Abstract
glioblastoma multiforme (IV glioma grade) é um câncer humano muito agressivo com uma sobrevida média de diagnóstico pós 1 ano. Apesar do aumento da compreensão dos eventos moleculares que dão origem a glioblastomas, este cancro continua a ser altamente refractário ao tratamento convencional. A ressecção cirúrgica de tumores cerebrais de alto grau raramente é completa devido à natureza altamente infiltrativa de células de glioblastoma. abordagens terapêuticas que atenuam a invasão de células de glioblastoma, portanto, é uma opção atraente. O nosso laboratório e outros mostraram que o tumor macrófagos e microglia (macrófagos residentes de cérebro) estimulam fortemente a invasão glioblastoma associados. O protocolo descrito neste documento é usado para modelar glioblastoma e macrófagos / microglia interação utilizando ensaios in vitro de cultura. Esta abordagem pode facilitar grandemente o desenvolvimento e / ou descoberta de drogas que interrompem a comunicação com os macrófagos que permite que este behav malignoeu ou. Nós estabelecemos dois ensaios de co-cultura de invasão robustos, onde microglia / macrófagos estimulam a invasão de células de glioma por 5-10 vezes. células de glioblastoma marcadas com um marcador fluorescente ou constitutivamente expressando uma proteína fluorescente foram semeadas com e sem macrófagos / microglia em insertos de câmara de policarbonato revestidos de matriz ou embebida numa matriz tridimensional. invasão celular é avaliada por microscopia de fluorescência usando a imagem e contam apenas as células invasivas sobre o lado de baixo do filtro. Usando estes ensaios, vários inibidores farmacológicos (JNJ-28312141, PLX3397, gefitinib, e Semapimod), foram identificados que bloqueiam macrófagos / microglia estimulou invasão glioblastoma.
Introduction
Glioblastoma multiforme é um câncer de cérebro humano agressivo com uma sobrevida média de aproximadamente 12 meses a partir do momento do diagnóstico 1,2. Glioblastoma é um dos cancros mais mortais e clinicamente desafiadoras como é refratário à quimioterapia padrão e ressecção cirúrgica. A natureza difusa do glioblastoma permite que as células tumorais se espalhar por todo o cérebro normal, fazendo com que o tumor avançado praticamente impossível para ressecar cirurgicamente completamente. Este aspecto altamente invasivo é uma característica marca de glioblastoma e outros astrocitomas avançados. Portanto, o foco de muita pesquisa tem sido sobre o mecanismo molecular de invasão de células de glioblastoma. O microambiente do tumor glioblastoma desempenha um papel vital no estabelecimento de malignidade 3-6. Associados a tumores macrófagos / microglia foram mostrados para ser responsável pela promoção do glioblastoma invasão 7,8. A maioria destes estudos no entanto medido o efeito de macrófagos / microglia usandoensaios que fisicamente separá-los a partir de células de glioblastoma. Nosso laboratório tem a intenção de gerar ensaios melhorados que nos permitem estudar como glioblastoma invasão é dependente de macrófagos / microglia em co-culturas e permitir-nos de imagem a interação física entre eles durante a invasão.
ensaios clássicos para medir a invasão de células incluem as quimiotaxia câmara de Boyden "padrão" e formatos quimioinvasão. Aqui, as células a serem estudadas são colocadas numa câmara de plástico que contém um filtro de policarbonato sobre o fundo, que tem poros de um tamanho especificado (geralmente entre 0,4 e 8 um de diâmetro). O processo de invasão celular envolve uma barreira física, normalmente composta de proteínas da matriz extracelular. No ensaio de quimioinvasão, a matriz preferida é utilizado Matrigel (daqui em diante referido como "matriz"), uma mistura de proteínas de matriz extracelular segregada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de rato e consiste em grande parte de colTipo de lagen IV e laminina. As câmaras são então colocadas num poço de cultura de tecido que contém o meio de cultura de células com ou sem factores de crescimento que são suspeitos de estimular a invasão. As células que têm uma maior capacidade invasiva irão invadir através do filtro revestido matriz extracelular com uma frequência mais elevada e aderir ao lado de baixo do filtro. Nós modificamos este ensaio, a fim de avaliar o papel da microglia e tumorais macrófagos associados na invasão de células de glioblastoma.
