Abstract
El glioblastoma multiforme (grado IV glioma) es un cáncer muy agresivo humana con una supervivencia media de diagnóstico posterior a 1 año. A pesar de la mayor comprensión de los eventos moleculares que dan lugar a glioblastomas, este cáncer sigue siendo altamente refractaria al tratamiento convencional. La resección quirúrgica de los tumores cerebrales de alto grado es rara vez completa debido a la naturaleza altamente infiltrante de células de glioblastoma. Los enfoques terapéuticos que atenúan la invasión de células de glioblastoma, por tanto, es una opción atractiva. Nuestro laboratorio y otros han demostrado que los macrófagos y microglia tumor (macrófagos cerebrales residentes) estimular fuertemente invasión glioblastoma asociados. El protocolo descrito en este documento se utiliza para modelar la interacción glioblastoma y macrófagos / microglia utilizando ensayos de cultivo in vitro. Este enfoque puede facilitar en gran medida el desarrollo y / o el descubrimiento de fármacos que interrumpen la comunicación con los macrófagos que permite a este Behav malignoior. Hemos establecido dos ensayos de co-cultivo de invasión robustas donde microglía / macrófagos estimulan la invasión de células de glioma de 5 - 10 veces. células de glioblastoma marcados con un marcador fluorescente o expresar constitutivamente una proteína fluorescente se cultivan en placas con y sin los macrófagos / microglia en insertos de cámara de policarbonato de matriz recubierto o embebidas en una matriz tridimensional. la invasión de células se evaluó mediante el uso de microscopía de fluorescencia a la imagen y contar células sólo invasivos en la parte inferior del filtro. Usando estos ensayos, varios inhibidores farmacológicos (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, y Semapimod), se han identificado que bloquean los macrófagos / microglia estimulados invasión glioblastoma.
Introduction
El glioblastoma multiforme es un cáncer de cerebro humano agresivo con una supervivencia media de aproximadamente 12 meses desde el momento del diagnóstico 1,2. El glioblastoma es uno de los cánceres más mortales y clínicamente desafiantes, ya que es refractario a la quimioterapia estándar y la resección quirúrgica. La naturaleza difusa de glioblastoma permite a las células tumorales a extenderse por todo el cerebro normal haciendo que el tumor avanzado prácticamente imposible quirúrgicamente resecar completamente. Este aspecto altamente invasiva es una característica distintiva del glioblastoma y otros astrocitomas avanzadas. Por lo tanto, el foco de mucha investigación ha sido el mecanismo molecular de la invasión de células de glioblastoma. El microambiente del tumor glioblastoma juega un papel vital en el establecimiento de malignidad 3-6. Macrófagos tumorales asociados / microglía mostraron ser responsable de promover el glioblastoma invasión 7,8. La mayoría de estos estudios, sin embargo midió el efecto de los macrófagos / microglia utilizandoensayos que separan físicamente de las células de glioblastoma. Nuestro laboratorio ha dedicado a generar mejores ensayos que permiten estudiar cómo la invasión glioblastoma es dependiente de macrófagos / microglia en co-cultivos y permitirnos la imagen de la interacción física entre ellos durante la invasión.
Los ensayos clásicos para medir la invasión de células incluyen los quimiotaxis cámara de Boyden "estándar" y formatos quimioinvasión. Aquí las células para ser estudiados se colocaron en placas en una cámara de plástico que contiene un filtro de policarbonato en la parte inferior que tiene poros de un tamaño especificado (en general, entre 0,4 y 8 m de diámetro). El proceso de invasión de las células implica una barrera física, por lo general compuesta de proteína de la matriz extracelular. En el ensayo de quimioinvasión, la matriz preferido usado es Matrigel (en lo sucesivo denominado "matriz"), una mezcla de proteína de la matriz extracelular secretada por Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) células de sarcoma de ratón y consiste en gran parte de colLagen tipo IV y laminina. Las cámaras se colocan a continuación en un pozo de cultivo de tejidos que contiene medios de cultivo celular con o sin factores de crecimiento que se sospecha para estimular la invasión. Las células que tienen una mayor capacidad invasiva invadirá a través del filtro recubierto de matriz extracelular a una frecuencia superior y se adhieren a la parte inferior del filtro. Hemos modificado este ensayo con el fin de evaluar el papel de la microglía y los macrófagos asociados a tumores en la invasión de células de glioblastoma.
Hemos sido capaces de determinar usando ensayos de cocultivo descritos en este documento que la microglia pueden estimular la invasión de dos líneas celulares de glioblastoma por 5 a 10 veces 9,10. Esto refleja lo que se observa en los modelos animales de glioblastoma. Además, se desarrolló un ensayo de invasión de tres dimensiones donde las interacciones entre las células de glioblastoma y macrófagos / microglía se pueden examinar de forma más directa. La extensión de la invasión de células de glioblastoma estimulada por macrophages / microglia en el ensayo 3D es comparable a lo que se ve usando el enfoque de la cámara recubierta matriz. Ensayos similares se desarrollaron previamente para estudiar las interacciones de carcinoma de mama con macrófagos durante la invasión 11-13. Ambos métodos descritos en este documento deben ayudar en la capacidad de diseccionar el mecanismo molecular (s) de macrófagos / microglia invasión estimulada de las células de glioblastoma.
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Protocol
1. etiquetado fluorescente de células
Líneas celulares de glioblastoma etiqueta y microglia con tintes fluorescentes 9: NOTA. Alternativamente, generar líneas celulares que expresan constitutivamente proteínas fluorescentes, tales como GFP / RFP como se describe en 14.
- células de la placa en una placa de 6 pocillos de tal manera que será de 70 - 80% de confluencia en el día de la tinción. Para la línea celular de glioblastoma murino GL261 y la línea celular de glioblastoma humano U87, placa 1 x 10 6 y 1,5 x 10 6 células, respectivamente, en una placa de 6 cm 24 horas antes de la tinción.
- Preparar la solución de tinte mancha de células fluorescentes en DMSO y añadir colorante 5 M a medios de comunicación, ya sea medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) o macrófagos medio libre de suero (MSFM) y agitar bien.
- Se incuban las células con colorante durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Retire los medios que contienen colorantes y añadir medio fresco (RPMI o MSFM) a las células.
- Se incuban las células durante 30 min. Nota: Las células son ahoramanchadas y listo para ser utilizado en el experimento.
Ensayo Matrix Cámara Coculture Invasion 2. Pre-revestido
- Diferenciar las células THP-1 utilizando acetato de forbol miristato (PMA) 15.
- Placa 2 - 3 x 10 5 THP-1 células en 1,5 ml de RPMI / 10% FBS en una placa de cultivo de 6 pocillos. Inmediatamente después de la siembra añadir 100 nM PMA y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
NOTA: Después de 48 horas, las células THP-1 que han superado con éxito la diferenciación van a ser adherente y se extendió a la parte inferior del pozo asumir una morfología redonda. - Retire PMA lavando una vez con PBS 1x y reemplazar con RPMI / FBS al 10%. Esperar otro 48 horas hasta que las células están listas para utilizar en el ensayo.
- Placa 2 - 3 x 10 5 THP-1 células en 1,5 ml de RPMI / 10% FBS en una placa de cultivo de 6 pocillos. Inmediatamente después de la siembra añadir 100 nM PMA y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
- Equilibrar cámaras de pre-recubiertas de matriz colocándolos en un pocillo que contiene 500 l de medio solo (sin suero) y la adición de 500 l de medio solo a la parte superior. Incubar las cámaras durante 2 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
Tabla de Materiales / Equipos. - Para separar suavemente las células (líneas celulares de glioblastoma marcados con fluorescencia y la microglía / macrófagos), quitar el medio de las células mediante aspiración. Lavar las células en un plato con 2 mM EDTA / PBS. Añadir 500 l de 2 mM EDTA / PBS y se incuba durante 5 a 10 min en un incubador de células a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Resuspender las células en 5 ml de medio que contiene 0,3% de albúmina sérica bovina (BSA).
- Centrifugar durante 5 min a 120 x g.
- Aspirar el sobrenadante y pellet se resuspende en medios BSA MSFM / 0,3% (para las células GL261 y microglia) o RPMI /% BSA 0,3 (para U87 y las células THP-1) tal que la concentración de células es igual a 1 x 10 6 células / ml . Use un hemocitómetro para contar las células.
- Añadir 500 l de medios / BSA al 0,3% por pocillo de placa de 24 pocillos.
- Retire el medio de cámaras que han sido equilibrada durante al menos 2 horas (paso 2.2). lugar chambers en pocillos que contiene 500 l de medios / BSA al 0,3% (paso 2.7).
- Si inhibidores se utilizan para estudiar su efecto sobre los macrófagos / microglia estimulados invasión glioma, añadir la concentración apropiada tanto a la parte inferior y la parte superior partes de la cámara.
NOTA: Las concentraciones de CSF-1R inhibidor usado para inhibir completamente microglia estimulado GL261 invasión glioblastoma se puede encontrar en la referencia 9. - En función de las líneas celulares utilizadas, añadir células a la cámara superior como se describe en los siguientes dos pasos: glioblastoma ratón (2.10.1) y glioblastoma humano (2.10.2).
- Mezclar 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) células (150 l) y 5 x 10 4 microglia ratón (50 l) (véase el paso 2.6 para los detalles de los medios). Se ajusta el volumen a 500 l mediante la adición de 300 l MSFM / BSA al 0,3%. Añadir la mezcla de células a la cámara superior y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
NOTA: microglia murino se aislaron de ratones recién nacidos como se describe in 1 6.
- Mezclar 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) células (150 l) y 5 x 10 4 microglia ratón (50 l) (véase el paso 2.6 para los detalles de los medios). Se ajusta el volumen a 500 l mediante la adición de 300 l MSFM / BSA al 0,3%. Añadir la mezcla de células a la cámara superior y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
Mezclar 7,5 x 10 4 U87 (glioblastoma) células (75 l) y 2,5 x 10 4 THP1 (macrófagos) células (25 l). Llevar a un volumen de 500 l mediante la adición de 400 l de RPMI / BSA al 0,3%. Añadir la mezcla de células a la cámara superior. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 24 hr.
- Después de la incubación, retirar las células de la parte superior de la cámara por aspiración suave y fijar mediante la colocación de cámaras en formaldehído al 3,7% en PBS. Permitir a cámaras permanezcan en fijador durante 15 min a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 ° C). Retire el fijador por aspiración suave y reemplazar con 500 l de PBS 1x. Pase a la sección 4 para el análisis de imágenes.
NOTA: Experimento puede ser pausado en este momento y se guarda para la formación de imágenes en 1x PBS. señales de tinte fluorescente puede detectarse por hasta 2 semanas después de la fijación.
3. Ensayo de Invasión "3D" -embedding glioma y macrófagos / microglía en Matrix
- mezcla matriz de descongelar a 4 ° C durante la noche. Realizar todas las manipulaciones adicionales utilizando la matriz en el hielo en la campana.
- Preparar 10 mg de concentración / ml de matriz en medios de comunicación (MSFM o RPMI) con 0,3% de BSA en hielo.
NOTA: concentración de la de la matriz es típicamente alrededor de 15 mg / ml. - Para preparar las células marcadas en el paso (1) para la suspensión en la matriz, quitar el medio de las células mediante aspiración. Lavar las células en un plato con 2 mM EDTA / PBS. Añadir 500 l de 2 mM EDTA / PBS a las células y se incuba durante 5 a 10 min en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Resuspender las células en 5 ml de medio que contiene 0,3% de BSA.
- Centrifugar durante 5 min a 120 x g.
- Aspirar el sobrenadante de pellet. Resuspender pellet en media / 0,3% BSA tal que la concentración de células es igual a 1 x 10 6 células / ml. Use un hemocitómetro para contar las células.
- Añadir 1,5 x 10 5 células GL261 (en 150 l) + 5 x 10 4 células de microglia (en 50 l) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.Añadir 2 x 10 5 células GL261 (200 l) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml por separado.
NOTA: GL261 células solo sin microglia sirve como control. - Centrifugar las células en microcentrífuga durante 5 min a 120 x g.
- Resuspender las células en 200 l de matriz fría en hielo.
- Plate 50 l (50.000 células) en el centro del compartimiento superior de 8 M inserto de la cámara de tamaño de poro.
- Incubar a 37 ° C durante 30 min para la polimerización que se produzca.
- Añadir 200 l de medio libre de suero a la cámara superior y que contiene medio de cultivo de células 700 de suero l al pocillo inferior.
- Incubar a 37 ° C, 5% de CO2 durante 48 hr.
- Después de la incubación, retirar las células de la parte superior de la cámara por aspiración suave y fijar mediante la colocación de cámaras en formaldehído al 3,7% en PBS. Permitir a cámaras permanezcan en fijador durante 15 min a temperatura ambiente (o durante la noche a 4 ° C). Retire el fijador por aspiración suave y reemplazar con 500 l de PBS 1x. Pase a la sección 4 foanálisis de imagen r.
4. Los ensayos Imaging
- Retire las cámaras de formaldehído al 3,7% y se lava bien en fresco que contiene 500 l de PBS 1x.
NOTA: No permita que las cámaras se sequen. - El uso de un aplicador de punta de algodón, limpiar suavemente las células no invasivas de la parte superior del filtro (lado dirigido hacia el interior de la cámara), raspando la superficie del filtro. Comience lentamente y aumentar gradualmente la presión. Haga esto por lo menos 3 veces por cámara.
- Colocar cámaras, ya sea en un plato con fondo de cristal o dejarlo en una placa de 24 pocillos.
- Coloque la muestra en el escenario de un microscopio de epifluorescencia o láser confocal de fluorescencia equipado con cámara y software de captura de imágenes 9,10.
- Tome varias 10X o 20X imágenes de campos representativos.
- El uso de un software de análisis de imágenes, tales como ImageJ, contar el número de células de glioblastoma que han atravesado el filtro a la parte inferior 9,10.
- Si obtención de imágenes del "3D. "Ensayo de invasión (descrito en el apartado 3), generar una serie de pila Z usando un láser fluorescente microscopio confocal 5-6 Para la imagen de la población de células invasoras en la parte inferior del filtro, siga el protocolo de los pasos 4.2 a 4.6 se ha descrito anteriormente.
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Representative Results
Utilizando los métodos descritos aquí, hemos demostrado que la microglia y macrófagos pueden estimular considerablemente la invasión de células de glioblastoma. Dos ensayos de invasión se emplean diferentes y se representan en la Figura 1. En la Figura 2, GL261 células que expresan constitutivamente la proteína fluorescente mCherry se sembraron en cámaras de pre-recubierto con y sin microglia por 48 hr. GL261 células fueron mínimamente invasivo por su propia cuenta sin embargo, cuando se cultivaron con microglia la capacidad invasiva aumentó aproximadamente 10 veces.
Observamos un efecto similar usando líneas celulares humanas. En la Figura 3, las células U87 (teñidas con verde 5-diacetato de clorometilfluoresceína (CMFDA)) muestra 5-6 invasión veces mayor cuando cocultivaron con células diferenciadas THP-1. THP-1 es una línea humana monocítica de células (derivado de un paciente con leucemia monocítica aguda) que puede ser differentiated en un estado similar a macrófagos utilizando acetato de forbol miristato (PMA) 15. Diferenciadas las células THP-1 muestran muchas de las características de los macrófagos humanos, tales como la secreción de citoquinas y la capacidad para llevar a cabo la fagocitosis.
Alternativamente, la invasión de células se puede medir mediante la incorporación en la matriz y chapado este directamente sobre el filtro en un inserto de la cámara. Laser microscopía confocal se puede usar para producir una serie de imágenes que produce una representación tridimensional (Z-pila). Similar a lo que se observa en el ensayo de cámara de matriz recubierto (que se muestra en las figuras 2-3), el co-cultivo de la microglia (teñido con CMPTX rojo) estimula las células GL261 (CMFDA verde) para invadir, medido por el número de células que han cruzado a la parte inferior del filtro (Figura 4). Este formato tiene la ventaja añadida de ser capaz de visualizar posibles interacciones célula-célula entre gliocélulas blastoma y microglia durante la invasión. De hecho, microglia parecen asociarse estrechamente con las células de glioma suspendidas en la matriz en 3D (Figura 5). Si sólo se requiere el análisis de punto final y un láser confocal no está disponible para su uso, las cámaras de los teléfonos se pueden limpiar como se describe para las cámaras con recubrimiento de la matriz. Entonces el número de las células restantes (invasoras) se puede determinar mediante el recuento utilizando imágenes obtenidas de un microscopio de epifluorescencia estándar. Película 1 muestra los tres montaje dimensional de un ensayo de este tipo.
Figura 1:. Esquemática de dos diferentes protocolos para el ensayo de microglía / macrófagos estimulada celular de glioblastoma Invasion El panel superior ilustra el ensayo pre-recubiertos invasión cámara de matriz (Sección 2). El panel inferior ilustra ensayo de invasión de la matriz 3D (Sección 3). Figura adaptada de9. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La microglía (MG) Mejorar GL261 glioblastoma invasión celular. (A) Imágenes representativas de la invasión de células GL261 (expresando mCherry) en ausencia (panel izquierdo; GL261 solo) o presencia de microglia (panel de la derecha; GL261 + MG) se combinaron y se sembraron en cámaras de matriz-revestido, seguido de incubación durante 48 hr y después la evaluación de la cantidad de células que han atravesado el filtro. Imágenes tomadas con el objetivo de 10X. Barra de escala = 400 M. (B) Cuantificación de ensayo contando sólo GL261 células invasoras (rojo). Los datos mostrados son la Media ± SEM de tres experimentos independientes. (C) Cuantificación de la invasión GL261 microglia estimulada en el presence inhibidores de gefitinib farmacológica (5 M), JNJ-28312141 (10 mM), PLX3397 (1 M), PLX5562 (1 M). Los datos mostrados son la Media ± SEM de seis experimentos independientes. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Los macrófagos THP1 Mejorar la invasión de células de glioblastoma U87. (A) Imágenes representativas de la invasión de células U87 teñidas con CMFDA verde plateado en cámaras de matriz recubierto solo (panel izquierdo; U87) o con macrófagos THP1 diferenciadas (panel derecho; U87 + THP1), seguido de incubación durante 24 horas y después la evaluación de el número de células que han atravesado el filtro. Las fotografías tomadas con un objetivo de 10X. Barra de nivel = 400 m. (B) Cuantificación de ensayo contando sóloU87 células invasoras (verde). Los datos mostrados son la Media ± SEM de diez experimentos independientes.
. O con microglia murino (; Figura 4. 3D Invasion ensayo de GL261 y Microglial Coculture (A) Las imágenes mostradas son proyecciones de una Z-serie de imágenes de células GL261 (teñidas con CMFDA verde) incrustados en la matriz solo (GL261 panel izquierdo) marcado con rojo CMPTX; panel de la derecha; GL261 + MG). El Z-proyecciones eran de la parte inferior 4 rebanadas de la pila de imágenes que abarca la parte inferior de la cámara de filtro y por lo tanto representa las células invasoras. Barra de escala = 200 M. (B) Cuantificación de las células GL261 (verde) determina que en la parte inferior del filtro tal como se describe anteriormente. Se determinó el número total de células GL261 invasores y normalizada a la de las células GL261 en monocultivo. Los datos mostrados representan la media ± SEM de 3 experimentos independientes realizados por duplicado (Figura adaptada de 10). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. Imagen de una rebanada dentro de la pila 3D de GL261 (verde) y microglía (rojo) Coculture incrustado en la matriz. GL261 y las interacciones de células microglia se resaltan con flechas blancas. Barra de escala = 100 mM.
Película 1:. Glioblastoma y microglia Interacción en 3D de rotación alrededor del eje X de una proyección 3D de todo serie Z de imágenes tomadas de GL261 (verde) y microglia (rojo) cocultivo incrustado en matrix. Las divisiones son de 5 micras incrementos. Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.
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Discussion
La naturaleza altamente invasiva de los astrocitomas de alto grado y el glioblastoma hacer estos cánceres cerebrales muy mortal. Por lo tanto, es de suma importancia para comprender los mecanismos moleculares y celulares de glioblastoma invasión. Se ha aprendido mucho sobre el proceso de invasión glioblastoma ya 17. El uso de los formatos de ensayo que se detallan en este documento, nuestro laboratorio ha demostrado, tanto en modelos de ratón y humanos que los macrófagos asociados a tumores pueden estimular la invasión de células de glioma de 5 - 10 veces. Este modelo de cocultivo replica fielmente la capacidad de las células de glioblastoma de interactuar físicamente con los macrófagos / microglia que permitiría paracrinos y juxtacrine interacciones (a través de los sistemas de ligando-receptor, tales como Notch-Delta y ephrin-Ephs) que están potencialmente implicadas en la comunicación bidireccional entre el las células tumorales y macrófagos. Otros formatos de ensayo que tratan de descubrir el efecto de los macrófagos en la invasión de células de glioma tienen típicamente las célulasfísicamente separados como los macrófagos se colocan en la parte inferior del pocillo y las células de glioblastoma están en la cámara de 3,4. En consecuencia, estos estudios muestran un aumento más modesto en la invasión glioma macrófagos estimulados (2 veces). Este ensayo de co-cultivo mejora en este efecto (5-10 veces) probable que indica la importancia de las interacciones juxtacrine durante macrófagos / microglia estimulados invasión glioblastoma.
El protocolo descrito en este documento implica varios pasos que deben realizarse cuidadosamente para lograr resultados satisfactorios. Si el experimento se llevó a cabo como se describe aquí y no se ven células invasoras, el colorante fluorescente puede que haya terminado lo que conducirá a la tinción muy débil o inexistente. Para los ensayos de invasión utilizando las cámaras de pre-revestido, es imprescindible el uso de cámaras de invasión frescas, que no han pasado la fecha de vencimiento y se han mantenido congelados todo el tiempo hasta la realización del experimento. Cámaras que se dejarona temperatura ambiente durante más de 12 horas se encontró que eran insatisfactorios en que la matriz de barrera ya no era intacto y células invadidas a una frecuencia mucho más alta de lo normal. Para el ensayo de 3D, es absolutamente crucial para mantener todas las pipetas y tubos en hielo. Si a temperatura ambiente durante un período de tiempo significativo, la matriz se polimerizará y no puede ser utilizado para volver a suspender las células en el mismo. Se recomienda que una pequeña bandeja llena de hielo se utiliza en la campana para contener todos los materiales que entrarán en contacto con la matriz. El protocolo puede ser modificado para incluir una mayor densidad celular, sin embargo, esto puede afectar a la duración del tiempo requerido para ver el efecto óptimo sobre la invasión glioma. Sería interesante ver si otros tipos de células pueden ser agregado en el ensayo de co-cultivo y qué efectos potenciales que pueden tener en la invasión. Por último, reconocemos que el microambiente del cerebro es único y difícil de reproducir in vitro. Una limitación de este protocolo es que la invasión chambers utilizados aquí carecen de los componentes típicos de cerebro normal que las células de glioblastoma se encontrará durante la invasión (es decir, neuronas densamente empaquetadas y astrocitos). Aunque con esta advertencia, el efecto estimulador de los macrófagos / microglia en este ensayo es consistente con lo que se observa in vivo y se puede utilizar para predecir que los inhibidores y / o proteínas pueden interferir con este proceso.
Imitando el microambiente tumoral en cultivo es una tarea de enormes proporciones dadas cuántos variada están presentes en los tumores en diversas etapas de malignidad tipos de células y proteínas de la matriz. Sin embargo, razonablemente exacta en modelos in vitro de la interacción con los componentes de tumor del microambiente facilitaría en gran medida el descubrimiento de nuevas vías terapéuticas. Ahora se apreciará que las células como los macrófagos juegan un papel crítico en varios aspectos asociados con la progresión hacia la malignidad incluyendo la angiogénesis, la invasión, la evasión inmune y la resistencia a los medicamentos. la cocensayo de invasión ULTURA descrito aquí utiliza la relación de las células tumorales a los macrófagos que se observa en los pacientes con glioblastomas de alto grado (aproximadamente 3: 1; 5). Se ha demostrado que la capacidad de macrófagos / microglia para estimular la invasión glioblastoma depende de CSF-1R y la señalización de EGFR como la inhibición farmacológica de estas vías utilizando JNJ-28312141, PLX3397 (CSF-1R) y gefitinib (EGFR) atenúa fuertemente el aumento 9 en la invasión. Además, usando el ensayo de matriz de embebido, se demostró que Semapimod, una pequeña molécula conocida para orientar los macrófagos y microglia, también puede bloquear microglia estimulado invasión glioblastoma 10. Los resultados de estos experimentos de cocultivo dieron el impulso para validar estos compuestos utilizando modelos in vivo. En consonancia con los datos de los ensayos in vitro descritos en el presente documento, el bloqueo de CSF-1R con el inhibidor de PLX3397 (que cruza la barrera hematoencefálica) bloqueado en gran medida lacapacidad de las células de glioma GL261 a la invasión en los cerebros de ratones C57BL / 6 9. Del mismo modo, Semapimod entregado en el cerebro ha demostrado inhibir la invasión y para crear sinergias con el tratamiento estándar de radiación en prolongar considerablemente la supervivencia de ratones portadores de tumores GL261 10. Ambos enfoques pueden resultar eficaces en la clínica.
Ahora es bien apreciará que el sistema de macrófagos es muy importante para la progresión de diversos cánceres a la malignidad 3-6, 11-13. Se ha establecido claramente en los modelos de mama y el cáncer cerebral que los macrófagos asociados a tumores son críticos para la invasión de células tumorales y la metástasis. Además, los macrófagos son probable que sea muy importante para la mediación de escape inmune como los macrófagos (y las células de linaje relacionados, tales como las células dendríticas) funcionan como células presentadoras de antígeno profesionales que orquestan la inmunidad adaptativa en respuesta a la infección 18. Ahora está claro que uno de los pH normalysiological funciones del sistema inmune adaptativo es prevenir la proliferación incontrolada mediante la destrucción de células aberrantes. Inmunidad hacia las células tumorales es probablemente debido al hecho de que la naturaleza altamente mutagénico de la célula de cáncer genera neo-antígenos que son reconocidos como extraños por el sistema inmune adaptativo. De hecho, el proceso de "evasión inmune" se postula a ser una parte importante de malignidad como las células cancerosas necesitan para evitar que el sistema inmune (en particular, los linfocitos citotóxicos, células asesinas naturales y macrófagos inflamatorios) de destruir el tumor. Se espera que el ensayo descrito en el presente documento se facilita el estudio de la interacción con los macrófagos glioblastoma y potencialmente permitir la expansión de los tipos de preguntas que podemos abordar sobre el cáncer maligno utilizando en ensayos de cultivo in vitro.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
