Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

उच्च सामग्री स्क्रीनिंग हानिकारक और हानिकारक घटकों की विषाक्तता प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए विश्लेषण (HPHC)

Published: May 10, 2016 doi: 10.3791/53987
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Biological System Research (BSR), Philip Morris International R&D

Abstract

सिगरेट के धुएं (सीएस) हृदय और फेफड़ों के रोगों के लिए एक बड़ा जोखिम कारक है। क्योंकि सीएस एक जटिल एयरोसोल 7,000 से अधिक रसायन युक्त 1 यह अपने समग्र विषाक्तता के लिए अलग-अलग घटकों के योगदान का आकलन करने के लिए चुनौतीपूर्ण है। अलग-अलग घटक के रूप में अच्छी तरह से मिश्रण की विषाक्तता प्रोफाइल हालांकि, इन विट्रो में स्थापित किया जा सकता है, के माध्यम से डाल स्क्रीनिंग उपकरण है, जो तंबाकू के धुएं के हानिकारक और हानिकारक घटक (HPHCs) की रूपरेखा सक्षम उच्च लगाने से के रूप में अमेरिका के खाद्य एवं औषधि द्वारा परिभाषित प्रशासन (एफडीए)। 2

एक प्रारंभिक आकलन के लिए, एक प्रतिबाधा आधारित साधन यौगिक की विषाक्तता के एक वास्तविक समय, लेबल मुक्त मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया गया था। साधन readout कोशिका आसंजन, व्यवहार्यता और आकृति विज्ञान है कि सभी एक साथ सेल स्थिति का अवलोकन प्रदान पर निर्भर करता है। एक आयामरहित पैरामीटर, सेल सूचकांक का नाम, मात्रा का ठहराव के लिए प्रयोग किया जाता है। अलग का एक सेटअलग धुंधला प्रोटोकॉल एक प्रतिदीप्ति इमेजिंग आधारित जांच के लिए विकसित किया गया था और एक एचसीएस मंच प्रत्येक HPHC द्वारा हासिल cytotoxicity के प्रकार पर अधिक गहराई से जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

15 घटक का परीक्षण में से सिर्फ पांच एचसीएस आधारित विश्लेषण के लिए चयन किया गया था के रूप में वे एक गणनीय एलडी 50 (<20 मिमी) दर्ज की गई। इनमें 1-aminonaphtalene, आर्सेनिक (वी), क्रोमियम (छठे), Crotonaldehyde और Phenol। एचसीएस में उनके प्रभाव के आधार पर, 1-aminonaphtalene और Phenol क्रोमियम (छठे) में वृद्धि हुई हिस्टोन H2AX फोस्फोराइलेशन पर आधारित genotoxic के रूप में साथ mitochondrial रोग को उत्पन्न करने के लिए की पहचान की जा सकता है, और एक साथ। Crotonaldehyde एक ऑक्सीडेटिव तनाव inducer और आर्सेनिक एक तनाव काइनेज मार्ग उत्प्रेरक के रूप में के रूप में पहचान की थी।

यह अध्ययन दर्शाता है कि प्रतिबाधा आधारित और एचसीएस प्रौद्योगिकियों के संयोजन सीएस घटक की इन विट्रो मूल्यांकन के लिए एक मजबूत उपकरण प्रदान करता है।

Introduction

Toxicological जोखिम मूल्यांकन ऐतिहासिक पशु मॉडल का उपयोग करें, जो, हालांकि जीवन विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक, भी इस तरह के मानव और उच्च लागत के लिए असंगत translatability के रूप में कमियों के साथ जुड़े हुए हैं पर भरोसा किया है। इसके अलावा, वहाँ एक बढ़ती हुई की "3Rs" 2 (प्रतिस्थापन, कमी, और शोधन) भावना में पशु परीक्षण के लिए विकल्प खोजने का प्रयास किया गया। इस प्रयास, पिछले कुछ वर्षों में त्वरित किया गया है ही नहीं, क्योंकि इस तरह के उच्च throughput तकनीक और प्रणालियों जीव विज्ञान के दृष्टिकोण, लेकिन यह भी पशु परीक्षण के उपयोग को सीमित करने के विधान के कारण के रूप में हाल के अग्रिमों, विशेष रूप से यूरोपीय संघ में की।

विषाक्त अपमान के जवाब को विनियमित सेलुलर संकेत दे रास्ते की जटिलता यह स्पष्ट है कि एकल विषाक्तता समापन का उपयोग कर कुछ यौगिकों की विषाक्तता आधार वर्णन करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा बनाता है। इस के लिए, बातचीत पी के सैकड़ों की परस्पर क्रियाएक जैविक नेटवर्क के लिए योगदान दे roteins भी ध्यान में रखा जाना करने की आवश्यकता होगी। उन नेटवर्कों पर विषैले पदार्थ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, एक प्रणाली विष विज्ञान प्ररूपी मध्यम और उच्च throughput स्क्रीनिंग assays के साथ संयुक्त दृष्टिकोण शक्ति अनुमान करने के लिए और एक ही समय में अलग-अलग विषैले पदार्थ की कार्रवाई की व्यवस्था के बारे में अधिक जानकारी उपलब्ध कराने के लिए उपयोगी है।

इस अध्ययन में, हम एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण है, जो एक स्वचालित माइक्रोस्कोप और एक जैविक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग से बना है, कि प्राप्त कर सकते हैं, प्रक्रिया और विशिष्ट प्रतिदीप्ति आधारित सेलुलर assays से ली गई छवि डेटा का विश्लेषण के रूप में एचसीएस कार्यरत हैं। यह 3 उदाहरण के लिए एक एकल कोशिका या subcellular स्तर पर, मात्रा निर्धारित किया जा करने के लिए एक सेल के भीतर दृश्य परिवर्तन के लिए अनुमति देता है, और कई मापदंडों एक साथ विश्लेषण किया जा सके।, डीएनए डबल कतरा टूटता हिस्टोन H2AX फोस्फोराइलेशन की एक एंटीबॉडी आधारित पहचान का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) एक सेल पर्म का उपयोग कर मात्रा निर्धारित किया गयाeable सुपरऑक्साइड संवेदनशील डाई।

क्योंकि फेफड़ों उपकला कोशिकाओं सिगरेट का धुआँ सहित साँस विषैले पदार्थ, के खिलाफ पहला जैविक बाधा प्रतिनिधित्व करते हैं, हम संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि प्रशासन द्वारा प्रकाशित HPHCs के प्रभाव प्रोफ़ाइल करने के लिए इन विट्रो मॉडल के रूप में प्राथमिक ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं का उपयोग किया। 4 यह पांडुलिपि एक अनुवर्ती है पिछले एक अध्ययन 5 जिसमें हम HPHCs का एक अलग सबसेट का जैविक प्रभाव का मूल्यांकन पर मेकअप।

हमारे कार्यप्रवाह इन विट्रो में cytotoxicity का आकलन करने के हिस्से के रूप में, हम शुरू में 15 HPHC के एक चयन की शक्ति का मूल्यांकन, एक प्रतिबाधा आधारित वास्तविक समय सेलुलर विश्लेषण (RTCA) प्रणाली है जो हमें खुराक पर्वतमाला, बाद में HCS के लिए उपयुक्त स्थापित करने के लिए अनुमति का उपयोग कर विश्लेषण (चित्रा 1)। एक विषाक्तता एचसीएस आकलन तो सेलुलर विषाक्तता के नौ मल्टी पैरामीट्रिक समापन का उपयोग किया गया था, जिनमें से प्रत्येक दो समय अंक (4 और 24 घंटे) पर नजर रखी। तालिका 1 में वर्णित के रूप में, 7 गतिविधि, साइटोक्रोम सी जारी है और कोशिका झिल्ली पारगम्यता - इस्तेमाल किया मार्करों mitochondrial विषाक्तता, डीएनए की क्षति, तनाव काइनेज, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस), glutathione (GSH) सामग्री, कस्पासे 3 की सूचक थी।

हमारा दृष्टिकोण सक्षम पहचान और खुराक और समय पर निर्भर नमूने के माध्यम से सिगरेट के धुएं के घटक दलों के प्रभाव की विशेषता। अंत में, यह प्रत्येक HPHC के लिए इन विट्रो विषाक्तता प्रोफ़ाइल का उत्पादन किया। मल्टी omics दृष्टिकोण भी आगे एचसीएस विश्लेषण पूरक करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह अंत में भी सेल संकेतन और / या ट्रांसक्रिप्शनल स्तर पर प्रभाव की एक गहरी समझ प्रदान करेगा।

Protocol

1. कटाई सामान्य मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं (NHBEs)

