Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Hög halt Screening Analys För att utvärdera de toxikologiska effekterna av skadliga och potentiellt skadliga beståndsdelar (HPHC)

Published: May 10, 2016 doi: 10.3791/53987

Abstract

Cigarettrök (CS) är en viktig riskfaktor för hjärt- och lungsjukdomar. Eftersom CS är en komplex aerosol som innehåller mer än 7000 kemikalier ett det är svårt att bedöma bidragen från enskilda beståndsdelar till dess totala toxicitet. Toxikologiska profiler av enskilda beståndsdelar liksom blandningar kan dock etableras in vitro, genom att tillämpa höga genomlopps screening verktyg, som gör det möjligt att profilering av skadliga och potentiellt skadliga beståndsdelar (HPHCs) av tobaksrök, enligt definitionen i US Food and Drug administration (FDA). 2

För en första bedömning, var en impedans baserat instrument som används för en realtids, etikett-fri bedömning av föreningens toxicitet. Instrumentet avläsning bygger på celladhesion, livskraft och morfologi som tillsammans ger en översikt över cellens status. En dimensions parameter som heter cell index används för kvantifiering. En uppsättning av difka färgningsprotokoll har utvecklats för ett fluorescens avbildning baserad undersökning och en HCS plattform användes för att få mer detaljerad information om vilken typ av cytotoxicitet framkallad av varje HPHC.

Av de 15 beståndsdelar testade bara fem valdes ut för HCS baserad analys som de registrerade en beräkningsbar LD 50 (<20 mm). Dessa inkluderade en-aminonaphtalene, arsenik (V), krom (VI), Krotonaldehyd och fenol. Baserat på deras effekt i HCS, kan en-aminonaphtalene och Fenol identifieras för att inducera mitokondriell dysfunktion, och tillsammans med krom (VI) som genotoxiskt vilket baseras på den ökade histon H2AX fosforylering. Krotonaldehyd identifierades som en oxidativ stress inducerare och arsenik som en stress-kinasvägen aktivator.

Denna studie visar att en kombination av impedans-baserade och HCS teknik tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för in vitro-bedömning av CS beståndsdelar.

Introduction

Toxikologiska riskbedömningen har historiskt förlitat sig på användningen av djurmodeller som, även om grundläggande i biovetenskap, är också kopplade med brister som inkonsekvent översättbarhet för människor och höga kostnader. Dessutom har det skett en ökad ansträngning för att hitta alternativ till djurförsök i en anda av "3R" 2 (ersättning, begränsning och förfining). Detta arbete har ökat under de senaste åren, inte bara på grund av de senaste framstegen såsom hög genomströmning tekniker och systembiologiska metoder, men också på grund av lagstiftning som begränsar användningen av djurförsök, särskilt i EU.

Komplexiteten i cellulära signaleringsvägar som reglerar svar på giftiga förolämpningar gör det uppenbart att användning av enskilda toxikologiska endpoints inte kommer att vara tillräcklig för att beskriva den toxikologiska grund av vissa föreningar. För detta samspelet mellan hundratals samverkande proteins som bidrar till en biologisk nätverk kommer också att behöva tas med i beräkningen. För att studera effekten av gifter på dessa nätverk, är ett system toxikologi strategi kombinerat med fenotypiska medelhög och hög genomströmning screeningsanalyser användbara för att sluta potenser och samtidigt ge mer information om verkningsmekanismen för enskilda gifter.

I denna studie använde vi HCS som ett kraftfullt screeningmetod, som består av ett automatiserat mikroskop och en biologisk program, som kan förvärva, bearbeta och analysera bilddata härrör från specifika fluorescensbaserade cellulära analyser. Detta medger visuella förändringar inom en cell som skall kvantifieras, vid en enda cell eller subcellulär nivå, och många parametrar som skall analyseras samtidigt. 3 Till exempel har DNA-dubbelsträngbrott utvärderades med användning av en antikropp-baserad identifiering av histon H2AX fosforylering och reaktiva syreradikaler (ROS) kvantifierades med hjälp av en cell-permeable superoxid känsligt färgämne.

Eftersom lungepitelceller representerar första biologisk barriär mot inhalerade gifter, inklusive cigarettrök, utnyttjade vi primära bronkiala epitelceller som ett in vitro-modell för att profilera effekten av HPHCs offentliggjorts av den amerikanska myndigheten Food and Drug Administration. 4 Detta manuskript är en uppföljning -upp på en tidigare studie 5 där vi utvärderat biologiska effekterna av en annan delmängd av HPHCs.

Som en del av vårt arbetsflöde för att bedöma cytotoxicitet in vitro, vi inledningsvis utvärderat potenser av ett urval av 15 HPHC s med hjälp av en impedans-baserade realtidscellanalys (RTCA) system som tillät oss att etablera dos-intervall, som lämpar sig för efterföljande HCS analys (Figur 1). En toxikologisk HCS bedömning utfördes sedan med hjälp av nio flera parametriska endpoints av cellulär toxicitet, varje övervakad vid två tidpunkter (4 och 24 h). Markörerna som användes var indikativ för mitokondriell toxicitet, DNA-skada, stress-kinas, reaktiva syreradikaler (ROS), glutation (GSH) innehåll, kaspas 3-7 aktivitet, cytokrom C frisättning och cellmembranpermeabilitet, såsom beskrivs i Tabell 1.

Vår strategi aktiverat identifiering och karakterisering av effekten av cigarettrök beståndsdelar genom dos- och tidsberoende provtagning. I slutändan, producerade detta ett in vitro toxikologiska profilen för varje HPHC. Multi-liknande områden metoder kan även användas för att ytterligare komplettera HCS-analys. Detta skulle slutligen också ge en djupare förståelse av effekterna på cellsignalering och / eller transkriptionsnivå.

Protocol

1. Skörd Normal Human Bronkial epitelceller (NHBEs)

  1. Pre-värma cellodlingsmediet (bronkial epitelcellinje tillväxtmedium-kompletterat medium), HEPES, trypsin och trypsin neutraliserande lösning (TNS) i vattenbadet vid 37 ° C.
  2. Skörda cellerna då 80% av konfluens uppnås.
    OBS: Följande NHBE cellodling sådd förhållanden kan användas för att uppnå optimal sammanflödet i obelagda T75-kolvar med 20 ml medium:
    1. Seed 1 x 10 6 celler för 3-dagars kultur, 0,5 x 10 6 celler för 4-dagars kultur och 0,25 x 10 6 celler för 5-dagars odling. Byt medium var 2 dagar när celler i odling för att uppdatera näringsämnen. Odlingsceller vid 37 ° C och 5% CO2.
  3. Avlägsna supernatanten från kolven (er) och tillsätt HEPES att tvätta cellerna (t ex., 3 ml för en 75 cm 2-kolv). Rotera varje flaska för att täcka cellmonoskiktet med HEPES solution.
  4. Avlägsna HEPES-lösning och tillsätt trypsin lösning (t ex., 3 ml för en 75 cm 2 kolv). Rotera kolven för att täcka cellmonoskiktet med trypsin lösning.
  5. Inkubera kolven under 5 minuter vid 37 ± 2 ° C. Övervaka cell lossnar under mikroskop och vid behov, inkubera längre och knacka försiktigt på kolven för att frigöra eventuella kvarvarande bundna celler.
  6. Lägg TNS att stoppa reaktionen (t ex., 3 ml för en 75 cm 2 kolv) och överföra cellsuspensionen till en 15 ml tub.
  7. Centrifugera cellsuspensionen vid 300 x g under 5 min.
  8. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 10 ml färskt medium, blanda försiktigt för att ge en homogen cellsuspension.
  9. Filtrera cellsuspensionen genom en 100 | iM cell sil för att avlägsna aggregat och räkna cellerna. Notera: I vårt laboratorium ett elektriskt fält flerkanalig cellräkning system användes för att precist och konsekvent utvärdera viable celler nummer.

2. Real Time Cell Analyzer (RTCA) -baserade dosintervallet Finding (DRF)

OBS: Ett mätsystem impedans-baserade användes för att: 1) utvärdera förening toxicitet, 2) välja föreningar som skall undersökas ytterligare genom HCS och 3) välja lämpliga doser för HCS. De NHBE celler i rCTA plattorna doseras genom att tillsätta 25 pl av testförening späd till 100 pl medel närvarande i varje brunn. Därför är alla testlösningar bereddes vid 5 gånger (5x) den önskade slutkoncentrationen.

  1. Seeding NHBE Celler
    1. Programmera instrumentet för att definiera antalet och varaktigheten av impedansmätningar. I denna studie användes data registreras var 15: e min under 48 h (från 24 h ± 2 h före och 24 h efter dosering av cellerna med testmedlen).
    2. Mäta plattan bakgrunden genom att pipettera 50 ul av förvärmda mediet i varje brunn i en 96-brunnars RTCA platta. Obs: Detta steg innebär ett tekniskt kravför instrumentet för att beräkna medel elektriskt motstånd som sedan används som en baslinje referens för cellbaserad beräkning.
    3. Förbereda en cellsuspension vid en koncentration av 144.000 celler / ml (± 5%) och tillsätt 50 | il cellsuspension (7200 celler / brunn) till varje brunn i RTCA platta i vilken 50 | il / brunn av medium till redan lagts för instrumentbakgrund mått.
    4. Låt cellerna vidhäfta under 30 minuter vid rumstemperatur innan du placerar dem i RTCA vaggan (för att förbättra den homogena fördelningen av cellerna). Inkubera RTCA plattorna i RTCA vagga i inkubatorn (37 ° C och 5% CO2) och börja spela in data för nästa 24 ± 2 timmar före doseringen.
  2. Utspädningar av HPHCs och positiva kontroller
    1. Positiv kontroll Späd
      1. Späd Staurosporin stamlösning (10 mM) 01:10 i DMSO (se tabell 3) och tillsätt 5 pl av dilution till 195 pl medium för att erhålla en 5x arbetslösning.
    2. HPHC Utspädning
      1. Lös upp / utspädd varje HPHC i fordonet (Tabell 2) för att generera en 1 M förrådslösning. Späd ut varje HPHC stamlösning 1:10 i medium för att generera en 100 mM lösning.
      2. Generera den "förening masterplåten" genom att utföra en fem-stegs 1:10 serieutspädning med användning av medium + 10% fordon för att erhålla de 5x arbetslösningar (Figur 2). Obs: I slutändan kommer de slutliga doserna vara 0,2 pm, 2 iM, 20 ^ M, 0,2 mm, 2 mm, 20 mm. förbereder också dosen 0, motsvarande den enda bilen i det här steget.
    3. dosering
      1. Pausa RTCA instrumentet och öppna vaggan för att ta bort plattan.
      2. Avlägsna plattan och placera den i RTCA plattemperatur verktyg (för att stabilisera temperaturen i RTCA plattan under experimentella procedurer utanför RTCAstation) för att undvika kyla celler, som kan påverka impedansen mätningen.
      3. Tillsätt 25 pl 5x lösning från "föreningen masterplatta" till celler i tre exemplar upprätthålla samma doserings ordning som i föreningen huvudplattan (högsta dosen i den översta raden och fordonskontroll i rad nummer 7) (Figur 2). Ta inte bort den befintliga (100 l) cellodlingsmedium.
      4. Tillsätt 25 pl 5x positiv kontroll lösning till cellerna i den nedersta raden (halv till höger) utan att ta bort befintliga odlingsmedium. Tillsätt 25 | il medium till cellerna i den nedersta raden (halv-vänster) utan att ta bort existerande cellodlingsmediet.
      5. Täta plattan med plattförslutning. Placera plattan tillbaka i RTCA vaggan och låsa den. Omstarts datainsamling för den önskade exponeringstiden (t ex., 24 h). Obs: Användningen av denna tätningsfilmen rekommenderas att undvika eventuella föroreningar, inklusive väl till väl korskontaminering.
    4. <strong> Dataanalys RTCA och LD 50 Beräkning
      1. Exportera rådata som en text (.txt) eller Excel (xls-fil). Obs: Filen innehåller all information om plattslayouten (föreningar, doser och väl läge). Rå cellindexvärden är organiserade i en 96 brunnsformat (spegling plattan väl distribution) och tillhandahålls för varje tidpunkter där inspelningen skett. Värdet vid position i i den platta med 96 brunnar vid tiden t betecknas med CI t (i).
      2. Identifiera som en normalisering referera till senaste tidpunkt före doseringen för varje position i i 96 brunnar (t.ex. Cell index på 23 tim 50 min 00 sek vid position i, CI t (i) = 23: 50: 00 = CI ref (i)). Obs: Denna information måste kommenteras när doseringen utförs.
      3. Divide, på en väl bas, varje tidpunkt värden genom normalisering hänvisning till normalisera alla värden vid doseringstiden. Det normaliserade värdet vid positioneringNi i plattan med 96 brunnar vid tiden t betecknas med NCI t (i) och kännetecknas således av NCI t (i) = Cl t (i) / CI Ref (i) för alla t.
      4. Beräkna arean under kurvan (AUC) vid 24 h efter dosering för varje prov i (läge I i plattan med 96 brunnar), inkluderande positioner för positiv kontroll och vehikel.
        1. Erhålla AUC vid position I erhålles genom att summera områdena varje rektangel, varje rektangel är mellan två tidpunkter betecknas med tk och t l (t k <t l); beräkna varje rektangel område med x * y med x = t l - tk är avståndet mellan två tidpunkter och y är medelvärdet av aktiviteten hos de två tidpunkter (y = (NCI tk (i) + NCI tl (i)) / 2).
          Anmärkning: AUC vid 24 h efter dosering för position i är betecknad med AUC (i). Eftersom alla villkor stryks i trippelbrunnar medianen av de tre värdena används.
      5. <li> Normalisera värden med hjälp av följande ekvation:
        ekvation 1
        där i är det läge i plattan med 96 brunnar, för vilka AUC beräknades vid 24 h efter dosering,
        Fordonet är medianen av AUC värdena för fordons brunnar på en platta med 24 timmar efter dosering,
        Positiv kontroll är medianen av AUC-värdena för de positiva kontrollbrunnar på en platta vid 24 timmar efter dosering,
        CR är den önskade median normaliserade värdet för fordonet (0%), och
        SC är det önskade median normaliserade värdet för de positiva kontrollerna (-100%)
        OBS: Vid slutet av detta steg, är en datauppsättning som erhållits som innehåller, för varje position i i plattan med 96 brunnar, en koncentration ci (i logaritmiska enheter) som appliceras på provet som finns i position / brunn i och dess motsvarande normaliserad AUC vid 24 timmar efter dosering AUC_normalized (i).
      6. Plot och montera (Ci, AUC_normalized (i)) -värden med användning av en 4-parameters Hill-ekvationen. När det är möjligt, även beräkna LD 50.
        ekvation 2
        där Y = AUC_normalized,
        Zero Activity S 0 = aktivitetsnivå på noll koncentration av testföreningen,
        Oändlig aktivitet S inf = Aktivitetsnivån vid oändlig koncentration,
        AC50 = koncentration vid vilken aktiviteten når 50% av maximal nivå,
        Hill koefficient n = Mått på lutningen på AC50, och
        c = koncentration i logaritmiska enheter som motsvarar värdena på x-axeln för dosresponskurvan plot.
        OBS: AC50 motsvarar LD 50 (cytotoxicitetsanalyser). Det är ett mått på styrkan där låga värden indikerar hög potens.

3. Mätning toxikologiska effekterna av HCS

OBS: Totalt nio fler parametriska markörer på toxicitet, grupperade i sex olika analyser, mäts med HCS plattformen (tabell 1). Baserat på cellviabiliteten analys RTCA (§ 2) dosområdet varje beståndsdel definieras och en 3R4F referensdosen ingår också. Referensdosen motsvarar den mängd HPHC närvarande i röken från en pinne från referenscigarett 3R4F.

  1. Seeding NHBE Celler
    1. Bered en cellsuspension vid 120.000 celler / ml (± 5%) och tillsätt 100 | il cellsuspension till varje brunn i en 96-brunnars HCS platta (12.000 celler / brunn). Förbered tillräckligt plattor för bedömning av alla analyser (cytotoxicitet, DNA skada, Stress kinas, ROS, GSH innehåll och apoptos) och tidpunkter (4 och 24 h).
    2. Lämna de HCS plattorna vid rumstemperatur under 30 min för att tillåta cellerna att fästa till brunnar och sedan inkubera vid 37 ° C och 5% CO2 under 24 ± 2 timmar före dosering.
  2. Utspädning av HCHPs och positiva kontroller
    OBS! NHBE celler i HCS plattorna kommer att doseras genom att tillsätta 25 pl av testprovlösningar till 100 pl medium som redan finns i varje brunn. Därför är alla doser ställdes vid 5x den önskade slutkoncentrationen.
    1. Positiva kontroller Utspädning (positiv kontrollplatta)
      1. Dispensera 40 ni stamlösning av varje positiv kontroll (se tabell 3) i kolumn # 2 (figur 4a, brunnar skuggade i rött). Fördela 20 pl fordon i kolumnerna # 3 och # 5 (figur 4a, brunnar skuggade i ljusblå) och 40 fil fordon i kolumn # 4 (figur 4a, brunnar skuggade i ljusblå).
      2. Uttag 12 pl från brunnarna i kolumn # 2, fördela den till brunnarna i kolumn # 3 och blanda (figur 4b), Fortsätta till en slutlig seriell spädning med 3 doser (d1, D2 och D3) och fordon (V) för varje positiva kontrollföreningen erhålles (figur 4c). För att generera positiva kontrollplatta, förbereda en 1:40 utspädning av föreningar i media (figur 4d).
    2. HPHC Utspädning (Förening masterplåt)
      OBS: De valda dosintervallen av HPHCs för HCS är listade i tabell 2.
      1. Späd ut varje HPHC stamlösning (1 M) 1:10 i medium för en koncentration av 100 mM. Utföra spädningar med användning av medium med 10% fordon för att erhålla de valda 5x doser för varje HPHC.
  3. dosering
    1. Tillsätt 25 pl av 5x lösningar från föreningen masterplåten till cellerna i triplikat bibehålla samma doserings ordning som i föreningen masterplåten (högsta dosen i den översta raden och fordonskontroll i radnumret 7) (Figur 5). Ta inte bort eEFINTLIGA (100 | il) cellodlingsmediet.
    2. Tillsätt 25 ul av 5x lösning från den positiva kontrollplatta till cellerna i den nedersta raden bibehålla samma doserings ordning som i den positiva kontrollplattan (Figur 5). Ta inte bort den befintliga (100 l) cellodlingsmedium. Obs: Varje analys har en viss positiv kontroll; se tabell 3. Inkubera plattan vid 37 ° C och 5% CO2 för den önskade exponeringstiden (4 eller 24 h).
  4. färgning
    1. Förberedelse för alla analyser
      1. Pre-värma Tvättbuffert (PBS) lösningar vid 37 ° C.
      2. Bereda Fixering lösning (4% formaldehydlösning) tillsätta 10,81 ml 37% formaldehyd till 89,19 ml tvättbuffert och pre-warm den vid 37 ° C.
      3. Förbered Permeabilization buffert genom att tillsätta 10 ml av 10x permeabilization buffert till 90 ml tvättbuffert och pre-warm den vid 37 ° C.
      4. Förbered Blocking buffert genom att tillsätta 10 ml av 10 x blockeringsbuffert till 90 ml tvättbuffert och pre-warm den vid 37 ° C.
      5. Pre-värma cellodlingsmediet vid 37 ° C.
      6. Ta HCS plattorna från inkubatorn när 4 och 24 timmar exponeringstider uppnås och utföra följande särskilda regler för varje analys.
    2. cytotoxicitetsanalys
      1. Bered en tillräcklig volym (V) av levande celler Staining Solution enligt följande formel: volym av medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar)
      2. Späd Mitokondrier färgämnet i levande celler färglösningen enligt leverantörens instruktioner. Späd membranpermeabiliteten färgämnet i levande celler färglösningen enligt leverantörens instruktioner.
      3. Tillsätt 50 pl Levande cell Staining-lösning till varje brunn i plattan (er) som har utsetts "Cytotoxicitet analys". INTE avlägsna cellkulturmedium och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C, 5% CO
      4. aspirera försiktigt på medellång och färglösningen och tillsätt 100 pl / brunn av fixeringslösning till varje brunn, sedan inkubera plattan (s) under 20 min vid rumstemperatur i mörker.
      5. aspirera försiktigt fixeringslösningen och tvätta en gång med 100 pl / brunn tvättbuffert.
      6. Avlägsna tvättbuffert och tillsätt 100 pl / brunn 1x permeabilization buffert till varje brunn och inkubera under 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
      7. Aspirera permeabilization buffert och tvätt plattan två gånger med 100 | il / brunn av tvättbuffert.
      8. Aspirera tvättbuffert och tillsätt 100 | il av 1x blockeringsbuffert till varje brunn och inkubera under 15 minuter vid rumstemperatur i mörker.
      9. Bered en tillräcklig volym (V) av primär antikropp lösning i enlighet med följande formel: Volym av blockeringsbuffert (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar). Späd den anti-cytokrom C-antikropp (mus) 1: 250 i Primär antikroppslösning.
      10. Aspirera blockerande buffert end lägga 50 | il / brunn Primär antikroppslösning till varje brunn och inkubera under 60 minuter vid rumstemperatur i mörker.
      11. Bered en tillräcklig volym (V) av sekundär antikropp och Nuclear Lösning i enlighet med följande formel: Volym av blockeringsbuffert (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar). Späd anti-mus-antikropp 1: 500 i sekundär antikropp och Nuclear Solution. Späd Nuclear färgämnet 1: 1000 i sekundär antikropp och Nuclear lösning.
      12. Aspirera Primär antikroppslösning och tvättvätskan plattan tre gånger med 100 | il / brunn av tvättbuffert med användning av plattvättare.
      13. Aspirera tvättbuffert och tillsätt 50 | il / brunn av sekundär antikropp och Nuclear lösning till varje brunn i plattan (s) och inkubera i 60 minuter vid rumstemperatur i mörker.
      14. Aspirera sekundär antikropp och Nuclear Solution och tvättplattan tre gånger med 100 | il / brunn av tvättbuffert med användning av plattvättare. Tillsätt 100 | il / brunn av tvättbuffert. Skylt (ar) är (är) nuredo att utvärderas på HCS läsaren.
    3. DNA-skador Assay
      1. aspirera försiktigt mediet från plattorna betecknade "DNA-skada".
      2. Utför samma steg som beskrivs i sekvens: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Observera att i detta fall är enda medium avlägsnas under steg 3.4.2.4.
      3. Bered en tillräcklig volym (V) av primär antikropp lösning i enlighet med följande formel: Volym av blockeringsbuffert (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar)
      4. Späd anti-fosfo H2AX antikropp (mus) 1: 2000 i primär antikropp lösning.
      5. Utför samma steg som beskrivs i 3.4.2.10.
      6. Bered en tillräcklig volym (V) av sekundär antikropp och Nuclear Lösning i enlighet med följande formel: Volym av blockeringsbuffert (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar)
      7. Späd anti-mus-antikropp 1: 500 i sekundär antikropp och Nuclear Solution.
      8. Späd Nuclear färgämne 1: 1000 i sekundär antikropp och Nuclear lösning.
      9. Utför samma steg som beskrivs i sekvens: 3.4.2.12-3.4.2.14.
    4. Stress kinasanalys
      1. aspirera försiktigt mediet från var och en av plattorna betecknas "Stress Kinase".
      2. Utför samma steg som beskrivs i sekvens: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Observera att i detta fall är enda medium avlägsnas under steg 3.4.2.4.
      3. Bered en tillräcklig volym (V) av primär antikropp lösning i enlighet med följande formel: Volym av blockeringsbuffert (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar)
      4. Späd anti-fosfo cJun antikropp (kanin) 1: 200 i primär antikropp lösning.
      5. Utför samma steg som beskrivs i 3.4.2.10.
      6. Bered en tillräcklig volym (V) av sekundär antikropp och Nuclear Lösning i enlighet med följande formel: Volym av blockeringsbuffert (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar)
      7. Späd anti-kaninantikropp 1: 500 i sekundär antikropp och Nuclear Solution.
      8. Späd Nuclear färgämnet 1: 1000 i sekundär antikropp och Nuclear lösning.
      9. Utför samma steg som beskrivs i sekvens: 3.4.2.12-3.4.2.14.
    5. ROS-analys
      1. Bered en tillräcklig volym (V) av levande celler Staining Solution enligt följande formel: volym av medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar).
      2. Späd ROS färgämnet i levande celler färglösningen enligt säljaren instruktion
      3. Späd Nuclear färgämnet 1: 1000 i levande celler Färgning Solution.3.4.5.4) Tillsätt 50 l Live cellfärgning lösning till varje brunn plattor betecknade "ROS"; Avlägsna INTE cellodlingsmedia och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
      4. aspirera försiktigt på medellång och färgningslösningen och tvätta plattan tre gånger med 100 ul / brunn medium.
      5. Aspirera mediet, tillsätt 100 _6; l / brunn fixeringslösning till varje brunn och inkubera plattan under 20 min vid rumstemperatur i mörker.
      6. aspirera försiktigt fixeringslösning och tvätta plattan tre gånger med 100 | j, l / brunn tvättbuffert.
      7. Tillsätt 100 | il / brunn tvättbuffert. Skylt (ar) är (är) nu redo.
      8. Utvärdera plattan på HCS läsaren inom en timme.
    6. GSH Content Assay
      1. Bered en tillräcklig volym (V) av levande cell nukleär färgning Lösning i enlighet med följande formel: volym av medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar).
      2. Späd Nuclear färgämne (Far Red) 1: 1000 i levande celler nukleär färgning Solution.3.4.6.3). Tillsätt 50 pl levande cell nukleär färgning lösning till varje brunn av plattorna betecknade "GSH innehåll". Avlägsna INTE cellodlingsmedia och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
      3. Förbered en tillräcklig volym (V) i levande celler GSH färglösningen enligtföljande formel: Volym HBSS (l) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar)
      4. Späd GSH färgämnet i levande celler GSH färglösningen enligt instruktionerna säljarens.
      5. aspirera försiktigt mediet och det nukleära färgningslösningen och tvätta plattan tre gånger med 100 ul / brunn medium.
      6. Aspirera medium och tillsätt 100 | il / brunn av levande cell GSH Staining lösning till varje brunn i plattan (er).
      7. Inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörker. Skylt (ar) är (är) nu redo.
      8. Utvärdera skylt (ar) på HCS Reader i en timme.
    7. apoptos Assay
      1. Bered en tillräcklig volym (V) av levande celler Staining Solution enligt följande formel: volym av medium (il) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar).
      2. Späd kaspas färgämnet 1: 300 i levande celler färglösningen.
      3. Avlägsna cellkulturmedia, tillsätt 50 | il Levande cell Staining lösning till varje brunn av than skylt (ar) som har utsetts "Apoptos" och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
      4. Bered en tillräcklig volym (V) av levande cell nukleär färgning Lösning i enlighet med följande formel: Volym av Fix-lösning (| j, l) V = 50 x B x 1,2 (W Antal brunnar).
      5. Späd Nuclear färgämnet 1: 1000 i levande celler Nuclear färglösningen.
      6. Ta bort den levande cellfärgning lösningen, tillsätt 100 | il / brunn av levande cell nukleär färgning lösning till varje brunn i plattan (s) och inkubera under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker.
      7. Aspirera fixativ / kärnfärglösningen och tvätta plattan (s) tre gånger med 100 pl / brunn tvättbuffert.
      8. Tillsätt 100 | il / brunn tvättbuffert. Skylt (ar) är (är) nu redo.
      9. Utvärdera skylt (ar) på HCS läsaren.
  5. Data Analysis HCS
    1. Exportera rådata som Excel (xls-fil). Obs: Råcellindexvärden är organiserade i en 96 brunnar formulärvid (spegling plattbrunn distribution) och är anordnade för varje ändpunkterna vid en given tidpunkt efter dosering.
    2. Normalisera värden med följande ekvation:
      ekvation 3
      där i är den uppmätta obehandlade signalvärdet av en brunn,
      Fordonet är medianen av de uppmätta signalvärdena för fordons brunnar på en tallrik,
      CR är den önskade median normaliserade värdet för fordonet (0%), och
      SC är den önskade median normaliserade värdet för de positiva kontrollerna (100),
      OBS: Vid slutet av detta steg, är en datauppsättning som erhållits som innehåller, för varje position i i plattan med 96 brunnar, en koncentration Ci (i logaritmiska enheter) som applicerades på provet som finns i position / brunn i och dess motsvarande normaliserade signalen N (i).
    3. Plot och montera (Ci, N (i)) - värden med en 4-parametrar Hill ekvation.
      ekvation 4
      där Zero Activity S 0 = aktivitetsnivå på noll koncentration av testföreningen,
      Oändlig aktivitet S inf = Aktivitetsnivån vid oändlig koncentration,
      AC50 = koncentration vid vilken aktiviteten når 50% av maximal nivå,
      Hill koefficient n = Mått på lutningen på AC50, och
      c = koncentration i logaritmiska enheter som motsvarar värdena på x-axeln för dosresponskurvan plot.
      OBS: AC50 är ett mått på potens där låga värden anger hög potens.

Representative Results

RTCA

Eftersom de HCS endpoints inte kommer att vara informativ när ingen toxisk effekt upptäcks, de föreningar som inte uppvisar minskad cellviabilitet upp till den högsta koncentrationen i rCTA är inte testade av HCS (figur 3b, c, d, g, k, l, m , p). Föreningar som visar minskad cellviabilitet endast den högsta koncentrationen (figur 3e, o) är också avmarkerat för HCS. Slutligen bara beståndsdelarna med en beräkningsbar LD 50 (<20 mm) ut för ytterligare HCS analys (figur 3a, f, h, j, n). HPHCs uppfyller ovanstående kriterier är: 1-aminonaphtalene, arsenik (V), krom (VI), Krotonaldehyd och fenol.

HCS

Som en kvalitetskontroll (QC), positiva kontroller är fiRST analyseras för att säkerställa att färgningsproceduren utförs korrekt. Representativa bilder av positiva kontrollbehandlade celler visas i Figur 6. Datavärden är normaliserade till fordon såsom tidigare beskrivits. Inga dos-responskurvor plottas som endast tre doser testas och inte alla tre doserna beaktas vid varje tidspunkt. Positiva kontrolldoser väljs (baserat på tidigare experiment, data visas ej), så att lämpliga svar observeras för varje ändpunkt på både 4 h och 24 h. I synnerhet doser 1 och 2 används för att utvärdera effekten på 4 timmar medan doser 2 och 3 används för att utvärdera effekten på 24 timmar. Plattorna kasseras om inget svar observeras för de positiva kontrolldoser. Notera att för alla slutpunkter, med undantag mitokondriell membranpotential och GSH innehåll, är en ökning av signalintensiteten förväntas.

Alla föreningar, med undantag av Fenol, inducerade en nekrotisk Fenol typ, baserad på ökad cell membranpermeabilitet (figur 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, krom (VI), var Krotonaldehyd och Fenol identifierats som genotoxiskt vilket baseras på ökad fosforylering av histon H2AX (figur 7e, j, n, p). Fenol och en-aminonaphtalene befanns inducera svår mitokondriell dysfunktion (figur 7b, o) som, med en-aminonaphtalene lett till en ökad cytokrom C frisättning (figur 7c). Detektering av ökad kaspas 3/7 aktivitet tillhandahållit bevis på apoptotiska händelse vid kromexponering. Oxidativ stress induktion (ROS eller GSH) detekterades även vid behandling med en-aminonaphtalene, Krotonaldehyd och fenol (figur 7d, m, q). Slutligen Arsenik inducerar cellstress, vilket framgår av den ökade fosforyleringen av transkriptionsfaktorn cJun (figur 7g).

belastning / 53.987 / 53987fig1.jpg "/>
Figur 1. Förening Tox-Profiler arbetsflöde. A) Schematisk bild av arbetsflödet följt i denna studie. Först ett konstaterande dosintervallet utförs med hjälp av RTCA plattform för att välja lämpliga doser för efterföljande HCS att karakterisera toxicitetsprofiler föreningsspecifika. B) Experimentell design av studien. 24 timmar efter sådd cellerna doseras och impedansvärden övervakas kontinuerligt under följande 24 timmar, medan HCS slutpunkter undersöktes 4 och 24 timmar efter dosering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. RTCA Exponerings Plate. Förening huvudplattan först genereras genom att utföra en fem-steg 1:10 serieutspädning. Varje förening,inklusive vehikelkontroll (dos 0) tillsättes sedan i tre exemplar till exponeringsplattan tillsammans med medium och Staurosporin som kontroller. Observera att doserna sekvens upprätthålls vid överföringen, högsta doserna i rad nummer 1, medan kontroller fordons är i rad nummer 7. klicka god här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Representativa RTCA cellviabiliteten Resultat. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropan, c) acetamid, d) Aceton, e) Akrylamid, f) Arsenik (V), g) Bensen, h) Krom (VI) , j) krotonaldehyd, k) metyletylketon, l) Nickel (II), m) nitrobensen, n) Fenol, o) kinolin, s) Toluen. Vid 24 h efter dosering, var ytan under kurvan (AUC) beräknades för varje dos (inklusive positiv kontroll och fordon) och normaliseras i ett område från 0 till -100% aktivitet (y-axeln), där 0 avspeglar aktiviteten av fordonet och -100 av den positiva kontrollen. Värden sedan ritas och monteras med en fyra-parameter Hill ekvationen och, när det är möjligt, var LD50 beräknades. Koncentrationerna uttrycks på en logaritmisk skala (x-axeln). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Utspädning System för positiv kontroll Föreningar för HCS analyser. A) Tillsats av Positiva kontroller och vedonet till serieutspädningsplatta. b) serieutspädning av de positiva kontrollerna. c) 200X positiva kontroller doser. de) Spädning av 200x positiva kontroller doser i medium (01:40) för att generera den positiva kontrollplatta innehållande 5x doser. Observera att varje doser späds i tre exemplar för att återspegla den slutliga utformningen i exponeringsplattan). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5. HCS Exponerings Plate. Förening huvudplattan först genereras genom att utföra en fem-steg utspädning. Varje förening, inklusive vehikelkontroll (dos 0) tillsättes sedan i tre exemplar till exponeringsplattan tillsammans med de positiva kontrollerna. Notera att doser ordning upprätthålls vid överföring,högsta doserna är i rad nummer 1, medan kontroller fordons är i rad nummer 7. klicka god här för att se en större version av denna siffra.

figur 6
Figur 6. Representativa Fluorescerande bilder av antikropps eller Dye-färgade celler a) Kärnparametrar - Nuclear färgämnes: a. Släppligt färgämne, som binder till DNA i levande eller fixerade celler. Denna fläck används för att identifiera enskilda celler märkning kärnområdet b) Necrosis - cellmembranpermeabilitet färgämne. Dye-baserad detektering av cellmembranintegritet. Reagens är i sig ogenomträngligt för cellmembranet. Under nekros, blir membranet genomsläppliga och färgen kommer in i cellen och binder till DNA producerar en stark fluorescerande s. ignal c) Apoptos - cytokrom C: Antikropps baserad detektering av cytokrom C release, ett välkänt kännetecken för tidig apoptos. Efter induktion av apoptos, är cytokrom c frigörs från mitokondrier och diffunderar in i kärnan d) DNA Damage - pH2AX:.. Antikropp-baserad detektering av fosforylering av histon H2AX, ett välkänt kännetecken för dubbelsträng DNA-brott e) Stress Kinase - cJun. Antikroppsbaserad baserad~~POS=HEADCOMP detektering av fosforylering vid Ser-73 i cJun, ett välkänt kännetecken för cellulär stress f) Oxidativ stress - DHE: Dye-baserad detektering av superoxidradikaler. Dihydroethidium själv fluorescerar blått i cytoplasman medan den oxiderade formen etidium fluorescerar rött på DNA interkalering g) GSH - mBcl. Dye-baserad detektering av fria GSH molekyler. mBcl reagerar med GSH tillgenerera en mycket fluorescerande produkt h) Apoptosis - Caspas 3/7 aktivering. Dye-baserad detektering av kaspas 3/7 aktivitet. Reagens är icke-fluorescerande med en fyra aminosyror lång peptid som inhiberar DNA-bindning. Upon caspas-3/7-aktivering, klyvs peptiden möjliggör färgämnet att binda till DNA och producera en ljus, fluorogen reaktion. Paneler BH visar positiva kontrollbehandlade celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 7
Figur 7. Representant HCS resultat. 1-aminonaphtalene (ae), arsenik (V) (f och g), krom (VI) (HK), Krotonaldehyd (ln) och fenol (OQ). 4 h (blå linje) och24 h (orange linje) signaler beräknades för varje doser och normaliserades till fordonets aktivitet (0%). Värden som inte ingår i kurvanpassnings beräkningar visas i grått. Koncentrationerna uttrycks på en logaritmisk skala (x-axeln). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Analysera endpoint # biologisk endpoint cellulär avdelning output funktionen
cytotoxicitet 1 Mitokondriemassa 6 cytoplasman Spot genomsnittliga område
2 Mitokondriell membranpotential 6 cytoplasman Spot medelintensitet
3 Cytokrom C frisättning Nucleus medelintensitet
4 Cellmembranpermeabilitet 8 Nucleus medelintensitet
DNA-skador 5 fosfo-H2AX 9 Nucleus medelintensitet
Stress Kinase 6 fosfo-cJun 10 Nucleus medelintensitet
ROS 7 ROS 11 Nucleus medelintensitet
GSH innehåll 8 GSH 12 cytoplasman Spot medelintensitet
apoptos 9 Caspase 3 13 cytoplasman Spot medelintensitet

Tabell 1. Förteckning över HCS enssays och slutpunkter.

<td> 0,17
Fordon RTCA doser (M) LD 50 HCS doser
Cellviabilitet-vald (^ M) 3R4F (nM)
1-Aminonaphtalene EtOH 20000 2000 200 20 2 0,2 280 | iM 2000 500 200 150 0,27
2-nitropropan EtOH 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
acetamid EtOH 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
Aceton Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
akrylamid Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
Arsenik (V) Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 160 | iM 200 100 50 25
Bensen EtOH 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
Krom (VI) Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 20 ^ M 100 50 20 10 0,06
krotonaldehyd Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 200 | iM 20000 2000 200 20 2000
Metyletylketon Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 >20 mM
Nickel Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
nitrobensen EtOH 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
Fenol EtOH 20000 2000 200 20 2 0,2 2.300 uM 5000 2000 1000 500 240
kinolin EtOH 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM
toluen Vatten 20000 2000 200 20 2 0,2 > 20 mM

Tabell 2. Förteckning över testade HPHC föreningar med relativ LD 50 vid 24 h av behandling. Föreningar som valts ut för HCS analys är markerade i orange och testade doserna ges också. Den 3R4F dos motsvarar mängden för beståndsdelen närvarande i röken från en pinne från referenscigarett 3R4F.

Analysera Förening Förrådslösning lösning~~POS=HEADCOMP Lösningsmedel Dos (er) (^ M)
cellviabilitet staurosporin 10 mM DMSO 50
cytotoxicitet valinomycin 10 mM DMSO 50 20 5
DNA-skador paraquat 100 mM DMSO 500 200 50
Stress Kinase anisomycin 2 mM DMSO 10 4 1
ROS rotenon 200 mM DMSO 1000 400 100
GSH innehåll etakrynsyra 200 mM DMSO 1000 400 100
apoptos staurosporin 40 mM DMSO 200 </ Td> 50 20

Tabell 3. Lista över positiva kontroller och koncentrationer användes för varje försök.

Discussion

Behovet av alternativ till djurförsök och för nya hög genomströmning testning tillvägagångssätt har diskuterats under de senaste åren. Detta har lett forskare och myndigheter att undersöka alternativa metoder för att testa standard toxicitet, som utnyttjar cellulära analyser som nära efterliknar fysiologi målvävnader. I denna studie har vi visat användbarheten av att kombinera en realtidscell analysator (RTCA) med en hög halt screening (HCS) plattform för att bedöma effekterna av exponering för enskilda CS beståndsdelar på humana lungepitelceller. Denna inställning skulle kunna tillämpas analogt för att utvärdera cytotoxiciteten som induceras av olika andra luftföroreningar, luftburna partiklar och nanopartiklar. Dessutom kan de erhållna resultaten matchas med de från hel-genomet transkriptomik och beräkningsmetoder baserade på orsaks biologiska nätverk. Som tidigare rapporterats, detta tillvägagångssätt tillät oss att bekräfta uppgifter om molekylärstörning på CS exponering 5 med HCS ändpunkter, ta itu med dessa pathway störningar också fenotypiskt.

Som ett flödesschema analys i realtid cellanalys cellviabilitet relaterad information på ett dos- och tidsberoende upplösning, vilket ger bättre beslutsfattande vilken dos och exponerings tidpunkt kan vara gynnsamt för nedströms analys 14. Principen om analysatorn bygger på förändringar i elektriska impedansen genereras av celler som de fäster och sprids på en odlingsbrunn yta täckt med en guldmikroelektrod. Impedansen omvandlas till en dimensionslös parameter med namnet cell-index, vilket kan användas för att övervaka cellvidhäftning, fördelning, morfologi och slutligen cellviabilitet. Även om denna teknik inte ger information om cytotoxiska mekanismer möjliggör detektion av morfologiska cellförändringar även vid mycket låga doser där HCS är inte informativ dess känslighet (data ej visade). Baserat på PREVíka experiment har vi noterat att RTCA metoden kan upptäcka morfologiska förändringar vid lägre doser jämfört med HCS endpoints.

Efter inledande screening med realtidscell analysator, var en HCS plattform som används för att få mer detaljerad information om vilken typ av cytotoxicitet framkallad av varje HPHC. HCS analys panel tillåts att profilera HPHCs mot deras potentiella inverkan på cellulära fack / organeller samt att identifiera de framkalla genotoxicitet eller oxidativ stress. Analysen visade tydliga profiler där de utvalda HPHCs inducerar cytotoxicitet i NHBE celler. I allmänhet samtliga föreningar, utom Fenol, befanns inducera nekros vid de högsta testade doserna. I överensstämmelse med en potentiell roll i utvecklingen av cancer en-aminonaphtalene inducerad fosforylering av H2AX som en markör för genotoxicitet, men HCS panelen också avslöjats aktiviteten hos detta HPHC i mitokondriell toxicitet avläsning (massa ökade och cytokrom C ReleaSE) och oxidativ stress (GSH utarmning). På samma sätt som tidigare beskrivits, var Fenol identifierades att inducera mitokondriell dysfunktion och ge DNA-skador samt GSH utarmning. Krom (VI), en av de föreningar som klassificeras som grupp I cancerframkallande, och Krotonaldehyd också båda identifierats som genotoxiska, särskilt krom (VI) också inducerad apoptos (caspase kaskad aktivering) och Krotonaldehyd orsakade ökad ROS generation. Slutligen Arsenik (V), befanns inducera cJun fosforylering som är en markör för spänningskinasvägen aktivering.

I denna studie, utnyttjade vi NHBE celler som en modell för lungepitelceller in vitro. Med hjälp av dessa celler i en HCS inställning är utan motstycke och möjliggjorde undersökning av ett bredare utbud av endpoints, inklusive genotoxicitet och oxidativ stress markörer. Både levande cell och fasta cellfärgning tillvägagångssätt beskrevs i våra protokoll, visar flexibiliteten av den totala tekniken. i fhandling, kan mycket samma protokoll tillämpas på ett bredare spektrum av mål, som kan åtgärdas genom användning av något fluorescerande färgämne eller antikropp. För ett framgångsrikt genomförande av de levande färgningsprotokoll, är det viktigt att respektera inkubationstiden, som en del av färgämnena har en begränsad halveringstid och fluorescenssignalen kan minska innan bilden förvärvet är genomfört. Det är också viktigt att beakta att om en annan celltyp användes, alla färgnings villkor bör utvärderas på nytt, som den optimala färgämneskoncentrationen och inkuberingstiden kan vara olika.

I det nuvarande pappers har vi beskrivit ett scenario där endast fem föreningar där screenas med HCS metoden. Med tanke på den tidigare beskrivna plattslayouten, de doseras över två olika plattuppsättningar för totalt 24 plattor (6-analyser och 2 tid-punkter) .Det antal plattor kan också ökas, vilket möjliggör en samtidig screening av flera föreningar eller de undersökdersökning av flera endpoints. Innan detta sker dock bör man ta hänsyn till att vissa endpoints (GSH och ROS) kräver omedelbar förvärv, och som en konsekvens, bör utföras doseringen av plattorna i en sicksack sätt för att möjliggöra förvärv av föregående plattan. Å andra sidan, med hjälp av en fast cellfärgningsprotokollet representerar en fördel eftersom plattorna kan staplas, att avbryta protokoll vid vilket steg som helst efter fixeringen, för slutförande av färgningsproceduren i ett senare skede. Detta tillvägagångssätt, till exempel, skulle ge operatören tid att slutföra alla levande cell färgning plattor utan att kompromissa med kvaliteten på uppgifterna.

För att ytterligare optimera arbetsflödet genom att minska antalet plattor, skulle det också vara möjligt att multiplexera flera endpoints tillsammans. Till exempel i det här sammanhanget DNA-skador och stress kinas kan undersökas tillsammans att bara använda två sekundär antikropp med fluorokromer som emitterar i olika channels. Kontinuerlig utveckling av HCS-plattformen, inklusive fullt automatiserad cellsådd, förening utspädning, dosering och färgning, samt tillägg av nya endpoints kommer att ytterligare utöka förmågan hos HCS plattformen som ett kraftfullt profileringsverktyg för HPHCs på epiteliala och andra celltyper .

Disclosures

Alla författare är anställda av Philip Morris International. Philip Morris International är den enda källan för finansiering och sponsor av projektet.

Acknowledgments

Författarna vill tacka Karsta Luettich och Grégory Vuillaume för sin granskning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader Thermo N01-0002B
xCelligence RTCA MP ACEA 05331625001
Screener (HCS) Genedata NA
CASY counter TTC Roche 05 651 719 001
e-Plates VIEW 96 ACEA 06 472 451 001
RTCA Frame 96 ACEA 05232392001
RTCA Cardio Temperature Tool ACEA 2801171
Plate sealer breathseal Greiner bio-one 676051
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) Lonza CC-2540 non-smoking 60-year-old Caucasian male donor 
BEGM BulletKit Lonza CC-3170 Warm at 37 °C before use
ReagentPack Subculture Reagents kit Lonza CC-5034 Warm at 37 °C before use
Penicillin/Streptomycin (100x) Corning 30-002-CI
Easy Flask filter cap 75 cm2 Thermo Scientific 12-565-349
96 well assay plate  black  Corning 3603
Hoechst 33342  Fisher Scientific PI-62249
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) Biostatus DR50200
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos Life technologies M-7512
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos Life technologies M-7513
ROS Dye: Dihydroethidium Sigma D7008
ROS Dye: CellROX Life technologies C10422
ROS Dye: MitoSOX Life technologies M36008
GSH Dye: Monochlorobimane Sigma 69899 Toxic
GSH Dye: Monobromobimane Life technologies M-1378 Toxic
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1  Life technologies Y3603 Irritating 
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1  Life technologies T3602 Irritating 
Membrane permeability Dye: TOTO-1  Life technologies T3600 Irritating 
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green Life technologies C10423 Irritating 
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) Thermo MA5-11823
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) Thermo MA5-15889
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) Thermo MA1-2022
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650  Abcam ab96878
10x permeabilization buffer Fisher 8408400
4% Formaldehyde solution Sigma F1635 Toxic
10x blocking buffer Fisher 8408500
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline  Sigma D8537
Hanks' Balanced Salt solution Sigma H8264
Staurosporine Sigma S4400 Toxic
Valinomycin Sigma V0627 Toxic
Paraquat Sigma 36541 Toxic
Anisomycin Sigma A9789 Toxic
Ethacrynic acid Sigma E4754 Toxic
1-Aminonaphthalene Sigma 34390 Toxic
2-Nitropropane Sigma 130265 Toxic
Acetamide Sigma 695122 Toxic
Acetone Sigma 650501 Toxic
Acrylamide Sigma A9099 Toxic
Arsenic (V) Sigma A6756 Toxic
Benzene Sigma 12540 Toxic
Chromium (VI) Sigma 216623 Toxic
Crotonaldehyde Sigma 262668 Toxic
Methyl ethyl ketone Sigma 34861 Toxic
Nickel  Sigma 203866 Toxic
Nitrobenzene Sigma 48547 Toxic
Phenol Sigma P5566 Toxic
Quinoline Sigma 241571 Toxic
Toluene Sigma 34866 Toxic

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
  2. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
  3. Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
  4. US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
  5. Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
  6. Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
  7. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
  8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  9. Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
  10. Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
  11. Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
  12. Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
  13. Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
  14. Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).

Tags

Molekylärbiologi hög halt screening Systems toxikologi Normal Human Bronkial epitelceller DNA-skador Cell stress rökbeståndsdelar
Hög halt Screening Analys För att utvärdera de toxikologiska effekterna av skadliga och potentiellt skadliga beståndsdelar (HPHC)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., More

Marescotti, D., Gonzalez Suarez, I., Acali, S., Johne, S., Laurent, A., Frentzel, S., Hoeng, J., Peitsch, M. C. High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC). J. Vis. Exp. (111), e53987, doi:10.3791/53987 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter