toksisite testleri için alternatif yöntemler, araştırmak için bilim adamları ve düzenleyici otoriteleri yol açmıştır. Bu çalışmada, insan akciğer epitel hücreleri üzerinde tek CS bileşenlere maruz kalma etkisini değerlendirmek için bir içeriği yüksek tarama (HCS) platformu ile gerçek zamanlı hücre analizörü (RTCA) birleştirerek uygulanabilirliğini göstermiştir. Bu kurulum benzer diğer çeşitli havada bulunan kirleticilerin, havadaki partiküllerin ve nanopartiküller tarafından uyarılan sitotoksisite değerlendirmek için uygulanabilir. Ayrıca, elde edilen sonuçlar nedensel biyolojik ağlarına dayalı tam genom transkriptomik ve hesaplama yöntemleri gelenler ile uyumlu olabilir. Önceden bildirildiği gibi, bu yaklaşım moleküler yolu verileri doğrulamak için bize izinHCS bitiş noktaları ile CS maruz 5 üzerine pertürbasyon, ayrıca fenotipik bu yolu tedirginlikler ele.
Bir akış deneyi olarak, gerçek zamanlı hücre analiz dozu ve maruz kalma süresi noktası aşağı analiz 14 için uygun olabilir daha iyi karar verme sağlayan bir doz ve zamana bağımlı çözünürlük, hücre canlılığı ile ilgili bilgi sağlar. analizörü ilkesi bir altın mikroelektrot ile kaplı bir kültür de yüzeyde takmak ve yayılma olarak hücreler tarafından üretilen elektrik empedans değişikliklere dayanır. Empedans sonuçta morfolojisi ve hücre canlılığı, yayma, hücre yapışmasını izlemek için kullanılabilir hücre dizini adlı bir boyutsuz parametre, dönüştürülür. Bu teknik sitotoksik mekanizmaları hakkında bilgi sağlamaz rağmen, duyarlılığı bile HCS bilgilendirici olmadığı çok düşük dozlarda morfolojik hücresel değişimlerin tespit edilmesini sağlar (veriler gösterilmemiştir). Kümelenme Strateji dayalılı deneyler, biz RTCA metodoloji HCS bitiş noktaları ile karşılaştırıldığında daha düşük dozlarda morfolojik değişiklikleri tespit etmek mümkün olduğunu kaydetti.
Gerçek zamanlı hücre analizörü ile ilk gösteriminin ardından, bir HCS platformu her HPHC tarafından ortaya sitotoksisite tür daha derinlemesine bilgi elde etmek için kullanıldı. hücre bölmeleri üzerindeki potansiyel etkileri doğru HPHCs profil izin HCS tahlil paneli / organelleri yanı sıra genotoksisite veya oksidatif stres yol açanlara tanımlamak için. Analiz seçilen HPHCs NHBE hücrelerinde sitotoksisite neden bu sayede farklı profiller ortaya çıkardı. Genel olarak, tüm bileşikler, fenol hariç test edilen en yüksek dozda nekroza neden olduğu bulunmuştur. potansiyel genotoksisite için bir marker olarak H2AX kanser gelişimi 1-aminonaphtalene indüklediği fosforilasyon rolü ise mitokondriyal toksisite okuma bu HPHC de ortaya çıkarılan aktivite HCS paneli (kütle artarak sitokrom C Relea tutarlıse) ve oksidatif stres (GSH azalması). Daha önce de tarif edildiği gibi, fenol mitokondriyal işlev bozukluğu indükler ve DNA hasarı gibi GSH tüketilmesine neden olarak tespit edilmiştir. Krom (VI), grup I kanserojen olarak sınıflandırılmıştır bileşiklerden biri ve Crotonaldehyde de hem özellikle krom (VI) aynı zamanda kaynaklı apoptosis (kaspaz çağlayanı etkinleştirme) ve krotonaldehit ROS üretimini artış neden olarak genotoksik tespit edilmiştir. Son olarak arsenik (V), stres kinaz yolu aktivasyonunun bir belirtecidir cJun fosforilasyonu uyardığı bulunmuştur.
Bu çalışmada, in vitro olarak akciğer epitel hücreleri için bir model olarak NHBE hücreleri kullanılmıştır. Bir HCS ortamda bu hücreleri kullanılarak görülmemiş ve genotoksisite ve oksidatif stres belirteçleri de dahil olmak üzere uç noktalar, daha geniş bir yelpazede soruşturma sağladı. canlı hücre ve sabit hücre boyama yaklaşımları Hem genel teknik esneklik göstererek bizim protokoller dahilinde tarif edildi. fişlem, aynı protokoller bir flüoresan boya veya antikor kullanılarak saptanabilir hedefleri daha geniş bir yelpazesi için uygulanabilir. Canlı boyama protokollerin başarıyla uygulanması için, boyalar, bazı sınırlı yarılanma ömrü ve görüntü alma tamamlanmadan önce azalabilir floresan sinyali olarak, inkübasyon süresi saygı önemlidir. Farklı bir hücre tipi kullanılırsa, tüm boyama koşullarının uygun boya konsantrasyonu, yeniden değerlendirilmeli ve inkübasyon süresi farklı olabileceğini dikkate almak da önemlidir.
Geçerli yazıda sadece beş bileşikler HCS metodolojisi ile tarandı bir senaryo tarif var. daha önce tarif edilen plaka düzeni göz önüne alındığında, bu şekilde daha fazla bileşik ya da eş zamanlı olarak taranması için sağlayan 24 levha (6 deneyleri, 2 zaman noktalarında) levha .bir sayısı da artırılabilir toplam 2 farklı levhayı dozlandı yatırımcılarınDaha fazla uç noktaları sunda. Bunu yapmadan önce, ancak, bir belirli uç noktalar (GSH ve ROS) derhal satın gerektiren dikkate almalı ve bunun sonucu olarak, plakaların dozaj önceki plaka satın izin vermek için kademeli bir şekilde yapılmalıdır. Plakalar daha sonraki bir aşamada boyama işleminin tamamlanması için, tespit sonrasında herhangi bir aşamada iletişim kuralı bölerek istiflenebilir Diğer taraftan, sabit bir hücre boyama protokolü kullanılarak bir avantajı temsil eder. Bu yaklaşım, örneğin veri kalitesinden ödün vermeden tüm canlı hücre boyama plakaları tamamlamak için zaman operatör sağlayacaktır.
ayrıca plakaların sayısını azaltarak iş akışını optimize etmek için, aynı zamanda birlikte daha uç noktaları multipleks mümkün olacaktır. Bu bağlamda DNA Hasarı ve Stres Örneğin Kinaz farklı c yayan fluorochromes sadece iki ikincil antikor kullanılarak birbirine araştırılması olabilirhannels. Sürekli tam otomatik Hücre Serpilmesi bileşik seyreltme, dozajlama ve boyama dahil HCS platformun geliştirilmesi, hem de yeni uç noktaları ilavesi, epitelyal ilgili HPHCs ve diğer hücre tipleri için güçlü bir profil aracı olarak HCS platformun kapasitesini artıracaktır .
Disclosures
Tüm yazarlar Philip Morris International'ın çalışanlarıdır. Philip Morris International, bu projenin finansman ve sponsor tek kaynağıdır.
Acknowledgments
Yazarlar yazının kendi incelenmek üzere Karsta Luettich ve Grégory VUILLAUME teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75 cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10x permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10x blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