  1. पूर्व गर्म सेल संस्कृति के माध्यम से (ब्रोन्कियल उपकला सेल के विकास मध्यम पूरक मध्यम), HEPES, ट्रिप्सिन, और trypsin निष्क्रिय नहाने के पानी में 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान (टीएनएस)।
  2. कोशिकाओं फसल जब संगम का 80% तक पहुँच जाता है।
    नोट: निम्न NHBE सेल संस्कृति शर्तों बोने 20 मिलीलीटर माध्यम के साथ uncoated T75 बोतल में इष्टतम संगम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है:
    1. 1 एक्स 10 6 3 दिन की संस्कृति के लिए कोशिकाओं, 4 दिन की संस्कृति के लिए 0.5 x 10 6 कोशिकाओं और 5 दिन संस्कृति के लिए 0.25 x 10 6 कोशिकाओं बीज। मध्यम बदलें हर 2 दिन जब कोशिकाओं को पोषक तत्वों ताज़ा करने के लिए संस्कृति में हैं। 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति कोशिकाओं और 5% सीओ 2।
  3. कुप्पी (एस) से सतह पर तैरनेवाला निकालें और HEPES जोड़ने कोशिकाओं को धोने के लिए (जैसे।, एक 75 सेमी 2 फ्लास्क के लिए 3 मिलीग्राम)। प्रत्येक फ्लास्क घुमाएँ HEPES सोल के साथ सेल monolayer कवर करने के लिएसंविधान।
  4. HEPES समाधान निकालें और trypsin समाधान जोड़ने (जैसे।, एक 75 सेमी 2 फ्लास्क के लिए 3 मिलीग्राम)। कुप्पी trypsin समाधान के साथ सेल monolayer कवर करने के लिए बारी बारी से।
  5. 37 ± 2 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए फ्लास्क सेते हैं। माइक्रोस्कोप के तहत सेल टुकड़ी पर नजर रखने और यदि आवश्यक हो तो, अब सेते हैं और धीरे से किसी भी शेष जुड़ी कोशिकाओं को रिहा करने की कुप्पी नल।
  6. टीएनएस जोड़े प्रतिक्रिया को रोकने के लिए (जैसे।, एक 75 सेमी 2 कुप्पी के लिए 3 मिलीग्राम) और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण।
  7. 5 मिनट के लिए 300 × छ पर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र।
  8. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और ताजा माध्यम के 10 मिलीलीटर में सेल गोली फिर से निलंबित, धीरे मिश्रण एक सजातीय सेल निलंबन उपज के लिए।
  9. एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर समुच्चय को दूर करने और कोशिकाओं की गिनती करने के लिए। नोट: हमारी प्रयोगशाला में एक बिजली के क्षेत्र मल्टी चैनल सेल गिनती प्रणाली ठीक से और लगातार viabl मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाई कोशिकाओं संख्या।

2. रियल टाइम को सेल विश्लेषक (RTCA) आधारित खुराक सीमा ढूँढना (डीआरएफ)

नोट: 1) का मूल्यांकन यौगिक विषाक्तता, 2) का चयन करें यौगिकों आगे एचसीएस द्वारा जांच की जानी है और 3) HCS के लिए उचित खुराक का चयन: एक प्रतिबाधा आधारित माप प्रणाली के लिए इस्तेमाल किया गया था। RCTA प्लेटों में NHBE कोशिकाओं में अच्छी तरह से प्रत्येक में 100 μl मध्यम पेश करने के लिए परीक्षण परिसर dilutions की 25 μl जोड़कर dosed हैं। इसलिए, सभी परीक्षण समाधान 5 बार (5x) वांछित अंतिम एकाग्रता में तैयार कर रहे हैं।

  1. सीडिंग NHBE प्रकोष्ठों
    1. संख्या और प्रतिबाधा माप की अवधि को परिभाषित करने के साधन कार्यक्रम। इस अध्ययन में, डेटा 48 घंटे के लिए हर 15 मिनट दर्ज किया गया (24 घंटा से ± 2 घंटा पहले और परीक्षण के एजेंटों के साथ कोशिकाओं खुराक के बाद 24 घंटे)।
    2. एक 96 अच्छी तरह RTCA प्लेट के प्रत्येक कुएं में पूर्व गर्म माध्यम के 50 μl pipetting द्वारा प्लेट पृष्ठभूमि उपाय। नोट: यह कदम एक तकनीकी आवश्यकता का प्रतिनिधित्व करता हैसाधन के लिए मध्यम विद्युत प्रतिरोध जो तब सेल आधारित गणना के लिए एक आधार रेखा के संदर्भ के रूप में प्रयोग किया जाता है की गणना करने के लिए।
    3. (7200 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) RTCA थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से है जिसमें 50 μl / अच्छी तरह से मध्यम से पहले ही साधन पृष्ठभूमि के लिए जोड़ा गया था करने के लिए 144,000 कोशिकाओं / एमएल (± 5%) की एकाग्रता में एक सेल निलंबन को तैयार है और 50 μl सेल निलंबन जोड़ें माप।
    4. कोशिकाओं (कोशिकाओं के सजातीय वितरण में सुधार करने के लिए) RTCA पालने में उन्हें रखने से पहले कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए पालन करते हैं। इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) में RTCA पालने में RTCA प्लेटें सेते हैं और अगले 24 ± 2 घंटा खुराक से पहले डेटा रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं।
  2. HPHCs और सकारात्मक नियंत्रण के dilutions
    1. सकारात्मक नियंत्रण कमजोर पड़ने
      1. Staurosporine शेयर समाधान (10 मिमी) 01:10 DMSO में (3 टेबल देखें) और डी के 5 μl जोड़ने पतलामाध्यम के 195 μl को ilution एक 5x काम कर समाधान प्राप्त करने के लिए।
    2. HPHC कमजोर पड़ने
      1. भंग / वाहन (तालिका 2) में प्रत्येक HPHC पतला एक 1 एम स्टॉक समाधान उत्पन्न करने के लिए। मध्यम में प्रत्येक HPHC शेयर समाधान 01:10 पतला एक 100 मिमी समाधान उत्पन्न करने के लिए।
      2. "यौगिक मास्टर थाली" एक पांच कदम 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने मध्यम + 10% वाहन का उपयोग कर 5x काम कर समाधान (चित्रा 2) प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन से उत्पन्न करता है। नोट: अंत में, अंतिम खुराक हो जाएगा: 0.2 माइक्रोन, 2 माइक्रोन, 20 माइक्रोन, 0.2 मिमी, 2 मिमी, 20 मिमी। इसके अलावा इस चरण में खुराक 0 तैयार करते हैं, केवल वाहन के लिए इसी।
    3. dosing
      1. RTCA साधन रोकें और प्लेट को दूर करने के पालने खुला।
      2. थाली निकालें और RTCA प्लेट तापमान उपकरण (RTCA बाहर प्रयोगात्मक प्रक्रिया के दौरान RTCA थाली के तापमान को स्थिर करने के लिए डिजाइन में जगहस्टेशन) कोशिकाओं है, जो प्रतिबाधा माप को प्रभावित कर सकता ठंडा करने से बचने के लिए।
      3. "यौगिक मास्टर थाली" यौगिक मास्टर थाली के रूप में ही खुराक व्यवस्था बनाए रखने के तीन प्रतियों में कोशिकाओं के लिए (चित्रा 2) (पंक्ति संख्या 7 में शीर्ष पंक्ति और वाहन नियंत्रण में सबसे ज्यादा खुराक) से 25 μl 5x समाधान जोड़ें। मौजूदा (100 μl) सेल संस्कृति के माध्यम से न निकालें।
      4. मौजूदा संस्कृति के माध्यम से हटाने के बिना नीचे पंक्ति (आधे दाएं) में कोशिकाओं के लिए 25 μl 5x सकारात्मक नियंत्रण समाधान जोड़ें। मौजूदा सेल संस्कृति के माध्यम से हटाने के बिना नीचे पंक्ति (आधा-बाएं) में कोशिकाओं के लिए 25 μl मध्यम जोड़ें।
      5. प्लेट मुहर के साथ थाली सील। प्लेट RTCA पालने में वापस जगह है और इसे बंद कर लो। पुनः प्रारंभ डेटा वांछित जोखिम समय के लिए रिकॉर्डिंग (जैसे।, 24 घंटे)। नोट: इस सीलेंट फिल्म का उपयोग अच्छी तरह से अच्छी तरह से पार संदूषण सहित संभावित संदूषण से बचने के लिए सिफारिश की है।
    4. <strong> डेटा विश्लेषण RTCA और एलडी 50 गणना
      1. एक पाठ (.txt) या एक्सेल (.xls) फ़ाइल के रूप में निर्यात कच्चे डेटा। नोट: इस फाइल थाली लेआउट (यौगिकों, खुराक और अच्छी तरह से स्थिति) के बारे में सभी जानकारी होगी। कच्चे सेल सूचकांक मूल्यों को एक साथ 96 प्रारूप (mirroring प्लेट अच्छी तरह से वितरण) में आयोजित कर रहे हैं और हर बार अंक जिस पर रिकॉर्डिंग हुई प्रदान की जाती हैं। समय टी में 96 अच्छी तरह से थाली में स्थिति मैं कम मूल्य सीआई टी (i) से चिह्नित है।
      2. नवीनतम समय बिंदु संदर्भ एक सामान्य बनाने के रूप में पहचान 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक स्थिति में मैं (के लिए खुराक से पहले जैसे, सेल सूचकांक 23 घंटा के 50 मिनट स्थिति मैं, सीआई टी (i) = 23 से 00 सेकंड में: 50: 00 = सीआई रेफरी (i))। नोट: जब खुराक किया जाता है यह जानकारी एनोटेट किया जाना चाहिए।
      3. फूट डालो, एक अच्छी तरह से आधार पर, सामान्य संदर्भ द्वारा हर बार बात मान सभी मूल्यों खुराक समय में सामान्य करने के लिए। पदों पर सामान्यीकृत मूल्यनी समय टी में 96 अच्छी तरह से थाली में NCI टी (i) से चिह्नित किया जाता है और इस प्रकार NCI टी (i) = सीआई टी (i) / सीआई रेफरी (i) सभी टी के लिए द्वारा परिभाषित किया गया है।
      4. 24 घंटे में वक्र (नीलामी) के तहत क्षेत्र की गणना प्रत्येक नमूना मैं (स्थिति मैं 96 अच्छी तरह से थाली में) के लिए पोस्ट-खुराक, सकारात्मक नियंत्रण और वाहन के लिए पदों सहित।
        1. नीलामी के स्थान पर मैं प्रत्येक आयत के क्षेत्रों संक्षेप द्वारा प्राप्त की है प्राप्त करते हैं, प्रत्येक आयत दो timepoints के बीच किया जा रहा है टी कश्मीर और टी एल (टी कश्मीर <टी एल) से चिह्नित; प्रत्येक आयत क्षेत्र की गणना एक्स = टी एल के साथ एक्स * y का उपयोग कर - टी कश्मीर दो timepoints और y दो timepoints (y = (NCI टी (i) + NCI टीएल (i)) की गतिविधि का मतलब होने के बीच दूरी जा रहा है / 2)।
          नोट: नीलामी 24 घंटे में स्थिति मैं नीलामी (i) से चिह्नित है के लिए पोस्ट-खुराक। जैसा कि सभी शर्तों तीन प्रतियों कुओं में चढ़ाया जाता है तीन मूल्यों के बीच का प्रयोग किया जाता है।
        5. <li> निम्न समीकरण का उपयोग मूल्यों मानक के अनुसार:
        1 समीकरण
        जहां मैं 96 अच्छी तरह से थाली में स्थिति है जिसके लिए नीलामी 24 घंटे बाद खुराक पर गणना की गई है,
        वाहन, 24 घंटे बाद खुराक पर एक प्लेट पर वाहन कुओं के लिए नीलामी मूल्यों के बीच का है
        सकारात्मक नियंत्रण, 24 घंटे बाद खुराक पर एक थाली पर सकारात्मक नियंत्रण कुओं के लिए नीलामी मूल्यों के बीच का है
        सीआर वाहन (0%) के लिए वांछित मंझला सामान्यीकृत मूल्य है, और
        अनुसूचित जाति सकारात्मक नियंत्रण के लिए वांछित मंझला सामान्यीकृत मूल्य है (-100%)
        नोट: इस चरण के अंत में, एक डेटा सेट प्राप्त की है जिसमें 96 अच्छी तरह से थाली, एक एकाग्रता सीआई में प्रत्येक स्थिति में मैं (लघुगणक इकाइयों में) के लिए है कि नमूना स्थिति में समाहित करने के लिए लागू किया जाता है / मैं अच्छी तरह से और अपनी इसी 24 घंटे बाद खुराक AUC_normaliz पर सामान्यीकृत नीलामीएड (i)।
      5. प्लॉट और फिट (ग रहा, AUC_normalized (i)) एक 4 मानकों को हिल समीकरण का उपयोग -values। जब संभव हो, यह भी एलडी 50 की गणना।
        2 समीकरण
        जहां वाई = AUC_normalized,
        परीक्षण परिसर के शून्य एकाग्रता में शून्य गतिविधि एस 0 = गतिविधि के स्तर पर,
        अनंत एकाग्रता में अनंत गतिविधि एस inf = गतिविधि के स्तर पर,
        AC50 = एकाग्रता, जिस पर गतिविधि अधिकतम स्तर के 50% तक पहुँच जाता है,
        हिल गुणांक एन = AC50 पर ढलान के उपाय, और
        सी = खुराक प्रतिक्रिया वक्र साजिश के एक्स अक्ष पर मूल्यों के लिए इसी लघुगणक इकाइयों में एकाग्रता।
        नोट: AC50 एलडी 50 (cytotoxicity assays) से मेल खाती है। यह शक्ति का एक उपाय है, जहां कम मूल्यों उच्च शक्ति का संकेत मिलता है।

3. एचसीएस द्वारा Toxicological प्रभाव को मापने

नोट: विषाक्तता के नौ मल्टी पैरामीट्रिक मार्कर, छह अलग assays में बांटा की कुल एचसीएस मंच (तालिका 1) का उपयोग कर मापा जाता है। (धारा 2) RTCA सेल व्यवहार्यता विश्लेषण के आधार पर प्रत्येक घटक की खुराक रेंज परिभाषित किया गया है और एक 3R4F संदर्भ खुराक भी शामिल है। संदर्भ खुराक संदर्भ सिगरेट 3R4F से एक छड़ी के धुएं में HPHC वर्तमान की राशि के बराबर है।

  1. सीडिंग NHBE प्रकोष्ठों
    1. (12,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) 120,000 कोशिकाओं / एमएल (± 5%) में एक सेल निलंबन को तैयार है और एक 96 अच्छी तरह एचसीएस थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl सेल निलंबन जोड़ें। सभी assays (cytotoxicity, डीएनए की क्षति, तनाव काइनेज, आरओएस, GSH सामग्री और Apoptosis) और timepoints (4 और 24 घंटे) के आकलन के लिए पर्याप्त प्लेटें तैयार करें।
    2. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर एचसीएस प्लेटों छोड़ दो कोशिकाओं कुओं को देते हैं और फिर 3 पर सेते अनुमति देने के लिए7 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 खुराक से पहले 24 ± 2 घंटे के लिए।
  2. HCHPs और सकारात्मक नियंत्रण के कमजोर पड़ने
    नोट: एचसीएस प्लेटों में NHBE कोशिकाओं मध्यम पहले से ही अच्छी तरह से प्रत्येक में मौजूद 100 μl करने के लिए परीक्षण के नमूने के समाधान के 25 μl जोड़कर dosed दिया जाएगा। इसलिए, सभी खुराक 5x वांछित अंतिम एकाग्रता में तैयार कर रहे हैं।
    1. सकारात्मक नियंत्रण कमजोर पड़ने (सकारात्मक नियंत्रण प्लेट)
      1. प्रत्येक के लिए सकारात्मक नियंत्रण का जायजा समाधान के 40 μl बांटना स्तंभ # 2 (चित्रा -4 ए, लाल रंग में छायांकित कुओं) में (3 टेबल देखें)। कॉलम # 3 और # 5 (चित्रा -4 ए, कुओं हल्के नीले रंग में छायांकित) और स्तंभ # 4 में वाहन के 40 μl (चित्रा -4 ए, हल्के नीले रंग में छायांकित कुओं) में वाहन के 20 μl बांटना।
      2. # 2 कॉलम में कुओं से 12 μl वापस लेने # 3 कॉलम में कुओं के लिए यह बांटना और मिश्रण (चित्रा 4 बी), प्रत्येक के लिए सकारात्मक नियंत्रण यौगिक प्राप्त की है (चित्रा 4C) के लिए 3 खुराक (डी 1, डी 2, और डी 3) और वाहन (वी) के साथ एक अंतिम धारावाहिक कमजोर पड़ने तक जारी है। सकारात्मक नियंत्रण प्लेट उत्पन्न करने के लिए, मीडिया (चित्रा 4D) में यौगिकों की एक 1:40 कमजोर पड़ने तैयार करते हैं।
    2. HPHC कमजोर पड़ने (कंपाउंड मास्टर प्लेट)
      नोट: HCS के लिए HPHCs के चयनित खुराक पर्वतमाला 2 टेबल में सूचीबद्ध हैं।
      1. 100 मिमी की एकाग्रता के लिए माध्यम में प्रत्येक HPHC शेयर समाधान (1 एम) 01:10 पतला। 10% वाहन के साथ माध्यम का उपयोग कर प्रत्येक HPHC के लिए चयनित किया 5x खुराक प्राप्त करने के लिए dilutions प्रदर्शन करना।
  3. dosing
    1. 5x समाधान के 25 μl (चित्रा 5) (पंक्ति संख्या 7 में शीर्ष पंक्ति और वाहन नियंत्रण में सबसे ज्यादा खुराक) यौगिक मास्टर थाली के रूप में ही खुराक व्यवस्था बनाए रखने के तीन प्रतियों में कोशिकाओं को यौगिक मास्टर थाली से जोड़ें। ई न निकालेंxisting (100 μl) सेल संस्कृति के माध्यम से।
    2. नीचे पंक्ति सकारात्मक नियंत्रण प्लेट (चित्रा 5) के रूप में ही खुराक व्यवस्था बनाए रखने में कोशिकाओं के लिए सकारात्मक नियंत्रण थाली से 5x समाधान के 25 μl जोड़ें। मौजूदा (100 μl) सेल संस्कृति के माध्यम से न निकालें। नोट: प्रत्येक परख एक विशिष्ट सकारात्मक नियंत्रण नहीं है; टेबल देखें 3. वांछित जोखिम समय (4 या 24 घंटे) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर थाली सेते हैं।
  4. धुंधला हो जाना
    1. सभी assays के लिए तैयारी
      1. धो बफर (पीबीएस) 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान पूर्व गर्म।
      2. 37 डिग्री सेल्सियस पर धो बफर और पूर्व गर्म इसे से 89.19 मिलीलीटर निर्धारण समाधान (4% formaldehyde समाधान) 10.81 37 formaldehyde के मिलीलीटर% जोड़ने की तैयारी।
      3. 37 डिग्री सेल्सियस पर धो बफर और पूर्व गर्म यह 90 मिलीलीटर 10x permeabilization बफर के 10 मिलीलीटर जोड़कर Permeabilization बफर तैयार करें।
      4. Blo तैयार37 डिग्री सेल्सियस पर धो बफर और पूर्व गर्म यह 90 मिलीलीटर 10x बफर अवरुद्ध के 10 मिलीलीटर जोड़कर cking बफर।
      5. पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति के माध्यम से।
      6. इनक्यूबेटर से एचसीएस प्लेटें निकाल देने के बाद 4 और 24 घंटा जोखिम बार पहुँच रहे हैं और प्रत्येक परख के लिए निम्नलिखित विशिष्ट प्रोटोकॉल प्रदर्शन करते हैं।
    2. cytotoxicity परख
      1. निम्न सूत्र के अनुसार लाइव सेल धुंधला समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: मध्यम की मात्रा (μl) वी = 50 एक्स डब्ल्यू 1.2 x (डब्ल्यू कुओं की संख्या)
      2. विक्रेता के निर्देश के अनुसार लाइव सेल धुंधला समाधान में माइटोकॉन्ड्रिया डाई पतला। विक्रेता के निर्देश के अनुसार लाइव सेल धुंधला समाधान में झिल्ली पारगम्यता डाई पतला।
      3. प्लेट (ओं) नामित "cytotoxicity परख" के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl लाइव सेल धुंधला समाधान जोड़ें। सेल संस्कृति के माध्यम से हटाने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ पर 30 मिनट के लिए सेते नहीं करते
      4. धीरे मध्यम और धुंधला समाधान निकालना और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए निर्धारण समाधान के 100 μl / अच्छी तरह से जोड़ने, तो अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए प्लेट (ओं) सेते हैं।
      5. धीरे निर्धारण समाधान निकालना और 100 μl के साथ एक बार धोने / अच्छी तरह से बफर धो लें।
      6. धोने बफर निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl / अच्छी तरह 1x permeabilization बफर जोड़ने के लिए और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
      7. महाप्राण permeabilization बफर और धोने थाली के साथ दो बार 100 μl / अच्छी तरह से धो बफर।
      8. महाप्राण बफर और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1x अवरुद्ध बफर के 100 μl जोड़ें और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते धो लें।
      9. निम्न सूत्र के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: बफर (μl) वी अवरूध्द का आयतन = 50 एक्स डब्ल्यू एक्स 1.2 (डब्ल्यू कुओं की संख्या)। प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में 250: पतला विरोधी साइटोक्रोम सी एंटीबॉडी (माउस) 1।
      10. महाप्राण अवरुद्ध एक बफरघ अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 50 μl / अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान जोड़ने के लिए और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
      11. निम्न सूत्र के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: बफर (μl) वी अवरूध्द का आयतन = 50 एक्स डब्ल्यू एक्स 1.2 (डब्ल्यू कुओं की संख्या)। माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान में 500: पतला विरोधी माउस एंटीबॉडी 1। माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान में 1000: पतला परमाणु डाई 1।
      12. महाप्राण प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान और धोने प्लेट 100 μl / अच्छी तरह से धो बफर प्लेट वॉशर का उपयोग कर के साथ तीन बार।
      13. महाप्राण बफर धोने और 50 μl / अच्छी तरह से माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें और प्लेट (ओं) में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए परमाणु समाधान और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए सेते हैं।
      14. महाप्राण माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान और धोने प्लेट 100 μl / अच्छी तरह से धो बफर प्लेट वॉशर का उपयोग कर के साथ तीन बार। 100 μl / धो बफर का अच्छी तरह से जोड़ें। प्लेट (s) (हैं) अबतैयार HCS रीडर पर मूल्यांकन किया जाना है।
    3. डीएनए में नुकसान परख
      1. धीरे नामित "डीएनए की क्षति" प्लेटों से मध्यम aspirate।
      2. - 3.4.2.8 3.4.2.4: अनुक्रम में वर्णित के रूप में एक ही चरणों का प्रदर्शन। ध्यान दें कि इस उदाहरण में, केवल मध्यम कदम 3.4.2.4 के दौरान हटा दिया जाता है।
      3. निम्न सूत्र के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: बफर अवरुद्ध की मात्रा (μl) वी = 50 एक्स डब्ल्यू 1.2 x (डब्ल्यू कुओं की संख्या)
      4. पतला विरोधी phospho H2AX एंटीबॉडी (माउस) 1: प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में 2,000।
      5. एक ही कदम 3.4.2.10 में वर्णित के रूप में कार्य करें।
      6. निम्न सूत्र के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: बफर अवरुद्ध की मात्रा (μl) वी = 50 एक्स डब्ल्यू 1.2 x (डब्ल्यू कुओं की संख्या)
      7. माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान में 500: पतला विरोधी माउस एंटीबॉडी 1।
      8. Nuclea पतलाआर डाई 1: माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान में 1,000।
      9. एक ही कदम अनुक्रम में वर्णित के रूप में प्रदर्शन करना: 3.4.2.12-3.4.2.14।
    4. तनाव Kinase परख
      1. धीरे नामित "तनाव Kinase" प्लेटों में से प्रत्येक से मध्यम aspirate।
      2. - 3.4.2.8 3.4.2.4: अनुक्रम में वर्णित के रूप में एक ही चरणों का प्रदर्शन। ध्यान दें कि इस उदाहरण में, केवल मध्यम कदम 3.4.2.4 के दौरान हटा दिया जाता है।
      3. निम्न सूत्र के अनुसार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: बफर अवरुद्ध की मात्रा (μl) वी = 50 एक्स डब्ल्यू 1.2 x (डब्ल्यू कुओं की संख्या)
      4. प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान में 200: पतला विरोधी phospho cJun एंटीबॉडी (खरगोश) 1।
      5. एक ही कदम 3.4.2.10 में वर्णित के रूप में कार्य करें।
      6. निम्न सूत्र के अनुसार माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: बफर अवरुद्ध की मात्रा (μl) वी = 50 एक्स डब्ल्यू 1.2 x (डब्ल्यू कुओं की संख्या)
      7. माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान में 500: पतला विरोधी खरगोश एंटीबॉडी 1।
      8. माध्यमिक एंटीबॉडी और परमाणु समाधान में 1000: पतला परमाणु डाई 1।
      9. एक ही कदम अनुक्रम में वर्णित के रूप में प्रदर्शन करना: 3.4.2.12-3.4.2.14।
    5. आरओएस परख
      1. निम्न सूत्र के अनुसार लाइव सेल धुंधला समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: मध्यम (μl) वी का आयतन = 50 एक्स डब्ल्यू एक्स 1.2 (डब्ल्यू कुओं की संख्या)।
      2. विक्रेता के निर्देश के अनुसार लाइव सेल धुंधला समाधान में आरओएस डाई पतला
      3. परमाणु डाई 1 पतला: लाइव सेल धुंधला Solution.3.4.5.4 में 1,000) प्रत्येक अच्छी तरह प्लेटें नामित "आरओएस" करने के लिए 50 μl लाइव सेल धुंधला समाधान जोड़ें; सेल संस्कृति मीडिया को हटाने और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते करते।
      4. धीरे मध्यम और धुंधला समाधान निकालना और प्लेट 100 μl / अच्छी तरह से मध्यम के साथ तीन बार धोएं।
      5. मध्यम Aspirate, 100 जोड़ने _6, एल / अच्छी तरह से निर्धारण प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए समाधान और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
      6. धीरे निर्धारण समाधान निकालना और प्लेट 100 μl के साथ तीन बार धोने / अच्छी तरह से बफर धो लें।
      7. 100 μl / अच्छी तरह से धो बफर जोड़ें। प्लेट (ओं) अब तैयार है (हैं)।
      8. 1 घंटा के भीतर एचसीएस पाठक पर थाली का मूल्यांकन।
    6. GSH सामग्री परख
      1. निम्न सूत्र के अनुसार जीने सेल परमाणु धुंधला समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: मध्यम (μl) वी का आयतन = 50 एक्स डब्ल्यू एक्स 1.2 (डब्ल्यू कुओं की संख्या)।
      2. 1,000 लाइव सेल परमाणु धुंधला Solution.3.4.6.3 में): परमाणु डाई (सुदूर लाल) 1 पतला। नामित "GSH सामग्री" प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए लाइव सेल परमाणु धुंधला समाधान के 50 μl जोड़ें। सेल संस्कृति मीडिया को हटाने और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 30 मिनट के लिए सेते करते।
      3. के अनुसार लाइव सेल GSH धुंधला समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयारनिम्न सूत्र: HBSS की मात्रा (μl) वी = 50 एक्स डब्ल्यू 1.2 x (डब्ल्यू कुओं की संख्या)
      4. विक्रेता के निर्देशों के अनुसार लाइव सेल GSH धुंधला समाधान में GSH डाई पतला।
      5. धीरे मध्यम और परमाणु धुंधला समाधान निकालना और प्लेट 100 μl / अच्छी तरह से मध्यम के साथ तीन बार धोएं।
      6. महाप्राण मध्यम और प्लेट (ओं) की अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl / अच्छी तरह से लाइव सेल GSH धुंधला समाधान जोड़ें।
      7. अंधेरे में कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए सेते हैं। प्लेट (ओं) अब तैयार है (हैं)।
      8. 1 घंटा के भीतर एचसीएस रीडर पर प्लेट (ओं) का मूल्यांकन।
    7. apoptosis परख
      1. निम्न सूत्र के अनुसार लाइव सेल धुंधला समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: मध्यम (μl) वी का आयतन = 50 एक्स डब्ल्यू एक्स 1.2 (डब्ल्यू कुओं की संख्या)।
      2. लाइव सेल धुंधला समाधान में 300: पतला कस्पासे डाई 1।
      3. सेल संस्कृति मीडिया निकालें, टी के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 50 μl लाइव सेल धुंधला समाधान जोड़ेंवह प्लेट (ओं) नामित "Apoptosis" और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं, 5% सीओ 2।
      4. निम्न सूत्र के अनुसार जीने सेल परमाणु धुंधला समाधान की पर्याप्त मात्रा (वी) तैयार: फिक्स समाधान (μl) वी का आयतन = 50 एक्स डब्ल्यू एक्स 1.2 (डब्ल्यू कुओं की संख्या)।
      5. लाइव सेल परमाणु धुंधला समाधान में 1000: पतला परमाणु डाई 1।
      6. , लाइव सेल धुंधला समाधान निकालें प्लेट (ओं) में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl / अच्छी तरह से लाइव सेल परमाणु धुंधला समाधान जोड़ने के लिए और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
      7. प्लेट (ओं) 100 μl / अच्छी तरह से धो बफर के साथ तीन बार लगानेवाला / परमाणु डाई समाधान Aspirate और धो लें।
      8. 100 μl / अच्छी तरह से धो बफर जोड़ें। प्लेट (ओं) अब तैयार है (हैं)।
      9. एचसीएस रीडर पर प्लेट (ओं) का मूल्यांकन।
  5. डेटा विश्लेषण एचसीएस
    1. के रूप में Excel (.xls) फ़ाइल निर्यात कच्चे डेटा। नोट: कच्चे सेल सूचकांक मूल्यों को एक साथ 96 के रूप में संगठित कर रहे हैं(Mirroring प्लेट अच्छी तरह से वितरण) में और एक निश्चित समय बिंदु के बाद खुराक पर हर अंत अंक के लिए प्रदान की जाती हैं।
    2. निम्न समीकरण का उपयोग मूल्यों मानक के अनुसार:
      3 समीकरण
      जहां मैं मापा एक अच्छी तरह से कच्चे संकेत मान है,
      वाहन, एक प्लेट पर वाहन कुओं के लिए मापा संकेत मूल्यों के बीच का है
      सीआर वाहन (0%) के लिए वांछित मंझला सामान्यीकृत मूल्य है, और
      अनुसूचित जाति, सकारात्मक नियंत्रण (100) के लिए वांछित मंझला सामान्यीकृत मूल्य है
      नोट: इस चरण के अंत में, एक डेटा सेट प्राप्त की है जिसमें 96 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक स्थिति मैं एक एकाग्रता मैं सी (लघुगणक इकाइयों में) है कि नमूना स्थिति में समाहित करने के लिए लागू किया गया था के लिए / अच्छी तरह से मैं और इसके इसी सामान्यीकृत संकेत एन (i)।
    3. प्लॉट और फिट (ग मैं, एन (i)) - एक 4-पैरामीटर हिल समीकरण का उपयोग मूल्यों।
      4 समीकरण
      जहां परीक्षण परिसर के शून्य एकाग्रता में शून्य गतिविधि एस 0 = गतिविधि के स्तर पर,
      अनंत एकाग्रता में अनंत गतिविधि एस inf = गतिविधि के स्तर पर,
      AC50 = एकाग्रता, जिस पर गतिविधि अधिकतम स्तर के 50% तक पहुँच जाता है,
      हिल गुणांक एन = AC50 पर ढलान के उपाय, और
      सी = खुराक प्रतिक्रिया वक्र साजिश के एक्स अक्ष पर मूल्यों के लिए इसी लघुगणक इकाइयों में एकाग्रता।
      नोट: AC50 शक्ति का एक उपाय है, जहां कम मूल्यों उच्च शक्ति का संकेत मिलता है।

Representative Results

RTCA

क्योंकि एचसीएस समापन जानकारीपूर्ण जब कोई विषाक्त प्रभाव का पता चला है नहीं होगा, उन यौगिकों नहीं दिखा RCTA में सर्वोच्च एकाग्रता एचसीएस (चित्रा 3 बी, सी, डी, जी, कश्मीर, एल, एम द्वारा परीक्षण नहीं कर रहे हैं करने के लिए सेल व्यवहार्यता को कम किया है , पी)। यौगिकों दिखा केवल उच्चतम एकाग्रता में कमी आई है सेल व्यवहार्यता (चित्रा 3E, ओ) भी HCS के लिए अचयनित कर रहे हैं। अंत में, केवल एक गणनीय एलडी 50 (<20 मिमी) के साथ घटक आगे एचसीएस विश्लेषण (चित्रा 3 ए, एफ, एच, जम्मू, एन) के लिए चुने गए हैं। उपरोक्त मानदंडों को पूरा करने HPHCs हैं: 1-aminonaphtalene, आर्सेनिक (वी), क्रोमियम (छठे), Crotonaldehyde और Phenol।

एचसीएस

एक गुणवत्ता की जांच (क्यूसी) के रूप में, सकारात्मक नियंत्रण फाई रहे हैंआरएसटी कि धुंधला प्रक्रिया सही ढंग से किया जाता है आश्वस्त करने के लिए विश्लेषण किया। सकारात्मक नियंत्रण इलाज कोशिकाओं के प्रतिनिधि चित्रों 6 चित्र में दिखाया गया है। डेटा मूल्यों वाहन के लिए सामान्यीकृत के रूप में पहले से वर्णित हैं। कोई खुराक प्रतिक्रिया घटता प्लॉट किए जाते हैं के रूप में केवल तीन खुराक परीक्षण कर रहे हैं और सभी तीन खुराक नहीं हर समय बिंदु पर विचार कर रहे हैं। सकारात्मक नियंत्रण खुराक चुने गए हैं (पिछले प्रयोगों के आधार पर, डेटा नहीं दिखाया गया है) तो यह है कि उचित प्रतिक्रिया दोनों 4 घंटा और 24 घंटे में प्रत्येक समापन बिंदु के लिए मनाया जाता है। विशेष खुराक में 1 और 2, जबकि खुराक 2 और 3 24 घंटे में प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं 4 घंटा पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। प्लेट्स खारिज कर रहे हैं, तो कोई जवाब सकारात्मक नियंत्रण खुराक के लिए मनाया जाता है। ध्यान दें कि सभी समापन, mitochondrial झिल्ली क्षमता और GSH सामग्री के लिए छोड़कर, संकेत तीव्रता की वृद्धि की उम्मीद है।

सभी यौगिकों, फिनोल के अलावा, एक परिगलित pheno प्रेरित प्रकार, वृद्धि की कोशिका झिल्ली पारगम्यता (चित्रा 7A, एफ, एच, एल) पर आधारित है। 1-aminonaphtalene, क्रोमियम (छठे), Crotonaldehyde और Phenol हिस्टोन H2AX की वृद्धि की फोस्फोराइलेशन (चित्रा 7E, जम्मू, एन, पी) के आधार पर genotoxic होने के रूप में पहचान की गई। फिनोल और 1-aminonaphtalene गंभीर mitochondrial रोग (चित्रा 7b, ओ) है, जो 1-aminonaphtalene के साथ, एक वृद्धि साइटोक्रोम सी रिहाई (चित्रा 7C) का नेतृत्व करने के लिए प्रेरित करने के पाए गए। बढ़ी हुई कस्पासे 3/7 गतिविधि का पता लगाने क्रोमियम जोखिम पर apoptotic घटना के सबूत प्रदान की है। ऑक्सीडेटिव तनाव प्रेरण (आरओएस या GSH) भी 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyde और फिनोल (चित्रा 7 डी, एम, क्यू) के साथ इलाज पर पाया गया। के रूप में प्रतिलेखन कारक cJun (चित्रा 7G) की वृद्धि की फोस्फोराइलेशन द्वारा प्रदर्शन अंत में, आर्सेनिक सेल तनाव लाती है।

लोड / 53987 / 53987fig1.jpg "/>
चित्रा 1. यौगिक Tox-प्रोफाइलर कार्यप्रवाह। एक) कार्यप्रवाह के योजनाबद्ध इस अध्ययन में पीछा किया। सबसे पहले, एक खुराक रेंज खोजने RTCA मंच का उपयोग कर उचित खुराक का चयन करने के बाद एचसीएस यौगिक विशेष विषाक्तता प्रोफाइल। बी) के एक अध्ययन के प्रायोगिक डिजाइन को चिह्नित करने के लिए किया गया था। बोने के बाद 24 घंटे, कोशिकाओं dosed थे और प्रतिबाधा मूल्यों लगातार बाद 24 घंटा से अधिक नजर रखी, जबकि एचसीएस समापन 4 की जांच की गई और खुराक के बाद 24 घंटे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. RTCA एक्सपोजर प्लेट। कंपाउंड मास्टर थाली पहले एक पांच कदम 1:10 धारावाहिक कमजोर पड़ने के प्रदर्शन से उत्पन्न होता है। प्रत्येक यौगिक,वाहन नियंत्रण (खुराक 0) सहित उसके बाद मध्यम और Staurosporine नियंत्रण के रूप में एक साथ के साथ जोखिम थाली करने के लिए तीन प्रतियों में जोड़ा जाता है। ध्यान दें कि खुराक अनुक्रम हस्तांतरण पर बनाए रखा है, उच्चतम खुराक, जबकि वाहन नियंत्रण पंक्ति संख्या 7 में हैं पंक्ति संख्या 1 में हैं कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रतिनिधि RTCA सेल व्यवहार्यता परिणाम। क) 1-aminonaphtalene, ख) 2-nitropropane, ग) acetamide, घ) एसीटोन, ई) एक्रिलामाइड, एफ) आर्सेनिक (वी), जी) बेंजीन, एच) क्रोमियम (छठे) , जम्मू) Crotonaldehyde, कश्मीर) मिथाइल एथिल ketone, एल) Nickeएल (द्वितीय), मी) Nitrobenzene, एन) फिनोल, ओ) क्विनोलिन, पी) टोल्यूनि। 24 घंटे बाद खुराक में वक्र (नीलामी) के तहत क्षेत्र प्रत्येक खुराक 0 से -100% गतिविधि (शाफ़्ट), जहाँ 0 की गतिविधि को दर्शाता है और एक सीमा में सामान्यीकृत (सकारात्मक नियंत्रण और वाहन सहित) के लिए गणना की गई वाहन और सकारात्मक नियंत्रण के -100। मानों तो साजिश रची और एक चार पैरामीटर हिल समीकरण और, जब भी संभव हो, एलडी 50 गणना की गई का उपयोग कर लगाया गया था। सांद्रता एक लॉग पैमाने (एक्स अक्ष) पर व्यक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एचसीएस Assays के लिए सकारात्मक नियंत्रण यौगिकों के लिए कमजोर पड़ने योजना। एक) सकारात्मक नियंत्रण के अलावा और veधारावाहिक कमजोर पड़ने थाली। ख) सकारात्मक नियंत्रण के धारावाहिक कमजोर पड़ने। ग) 200X सकारात्मक नियंत्रण खुराक। डी) मध्यम (1:40 में 200x सकारात्मक नियंत्रण खुराक के कमजोर पड़ने) को hicle 5x खुराक युक्त सकारात्मक नियंत्रण प्लेट उत्पन्न करते हैं। ध्यान दें कि प्रत्येक खुराक जोखिम थाली में अंतिम लेआउट को प्रतिबिंबित करने के triplicates में पतला है)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. एचसीएस एक्सपोजर प्लेट। कंपाउंड मास्टर थाली पहले एक पांच कदम कमजोर पड़ने के प्रदर्शन से उत्पन्न होता है। वाहन पर नियंत्रण सहित प्रत्येक यौगिक, (खुराक 0) तो सकारात्मक नियंत्रण के साथ एक साथ जोखिम थाली करने के लिए तीन प्रतियों में जोड़ा जाता है। ध्यान दें कि खुराक आदेश हस्तांतरण पर बनाए रखा है,जबकि वाहन नियंत्रण पंक्ति संख्या 7 में हैं सबसे ज्यादा खुराक पंक्ति संख्या 1 में हैं कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. प्रतिनिधि फ्लोरोसेंट Antibody- या डाई दाग कोशिकाओं की तस्वीरें एक) परमाणु मापदंडों - परमाणु डाई:। एक पारगम्य डाई जो रहते हैं या तय कोशिकाओं में डीएनए को बांधता है। यह दाग़ व्यक्तिगत परमाणु क्षेत्र लेबलिंग कोशिकाओं की पहचान करने के लिए प्रयोग किया जाता है ख) परिगलन - सेल झिल्ली पारगम्यता डाई:। कोशिका झिल्ली अखंडता की डाई आधारित पता लगाने। अभिकर्मक आंतरिक रूप से कोशिका झिल्ली को अभेद्य है। नेक्रोसिस के दौरान झिल्ली पारगम्य हो जाता है और डाई सेल में प्रवेश करती है और एक मजबूत फ्लोरोसेंट उत्पादन डीएनए को बांधता। ignal ग) Apoptosis - साइटोक्रोम सी: साइटोक्रोम सी विज्ञप्ति जारी की, जल्दी apoptosis के एक जाने-माने बानगी के एंटीबॉडी आधारित पता लगाने। Apoptosis के शामिल होने पर साइटोक्रोम ग माइटोकॉन्ड्रिया से जारी है और नाभिक घ) डीएनए में नुकसान में diffuses है - pH2AX:।। हिस्टोन H2AX के फोस्फोराइलेशन की एंटीबॉडी आधारित पता लगाने, डबल कतरा डीएनए टूट की एक प्रसिद्ध बानगी ई) तनाव Kinase - cJun:। Ser-73 cJun की, सेलुलर तनाव का एक प्रसिद्ध बानगी पर फोस्फोराइलेशन की एंटीबॉडी आधारित पता लगाने च) ऑक्सीडेटिव तनाव - DHE: सुपरऑक्साइड कण की डाई आधारित पता लगाने। । जबकि ऑक्सीकरण प्रपत्र ethidium डीएनए मध्यनिवेश जी पर लाल fluoresces Dihydroethidium में ही कोशिका द्रव्य में नीले fluoresces) GSH - mBcl: नि: शुल्क GSH अणुओं की डाई आधारित पता लगाने। mBcl को GSH के साथ प्रतिक्रिया। कस्पासे 3/7 गतिविधि की डाई आधारित पता लगाने: कस्पासे 3/7 सक्रियण - एक अत्यधिक फ्लोरोसेंट उत्पाद ज) Apoptosis उत्पन्न करते हैं। अभिकर्मक एक चार अमीनो एसिड पेप्टाइड है कि डीएनए बाध्यकारी रोकता के साथ गैर फ्लोरोसेंट है। पर कस्पासे 3/7 सक्रियण, पेप्टाइड डीएनए के लिए बाध्य है और एक उज्ज्वल, fluorogenic प्रतिक्रिया का उत्पादन करने के लिए डाई को सक्षम करने cleaved है। पैनलों बिहार सकारात्मक नियंत्रण इलाज कोशिकाओं को दिखाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. प्रतिनिधि एचसीएस परिणाम। 1-aminonaphtalene (एई), आर्सेनिक (वी) (एफ और जी), क्रोमियम (छठे) (एच), Crotonaldehyde (एल.एन.) और फिनोल (OQ)। 4 घंटा (नीली रेखा) और24 घंटा (नारंगी लाइन) संकेतों प्रत्येक खुराक के लिए गणना की और वाहन गतिविधि (0%) के लिए सामान्यीकृत किया गया। मूल्यों है कि वक्र ढाले संगणना में शामिल नहीं हैं ग्रे में दिखाया जाता है। सांद्रता एक लॉग पैमाने (एक्स अक्ष) पर व्यक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

परख समापन बिंदु # जैविक समापन बिंदु सेलुलर डिब्बे उत्पादन सुविधा
cytotoxicity 1 Mitochondrial बड़े पैमाने पर 6 कोशिका द्रव्य स्पॉट औसत क्षेत्र
2 Mitochondrial झिल्ली संभावित 6 कोशिका द्रव्य स्पॉट औसत तीव्रता
3 साइटोक्रोम ग रिलीज नाभिक औसत तीव्रता
4 कोशिका झिल्ली पारगम्यता 8 नाभिक औसत तीव्रता
डीएनए की क्षति 5 phospho-H2AX 9 नाभिक औसत तीव्रता
तनाव Kinase 6 phospho-cJun 10 नाभिक औसत तीव्रता
आरओएस 7 आरओएस 11 नाभिक औसत तीव्रता
GSH सामग्री 8 GSH 12 कोशिका द्रव्य स्पॉट औसत तीव्रता
apoptosis 9 कस्पासे 3 13 कोशिका द्रव्य स्पॉट औसत तीव्रता

तालिका 1 एचसीएस एक की सूचीssays और समापन।

<टीडी> 0.17
वाहन RTCA खुराक (माइक्रोन) एलडी 50 एचसीएस खुराक
सेल व्यवहार्यता चयनित (माइक्रोन) 3R4F (एनएम)
1-Aminonaphtalene EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 280 सुक्ष्ममापी 2,000 500 200 150 0.27
2-nitropropane EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
acetamide EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
एसीटोन पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
एक्रिलामाइड पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
आर्सेनिक (वी) पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 160 माइक्रोन 200 100 50 25
बेंजीन EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
क्रोमियम (छठे) पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 20 माइक्रोन 100 50 20 10 0.06
Crotonaldehyde पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 200 सुक्ष्ममापी 20,000 2,000 200 20 2,000
मिथाइल एथिल कीटोन पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 >20 मिमी
निकल पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
nitrobenzene EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
फिनोल EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 2300 सुक्ष्ममापी 5000 2,000 1,000 500 240
quinoline EtOH 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी
टोल्यूनि पानी 20,000 2,000 200 20 2 0.2 > 20 मिमी

उपचार की 24 घंटे में सापेक्ष एलडी 50 के साथ परीक्षण किया HPHC यौगिकों की तालिका 2 सूची। एचसीएस विश्लेषण के लिए चयनित यौगिकों नारंगी में डाला जाता है और जांच की खुराक भी दी जाती है। 3R4F खुराक संदर्भ सिगरेट 3R4F से एक छड़ी के धुएं में संविधान वर्तमान की राशि के बराबर है।

परख यौगिक शेयर समाधान विलायक खुराक (एस) (माइक्रोन)
सेल व्यवहार्यता Staurosporine 10 मिमी DMSO 50
cytotoxicity Valinomycin 10 मिमी DMSO 50 20 5
डीएनए की क्षति paraquat 100 मिमी DMSO 500 200 50
तनाव Kinase Anisomycin 2 मिमी DMSO 10 4 1
आरओएस rotenone 200 मिमी DMSO 1,000 400 100
GSH सामग्री Ethacrynic एसिड 200 मिमी DMSO 1,000 400 100
apoptosis Staurosporine 40 मिमी DMSO 200 </ Td> 50 20

तालिका 3. सकारात्मक नियंत्रण और सांद्रता प्रत्येक परख के लिए इस्तेमाल की सूची।

Discussion

पशु प्रयोग करने के लिए विकल्प के लिए और नए उच्च throughput परीक्षण के दृष्टिकोण के लिए जरूरतों को व्यापक रूप से पिछले वर्षों में चर्चा की गई है। यह वैज्ञानिकों और नियामक अधिकारियों मानक विषाक्तता परीक्षण के लिए वैकल्पिक तरीकों, सेलुलर assays कि निकट लक्ष्य ऊतकों के शरीर क्रिया विज्ञान की नकल के उपयोग की जांच करने के लिए प्रेरित किया है। इस अध्ययन में, हम एक उच्च सामग्री स्क्रीनिंग (एचसीएस) मंच के साथ एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक (RTCA) के संयोजन मानव फेफड़ों उपकला कोशिकाओं पर ही सीएस घटक के लिए जोखिम के प्रभाव का आकलन करने के लागू प्रदर्शन किया है। इस सेटअप तुलनात्मक रूप से विभिन्न अन्य हवाई प्रदूषण, हवाई कणों, और नैनोकणों से प्रेरित cytotoxicity का मूल्यांकन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्राप्त परिणामों के कारण जैविक नेटवर्क के आधार पर पूरे जीनोम transcriptomics और कम्प्यूटेशनल विधियों से उन लोगों के साथ मिलान किया जा सकता है। जैसा कि पहले बताया, इस दृष्टिकोण आणविक मार्ग पर डेटा की पुष्टि करने के लिए हमें की अनुमति दीसीएस जोखिम 5 एचसीएस समापन के साथ पर गड़बड़ी, ये मार्ग perturbations को संबोधित भी phenotypically।

एक फ़्लोचार्ट परख के रूप में, वास्तविक समय सेल विश्लेषण एक खुराक और समय पर निर्भर संकल्प है, जो बेहतर निर्णय लेने के जो खुराक और जोखिम समय बिंदु बहाव के विश्लेषण 14 के लिए अनुकूल हो सकता है की अनुमति देता में सेल व्यवहार्यता से संबंधित जानकारी प्रदान करता है। विश्लेषक के सिद्धांत कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न के रूप में वे देते हैं और एक संस्कृति में अच्छी तरह से सतह एक सोने microelectrode के साथ कवर पर फैल विद्युत प्रतिबाधा में बदलाव पर निर्भर करता है। प्रतिबाधा सेल सूचकांक नाम के एक आयामरहित पैरामीटर, जो कोशिका आसंजन की निगरानी के लिए, प्रसार, आकृति विज्ञान और अंततः सेल व्यवहार्यता का इस्तेमाल किया जा सकता है में बदल जाती है। हालांकि इस तकनीक साइटोटोक्सिक तंत्र के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करता है, इसकी संवेदनशीलता भी बहुत कम मात्रा है, जिस पर एचसीएस जानकारीपूर्ण नहीं है पर रूपात्मक सेलुलर परिवर्तन का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है (डेटा) नहीं दिखाया। previ के आधार परous प्रयोगों, हम उल्लेख किया है कि RTCA कार्यप्रणाली एचसीएस समापन की तुलना में कम मात्रा में रूपात्मक परिवर्तन का पता लगाने में सक्षम है।

वास्तविक समय सेल विश्लेषक के साथ प्रारंभिक जांच के बाद, एक एचसीएस मंच प्रत्येक HPHC द्वारा हासिल cytotoxicity के प्रकार पर अधिक गहराई से जानकारी हासिल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एचसीएस परख पैनल सेलुलर डिब्बों पर उनके संभावित प्रभाव की ओर HPHCs प्रोफ़ाइल करने के लिए अनुमति / अंगों के रूप में अच्छी तरह से genotoxicity या ऑक्सीडेटिव तनाव जानने उन की पहचान। विश्लेषण अलग प्रोफाइल जिससे चुने गए HPHCs NHBE कोशिकाओं में cytotoxicity प्रेरित का पता चला। सामान्य में, सभी यौगिकों, फिनोल, सिवाय उच्चतम परीक्षण किया खुराक पर नेक्रोसिस प्रेरित करने के लिए पाए गए। genotoxicity के लिए एक मार्कर के रूप H2AX के कैंसर के विकास 1-aminonaphtalene प्रेरित फोस्फोराइलेशन में एक संभावित भूमिका है, तथापि एचसीएस पैनल mitochondrial विषाक्तता readout में इस HPHC का भी खुला गतिविधि (बड़े पैमाने पर वृद्धि हुई है और साइटोक्रोम सी relea के अनुरूपएसई) और oxidative तनाव (GSH कमी)। इसी तरह, के रूप में पहले से वर्णित, फिनोल mitochondrial रोग को उत्पन्न, और डीएनए की क्षति के साथ ही GSH कमी पैदा करने के लिए पहचान की गई थी। क्रोमियम (छठे), यौगिकों के समूह मैं कार्सिनोजन के रूप में वर्गीकृत में से एक है, और Crotonaldehyde भी दोनों के रूप में genotoxic की पहचान की गई है, विशेष रूप क्रोमियम (छठे) भी प्रेरित apoptosis (कस्पासे झरना सक्रियण) और Crotonaldehyde में हुई वृद्धि हुई आरओएस पीढ़ी। अंत में आर्सेनिक (वी), cJun फोस्फोराइलेशन जो तनाव काइनेज मार्ग सक्रियण के एक मार्कर है प्रेरित करने के लिए मिला था।

इस अध्ययन में, हम इन विट्रो में फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं के लिए एक मॉडल के रूप में NHBE कोशिकाओं का उपयोग किया। एक एचसीएस की स्थापना में इन कोशिकाओं का उपयोग करते हुए अभूतपूर्व है और genotoxicity और oxidative तनाव मार्कर सहित समापन, का एक व्यापक रेंज की जांच सक्षम होना चाहिए। दोनों रहते सेल और निश्चित सेल धुंधला दृष्टिकोण हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित किया गया है, समग्र तकनीक के लचीलेपन का प्रदर्शन है। एफ मेंअधिनियम, बहुत ही प्रोटोकॉल के लक्ष्यों का एक व्यापक रेंज है, जो किसी भी फ्लोरोसेंट डाई या एंटीबॉडी के उपयोग के द्वारा संबोधित किया जा सकता करने के लिए लागू किया जा सकता है। लाइव धुंधला प्रोटोकॉल के सफल क्रियान्वयन के लिए, यह ऊष्मायन समय का सम्मान करने के लिए, के रूप में रंगों के कुछ एक सीमित आधा जीवन और प्रतिदीप्ति संकेत छवि अधिग्रहण के पूर्ण होने से पहले कम हो सकती है महत्वपूर्ण है। यह भी विचार है कि यदि एक अलग सेल प्रकार प्रयोग किया जाता है, सब धुंधला शर्तों इष्टतम डाई एकाग्रता के रूप में फिर से मूल्यांकन किया जाना चाहिए, और ऊष्मायन समय अलग हो सकता है महत्वपूर्ण है।

वर्तमान पत्र में हम एक परिदृश्य में जहां केवल पांच यौगिकों जहां एचसीएस कार्यप्रणाली के साथ जांच का वर्णन किया है। पहले से वर्णित थाली लेआउट को ध्यान में रखते, वे, 24 प्लेट (6 assays और 2 समय अंक) प्लेटों की व्याप्ति संख्या में भी वृद्धि हुई किया जा सकता है की एक कुल के लिए 2 से अधिक विभिन्न प्लेट सेट dosed थे जिससे अधिक यौगिकों या के एक साथ प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है जांचअधिक समापन के tigation। ऐसा करने से पहले, तथापि, एक ध्यान में रखना चाहिए कि कुछ समापन (GSH और आरओएस) तत्काल अधिग्रहण की आवश्यकता होती है, और एक परिणाम के रूप में, प्लेटों की खुराक पिछले प्लेट के अधिग्रहण की अनुमति के लिए एक कंपित फैशन में किया जाना चाहिए। के रूप में प्लेटें एक बाद में मंच पर, खड़ी की जा सकती निर्धारण के बाद किसी भी कदम पर प्रोटोकॉल दखल, धुंधला प्रक्रिया के पूरा होने के लिए दूसरी ओर, एक निश्चित सेल धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है। यह दृष्टिकोण, उदाहरण के लिए, समय डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना सभी को लाइव सेल धुंधला प्लेटों को पूरा करने के साथ ऑपरेटर प्रदान करेगा।

आगे प्लेटों की संख्या कम करके कार्यप्रवाह अनुकूलन करने के लिए, यह भी अधिक समापन एक साथ मल्टीप्लेक्स के लिए संभव हो जाएगा। इस संदर्भ डीएनए में नुकसान और तनाव में उदाहरण के लिए Kinase एक साथ जांच की जा सकता विभिन्न ग में उत्सर्जन fluorochromes के साथ बस दो माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोगhannels। एचसीएस मंच के सतत विकास, पूरी तरह से स्वचालित सेल बोने, यौगिक कमजोर पड़ने, खुराक और धुंधला सहित, साथ ही नए समापन के अलावा आगे अन्य प्रकार की कोशिकाओं उपकला पर HPHCs और के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में की रूपरेखा एचसीएस मंच की क्षमता का विस्तार होगा ।

Disclosures

सभी लेखकों फिलिप मॉरिस इंटरनेशनल के कर्मचारी हैं। फिलिप मॉरिस इंटरनेशनल धन और इस परियोजना का प्रायोजक का एकमात्र स्रोत है।

Acknowledgments

लेखकों पांडुलिपि की उनकी समीक्षा के लिए Kårsta Luettich और ग्रेगरी Vuillaume को धन्यवाद देना चाहूंगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader Thermo N01-0002B
xCelligence RTCA MP ACEA 05331625001
Screener (HCS) Genedata NA
CASY counter TTC Roche 05 651 719 001
e-Plates VIEW 96 ACEA 06 472 451 001
RTCA Frame 96 ACEA 05232392001
RTCA Cardio Temperature Tool ACEA 2801171
Plate sealer breathseal Greiner bio-one 676051
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) Lonza CC-2540 non-smoking 60-year-old Caucasian male donor 
BEGM BulletKit Lonza CC-3170 Warm at 37 °C before use
ReagentPack Subculture Reagents kit Lonza CC-5034 Warm at 37 °C before use
Penicillin/Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
Easy Flask filter cap 75 cm2 Thermo Scientific 12-565-349
96 well assay plate  black  Corning 3603
Hoechst 33342  Fisher Scientific PI-62249
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) Biostatus DR50200
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos Life technologies M-7512
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos Life technologies M-7513
ROS Dye: Dihydroethidium Sigma D7008
ROS Dye: CellROX Life technologies C10422
ROS Dye: MitoSOX Life technologies M36008
GSH Dye: Monochlorobimane Sigma 69899 Toxic
GSH Dye: Monobromobimane Life technologies M-1378 Toxic
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1  Life technologies Y3603 Irritating 
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1  Life technologies T3602 Irritating 
Membrane permeability Dye: TOTO-1  Life technologies T3600 Irritating 
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green Life technologies C10423 Irritating 
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) Thermo MA5-11823
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) Thermo MA5-15889
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) Thermo MA1-2022
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650  Abcam ab96878
10x permeabilization buffer Fisher 8408400
4% Formaldehyde solution Sigma F1635 Toxic
10x blocking buffer Fisher 8408500
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Sigma D8537
Hanks' Balanced Salt solution Sigma H8264
Staurosporine Sigma S4400 Toxic
Valinomycin Sigma V0627 Toxic
Paraquat Sigma 36541 Toxic
Anisomycin Sigma A9789 Toxic
Ethacrynic acid Sigma E4754 Toxic
1-Aminonaphthalene Sigma 34390 Toxic
2-Nitropropane Sigma 130265 Toxic
Acetamide Sigma 695122 Toxic
Acetone Sigma 650501 Toxic
Acrylamide Sigma A9099 Toxic
Arsenic (V) Sigma A6756 Toxic
Benzene Sigma 12540 Toxic
Chromium (VI) Sigma 216623 Toxic
Crotonaldehyde Sigma 262668 Toxic
Methyl ethyl ketone Sigma 34861 Toxic
Nickel  Sigma 203866 Toxic
Nitrobenzene Sigma 48547 Toxic
Phenol Sigma P5566 Toxic
Quinoline Sigma 241571 Toxic
Toluene Sigma 34866 Toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
  3. Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
  4. US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
  5. Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
  6. Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
  7. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
  10. Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
  11. Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
  12. Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
  13. Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
  14. Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).

Tags

आण्विक जीवविज्ञान अंक 111 उच्च सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम विष विज्ञान सामान्य मानव ब्रोन्कियल उपकला कोशिकाओं डीएनए की क्षति सेल तनाव धुआँ संघटक
उच्च सामग्री स्क्रीनिंग हानिकारक और हानिकारक घटकों की विषाक्तता प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए विश्लेषण (HPHC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., … More

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., Acali, S., Johne, S., Laurent, A., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC). J. Vis. Exp. (111), e53987, doi:10.3791/53987 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter