Abstract
Глиобластомы мультиформная (класс IV глиомы) является очень агрессивным человеком рак с медианой выживаемости 1 года после установления диагноза. Несмотря на повышенное понимание молекулярных событий, которые приводят к возникновению глиобластомы, этот рак все еще остается крайне невосприимчивы к обычному лечению. Хирургическая резекция опухолей головного мозга высокого класса редко бывает полным из-за высокой инфильтративного характера клеток глиобластомы. Поэтому терапевтические подходы, которые вытягивают инвазию клеток глиобластомы является привлекательным вариантом. Наша лаборатория и другие показали, что ассоциированные с опухолью макрофаги и микроглии (резидентные макрофаги мозга) сильно стимулируют глиобластомы вторжение. Протокол , описанный в этой статье , используется для моделирования глиобластомы-макрофагами / микроглии взаимодействия с использованием анализов культуры в пробирке. Такой подход может в значительной степени способствовать развитию и / или обнаружения наркотиков, которые нарушают связь с макрофагами, которая позволяет эту злокачественную BehavIOR. Мы установили два надежных вторжения Совместное культивирование анализов, где микроглии / макрофаги стимулируют вторжение глиомы клеток на 5 - 10 раз. Клетки глиобластомы, меченные флуоресцентным маркером или конститутивно экспрессирующих флуоресцентный белок высевают без и с макрофагами / микроглии на матричных покрытием из поликарбоната камерных вкладышей или внедренный в трехмерной матрице. Инвазии клеток оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии для изображения и рассчитывать только инвазивные клетки на нижней стороне фильтра. С помощью этих анализов, несколько фармакологических ингибиторов (JNJ-28312141, PLX3397, Гефитиниб и Semapimod), были идентифицированы, которые блокируют макрофаги / микроглия стимулировали глиобластомы вторжение.
Introduction
Глиобластомы мультиформная является агрессивным человеком рак мозга с медиана выживаемости составляет приблизительно 12 месяцев с момента постановки диагноза 1,2. Глиобластома является одним из самых опасных и клинически сложных видов рака, как она резистентной к стандартной химиотерапии и хирургической резекции. Диффузный характер глиобластомы позволяет опухолевым клеткам распространяться по всему нормальному мозгу, делая запущенная опухоль практически невозможно хирургическим резекцию полностью. Это очень инвазивные аспект является отличительной чертой глиобластомы и других продвинутых астроцитомах. Таким образом, в центре внимания многих исследований было на молекулярном механизме вторжения клеток глиобластомы. Микроокружение опухоли глиобластомы играет жизненно важную роль в установлении злокачественности 3-6. Ассоциированных с опухолью макрофаги / микроглия Было показано , что отвечать за содействие глиобластомы вторжения 7,8. Большинство из этих исследований, однако, измерили влияние макрофагов / микроглии с использованиемАнализы, которые физически отделить их от клеток глиобластомы. Наша лаборатория установила, чтобы произвести улучшенные анализы, которые позволяют нам изучить, как глиобластомы вторжение зависит от макрофагах / микроглии в совместных культурах и позволяют изображению физического взаимодействия между ними во время вторжения.
Классические анализы для измерения вторжения клеток включают "стандартные" Бойден камеры хемотаксис и форматы chemoinvasion. Здесь клетки должны быть изучены высевают в пластиковой камере, которая содержит поликарбонатный фильтр на дне, который имеет поры определенного размера (как правило, от 0,4 до 8 мкм в диаметре). Процесс инвазии клеток включает физический барьер, как правило, состоит из внеклеточного матрикса белка. В анализе chemoinvasion, предпочтительной является матрица, используемая Матригель (далее именуемые как "матрица"), внеклеточный смесь матричный белок, выделяемый Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) мыши клетки саркомы и состоит в основном из седловинеLagen типа IV и ламинин. Камеры затем помещают в культуральную лунку ткани, которая содержит среды для культивирования клеток с или без факторов роста, которые, как предполагается, стимулируют инвазию. Клетки, которые имеют более высокую инвазивную способность вторгнется через фильтр внеклеточной матрицы с покрытием на более высокой частоте, и прилипают к нижней стороне фильтра. Мы модифицировали этот анализ, чтобы оценить роль микроглии и макрофагов, ассоциированных с опухолью инвазии клеток глиобластомы.
Нам удалось определить с помощью анализов , описанных сокультивирования в этой статье , что микроглии может стимулировать вторжение двух глиобластомы клеточных линий на 5 - 10 раз 9,10. Это отражает то, что наблюдается в животных моделях глиобластомы. Кроме того, мы разработали анализ трехмерную инвазии, где взаимодействие между глиобластомы клеток и макрофагов / микроглии могут быть рассмотрены более непосредственно. Степень инвазии клеток глиобластомы стимулируется macrophaGES / микроглии в 3D-пробы сравнима с тем, что наблюдается с использованием матрицы с покрытием камеры подход. Аналогичные анализы были ранее разработаны для изучения карциномы молочной железы взаимодействия с макрофагами во время вторжения 11-13. Оба описанных в данной работе методы должны помочь в способности рассекать молекулярный механизм (ы) макрофагами / микроглии-стимулированной вторжения клеток глиобластомы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Флуоресцентная маркировка клеток
Линии клеток глиобластомы Этикетка и микроглии с флуоресцентными красителями 9: Примечание. В качестве альтернативы, генерировать клеточные линии , которые конститутивно экспрессируют флуоресцентные белки , такие как GFP / RFP , как описано в 14.
- Пластина клеток на 6-луночного планшета с таким образом, что они будут составлять 70 - 80% сливающийся в день окрашивания. Для мышиного клеток глиобластомы линии GL261 и линии U87 клеток глиобластомы человека, пластины 1 х 10 6 и 1,5 х 10 6 клеток соответственно на 6 см чашку 24 ч перед окрашиванием.
- Приготовьте раствор красителя флуоресцентный клеток пятно в ДМСО и добавляют 5 мкМ красителя к средствам массовой информации, либо Roswell институт Мемориальный парк среды (RPMI) или макрофаг бессывороточной среде (MSFM), вихревые хорошо.
- Инкубируйте клетки с красителем в течение 30 мин при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Удалить краситель, содержащие носитель и добавляют свежую среду, (RPMI или MSFM) к клеткам.
- Инкубируйте клетки в течение 30 мин. Примечание: Клетки теперьокрашена и готов к использованию в эксперименте.
2. Предварительно покрытые Матрица палата Совместное культивирование Invasion Анализ
- Дифференцировать клетки ТНР-1 с использованием форболмиристатацетата (PMA) 15.
- Пластина 2 - 3 × 10 5 ТНР-1 клеток в 1,5 мл RPMI / 10% FBS в культуральной пластины 6 также. Сразу после того, как покрытие добавить 100 нм РМА и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
Примечание: Через 48 ч клетки ТНР-1, которые успешно прошли дифференцировку будет клейкий и распространяться на дно колодца принимая на круглой морфологии. - Удалить РМА путем промывания один раз 1x PBS и заменяют свежей RPMI / 10% FBS. Подождите еще 48 ч, пока клетки не будут готовы к использованию в анализе.
- Пластина 2 - 3 × 10 5 ТНР-1 клеток в 1,5 мл RPMI / 10% FBS в культуральной пластины 6 также. Сразу после того, как покрытие добавить 100 нм РМА и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
- Равновесие матричные камеры предварительно покрытые, помещая их в лунку, содержащую 500 мкл среды в одиночку (без сыворотки) и добавлением 500 мкл среды в одиночку на вершину. Инкубируйте камеры в течение 2 ч при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
Таблица материалов / оборудования. - Чтобы аккуратно отделить клетки (флуоресцентно меченных линии клеток глиобластомы и микроглии / макрофаги), удалить носитель из клеток путем аспирации. Вымойте клеток на блюдо с 2 мМ ЭДТА / ФБР. Добавьте 500 мкл 2 мМ ЭДТА / ФБР и инкубируют в течение 5 - 10 мин в сотовом инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Ресуспендируют клеток в 5 мл среды, содержащие 0,3% бычьего сывороточного альбумина (БСА).
- Центрифуга в течение 5 мин при 120 х г.
- Отберите супернатант и ресуспендируют осадок в MSFM / 0,3% БСА сред (для GL261 клеток и микроглии) или RPMI / 0,3% БСА (для U87 и ТНР-1 клетки) таким образом, что концентрация клеток равна 1 × 10 6 клеток / мл , Используйте гемоцитометра для подсчета клеток.
- Добавить 500 мкл среды / 0,3% БСА на лунку 24-луночного планшета.
- Удалить материал из камер, которые были выдержаны в течение по меньшей мере 2 ч (шаг 2,2). Место ChambeRS в лунку, содержащую 500 мкл среды / 0,3% БСА (шаг 2.7).
- Если ингибиторы используются для изучения их влияния на макрофагах / микроглии стимулировали глиомы вторжения, добавьте соответствующую концентрацию как в верхней и нижней частях камеры.
Примечание: Концентрации CSF-1R ингибитор используется полностью ингибировать микроглии стимулировали GL261 глиобластомы вторжения можно найти в ссылке 9. - В зависимости от используемых клеточных линий, добавить клетки в верхней камере, как описано в следующих двух шагах: мышь глиобластомы (2.10.1) и человеческой глиобластомы (2.10.2).
- Смешайте 1,5 х 10 5 GL261 (глиобластомы) клеток (150 мкл) и 5 х 10 4 мыши микроглии (50 мкл) (см шаг 2.6 для деталей СМИ). Довести объем до 500 мкл добавлением 300 мкл MSFM / 0,3% БСА. Добавить смесь клеток в верхней камере и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
Примечание: Мышиный микроглии изолированы от новорожденных мышей, как описано Iп 1 6.
- Смешайте 1,5 х 10 5 GL261 (глиобластомы) клеток (150 мкл) и 5 х 10 4 мыши микроглии (50 мкл) (см шаг 2.6 для деталей СМИ). Довести объем до 500 мкл добавлением 300 мкл MSFM / 0,3% БСА. Добавить смесь клеток в верхней камере и инкубировать при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
Смешайте 7,5 х 10 4 U87 (глиобластомы) клетки (75 мкл) и 2,5 × 10 4 Thp1 (макрофаги) клетки (25 мкл). Доведите объем в 500 мкл добавлением 400 мкл RPMI / 0,3% БСА. Добавьте смесь клеток в верхней камере. Инкубируйте клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 24 часов.
- После инкубации удалить клетки из верхней части камеры путем осторожного аспирации и закрепить камеры путем размещения в 3,7% формальдегида в PBS. Разрешить камеры, чтобы оставаться в фиксаторе в течение 15 мин при комнатной температуре (или в течение ночи при 4 ° C). Удалить закрепитель нежным аспирации и заменить 500 мкл 1x PBS. Перейдите к разделу 4 для анализа изображений.
Примечание: Эксперимент может быть приостановлена в этот момент и сохранены для работы с изображениями в 1x PBS. Флуоресцентные сигналы красителя могут быть обнаружены в течение 2-х недель после фиксации.
3. Вторжение Пробирной "3D" -вложением глиомы и макрофаги / микроглия в матрице
- Оттепель матрица смеси при 4 ° С в течение ночи. Выполните все дальнейшие манипуляции с использованием матрицы на льду в капюшоне.
- Приготовьте 10 мг / мл концентрации матрицы в средах (MSFM или RPMI) с 0,3% BSA на льду.
Примечание: сток концентрация матрицы обычно составляет около 15 мг / мл. - Для подготовки клеток (помеченных на шаге 1) для суспензии в матрице, удалить носитель из клеток путем аспирации. Вымойте клеток на блюдо с 2 мМ ЭДТА / ФБР. Добавьте 500 мкл 2 мМ ЭДТА / ФБР до клеток и инкубировали в течение 5 - 10 мин в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
- Ресуспендируют клеток в 5 мл среды, содержащей 0,3% бычьего сывороточного альбумина.
- Центрифуга в течение 5 мин при 120 х г.
- Отберите супернатант из гранул. Ресуспендируют осадок в средствах массовой информации / 0,3% БСА , так что концентрация клеток равна 1 × 10 6 клеток / мл. Используйте гемоцитометра для подсчета клеток.
- Добавить 1,5 × 10 5 клеток GL261 (в 150 мкл) + 5 × 10 4 клеток микроглии (в 50 мкл) в 1,5 мл пробирке с.Добавляют 2 х 10 5 GL261 клеток (200 мкл) в отдельную 1,5 мл пробирке.
Примечание: GL261 только клетки без микроглии служит в качестве контроля. - Спин клетки в микроцентрифуге в течение 5 мин при 120 х г.
- Ресуспендируют клеток в 200 мкл холодной матрицы на льду.
- Пластина 50 мкл (50000 клеток) на центр верхнего отсека 8 мкм размер пор в камере вставки.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин для полимеризации происходить.
- Добавить 200 мкл бессывороточной среды в верхней камере и 700 мкл сыворотки, содержащей среду для роста клеток в нижней лунки.
- Инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение 48 часов.
- После инкубации удалить клетки из верхней части камеры путем осторожного аспирации и закрепить камеры путем размещения в 3,7% формальдегида в PBS. Разрешить камеры, чтобы оставаться в фиксаторе в течение 15 мин при комнатной температуре (или в течение ночи при 4 ° C). Удалить закрепитель нежным аспирации и заменить 500 мкл 1x PBS. Перейдите к разделу 4 FoАнализ г изображения.
4. визуализации Assays
- Удалить камеры с 3,7% формальдегида и промыть в лунку, содержащую свежие 500 мкл 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не допускайте камеры высохнуть. - С помощью ватной палочки, осторожно очистите неинвазивные клетки из верхней части фильтра (сторона, обращенная к внутренней части камеры), очищая поверхность фильтра. Начните мягко и постепенно увеличивать давление. Делайте это по крайней мере 3 раза в камере.
- Поместите камеры в любом стеклянным дном блюдо или оставить в 24-луночного планшета.
- Поместите образец на сцене с эпифлуоресцентной или лазерной конфокальной флуоресцентной микроскоп оснащен камерой и программным обеспечением захвата изображения 9,10.
- Возьмите несколько 10X или 20X образы представительных полей.
- Использование программного обеспечения для анализа изображений, таких как ImageJ, подсчитать количество клеток глиобластомы, которые пересекли фильтр к нижней стороне 9,10.
- Если визуализации "3D. "Нашествие анализ (описанный в разделе 3), генерируют серию Z стека с использованием флуоресцентного лазера конфокальный микроскоп 5-6 Для получения изображения инвазивной популяции клеток на нижней стороне фильтра, следовать протоколу шаги 4.2 - 4.6 описано выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя методы, описанные здесь, мы показали, что микроглии и макрофаги могут существенным образом стимулировать вторжение клеток глиобластомы. Два различных инвазия анализы используются и изображены на фиг.1. На фиг.2 клетки GL261 , которые конститутивно экспрессируют флуоресцентного белка mCherry высевали на предварительно покрытых камер с и без микроглии в течение 48 часов. GL261 клетки были минимально инвазивной сами по себе, однако при культивировании с микроглии инвазивная мощность увеличилась примерно в 10 раз.
Мы наблюдаем подобный эффект с использованием клеточных линий человека. На рисунке 3, U87 клетки (окрашивали 5-chloromethylfluorescein диацетат (CMFDA) зеленый) показывает 5-6 раз выше , когда вторжение сокультивировали дифференцированных клеток ТНР-1. ТНР-1 человека клеточной линии моноцитов (производный от острого моноцитарного лейкоза пациента), который может быть диfferentiated в макрофаги , как состояние с помощью форболмиристатацетата (PMA) 15. Дифференцированные клетки ТНР-1 отобразить многие из характеристик человеческих макрофагов, таких как секрецию цитокинов и способности осуществлять фагоцитоз.
В качестве альтернативы, клетка инвазия может быть измерена путем встраивания их в матрицу и покрытие это непосредственно на фильтр в камере вставки. Лазерная конфокальной микроскопии может быть использован для получения серии изображений, которая производит трехмерное представление (Z-стека). Подобно тому , что наблюдается в матрице с покрытием камеры анализа (показано на рисунках 2 - 3), Совместное культивирование микроглии (окрашивали CMPTX красный) стимулирует клетки GL261 (CMFDA зеленый) вторгаться как измерено по количеству клеток, которые перешли к нижней стороне фильтра (Рисунок 4). Этот формат имеет дополнительное преимущество, которое позволяет визуализировать потенциальные межклеточных взаимодействий между глиобластому клетки и микроглия во время вторжения. Действительно, микроглии , кажется, тесно связать с клетками глиомы , взвешенных в 3D матрице (рисунок 5). Если только конечная точка анализ необходим и лазерный конфокальный не доступен для использования, сотовые камеры могут быть очищены, как описано для матричных камер с покрытием. Тогда число оставшихся (инвазивными) клеток может быть определено путем подсчета с использованием изображений , полученных с помощью стандартного эпифлуоресцентной микроскопа. Фильм 1 показывает трехмерную сборку такого анализа.
Рисунок 1:. Схема двух различных протоколов для Опробование микроглии / макрофаг-стимулированных клеток глиобластомы Invasion Верхняя панель показывает предварительно покрытой матрицы камеры инвазии анализа (раздел 2). Нижняя панель показывает 3D-матрица инвазии анализа (раздел 3). Рисунок адаптирован из9. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. микроглии (MG) Повышение GL261 клеток глиобластомы вторжения. (А) Типичные изображения вторжения GL261 клеток (экспрессирующих mCherry) в отсутствие (левая панель, одна GL261) или наличие микроглии (правая панель; GL261 + Mg) объединяли и высевали на чашки с матричными покрытием камер, с последующей инкубацией в течение 48 ч, а затем оценка количества клеток, которые скрещенных фильтр. Изображения, полученные с использованием цели 10X. Шкала бар = 400 мкМ. (B) Количественный анализ подсчета только инвазивные GL261 клетки (красные). Данные представляют собой средние ± SEM из трех независимых экспериментов. (С) Количественное микроглии-стимулированной GL261 вторжения в presencе фармакологической ингибиторов гефитиниб (5 мкМ), JNJ-28312141 (10 мкМ), PLX3397 (1 мкМ), PLX5562 (1 мкМ). Приведенные данные представляют собой среднее ± SEM из шести независимых экспериментов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Thp1 Макрофаги Повышение U87 клеток глиобластомы вторжения. (A) Типичные изображения вторжения U87 клеток , окрашенных с CMFDA зеленым высевают на матричных покрытых камер одна (левая панель; U87) или с дифференцированными Thp1 макрофагов (правая панель; U87 + Thp1) с последующей инкубацией в течение 24 ч , а затем оценка количество ячеек, которые пересекли фильтр. Изображения, полученные с использованием объектива 10X. Шкала бар = 400 мкм. (B) Количественный анализ подсчета толькоинвазивные клетки U87 (зеленый). Приведенные данные представляют собой среднее ± SEM из десяти независимых экспериментов.
. Рисунок 4. 3D Invasion Количественный анализ GL261 и микроглии сокультивирования (A) Изображения показаны проекции из Z-серии изображений GL261 клеток (окрашенных CMFDA зеленый) , внедренных в матрицу одна (левая панель; GL261) или с мышиным микроглии ( помечены красным CMPTX; правая панель; GL261 + MG). Z-проекции были днищу 4 ломтика стека изображения, которая охватывает нижнюю часть фильтровальной камеры и, следовательно, представляет собой инвазивные клетки. Шкала бар = 200 мкМ. (В) Количественное GL261 клеток (зеленый) определено , что на нижней стороне фильтра , как описано выше. Общее количество вторгающихся GL261 клеток определяли и нормированы на что из GL261 клеток в монокультуры. Данные, приведенные представляют собой среднее значение ± SEM 3 независимых экспериментов, выполненных в двух экземплярах (рисунок адаптировано из 10). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. Изображение с ломтиком внутри 3D Стек GL261 (зеленый) и микроглии (красный) сокультивирования Embedded в матрице. GL261 и микроглии клеточных взаимодействий выделяются белыми стрелками. Шкала бар = 100 мкМ.
Фильм 1:. Глиобластомы и микроглии Взаимодействие в 3D вращение вокруг оси Х 3D - проекции всей Z серии снимков , сделанных из GL261 (зеленый) и микроглии (красный) сокультивирования встроенный в маТрикс. Ломтики с шагом 5 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть это видео.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Высоко инвазивный характер высоких астроцитомах класса и глиобластомы делают эти виды рака мозга очень смертельным. Поэтому крайне важно, чтобы это понять молекулярные и клеточные механизмы глиобластомы вторжения. Многое узнал о процессе глиобластомы вторжения уже 17. С помощью анализа форматов, подробно описанные в данной работе, в нашей лаборатории показали, как в мышиных и человеческих моделей, ассоциированные с опухолью макрофаги могут стимулировать вторжение глиомы клеток на 5 - 10 раз. Эта модель Совместное культивирование точно копирует способность клеток глиобластомы физически взаимодействовать с макрофагами / микроглии, которая позволила бы паракриновых и juxtacrine взаимодействий (с помощью систем лиганд-рецептор, таких как Notch-Delta и эфрин-Ephs), которые потенциально вовлеченных в двунаправленной связи между опухолевые клетки и макрофаги. Другие форматы анализа, которые стремятся обнаружить влияние макрофагов на вторжение глиомы клетки обычно имеют клеткифизически разделены , как макрофаги высевают на нижней части скважины и клетки глиобластомы находятся на камере 3,4. Следовательно, эти исследования показывают более умеренное увеличение макрофаги стимулировали глиомы вторжения (2 раза). Этот анализ улучшает Совместное культивирование на этом эффекте (5 - 10 раз), вероятно, указывает на важность juxtacrine взаимодействий при макрофагах / микроглии стимулировали глиобластомы вторжение.
Протокол изложенные в настоящем документе, включает в себя несколько шагов, которые должны быть выполнены тщательно, чтобы достичь удовлетворительных результатов. Если эксперимент проводится, как описано здесь, и никакие вторгшиеся клетки не видно, флуоресцентный краситель, возможно, истек, который приведет к очень слабым или несуществующим окрашивания. Для вторжения анализов с использованием предварительно покрытых камер, необходимо использовать свежие вторжения камеры, которые не мимо срока годности и были сохранены замороженном все время вплоть до проведения эксперимента. Камеры, которые были оставленыпри комнатной температуре в течение более 12 часов были признаны неудовлетворительными, что матрица барьера уже не нетронутыми и клетки вторгшиеся на гораздо более высокой частоте, чем обычно. Для 3D-анализа, это абсолютно необходимо, чтобы сохранить все пипец и трубки на льду. Если при комнатной температуре в течение значительного промежутка времени, то матрица будет полимеризоваться и не могут быть использованы для ресуспендирования клеток в ней. Рекомендуется небольшой поднос со льдом используется в вытяжном шкафу, чтобы держать все материалы, которые будут вступать в контакт с матрицей. Протокол может быть изменен, чтобы включать в себя более высокую плотность клеток, тем не менее, это может повлиять на продолжительность времени, необходимого, чтобы увидеть оптимальное воздействие на глиомы вторжения. Было бы интересно посмотреть, если другие типы клеток могут быть добавлены в анализе сокультивирования и какие потенциальные последствия они могут оказать на вторжение. И, наконец, мы признаем , что микроокружение мозг является уникальным и трудно воспроизвести в лабораторных условиях . Одним из ограничений этого протокола заключается в том , что вторжение чянтари используемые здесь отсутствуют типичные компоненты нормального мозга , которые глиобластомы клетки будут сталкиваться во время вторжения (то есть, плотно упакованных нейронов и астроцитов). Несмотря на то, с той оговоркой, стимулирующего действия макрофагов / микроглии в этом анализе согласуется с тем, что наблюдается в естественных условиях , и могут быть использованы для прогнозирования , какие именно ингибиторы и / или белки , могут мешать этому процессу.
Подражая микросреды опухоли в культуре является сложной задачей, учитывая то, как много различных типов клеток и матричные белки присутствуют в опухолях на разных стадиях злокачественной опухоли. Тем не менее , достаточно точны в пробирке моделей взаимодействия опухоли с компонентами микросреды во многом способствовало бы открытию новых терапевтических проспектов. Сейчас понятно, что клетки, такие как макрофаги играют критическую роль в нескольких аспектах, связанных с прогрессированием к малигнизации, включая ангиогенеза, инвазии, иммунный уклонением и лекарственной устойчивости. сосulture анализ вторжения , описанный здесь использует отношение опухолевых клеток к макрофагам, которая наблюдается у пациентов с высокосортных глиобластомы (приблизительно 3: 1; 5). Было показано, что способность макрофагов / микроглии, чтобы стимулировать глиобластомы вторжение зависит от CSF-1R и передачи сигналов EGFR в качестве фармакологического ингибирования этих путей с использованием JNJ-28312141, PLX3397 (КСФ-1Р) и гефитиниб (EGFR), сильно затухает рост во вторжении 9. Кроме того, с помощью встроенного матричного анализа, было показано , что Semapimod, малые молекулы , как известно, целевой макрофаги и микроглии, могут также блокировать микроглии стимулировали глиобластомы вторжение 10. Результаты этих экспериментов сокультивирования дало толчок для проверки этих соединений с использованием в естественных условиях модели. В соответствии с данными , полученными анализов в пробирке , описанных в данной работе, блокада CSF-1R с ингибитором PLX3397 (который пересекает гематоэнцефалический барьер) в значительной степени блокировалоСпособность GL261 клеток глиомы к вторжению в мозге мышей C57BL / 6 9. Точно так же, Semapimod доставлены в мозг было показано , ингибирует инвазию и синергистами со стандартной лучевой терапии в значительной степени продлить выживание мышей , несущих опухоли GL261 10. Оба эти подхода могут оказаться эффективными в клинике.
Сейчас хорошо понятно , что система макрофагов является весьма важным для прогрессирования различных видов рака к злокачественности 3-6, 11-13. Это было четко установлено, в моделях рака молочной железы и рака мозга, что ассоциированные с опухолью макрофаги являются критическими для вторжения опухолевых клеток и метастазов. Кроме того, макрофаги, вероятно, будут очень важны для опосредования иммунного побега как макрофаги (клетки и связанных с ними линии , такие как дендритные клетки) выступать в качестве профессиональных антиген - представляющих клеток , которые оркестровать адаптивного иммунитета в ответ на инфекцию 18. Теперь ясно, что один из нормального рНysiological функции адаптивной иммунной системы является предотвращение неконтролируемого распространения путем уничтожения аберрантных клеток. Иммунитет по отношению к опухолевым клеткам, вероятно, связано с тем, что в высшей степени мутагенный характер раковых клеток создает нео-антигенов, которые распознаются как чужеродные адаптивной иммунной системы. На самом деле процесс «иммунного уклонения от" постулируется важная часть злокачественных новообразований, как раковые клетки должны предотвратить иммунную систему (в частности цитотоксических лимфоцитов, естественных клеток-киллеров и воспалительных макрофагов) от разрушения опухоли. Хотелось бы надеяться на анализ , описанный в данной статье, облегчает изучение взаимодействия глиобластомы с макрофагами и потенциально позволить расширение типов вопросов , мы можем адресовать о злокачественной рака с использованием в пробирке анализов культуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
