Abstract
multiforme Glioblastoma (גליומה IV כיתה) הוא סרטן אדם אגרסיווי מאוד עם חציון הישרדות של אבחנת פוסט 1 שנים. למרות ההבנה המוגברת של אירועים המולקולריים להצמיח גליובלסטומה, סרטן זה עדיין נשאר מאוד עקשן לטיפול קונבנציונלי. כריתה כירורגית של גידולים במוח בדרגה גבוהה היא כמעט ולא להשלים בשל אופי infiltrative ביותר של תאי גליובלסטומה. גישות טיפוליות אשר להחליש פלישת תא גליובלסטומה ולכן היא אופציה אטרקטיבית. המעבדה שלנו ואחרים הראו גידול כי מקרופאגים הקשורים ו microglia (מקרופאגים מוח תושב) לעורר פלישה גליובלסטומה בחום. הפרוטוקול המתואר במאמר זה משמש מודל גליובלסטומה-מקרופאג / microglia אינטראקציה באמצעות מבחני תרבות חוץ גופית. גישה זו יכולה להקל על הפיתוח מאוד ו / או גילוי של תרופות לשבש את התקשורת עם מקרופאגים המאפשר behav הממארת זוIOR. הקמנו שני מבחני פלישת coculture חזקים שבו microglia / מקרופאגים לעורר פלישת תא גליומה ידי 5 - פי 10. תאי גליובלסטומה שסומנו בסמן פלורסנט או constitutively לבטא חלבון פלואורסצנטי הם מצופים בלי ועם מקרופאגים / microglia על מוסיף קאמרי פוליקרבונט מצופית מטריצה או מוטבע במטריצה תלת ממדים. פלישת תא נבחנת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי לתדמית ולספור רק תאים פולשני על החלק התחתון של המסנן. באמצעות מבחנים אלה, כמה מעכבים תרופתיים (JNJ-28,312,141, PLX3397, gefitinib, ו Semapimod), זוהה חוסמות מקרופאג / microglia מגורה פלישת גליובלסטומה.
Introduction
Multiforme Glioblastoma הוא סרטן המוח אנושי אגרסיווי עם הישרדות ממוצעת של כ 12 חודשים מרגע האבחון 1,2. גליובלסטומה הוא אחד מסוגי הסרטן הקטלני ביותר קליני מאתגר כפי שהוא עקשן כדי טיפול כימותרפי סטנדרטי, כריתה כירורגית. האופי המפוזר של גליובלסטומה מאפשר לתאי גידול להתפשט בכל רחבי המוח הנורמלי מה שהופך את הגידול המתקדם כמעט בלתי אפשרי בניתוח לכרות לחלוטין. היבט פולשני מאוד זוהי תכונת סימן היכר של גליובלסטומה ו astrocytomas המתקדמת אחרת. לכן, ההתמקדות של מחקר רב כבר על המנגנון המולקולרי של פלישת תא גליובלסטומה. במיקרו-סביבה של הגידול גליובלסטומה משחק תפקידים חיוניים בהקמת ממאירות 3-6. גידול הקשורים מקרופאגים / microglia הוצגו להיות אחראים לקידום הפלישה גליובלסטומה 7,8. רוב המחקרים האלה ככל שיהיו השפעת מקרופאגים / microglia באמצעותמבחנים שמפרידים אותם פיזית מתאי גליובלסטומה. המעבדה שלנו יצאה ליצור מבחני משופרת אשר מאפשרים לנו ללמוד כיצד פלישת גליובלסטומה תלויה מקרופאגים / microglia ב cocultures ומאפשרים לנו תמונת האינטראקציה הפיסית ביניהם במהלך פלישה.
מבחנים קלסיים למדוד פלישת תא כוללת את פורמטים "הסטנדרטית" chemotaxis הקאמרית בוידן ו chemoinvasion. הנה התאים להיחקר הם מצופים בתא פלסטיק המכיל מסנן פוליקרבונט על הקרקעית כי יש נקבוביות של גודל שצוין (בדרך כלל בין 0.4 ו -8 מיקרומטר קוטר). תהליך פלישת תא כרוך מכשול פיזי, בדרך כלל מורכב חלבון תאי מטריקס. ב assay chemoinvasion, המטריצה העדיפו להשתמש הוא Matrigel (להלן המכונה "מטריקס"), תערובת חלבון תאי מטריקס מופרש על ידי Engelbreth-הולם-נחיל (EHS) תאי סרקומה העכבר מורכב בעיקרו של colIV ו laminin סוג Lagen. התאים ממוקמים אז באר בתרבית רקמה המכיל תקשורת תרבית תאים עם או בלי גורמי גדילה נחשדים לעורר פלישה. תאים אשר בעל קיבולת פולשנית גבוהה תפלוש דרך המסנן צופה מטריקס בתדר גבוה לדבוק התחתון של המסנן. יש לנו שונה assay זה כדי להעריך את התפקיד של המיקרוגליה מקרופאגים גידולים הקשורים על פלישת תא גליובלסטומה.
הצלחנו לקבוע באמצעות מבחני coculture תארו בתוך נייר זה כי microglia יכול לעורר את הפלישה של שורות תאי שתי גליובלסטומה ידי 5 - 10 לקפל 9,10. זה משקף את מה שנצפה בבעלי חיים של גליובלסטומה. יתר על כן, פתחנו assay פלישה תלת ממדים שבו האינטראקציות בין תאי גליובלסטומה מקרופאגים / microglia ניתן לבדוק באופן ישיר יותר. היקף הפלישה תא גליובלסטומה מגורה על ידי macrophaGES / microglia ב assay 3D ניתן להשוות מה נתפס בגישה הקאמרית מצופה מטריקס. מבחנים דומים פותחו בעבר כדי לחקור אינטראקציות סרטן השד עם מקרופאגים במהלך הפלישה 11-13. שתי השיטות שתוארו במאמר זה אמור לסייע ביכולת לנתח את המנגנון המולקולרי (ים) של הפלישה מקרופאג / מגורה microglia של תאי גליובלסטומה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תיוג פלורסנט של תאים
הערה: שורות תאים לייבל גליובלסטומה ו microglia עם צבעי ניאון 9. לחלופין, ליצור שורות תאים constitutively להביע חלבוני ניאון כגון GFP / RFP כמתואר 14.
- פלייט תאים על צלחת 6 גם כך הם יהיו 70 - 80% ומחוברים ביום של מכתים. עבור הקו הסלולרי גליובלסטומה murine GL261 ו U87 שורת תאים גליובלסטומה האנושי, צלחת 1 x 10 6 ו -1.5 x 10 6 תאים, בהתאמה על hr 6 ס"מ צלחת 24 לפני מכתים.
- הכן פתרון לצבוע תאים כתם פלורסנט ב DMSO ולהוסיף 5 מיקרומטר לצבוע למדיה, או בינוני מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) או Macrophage סרום חינם בינוני (MSFM), מערבולת היטב.
- דגירת תאים עם צבע במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- סר מדיה לצבוע המכילה ולהוסיף תקשורת טריה (RPMI או MSFM) אל התאים.
- דגירת תאים עבור 30 דקות. הערה: תאים הם עכשיומוכתמת מוכנה לשמש בניסוי.
2. Assay הפלישה Coculture לשכת מטריקס טרום מצופה
- להבדיל תאים THP-1 באמצעות אצטט phorbol myristate (PMA) 15.
- פלייט 2 - 3 x 10 5 THP-1 תאים ב 1.5 מ"ל של RPMI / 10% FBS בצלחת תרבות 6 היטב. מיד לאחר ציפוי להוסיף PMA 100 ננומטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
הערה: לאחר 48 שעות, THP-1 תאים שעברו בהצלחת בידול יהיו חסיד והתפשטו עד לתחתית באר לקחת על מורפולוגיה עגולה. - הסר PMA ידי שטיפה פעם עם 1x PBS ולהחליף עם FBS טרי RPMI / 10%. לחכות עוד 48 שעות עד תאים מוכנים להשתמש ב assay.
- פלייט 2 - 3 x 10 5 THP-1 תאים ב 1.5 מ"ל של RPMI / 10% FBS בצלחת תרבות 6 היטב. מיד לאחר ציפוי להוסיף PMA 100 ננומטר ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
- לאזן תאי מצופה מראש מטריקס ידי הצבתם בתוך התקשורת 500 μl של המכיל גם לבד (אין סרום) והוספת 500 μl של התקשורת לבד לפסגה. דגירה לתאי עבור שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
טבלה של חומרים / ציוד. - כדי לנתק בעדינות תאים (שורות תאי גליובלסטומה שכותרתו fluorescently ואת microglia / מקרופאגים), להסיר תקשורת מתאי ידי שאיפה. שטפו תאים על צלחת עם 2 מ"מ EDTA / PBS. הוסף 500 μl של 2 מ"מ EDTA / PBS ו דגירה במשך 5 - 10 דק 'ב תא חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- תאים Resuspend ב 5 מ"ל של התקשורת המכיל 0.3% שור סרום אלבומין (BSA).
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 120 x.
- לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב MSFM / 0.3% התקשורת BSA (עבור תאים GL261 ו microglia) או RPMI / 0.3% BSA (עבור U87 ו THP-1 תאים) כך ריכוז של תאים הוא שווה ל 1 x 10 6 תאים / מ"ל . השתמש hemocytometer כדי לספור את התאים.
- הוספת 500 BSA מדיה / 0.3% μl לכל טוב של 24 הצלחת היטב.
- הסר מדיה מלשכתו כי כבר equilibrated לפחות שעה 2 (שלב 2.2). מקום chambers היטב המכיל 500 μl מדיה / 0.3% BSA (2.7 שלב).
- אם מעכבי נמצאים בשימוש ללמוד את השפעתם על מקרופאג / microglia מגורה הפלישה גליומה, להוסיף את הריכוז המתאים לשני לתחתית חלקים החלק העליון של החדר.
הערה: ריכוזי CSF-1R מעכב נהג לעכב לחלוטין microglia מגורה גליובלסטומה GL261 הפלישה ניתן למצוא התייחסות 9. - בהתאם שורות תאים המשמשים, להוסיף תאים לתא העליון כמתואר על שני השלבים הבאים: גליובלסטומה העכבר (2.10.1) ו גליובלסטומה האנושי (2.10.2).
- מערבבים 1.5 x 10 5 GL261 (גליובלסטומה) תאים (150 μl) ו -5 x 10 microglia העכבר 4 (50 μl) (ראה שלב 2.6 לפרטים התקשורת). תביאו נפח 500 μl ידי הוספת 300 μl MSFM / 0.3% BSA. להוסיף תערובת תא לתא העליון לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
הערה: microglia Murine מבודדים מעכברים בילוד כמתואר in 1 6.
- מערבבים 1.5 x 10 5 GL261 (גליובלסטומה) תאים (150 μl) ו -5 x 10 microglia העכבר 4 (50 μl) (ראה שלב 2.6 לפרטים התקשורת). תביאו נפח 500 μl ידי הוספת 300 μl MSFM / 0.3% BSA. להוסיף תערובת תא לתא העליון לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
מערבבים 7.5 x 10 4 U87 (גליובלסטומה) תאים (75 μl) ו -2.5 x 10 4 THP1 (מקרופאג) תאים (25 μl). תביאו נפח 500 μl ידי הוספת 400 μl RPMI / 0.3% BSA. מוסיפים את תערובת תא לתא העליון. דגירת תאים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.
- לאחר דגירה, להסיר תאים מלמעלה של חדר על ידי שאיפה עדינה ולתקן תאים ידי הצבת בפורמלין 3.7% ב- PBS. אפשר לתאים להישאר מקבע במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (או הלילה ב 4 ° C). הסר מקבע על ידי שאיפה עדינה להחליף עם 500 μl 1x PBS. המשך לסעיף 4 לניתוח תמונה.
הערה: הניסוי יכול להיות מושהה ברגע זה והציל בתחום ההדמיה 1x PBS. אותות צבע פלואורסצנטי ניתן לאתר עד 2 שבועות לאחר קיבוע.
3. Assay הפלישה "3D" -embedding Glioma ו המקרופאגים / Microglia במטריקס
- תמהיל מטריקס הפשרה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. בצע את כל מניפולציות נוספות באמצעות מטריקס על קרח מכסה המנוע.
- הכן 10 מ"ג / מ"ל ריכוז של מטריקס בתקשורת (MSFM או RPMI) עם 0.3% BSA על הקרח.
הערה: ריכוז המניות של מטריקס הוא בדרך כלל סביב 15 מ"ג / מ"ל. - כדי להכין תאים (שכותרתו בשלב 1) להשעיה מטריקס, להסיר התקשורת מתאי ידי שאיפה. שטפו תאים על צלחת עם 2 מ"מ EDTA / PBS. הוסף 500 μl של 2 מ"מ EDTA / PBS לתאים דגירה במשך 5 - 10 דק 'החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
- תאים Resuspend ב 5 מ"ל של התקשורת המכיל BSA 0.3%.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 120 x.
- supernatant לשאוב גלולה. Resuspend גלולה בתקשורת / 0.3% BSA כך ריכוז של תאים הוא שווה ל 1 x 10 6 תאים / מ"ל. השתמש hemocytometer כדי לספור את התאים.
- הוסף 1.5 x 10 5 תאים GL261 (150 μl) + 5 x 10 4 תאים microglia (50 μl) לתוך צינור 1.5 מ"ל microfuge.להוסיף 2 x 10 5 תאים GL261 (200 μl) לתוך צינור microfuge 1.5 מ"ל נפרד.
הערה: תאי GL261 לבד בלי microglia משמשים כביקורת. - תאי ספין microfuge במשך 5 דקות ב g 120 x.
- תאים Resuspend ב -200 מטריקס קר μl על הקרח.
- פלייט 50 μl (50,000 תאים) על גבי במרכז בתא העליון של כנס קאמרי גודל נקבובי 8 מיקרומטר.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עבור פילמור להתרחש.
- הוסף 200 μl בינוני סרום ללא לתא העליון 700 בינוני צמיחת תאים μl בסרום המכיל לבאר התחתון.
- לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 שעות.
- לאחר דגירה, להסיר תאים מלמעלה של חדר על ידי שאיפה עדינה ולתקן תאים ידי הצבת בפורמלין 3.7% ב- PBS. אפשר לתאים להישאר מקבע במשך 15 דקות בטמפרטורת חדר (או הלילה ב 4 ° C). הסר מקבע על ידי שאיפה עדינה להחליף עם 500 μl 1x PBS. המשך לסעיף 4 FOניתוח תמונת r.
4. מבחני הדמיה
- הסר תאי מ פורמלדהיד 3.7% ולשטוף היטב המכיל μl 500 טרי 1x PBS.
הערה: אל תאפשר תאים לייבוש. - באמצעות מוליך כותנה שקצו, נקה בעדינויות את התאים הלא-פולשני מן החלק העליון של המסנן (צד פונה אל החלק הפנימי של התא) על ידי גירוד פני השטח המסנן. התחל בעדינות להגביר את הלחץ בהדרגה. האם זה לפחות 3 פעמים לכל תא.
- מניחים תאי באחת צלחת זכוכית עם תחתית או להשאיר בצלחת 24 היטב.
- מניחים דגימה על הבמה של epifluorescent או מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal לייזר המצוידים בתוכנת המצלמה ללכוד תמונה 9,10.
- קח כמה 10X או 20X תמונות של שדות נציג.
- באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון ImageJ, לספור את מספר תאי גליובלסטומה שחצו את המסנן 9,10 התחתון.
- אם הדמיה "3D. "Assay הפלישה (בסעיף 3), ליצור סדרה מחסנית Z באמצעות לייזר פלורסנט מיקרוסקופ confocal 5-6 כדי לדמות את אוכלוסיית התאים פולשניים על החלק התחתון של המסנן, לעקוב אחר פרוטוקול צעדים 4.2 - 4.6 לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
השימוש בשיטות המתוארות כאן, הראינו כי המיקרוגליה מקרופאגים יכולים באופן משמעותי לעורר פלישת תא גליובלסטומה. שני מבחני פלישה שונים שעובדים מתוארים באיור 1. באיור 2, תאי GL261 כי constitutively לבטא חלבון פלואורסצנטי mCherry היו מצופים על תאים מראש מצופה עם ובלי microglia במשך 48 שעות. תאי GL261 היו פולשנית בכוחות עצמם עם זאת כאשר בתרבית עם microglia יכולת פולשני גדלה בכ -10 לקפל.
אנו צופים השפעה דומה באמצעות שורות תאים אנושיות. באיור 3, תאי U87 (מוכתמי diacetate 5 chloromethylfluorescein (CMFDA ירוק)) מראים 5-6 לקפל פלישה גבוהה כאשר cocultured עם תאי THP-1 מובחנים. THP-1 הוא קו תא monocytic אדם (נגזר חולה לוקמיה monocytic חריפה) כי יכול להיות דיfferentiated למצב מקרופאג דמוי באמצעות אצטט phorbol myristate (PMA) 15. תאי THP-1 בדיל להציג רבים מהמאפיינים של מקרופאגים אדם כגון הפרשת ציטוקינים ואת היכולת לבצע phagocytosis.
לחלופין, פלישת תא ניתן למדוד על ידי הטביע במטריצת הציפוי זה ישירות על גבי המסנן להכניס לתא. מיקרוסקופיה confocal לייזר יכול לשמש כדי לייצר סדרה של תמונות שמייצר ייצוג תלת מימדי (Z-stack). דומה למה שרואים ב assay קאמרית מצופה מטריצה (מוצגים איורים 2 - 3), את coculture של microglia (מוכתם אדום CMPTX) מגרה תאי GL261 (ירוק CMFDA) לפלוש כפי שהיא נמדדת על ידי מספר תאי שחצו לחלק התחתון של המסנן (איור 4). יש תבנית זו יתרון נוסף של היכולת לדמיין תאים תאים אינטראקציות אפשריות בין glioתאי blastoma ו microglia במהלך פלישה. ואכן, microglia נראה לשייך הדוק עם תאי גליומה המרחפים מטריקס 3D (איור 5). אם ניתוח נקודת סיום רק נדרש וכן confocal ליזר אינו זמין לשימוש, תאי תא ניתן לנקות כמתואר עבור התאים מצופים מטריקס. ואז את מספר התאים הנותרים (פולשנית) ניתן לקבוע על ידי ספירת תמונות באמצעות מתקבל מיקרוסקופ epifluorescent סטנדרטי. סרט 1 מראה שלוש ההרכבה הממדית של assay כזה.
איור 1:. סכמטי של שני פרוטוקולים שונים עבור Assaying Microglia / מגורה Macrophage Cell Glioblastoma הפלישה הפאנל העליון ממחיש assay הפלישה תא מטריקס מראש מצופה (סעיף 2). פנל תחתון ממחיש assay פלישת מטריקס 3D (סעיף 3). איור מותאם9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. Microglia (MG) שפר GL261 Glioblastoma תא הפלישה. (א) נציג תמונות של פולשים לתאים GL261 (להביע mCherry) בהעדר (פאנל משמאל; GL261 לבד) או נוכחות של microglia (פאנל מימין; GL261 + MG) אוחדו מצופה על תאי מצופה מטריקס, ואחריו הדגירה על 48 hr ולאחר מכן הערכה של מספר התאים שחצו את המסנן. תמונות שצולמו באמצעות מטרת 10X. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (ב) כימות של assay ספירת תאי GL261 פולשנית בלבד (אדום). הנתונים המוצגים הם ממוצע ± SEM משלושה ניסויים בלתי תלויים. (ג) כימות של הפלישה GL261 מגורה microglia ב presencדואר של gefitinib מעכבים התרופתי (5 מיקרומטר), JNJ-28,312,141 (10 מיקרומטר), PLX3397 (1 מיקרומטר), PLX5562 (1 מיקרומטר). נתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM משישה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
המקרופאגים איור 3. THP1 שפר U87 Glioblastoma תא הפלישה. (א) נציג תמונות של פולשים לתאים U87 מוכתם ירוק CMFDA מצופה על תאי מצופה מטריצה לבד (פאנל משמאל; U87) או עם מקרופאגים THP1 הבדיל (פאנל מימין; U87 + THP1), ואחריו הדגירה במשך 24 שעות ולאחר מכן הערכה של מספר התאים שחצו את המסנן. תמונות שצולמו באמצעות מטרת 10X. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (ב) כימות של assay לספור רקתאי U87 פולשנית (ירוקה). נתונים המוצגים הם ממוצעים ± SEM מ עשרה ניסויים בלתי תלויים.
. איור 4. 3D הפלישה Assay של GL261 ו microglial Coculture (א) מהתמונות המוצגות הינן מידע צופה מתוך Z-סדרה של תמונות של תאים GL261 (מוכתם ירוק CMFDA) מוטבע מטריצה לבד (פאנל משמאל; GL261) או עם microglia בעכברים ( שכותרתו עם אדום CMPTX; הפאנל הימני; GL261 + MG). The Z-התחזיות היו של 4 פרוסות בתחתית ערימת התמונה הכוללת את החלק התחתון של המסנן הקאמרי ולכן מייצג תאי פולשני. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (ב) כימות של תאים GL261 (ירוק) נחוש בדעתו להיות על החלק התחתון של המסנן כמתואר למעלה. המספר הכולל של תאי GL261 פולשים נקבע מנורמל לזה של תאי GL261 ב monoculture. הנתונים המוצגים מייצגים את ממוצע ± SEM של 3 ניסויים בלתי תלויים, בצעו בשני עותקים (דמות מותאמת 10). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. תמונה מתוך פרוסה בתוך 3D סטאק של GL261 (ירוק) Microglia (אדום) Coculture Embedded במטריקס. GL261 ואינטראקציות תא microglia מודגשים עם חצים לבנים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
סרט 1:. אינטראקציה Glioblastoma ו Microglia ב 3D סיבוב סביב ציר X של הקרנת 3D של סדרת Z שלם של דימויים הלקוחים GL261 (ירוק) ו microglia (אדום) coculture מוטבע maטריקס. פרוסות נמצאות 5 מיקרומטר במרווחים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האופי פולשני מאוד של astrocytomas הגבוהה כיתה ו גליובלסטומה לעשות סרטן המוח אלה קטלניים מאוד. לכן יש חשיבות עליונה להבין את המנגנונים המולקולריים ו הסלולר של פלישת גליובלסטומה. רבות כבר למדו על תהליך הפלישה גליובלסטומה כבר 17. באמצעות פורמטי assay המפורטים במאמר זה, המעבדה שלנו הראתה בשני עכבר המודלים אנושיים כי מקרופאגים גידולים הקשורים יכולים לעורר פלישת תא גליומה ידי 5 - פי 10. מודל coculture זה בנאמנות משכפל את היכולת של תאי גליובלסטומה לקיים אינטראקציה עם מקרופאגים / microglia פיזית שתאפשר אינטראקציות paracrine ו juxtacrine (באמצעות מערכות קולטן ליגנד כגון Notch-דלתא Ephrin-Ephs) כי הם מעורבים פוטנציאלית בתקשורת דו-כיוונית בין תאי מקרופאגים גידול. פורמטי assay אחרים אשר מבקשים לגלות את ההשפעה של מקרופאגים על פלישת תא גליומה יש בדרך כלל תאיםפיזית מופרד כמו מקרופאגים הם מצופים בתחתית הבאר ותאי גליובלסטומה הם על החדר 3,4. כתוצאה מכך, מחקרים אלה מראים עלייה מתונה יותר בפלישת גליומה מגורה מקרופאג (2 לקפל). assay coculture זה משפר על האפקט הזה (5 - פי 10) סביר המציין את החשיבות של אינטראקציות juxtacrine במהלך מקרופאג / microglia מגורה הפלישה גליובלסטומה.
הפרוטוקול המתואר במאמר זה כרוך כמה צעדים אשר חייבת להתבצע בזהירות כדי להשיג תוצאות משביעות רצון. אם הניסוי מתבצע כפי שתואר כאן וגם לא תאים פולשים נראים, צבע פלואורסצנטי ייתכן שפג התוקף שיוביל מכתים חלש או לא קיים מאוד. עבור מבחני הפלישה באמצעות התאים מראש מצופה, חיוני להשתמש בתאי פלישה טרייה אשר אינם מעבר לתאריך התפוגה נשמרו קפוא כל הזמן עד ביצוע הניסוי. צ'יימברס שהושארובטמפרטורת החדר במשך 12 שעות נמצאו אינה משביעת רצון כי מטריקס מחסום כבר לא היה שלם תאים פלשו בתדר גבוה בהרבה מהרגיל. עבור assay 3D, זה בהחלט חיוני כדי לשמור את כל pipets וצינורות על הקרח. אם בטמפרטורת החדר למשך פרק זמן משמעותי, המטריצה יהיה לפלמר ולא יכול לשמש כדי resuspend התאים אותו. מומלץ מגש קטן מלא קרח משמש מכסה המנוע כדי להכיל את כל החומרים אשר יבואו במגע עם מטריקס. הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי לכלול צפיפות תא גבוהה, אולם זה עלול להשפיע על משך הזמן הנדרש כדי לראות את ההשפעה האופטימלית על פלישת גליומה. זה יהיה עניין לראות אם סוגי תאים אחרים ניתן להוסיף ב assay coculture ומה ההשפעות האפשריות שעלולות להיות להן על הפלישה. לבסוף, אנו מכירים בכך במיקרו-סביבה של המוח הוא ייחודי וקשה לשכפל במבחנה. מגבלה אחת של פרוטוקול זה הוא כי ch הפלישהambers משמש כאן חסר המרכיבים האופייניים של מוח הנורמלי שבו תאי גליובלסטומה יפגשו במהלך הפלישה (כלומר, הנוירונים בצפיפות האסטרוציטים). למרות עם אזהרה, ההשפעה של גירוי מקרופאגים / microglia ב assay זה עולה בקנה אחד עם מה הוא ציין in vivo והוא יכול לשמש כדי לחזות אילו מעכבים ו / או חלבונים עלולים להפריע לתהליך זה.
חיקוי microenvironment הגידול בתרבות היא משימה מרתיעה בהתחשב כמה סוגי תאים מגוונים חלבונים מטריקס נוכחי גידולים בשלבים שונים של ממאירות. עם זאת סביר מדויק במודלים חוץ גופייה של אינטראקצית גידול ברכיבים של המיקרו-הסביבה יקל על הגילוי מאוד של שדרות טיפוליות חדשות. עכשיו זה מוערך כי תאים כגון מקרופאגים לשחק תפקיד קריטי בכמה היבטים הקשורים להתקדמות לממארת כולל אנגיוגנזה, פלישה, התחמקות חיסונית עמידים לתרופות. CoCassay פלישת ulture המתואר כאן משתמש היחס של תאים סרטניים מקרופאגים כי הוא ציין בחולים עם גליובלסטומה בדרגה גבוהה (כ 3: 1; 5). הוכח כי היכולת של מקרופאגים / microglia לעורר הפלישה גליובלסטומה תלויה CSF-1R והאיתות EGFR מפני שהוא מעכב תרופתי של מסלולים אלו באמצעות JNJ-28,312,141, PLX3397 (CSF-1R) ו gefitinib (EGFR) בתוקף פוחתת עלייה בפלישה 9. יתר על כן, באמצעות assay מטריקס המוטבע, הודגם כי Semapimod, מולקולה קטנה הידועה למקד מאקרופאגים microglia, גם הוא עשוי לעצור microglia מגורה פלישה גליובלסטומה 10. תוצאות מניסויים coculture אלה סיפקו את הדחיפה כדי לאמת התרכובות הללו באמצעות במודלים vivo. עולה בקנה אחד עם נתוני מבחני חוץ הגופייה המתוארים במאמר זה, מצור של CSF-1R עם PLX3397 המעכב (אשר חוצה את מחסום דם המוח) בעיקר חסם אתהיכולת של תאי גליומה GL261 לפלוש במוחם של עכברים C57BL / 6 9. באופן דומה, Semapimod נמסר לתוך המוח הוצג לעכב פלישה וכדי synergize עם טיפול קרינה סטנדרטי בהארכה מאוד להישרדות של עכברים מחסת גידולי GL261 10. שתי גישות אלה עשויים להוכיח יעיל במרפאה.
עכשיו זה גם מוערך כי מערכת מקרופאג חשובה למדי עבור התקדמות הסרטן שונה לממאיר 3-6, 11-13. זה הוכח בבירור מודלי סרטן שד והמוח כי מקרופאגים גידולים הקשורים הם קריטיים עבור פלישת תאים סרטניים וגרור. בנוסף, מקרופאגים צפויים להיות חשוב מאוד עבור בתיווך בריחה חיסונית כמו מקרופאגים (ותאי של שושלת נלווית כגון תאים דנדריטים) כמקור תאי מציגי אנטיגן מקצועיים אשר לתזמר חסינות אדפטיבית בתגובה לזיהום 18. עכשיו זה ברור שאחד ph הנורמליפונקציות ysiological של המערכת החיסונית אדפטיבית היא למנוע התפשטות לא מבוקרת על ידי השמדת תאים חריגים. חסינות כלפי תאי הגידול צפויה בשל העובדה כי אופי מוטגנים מאוד של התאים הסרטניים מייצר ניאו-אנטיגנים מוכרים זר על ידי המערכת החיסונית אדפטיבית. ואכן בתהליך של "העלמה חיסונית" הוא הניח להיות חלק חשוב של ממאירות כמו תאים סרטניים צריכים למנוע את המערכת החיסונית (בלימפוציטים ציטוטוקסיות מסוימים, תאי הרג טבעיים ו מקרופאגים דלקתיים) להרוס את הגידול. התקווה היא כי assay המתואר במאמר זה יהיה מקל על חקר אינטראקציה גליובלסטומה עם מקרופאגים ואפשרות לאפשר הרחבת סוגי השאלות שנוכל לטפל על סרטן ממאיר באמצעות מבחני תרבות במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