Temos sido capazes de determinar usando ensaios de co-cultura descritos neste artigo que microglia pode estimular a invasão de duas linhas de células de glioblastoma por 5 - 10 vezes 9,10. Isso reflete o que é observado em modelos animais de glioblastoma. Além disso, foi desenvolvido um ensaio de três invasão dimensional, onde as interações entre células de glioblastoma e macrófagos / microglia pode ser examinado mais diretamente. A extensão de invasão de células de glioblastoma estimulada por macrophaGES / microglia no ensaio 3D é comparável ao que é visto através da abordagem câmara de matriz revestido. Ensaios semelhantes foram anteriormente desenvolvidas para estudar interacções de carcinoma da mama com macrófagos durante a invasão 11-13. Ambos os métodos descritos neste artigo deve ajudar na capacidade de dissecar o mecanismo molecular (s) de macrófagos invasão / estimulada pela microglia de células de glioblastoma.
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Protocol
1. etiquetagem fluorescente de células
Linhas de células de glioblastoma rótulo e microglia com corantes fluorescentes 9: Nota. Em alternativa, geração de linhas celulares que expressam constitutivamente proteínas fluorescentes, tais como GFP / RFP como descrito em 14.
- células da placa em uma placa de 6 poços de modo a que eles vão ser de 70 - 80% confluentes no dia da coloração. Para a linha de murino de células de glioblastoma GL261 e linha U87 celular de glioblastoma humano, placa 1 x 10 6 e 1,5 x 10 6 células, respectivamente em um disco de 6 cm 24 horas antes da coloração.
- Preparar a solução de corante fluorescente da mancha de células em DMSO e adicionar corante de 5 uM a meios de comunicação, qualquer meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ou meio isento de soro Macrófago Médio (MSFM), bem vórtice.
- Incubar as células com corante durante 30 min a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Remova a mídia contendo corantes e adicionar meio fresco (RPMI ou MSFM) para as células.
- Incubar as células durante 30 min. Nota: As células são agoramanchado e pronto para ser utilizado na experiência.
2. Pré-revestidos Ensaio Matrix Câmara Coculture Invasion
- Diferenciar células THP-1 usando acetato de miristato de forbol (PMA) 15.
- Placa 2 - 3 x 10 5 células THP-1 em 1,5 ml de RPMI / 10% de FBS numa placa de cultura de 6 poços. Imediatamente após o plaqueamento adicionar PMA 100 nM e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
NOTA: Após 48 horas, as células THP-1 que foram submetidos com êxito a diferenciação será aderente e se espalhar para o fundo da cavidade assumindo uma morfologia redonda. - Remover PMA por lavagem uma vez com PBS 1x e substituir com frescos RPMI / FBS 10%. Esperar mais 48 horas até que as células estão prontos para usar no ensaio.
- Placa 2 - 3 x 10 5 células THP-1 em 1,5 ml de RPMI / 10% de FBS numa placa de cultura de 6 poços. Imediatamente após o plaqueamento adicionar PMA 100 nM e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
- Equilibrar câmaras de matriz pré-revestidos colocando-os num poço contendo 500 ul de meio por si só (sem soro) e adição de 500 ul de meios sozinho para o topo. Incubar as câmaras durante 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2.
tabela dos materiais / equipamentos. - Para células (linhas de células de glioblastoma fluorescente etiquetado e as microgliais / macrófagos) retire delicadamente, ao remover a mídia a partir de células por aspiração. Lave as células no prato com 2 mM EDTA / PBS. Adicionar 500 ul de 2 mM de EDTA / PBS e incubar durante 5 - 10 min numa incubadora celular a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Ressuspender as células em 5 ml de meio contendo 0,3% de Albumina de Soro Bovino (BSA).
- Centrifugar durante 5 minutos a 120 x g.
- Aspirar o sobrenadante e sedimento de ressuspender em meio BSA MSFM / 0,3% (para células GL261 e microglia) ou RPMI /% BSA a 0,3 (para U87 e as células THP-1) de tal modo que a concentração de células é igual a 1 x 10 6 células / ml . Use um hemocitômetro para contar as células.
- Adicionar 500 ul de meio / 0,3% de BSA por poço da placa de 24 poços.
- Remover o meio de câmaras, que têm sido equilibrada durante pelo menos 2 h (Passo 2.2). lugar chambeRS em poços contendo 500 ul de meio / BSA a 0,3% (passo 2.7).
- Se inibidores estão a ser utilizados para estudar o seu efeito sobre macrófagos / microglia estimuladas invasão glioma, adicionar a concentração apropriada para o fundo e as porções superiores da câmara.
NOTA: As concentrações de CSF-1R inibidor utilizado para inibir totalmente a microglia estimuladas GL261 invasão glioblastoma pode ser encontrado na referência 9. - Dependendo das linhas celulares utilizadas, adicionar células à câmara de topo como descrito nos seguintes dois passos: glioblastoma rato (2.10.1) e de glioblastoma humano (2.10.2).
- Misture 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) células (150 ul) e 5 x 10 4 microglia rato (50 ul) (veja o passo 2.6 para detalhes de mídia). Levar o volume a 500 mL por adição de 300 ul MSFM / 0,3% de BSA. Adicionar mistura de células na câmara de topo e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
NOTA: microglia de murino são isoladas a partir de ratinhos neonatais como descrito iN 1 6.
- Misture 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) células (150 ul) e 5 x 10 4 microglia rato (50 ul) (veja o passo 2.6 para detalhes de mídia). Levar o volume a 500 mL por adição de 300 ul MSFM / 0,3% de BSA. Adicionar mistura de células na câmara de topo e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
Misture 7,5 x 10 4 U87 (glioblastomas) células (75 uL) e células de 2,5 x 10 4 THP1 (macrófagos) (25 ul). Levar o volume a 500 mL por adição de 400 ul de RPMI / BSA a 0,3%. Adicionar a mistura de células à câmara superior. Incubar as células a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 24 horas.
- Após a incubação, remover as células da parte superior da câmara através de ligeira aspiração e corrigir câmaras, colocando em 3,7% de formaldeído em PBS. Permitir câmaras de permanecer em fixador durante 15 min à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 ° C). Remover fixador por aspiração suave e substituir com 500 mL de 1x PBS. Avance para a secção 4 para análise de imagem.
NOTA: Experiência pode ser pausado, neste momento, e salvo para geração de imagens em 1x PBS. sinais de corante fluorescente pode ser detectado por até 2 semanas após a sua fixação.
3. Invasão de Ensaio "3D" Embedding glioma e macrófagos / Microglia em Matrix
- Descongelar matriz mistura a 4 ° C durante a noite. Executar todas as outras manipulações usando matriz no gelo no capô.
- Prepare a 10 mg / ml de concentração da matriz em meio (RPMI ou MSFM) com 0,3% de BSA em gelo.
NOTA: da concentração de matriz é tipicamente cerca de 15 mg / ml. - Para preparar células (marcadas no passo 1) de suspensão, em matriz, remover a mídia a partir de células por aspiração. Lave as células no prato com 2 mM EDTA / PBS. Adicionar 500 ul de 2 mM de EDTA / PBS às células e incuba-se durante 5 - 10 min no incubador a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Ressuspender as células em 5 ml de meio contendo 0,3% de BSA.
- Centrifugar durante 5 minutos a 120 x g.
- Aspirar o sobrenadante da pelete. Ressuspender o sedimento em meios / 0,3% de BSA de tal modo que a concentração de células é igual a 1 X 10 6 células / ml. Use um hemocitômetro para contar as células.
- Adicionar 1,5 x 10 5 células GL261 (em 150 uL) + 5 x 10 4 células microgliais (no 50 ul) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.Adicionar 2 x 10 5 células GL261 (200 ul) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml separado.
NOTA: As células GL261 sozinho sem microglia serve como um controlo. - células de spin em microcentrífuga durante 5 min a 120 x g.
- Ressuspender as células em 200 ul matriz de frio no gelo.
- Placa 50 uL (50.000 células) para o centro do topo do compartimento de 8 uM inserção câmara de tamanho de poro.
- Incubar a 37 ° C durante 30 min para a polimerização ocorra.
- Adicionar meio isento de soro de 200 ul para a câmara superior e contendo o meio de crescimento de células de 700 ul de soro para o poço inferior.
- Incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 48 horas.
- Após a incubação, remover as células da parte superior da câmara através de ligeira aspiração e corrigir câmaras, colocando em 3,7% de formaldeído em PBS. Permitir câmaras de permanecer em fixador durante 15 min à temperatura ambiente (ou durante a noite a 4 ° C). Remover fixador por aspiração suave e substituir com 500 mL de 1x PBS. Avance para a secção 4 foanálise de imagem r.
4. Ensaios de imagem
- Remover câmaras de 3,7% de formaldeído e lave em poços contendo fresco 500 mL 1x PBS.
NOTA: Não permita que as câmaras para secar. - Usando um aplicador de algodão com ponta, suavemente limpar as células não invasivas a partir da porção superior do filtro (lado voltado para o interior da câmara) por raspagem da superfície do filtro. Comece devagar e aumentar a pressão gradualmente. Faça isso pelo menos 3 vezes por câmara.
- Coloque câmaras em qualquer um prato de vidro de fundo ou deixar em uma placa de 24 poços.
- Coloque amostra no palco de um epifluorescência ou confocal a laser microscópio de fluorescência equipado com câmera e captura de imagem de software 9,10.
- Levar vários 10X ou 20X imagens de campos representativos.
- Utilizando um software de análise de imagem, tal como ImageJ, contar o número de células de glioblastoma que tenham atravessado o filtro para o lado de baixo 9,10.
- Se imagiologia do "3D. "Ensaio de invasão (descrito no ponto 3), gerar uma série Z pilha usando um laser fluorescente microscópio confocal 5-6 para a imagem da população de células invasivas sobre o lado de baixo do filtro, seguir o protocolo passos 4,2-4,6 descrito acima.
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Representative Results
Usando os métodos descritos aqui, temos mostrado que microglia e macrófagos podem estimular substancialmente a invasão de células de glioblastoma. Dois ensaios de invasão diferentes são empregues e estão representados na Figura 1. Na Figura 2, as células que expressam constitutivamente GL261 a proteína fluorescente mCherry foram semeadas em câmaras de pré-revestidas, com e sem a microglia durante 48 h. células GL261 foram minimamente invasiva por conta própria no entanto, quando cultivadas com microglia a capacidade invasiva aumentada em aproximadamente 10 vezes.
Observamos um efeito semelhante utilizando linhas de células humanas. Na Figura 3, as células U87 (corados com diacetato de (CMFDA) verde 5-chloromethylfluorescein) mostra 5-6 vezes superior quando co-cultivadas com a invasão de células THP-1 diferenciadas. THP-1 é uma linha celular monocítica humana (derivada de um paciente com leucemia monocítica aguda) que pode ser differentiated em um estado de macrófagos-like usando acetato de forbol miristato (PMA) 15. células diferenciadas THP-1 apresentam muitas das características de macrófagos humanos tais como a secreção de citocinas e a capacidade de realizar a fagocitose.
Alternativamente, a invasão celular pode ser medida por incorporação-los na matriz e plaqueamento directamente sobre o filtro com uma inserção de câmara. microscopia confocal a laser pode ser usada para produzir uma série de imagens que produz uma representação tridimensional (Z-stack). À semelhança do que é observado no ensaio de câmara revestida de matriz (mostrados nas Figuras 2-3), a co-cultura de microglia (corado com CMPTX vermelho) estimula as células GL261 (CMFDA verde) para invadir como medida pelo número de células que atravessaram para o lado de baixo do filtro (Figura 4). Este formato tem a vantagem adicional de ser capaz de visualizar as interacções célula-célula potenciais entre GLIOcélulas blastoma e microglia durante a invasão. Com efeito, a microglia parece que associe estreitamente com as células de glioma em suspensão numa matriz 3D (Figura 5). Se apenas análise de ponto final é necessário e uma confocal laser não está disponível para o uso, as câmaras de célula pode ser limpo tal como descrito para as câmaras de matriz revestido. Em seguida, o número das restantes células (invasivos) pode ser determinado por contagem usando imagens obtidas a partir de um microscópio de epifluorescência padrão. Filme 1 mostra o conjunto tridimensional de um tal ensaio.
Figura 1:. Esquemático de dois protocolos diferentes para ensaiar Microglia / estimulada por macrófagos Glioblastoma celular Invasion Painel superior ilustra ensaio de invasão câmara de matriz pré-revestidos (Seção 2). painel inferior ilustra 3D ensaio de invasão matriz (Seção 3). Figura adaptada de9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Microglia (MG) Melhorar GL261 Glioblastoma celular Invasion. (A) Imagens representativas de invadir células GL261 (expressando mCherry) na ausência (painel da esquerda; GL261 sozinho) ou na presença de microglia (painel da direita; GL261 + Mg) foram combinados e semeadas em câmaras revestida de matriz, seguida por incubação durante 48 hr e, em seguida, a avaliação do número de células que tenham atravessado o filtro. As imagens tomadas com objetiva de 10X. Barra de escala = 400? M. (B) Quantificação do ensaio contando apenas as células GL261 invasivos (vermelho). Os dados apresentados são a média ± SEM de três experiências independentes. (C) Quantificação da invasão GL261 estimulada por microglia no presence inibidores de gefitinib farmacológico (5 uM), JNJ-28312141 (10 uM), PLX3397 (1 uM), PLX5562 (1 uM). Os dados apresentados são média ± SEM de seis experimentos independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. THP1 macrófagos Melhorar U87 Glioblastoma invasão celular. (A) Imagens representativas de invadir células U87 coradas com CMFDA verde semeadas em câmaras revestidos de matriz sozinho (painel esquerdo; U87) ou com macrófagos THP1 diferenciadas (painel da direita; U87 + THP1), seguido por incubação durante 24 h e, em seguida, a avaliação de o número de células que tenham atravessado o filtro. Imagens tiradas com uma objectiva 10X. Barra de escala = 400? M. (B) Quantificação do ensaio contando apenascélulas U87 invasivos (verde). Os dados apresentados são a média ± SEM de dez experiências independentes.
. Ou com microglia murino (; Figura 4. 3D Invasão Ensaio de GL261 e microglia Coculture (A) As imagens mostradas são projeções de um Z-série de imagens de células GL261 (corados com CMFDA verde) incorporadas em matriz sozinho (GL261 painel esquerdo) rotulados com CMPTX vermelho; painel direito; GL261 + MG). O Z-projecções eram da parte inferior 4 fatias de a pilha de imagens, que engloba a parte inferior da câmara de filtro e, por conseguinte, representa células invasivas. Barra de escala = 200 uM. (B) A quantificação de células GL261 (verde) Determinou-se que na parte inferior do filtro, como descrito acima. O número total de células GL261 invasoras foi determinada e normalizada com a das células GL261 em monocultura. Os dados mostrados representam a média ± SEM de 3 experiências independentes, realizadas em duplicado (figura adaptado de 10). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Imagem de uma fatia dentro da pilha 3D do GL261 (verde) e Microglia (vermelho) Coculture Embutido em Matrix. GL261 e interações celulares microglia são realçadas com setas brancas. Barra de escala = 100 uM.
Filme 1:. Glioblastoma e Microglia Interação em 3D rotação em torno do eixo X de uma projeção em 3D de toda a série Z de imagens tiradas a partir GL261 (verde) e microglia (vermelho) co-cultura incorporada em matrix. Fatias estão em 5 mM incrementos. Por favor clique aqui para ver este vídeo.
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Discussion
A natureza altamente invasiva de astrocitoma de alto grau e glioblastoma fazer estes cancros cerebrais muito mortal. Por isso, é de suma importância para compreender os mecanismos moleculares e celulares da invasão glioblastoma. Muito se aprendeu sobre o processo de glioblastoma invasão já 17. Usando os formatos de ensaio detalhados neste papel, nosso laboratório tem demonstrado em ambos mouse e modelos humanos que associados a tumores macrófagos pode estimular a invasão de células de glioma por 5-10 vezes. Este modelo de co-cultura replica fielmente a capacidade das células de glioblastoma para interagir fisicamente com macrófagos / microglia que permita as interacções parácrinos e juxtacrine (através de sistemas de ligando-receptor, tais como Notch-Delta e Efrina-EPHS) que estão potencialmente envolvidos na comunicação bidireccional entre o células tumorais e macrófagos. Outros formatos de ensaio, que procuram explorar o efeito de macrófagos na invasão de células de glioma têm tipicamente as célulasfisicamente separados como os macrófagos são plaqueadas na parte inferior do poço e as células de glioblastoma são na câmara de 3,4. Por conseguinte, estes estudos mostram um aumento mais modesto na invasão de macrófagos estimuladas com glioma (2 vezes). Este ensaio de co-cultura melhora este efeito (5-10 vezes) provável que indica a importância das interacções juxtacrine durante macrófagos / microglia estimuladas invasão glioblastoma.
O protocolo descrito neste artigo envolve várias etapas que devem ser executadas com cuidado para alcançar resultados satisfatórios. Se a experiência é efectuada tal como descrito aqui e não há células invasoras são vistas, o corante fluorescente pode ter expirado o que levará a coloração muito fraca ou inexistente. Para os ensaios de invasão usando as câmaras pré-revestido, é essencial utilizar câmaras de invasão frescas, que não são passados à data de validade e foram mantidas congeladas durante todo o tempo até que realizar a experiência. Chambers que foram deixadasà temperatura ambiente, durante mais de 12 horas foram considerados insatisfatórios em que a matriz de barreira não estava mais intacta e células invadidas a uma frequência muito mais elevada do que o normal. Para o ensaio em 3D, é absolutamente crucial para manter todas as pipetas e tubos em gelo. Se a temperatura ambiente durante um período significativo de tempo, a matriz irá polimerizar e não pode ser utilizado para voltar a suspender as células no mesmo. Recomenda-se que um pequeno tabuleiro cheio de gelo é utilizado na cobertura para manter todos os materiais que entram em contacto com a matriz. O protocolo pode ser modificado para incluir uma densidade celular mais elevada, no entanto, isto pode afectar a duração de tempo necessária para ver o efeito óptimo na invasão de glioma. Seria de interesse para ver se outros tipos de células pode ser adicionado no ensaio de co-cultura e o potencial de efeitos que podem ter na invasão. Finalmente, reconhecemos que o microambiente do cérebro é único e difícil de reproduzir in vitro. Uma limitação deste protocolo é que o ch invasãoâmbares usadas aqui não têm os componentes típicos de normal do cérebro que as células de glioblastoma vai encontrar durante a invasão (ou seja, os neurônios densamente empacotados e astrócitos). Embora com a ressalva, o efeito estimulador de macrófagos / microglia no presente ensaio é consistente com o que se observa in vivo e pode ser utilizado para prever que os inibidores e / ou proteínas podem interferir com este processo.
Imitando o microambiente do tumor em cultura é uma tarefa difícil dado quantas variados tipos de células e proteínas da matriz estão presentes em tumores em vários estágios de malignidade. No entanto, razoavelmente preciso em modelos in vitro de interacção tumor com componentes do microambiente iria facilitar grandemente a descoberta de novas vias terapêuticas. É agora apreciado que as células tais como os macrófagos desempenham um papel crítico em diversos aspectos relacionados com a progressão de doença maligna incluindo a angiogénese, invasão, evasão imune e resistência aos medicamentos. o COCensaio de invasão ultura descrito aqui utiliza a razão de células tumorais de macrófagos, que é observada em pacientes com glioblastomas alto grau (aproximadamente 3: 1; 5). Tem sido demonstrado que a capacidade dos macrófagos / microglia para estimular a invasão de glioblastoma é dependente do CSF-1R e a sinalização do EGFR como a inibição farmacológica destes caminhos utilizam JNJ-28312141, PLX3397 (CSF-1R) e gefitinib (EGFR) atenua fortemente o aumento 9 na invasão. Além disso, utilizando o ensaio de matriz de incorporado, foi demonstrado que Semapimod, uma pequena molécula conhecida para segmentar macrófagos e microglia, também pode bloquear a microglia estimuladas glioblastoma invasão 10. Os resultados destes experimentos co-cultura deu o impulso necessário para validar estes compostos utilizando modelos in vivo. Consistente com os dados dos ensaios in vitro descritos no presente documento, o bloqueio da CSF-1R com o PLX3397 inibidor (que atravessa a barreira sanguínea do cérebro), em grande parte bloqueada dacapacidade das células para invadir GL261 glioma nos cérebros de ratinhos C57BL / 6 9. Da mesma forma, Semapimod entregue no cérebro foi demonstrado inibir a invasão e a sinergia com o tratamento de radiação no padrão prolongando significativamente a sobrevivência de ratinhos com tumores GL261 10. Ambas estas abordagens podem revelar-se eficaz na prática clínica.
É agora bem apreciado que o sistema de macrófagos é muito importante para a progressão de vários cancros de malignidade 3-6, 11-13. Tem sido claramente estabelecida em modelos de câncer de mama e cérebro que macrófagos associados a tumores são críticos para a invasão de células de tumores e metástases. Além disso, os macrófagos são susceptíveis de ser muito importante para mediar fuga imune como os macrófagos (e as células de linhagem relacionadas, tais como as células dendríticas) funcionam como células apresentadoras de antigénios profissionais, que orquestram a imunidade adaptativa em resposta à infecção 18. É agora claro que um dos pH normalysiological funções do sistema imune adaptativo é para evitar a proliferação descontrolada de destruir as células aberrantes. Imunidade para as células tumorais é provavelmente devido ao facto de que a natureza altamente mutagénico da célula cancerosa gera neo-antigénios que são reconhecidos como estranhos pelo sistema imunitário adaptativo. Com efeito, o processo de "evasão imune" é postulada como sendo uma parte importante da malignidade como células cancerosas precisa de impedir que o sistema imunológico (em particular os linfócitos citotóxicos, as células assassinas naturais e macrófagos inflamatórios) de destruir o tumor. Espera-se o ensaio descrito neste documento irá facilita o estudo da interação glioblastoma com os macrófagos e, potencialmente, permitir a expansão dos tipos de perguntas que podem resolver cerca de cancro maligno utilizando ensaios de cultura in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
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