Abstract
Glioblastoma multiforme (grad IV gliom) är en mycket aggressiv human cancer med en medianöverlevnad på ett år efter diagnos. Trots ökad förståelse för de molekylära händelser som ger upphov till glioblastom, fortfarande denna cancer mycket okänsliga för konventionell behandling. Kirurgisk resektion av hjärntumörer hög kvalitet är sällan fullständigt på grund av den mycket infiltrativ natur glioblastomceller. Terapeutiska metoder som dämpar glioblastom cellinvasion är därför ett attraktivt alternativ. Vårt laboratorium och andra har visat att tumörassocierade makrofager och mikroglia (hjärn residenta makrofager) starkt stimulera glioblastom invasion. Protokollet som beskrivs i detta dokument används för att modellera glioblastom-makrofag / mikroglia interaktion med hjälp av in vitro-kulturanalyser. Detta tillvägagångssätt kan i hög grad underlätta utvecklingen och / eller upptäckt av läkemedel som stör kommunikationen med makrofager som möjliggör detta maligna behavior. Vi har etablerat två robusta coculture invasionsanalyser där mikroglia / makrofager stimulerar gliom cellinvasion av 5-10-faldigt. Glioblastomceller märkta med en fluorescerande markör eller konstitutivt uttrycker ett fluorescerande protein är pläterade utan och med makrofager / mikroglia på matrisbelagda polykarbonat kammarinsatser eller inbäddade i en tredimensionell matris. Cellinvasion bedöms genom användning av fluorescerande mikroskopi för att bilden och räkna endast invasiva celler på undersidan av filtret. Med hjälp av dessa analyser, flera farmakologiska hämmare (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib och Semapimod), har identifierats som blockerar makrofag / mikroglia stimulerade glioblastom invasion.
Introduction
Glioblastoma multiforme är en aggressiv human hjärncancer med en medianöverlevnad på ungefär 12 månader från tidpunkten för diagnos 1,2. Glioblastoma är en av de mest dödliga och kliniskt utmanande cancer som är refraktär mot befintliga cellgifter och kirurgisk resektion. Den diffusa karaktär glioblastom gör tumörceller att spridas över hela hjärnans normala göra avancerade tumör praktiskt taget omöjligt att kirurgiskt resect helt. Denna mycket invasiva aspekt är ett kännetecken inslag i glioblastom och andra avancerade astrocytom. Därför har fokus för mycket forskning varit på den molekylära mekanismen av glioblastom cellinvasion. Den glioblastom tumör mikro spelar viktiga roller i upprättandet malignitet 3-6. Tumörassocierade makrofager / mikroglia visade sig vara ansvarig för att främja glioblastom invasion 7,8. De flesta av dessa studier dock mätte effekten av makrofager / mikroglia med hjälp avanalyser som fysiskt skiljer dem från de glioblastomceller. Vårt laboratorium har som mål att generera förbättrade analyser som tillåter oss att studera hur glioblastom invasion är beroende av makrofager / mikroglia i samodlingar och göra det möjligt för oss att avbilda den fysiska interaktionen mellan dem under invasionen.
Klassiska analyser för att mäta cellinvasion inkluderar "standard" Boyden kammar kemotaxi och chemoinvasion format. Här de celler som skall studeras är pläterade i en plastkammare som innehåller ett polykarbonatfilter på undersidan som har porer med en viss storlek (i allmänhet mellan 0,4 och 8 ^ M i diameter). Processen för cellinvasion involverar en fysisk barriär, vanligtvis sammansatt av extracellulärt matrisprotein. I chemoinvasion analysen är den föredragna matrisen används Matrigel (hädanefter kallad "matris"), ett extracellulärt matrixprotein blandning utsöndras av Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus-sarkomceller och består till stor del av collagen typ IV och laminin. Kamrarna placeras sedan i en vävnadsodlingsbrunn som innehåller cellodlingsmedier med eller utan tillväxtfaktorer som misstänks för att stimulera invasionen. Celler som har en högre invasiv kapacitet kommer att invadera genom den extracellulära matrisen belagda filtret vid en högre frekvens och vidhäfta till undersidan av filtret. Vi har ändrat denna analys för att bedöma betydelsen av mikroglia och tumörassocierade makrofager på glioblastom cellinvasion.
Vi har kunnat fastställa att använda samodling analyser som beskrivits i detta dokument som mikroglia kan stimulera invasionen av två glioblastom cellinjer med 5-10-faldigt 9,10. Detta återspeglar vad som observerats i djurmodeller av glioblastoma. Dessutom har vi utvecklat en tredimensionell invasion analys där samspelet mellan glioblastomceller och makrofager / mikroglia kan undersökas direkt. Omfattningen av glioblastom cellinvasion stimuleras av macrophaGES / mikroglia i 3D-analysen är jämförbar med vad som ses med hjälp av matrisen belagda kammar strategi. Liknande analyser har tidigare utvecklats för att studera bröstkarcinom interaktioner med makrofager under invasion 11-13. Båda metoder som beskrivs i detta dokument bör stöd i förmågan att dissekera den molekylära mekanismen (er) av makrofag / mikroglia-stimulerad invasion av glioblastomceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fluorescerande märkning av celler
OBS: Label glioblastom-cellinjer och mikroglia med fluorescerande färgämnen 9. Alternativt generera cellinjer som konstitutivt uttrycker fluorescerande proteiner, såsom GFP / RFP som beskrivs i 14.
- Platt celler på en 6-brunnsplatta så att de kommer att vara 70 - 80% sammanflytande på dagen för färgning. För den murina glioblastomcellinje GL261 och human glioblastomcellinje U87, platta 1 x 10 6 och 1,5 x 10 6 celler, respektive på en 6 cm skål 24 h före färgning.
- Förbered fluorescerande cell fläck färgämneslösningen i DMSO och tillsätt 5 iM färgämne media, antingen Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) eller Macrophage serumfritt medium (MSFM), virvel väl.
- Inkubera cellerna med färgämnet under 30 min vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ta bort färg innehåller media och tillsätt färskt medium (RPMI eller MSFM) till cellerna.
- Inkubera cellerna i 30 min. Obs: Celler är nufärgade och redo att användas i experiment.
2. Pre-belagda Matrix avdelningen Coculture Invasion analys
- Differentiera THP-1-celler med användning av forbolmyristatacetat (PMA) 15.
- Plate 2 - 3 x 10 5 THP-1-celler i 1,5 ml RPMI / 10% FBS i en 6-brunnars odlingsplatta. Omedelbart efter plätering tillsätt 100 nM PMA och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 48 timmar.
OBS: Efter 48 timmar, kommer THP-1-celler som framgångsrikt har genomgått differentiering vara vidhäftande och spred sig till botten av brunnen med på en runda morfologi. - Ta PMA genom att tvätta en gång med 1x PBS och ersätta med färsk RPMI / 10% FBS. Vänta ytterligare 48 timmar tills cellerna är redo att använda i analysen.
- Plate 2 - 3 x 10 5 THP-1-celler i 1,5 ml RPMI / 10% FBS i en 6-brunnars odlingsplatta. Omedelbart efter plätering tillsätt 100 nM PMA och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 48 timmar.
- Jämvikta matris förbelagd kamrar genom att placera dem i en brunn som innehåller 500 | il av media enbart (inget serum) och tillsats av 500 pl av media enbart till toppen. Inkubera kammare under 2 h vid 37 ° C och 5% CO2.
tabell of Materials / utrustning. - Försiktigt loss celler (fluorescerande glioblastom cellinjer och mikroglia / makrofager), ta bort media från celler genom aspiration. Tvätta cellerna på skålen med 2 mM EDTA / PBS. Tillsätt 500 pl av 2 mM EDTA / PBS och inkubera i 5 - 10 min i en cellinkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Resuspendera cellerna i 5 ml medium innehållande 0,3% bovint serumalbumin (BSA).
- Centrifugera i 5 minuter vid 120 x g.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera pelleten i MSFM / 0,3% BSA-medium (för GL261 celler och mikroglia) eller RPMI / 0,3% BSA (för U87 och THP-1-celler) så att koncentrationen av celler är lika med 1 x 10 6 celler / ml . Använda en hemocytometer för att räkna cellerna.
- Tillsätt 500 | il medium / 0,3% BSA per brunn av 24-brunnsplatta.
- Ta bort media från kamrarna som har bringats till jämvikt i minst 2 h (steg 2,2). plats chambers i brunn innehållande 500 l media / 0,3% BSA (steg 2,7).
- Om hämmare används för att studera deras effekt på makrofager / mikroglia stimulerade gliom invasion, tillsätt lämplig koncentration till både undre och övre delarna av kammaren.
ANMÄRKNING: Halterna av CSF-1R hämmare som använts för att inhibera mikroglia fullt stimulerat GL261 glioblastom invasion kan hittas i referens 9. - Beroende på de cellinjer som används, tillsätt celler till den övre kammaren, såsom beskrivs i de följande två steg: mus glioblastom (2.10.1) och humant glioblastom (2.10.2).
- Blanda 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastom) celler (150 pl) och 5 x 10 4 mus mikroglia (50 ^) (se steg 2,6 för medieinformation). Bringa volymen till 500 | j, l genom tillsats av 300 | j, l MSFM / 0,3% BSA. Lägg cellblandningen till den övre kammaren och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 48 timmar.
OBS: Murin mikroglia isoleras från neonatala möss som beskrivs in en sex.
- Blanda 1,5 x 10 5 GL261 (glioblastom) celler (150 pl) och 5 x 10 4 mus mikroglia (50 ^) (se steg 2,6 för medieinformation). Bringa volymen till 500 | j, l genom tillsats av 300 | j, l MSFM / 0,3% BSA. Lägg cellblandningen till den övre kammaren och inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 48 timmar.
Blanda 7,5 x 10 4 U87 (glioblastom) celler (75 | il) och 2,5 x 10 4 THP1 (makrofag) celler (25 ^). Ta volym i 500 pl genom att tillsätta 400 pl RPMI / 0,3% BSA. Lägga cellblandningen till den övre kammaren. Inkubera cellerna vid 37 ° C, 5% CO2 under 24 timmar.
- Efter inkubation, avlägsna celler från toppen av kammaren genom försiktig aspiration och åtgärda kammare genom att placera i 3,7% formaldehyd i PBS. Tillåta kamrarna att stanna kvar i fixeringsmedel under 15 min vid rumstemperatur (eller över natt vid 4 ° C). Ta bort fixativ genom försiktig uppsugning och ersätta med 500 mikroliter 1x PBS. Gå vidare till avsnitt 4 för bildanalys.
OBS: Experiment kan pausas vid denna tidpunkt och sparas för avbildning i 1x PBS. Fluorescerande färgämnessignaler kan detekteras i upp till 2 veckor efter fixering.
3. Invasion analys "3D" -embedding Gliom och makrofager / mikroglia i Matrix
- Tina matris blandning vid 4 ° C över natten. Utför alla ytterligare manipulationer använder matris på is i huven.
- Förbered 10 mg / ml koncentration av matris i media (MSFM eller RPMI) med 0,3% BSA på is.
OBS: Stock koncentration av matrisen är typiskt omkring 15 mg / ml. - För att framställa celler (märkta i steg 1) för suspension i matris, avlägsna media från celler genom aspiration. Tvätta cellerna på skålen med 2 mM EDTA / PBS. Tillsätt 500 pl av 2 mM EDTA / PBS till cellerna och inkubera i 5 - 10 min i inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Resuspendera cellerna i 5 ml medium innehållande 0,3% BSA.
- Centrifugera i 5 minuter vid 120 x g.
- Sug ut supernatant från pellet. Resuspendera pelleten i media / 0,3% BSA så att koncentrationen av celler är lika med 1 x 10 6 celler / ml. Använda en hemocytometer för att räkna cellerna.
- Tillsätt 1,5 x 10 5 GL261 celler (i 150 pl) + 5 x 10 4 mikroglia-celler (i 50 ul) i ett 1,5 ml mikrofugrör.Tillsätt 2 x 10 5 GL261 celler (200 pl) i en separat 1,5 ml mikrofugrör.
OBS: ensam utan mikroglia GL261 celler fungerar som en kontroll. - Spin-celler i mikrofug under 5 min vid 120 x g.
- Resuspendera cellerna i 200 pl kall matris på is.
- Plattan 50 | il (50000 celler) på mitten av den övre avdelningen av 8 pM porstorlek kammaren insatsen.
- Inkubera vid 37 ° C under 30 min för polymerisation skall inträffa.
- Tillsätt 200 | il serumfritt medium till den övre kammaren och 700 | j, l serum innehållande celltillväxtmedium till den undre brunn.
- Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2 under 48 timmar.
- Efter inkubation, avlägsna celler från toppen av kammaren genom försiktig aspiration och åtgärda kammare genom att placera i 3,7% formaldehyd i PBS. Tillåta kamrarna att stanna kvar i fixeringsmedel under 15 min vid rumstemperatur (eller över natt vid 4 ° C). Ta bort fixativ genom försiktig uppsugning och ersätta med 500 mikroliter 1x PBS. Gå vidare till avsnitt 4 for bildanalys.
4. Bild Analyser
- Ta kammare från 3,7% formaldehyd och tvätta i brunn innehållande färsk 500 l 1x PBS.
OBS: Låt inte kamrarna torka. - Med användning av en bomulls tippas applikatorn, försiktigt rengöra icke-invasiva cellerna från den övre delen av filtret (sidan som vetter mot insidan av kammaren) genom skrapning filterytan. Börja försiktigt och öka trycket gradvis. Gör detta minst 3 gånger per kammare.
- Placera kammare i antingen en glasbottnad skål eller lämna in en platta med 24 brunnar.
- Placera provet på scenen av en epifluorescent eller laser konfokal fluorescensmikroskop utrustad med kamera och bildbehandlingsprogrammet 9,10.
- Ta flera 10X eller 20X bilder av representativa fält.
- Användning av ett bildanalysprogram, såsom ImageJ, räkna antalet glioblastomceller som har passerat filtret på undersidan 9,10.
- Om avbildning av "3D. "Invasionsanalys (beskrivs i avsnitt 3), generera en Z stack serie med hjälp av en fluorescerande laser konfokalmikroskop 5-6 att avbilda invasiv cellpopulationen på undersidan av filtret, följa protokollet steg 4,2-4,6 beskrivits ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med användning av metoderna som beskrivs här, har vi visat att mikroglia och makrofager väsentligt kan stimulera glioblastom cellinvasion. Två olika invasionsanalyser är anställd och är avbildade i figur 1. I figur 2, var GL261 celler som konstitutivt uttrycker det fluorescerande proteinet mCherry pläterade på förbelagda kammare med och utan mikroglia under 48 timmar. GL261 celler var minimalinvasiv på egen hand men när de odlas med mikroglia den invasiva kapacitet ökat med cirka 10 gånger.
Vi observerar en liknande effekt med användning av humana cellinjer. I figur 3, U87-celler (färgade med 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) grön) visar 5-6 gånger högre invasion när samodlades med differentierade THP-1-celler. THP-1 är en human monocytisk cellinje (härledd från en akut monocytisk leukemipatient) som kan vara differentiated in i en makrofag-liknande tillstånd med användning av forbolmyristatacetat (PMA) 15. Differentierade THP-1-celler uppvisar många av egenskaperna hos humana makrofager såsom cytokinutsöndring och förmåga att utföra fagocytos.
Alternativt kan cellinvasion mätas genom att bädda in dem i matrisen och plätering detta direkt på filtret i en kammare insats. Laser konfokal mikroskopi kan användas för att producera en serie av bilder som bildar en tredimensionell representation (Z-stack). Liknar vad som observeras i matrisen belagda kammare analysen (som visas i figurerna 2-3), samodlingen av mikroglia (färgade med CMPTX röd) stimulerar GL261 celler (CMFDA grön) att invadera mätt genom antalet celler som har passerat till undersidan av filtret (figur 4). Detta format har den ytterligare fördelen av att kunna visualisera potentiella cell-cell interaktioner mellan glioblastoma celler och mikroglia under invasion. I själva verket, mikroglia verkar nära associera med gliomceller suspenderade i 3D matrix (Figur 5). Om bara endpoint analys krävs och en laser konfokal finns inte tillgängligt för användning, kan cellkamrarna rengöras såsom beskrivits för matrisbelagda kamrarna. Sedan antalet av de återstående (invasiva) celler kan bestämmas genom att räkna med användning av bilder som erhålls från en standard epifluorescent mikroskop. Film 1 visar den tredimensionella montering av en sådan analys.
Figur 1:. Schematisk bild av två olika protokoll för att analysera mikroglia / makrofager stimulerade Glioblastoma Cell Invasion Top panel visar förbelagt matriskammaren invasionsanalys (avsnitt 2). Bottenpanelen visar 3D matrix invasion analys (avsnitt 3). Figur anpassad från9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mikroglia (MG) Förbättra GL261 Glioblastoma Cell Invasion. (A) Representativa bilder av invaderande GL261 celler (som uttrycker mCherry) i frånvaro (vänstra panelen, GL261 enbart) eller närvaro av mikroglia (högra panelen, GL261 + MG) förenades och ströks ut på matrisbelagda kammare, följt av inkubation under 48 h och sedan utvärdering av antalet celler som har passerat filtret. Bilder som tagits med 10X objektivet. Skalstreck = 400 | iM. (B) Kvantifiering av analysen räknar endast invasiva GL261 celler (röd). Data som visas är medelvärden ± SEM från tre oberoende experiment. (C) Kvantifiering av mikroglia-stimulerad GL261 invasion i presence farmakologiska hämmare gefitinib (5 M), JNJ-28.312.141 (10 M), PLX3397 (1 M), PLX5562 (1 M). Data som visas är medelvärden ± SEM från sex oberoende experiment. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. THP1 Makrofager Förbättra U87 Glioblastoma Cell Invasion. (A) Representativa bilder av invaderande U87 celler färgade med CMFDA grön pläterade på matrisbelagda kamrarna enbart (vänster fält, U87) eller med differentierade THP1 makrofager (högra panelen; U87 + THP1), följt av inkubation under 24 h och sedan utvärdering av antalet celler som har passerat filtret. Bilder tagna med en 10X objektiv. Skala bar = 400 | iM. (B) Kvantifiering av analysen räknar endastinvasiva U87-celler (grön). Data som visas är medelvärden ± SEM från tio oberoende experiment.
. Figur 4. 3D Invasion Analys av GL261 och mikroglia Coculture (A) Bilder visas är projektioner från en Z-serie bilder av GL261 celler (färgade med CMFDA grön) inbäddade i matris ensam (vänstra panelen, GL261) eller med mus mikroglia ( märkt med CMPTX röda, högra panelen, GL261 + MG). Z-projektioner var av de nedersta 4 segment av den bildstapel som omfattar botten av kammaren filtret, och motsvarar därför invasiva celler. Skalstreck = 200 | iM. (B) Kvantifiering av GL261 celler (gröna) bestämdes vara på undersidan av filtret, såsom beskrivits ovan. Det totala antalet invaderande GL261 celler bestämdes och normaliserades till den hos GL261 celler i monokultur. Data som visas representerar medelvärden ± SEM 3 oberoende experiment, utförda i duplikat (figur anpassad från 10). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Bild från en skiva i 3D Stack av GL261 (grön) och mikroglia (röd) Coculture Inbäddad i Matrix. GL261 och mikroglia cellinteraktioner markeras med vita pilar. Skalstreck = 100 | iM.
Film 1:. Glioblastoma och mikroglia interaktion i 3D rotation kring X-axeln av en 3D-projektion av hela Z-serien av bilder tagna från GL261 (grön) och mikroglia (röd) samodling inbäddad i matrix. Skivor är i 5 iM steg. Klicka här för att se filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den mycket invasiva karaktär av hög kvalitet astrocytom och glioblastom gör dessa hjärncancer mycket dödliga. Det är därför av största vikt att förstå de molekylära och cellulära mekanismer av glioblastoma invasion. Mycket har lärt sig om processen med glioblastom invasion redan 17. Använda analysformat som beskrivs i detta dokument, har vårt laboratorium visat i både mus och humana modeller som tumörassocierade makrofager kan stimulera gliom cellinvasion av 5-10-faldigt. Detta samodling modell replikerar troget förmåga glioblastomceller att fysiskt interagera med makrofager / mikroglia som skulle göra det möjligt för parakrina och juxtacrine interaktioner (via ligand-receptorsystem såsom Notch-Delta och ephrin-Ephs) som potentiellt är involverade i dubbelriktad kommunikation mellan tumörceller och makrofager. Andra analysformat som syftar till att upptäcka effekten av makrofager på gliom cellinvasion har typiskt cellernafysiskt separerade eftersom makrofagerna stryks ut på botten av brunnen och de glioblastomceller är på kammar 3,4. Följaktligen dessa studier visar en mer blygsam ökning av makrofag-stimulerad gliom invasion (2 gånger). Detta samodling analys förbättrar denna effekt (5-10 gånger) sannolikt om vikten av juxtacrine interaktioner under makrofag / mikroglia stimulerade glioblastom invasion.
Det protokoll som beskrivs i detta dokument innefattar flera steg som måste utföras noggrant för att uppnå tillfredsställande resultat. Om experimentet utförs som beskrivs här och inga invaderande celler förekommer, kan det fluorescerande färgämnet ha löpt ut, som kommer att leda till mycket svag eller obefintlig färgning. För invasionsanalyser med hjälp av pre-belagda kammare, är det viktigt att använda färska invasionskammare som inte efter utgångsdatum och har hållits fryst hela tiden fram till att utföra experiment. Chambers som lämnadesvid rumstemperatur i över 12 h befanns vara otillfredsställande i att matrisbarriären inte längre var intakt och celler invaderat vid en mycket högre frekvens än normalt. För 3D-analys, är det absolut nödvändigt att hålla alla pipetter och rör på is. Om vid rumstemperatur under en avsevärd tid, kommer matrisen polymerisera och kan inte användas för att resuspendera cellerna i den. Det rekommenderas att en liten bricka fylld med is används i huven för att hålla alla material som kommer att komma i kontakt med matrisen. Protokollet kan modifieras för att inkludera en högre celltäthet, men detta kan påverka hur lång tid som krävs för att se optimal effekt på gliom invasion. Det skulle vara intressant att se om andra celltyper kan läggas till i samodlingen analysen och vilken potential effekter de kan ha på invasion. Slutligen, vi erkänner att hjärnmikro är unik och svår att replikera in vitro. En begränsning av detta protokoll är att invasionen chbärnsten som används här saknar de typiska komponenterna i normal hjärna som glioblastomceller kommer att stöta på under invasion (dvs, tätt packade neuroner och astrocyter). Även med denna varning, den stimulerande effekten av makrofager / mikroglia i denna analys är i linje med vad som observerats in vivo och kan användas för att förutsäga vilka hämmare och / eller proteiner kan störa denna process.
Imitera tumörmikro i kultur är en svår uppgift med tanke på hur många olika celltyper och matrixproteiner förekommer i tumörer i olika stadier av malignitet. Ändå rimligt exakt in vitro-modeller av tumör interaktion med komponenter i mikro skulle i hög grad underlätta upptäckten av nya terapeutiska vägar. Det är nu uppenbart att celler såsom makrofager spelar en avgörande roll i flera avseenden i samband med progression till malignitet inklusive angiogenes, invasion, immun skatteflykt och läkemedelsresistens. COCulture invasion analys som beskrivs här använder förhållandet av tumörceller till makrofager som observerats hos patienter med hög kvalitet glioblastom (cirka 3: 1, 5). Det har visat sig att förmågan hos makrofager / mikroglia att stimulera glioblastom invasion är beroende av CSF-1R och EGFR-signalering som farmakologisk hämning av dessa vägar med användning av JNJ-28312141, PLX3397 (CSF-1R) och gefitinib (EGFR) dämpar kraftigt ökningen i invasion 9. Dessutom använder den inbäddade matrisanalys, visades att Semapimod, en liten molekyl känd för att rikta makrofager och mikroglia, kan också blockera mikroglia stimulerade glioblastom invasion 10. Resultat från dessa samodling experiment gav impulser för att validera dessa föreningar med användning av in vivo-modeller. I överensstämmelse med data från in vitro-analyser som beskrivs i detta dokument, blockad av CSF-1R med inhibitorn PLX3397 (som korsar blod-hjärnbarriären) till stor del blockeradeförmågan hos GL261 gliomceller att invadera i hjärnan hos C57BL / 6-möss 9. På liknande sätt, Semapimod levereras in i hjärnan visades inhibera invasion och för att samverka med standardstrålningsbehandling i hög grad förlänga överlevnaden hos möss som härbärgerar GL261 tumörer 10. Båda dessa tillvägagångssätt kan visa sig vara effektiva i kliniken.
Det är nu väl uppskattat att makrofagen systemet är mycket viktigt för utvecklingen av olika cancerformer till malignitet 3-6, 11-13. Det har tydligt framgår modeller bröst- och hjärncancer att tumörassocierade makrofager är avgörande för tumörcellinvasion och metastas. Dessutom, makrofager kommer sannolikt att vara mycket viktigt för att medla immun flykt som makrofager (och celler av tillhörande härkomst, t.ex. dendritiska celler) fungerar som professionella antigenpresenterande celler som orkestrera adaptiv immunitet som svar på infektion 18. Det är nu klart att en av den normala physiological funktioner adaptiva immunsystemet är att förhindra okontrollerad spridning genom att förstöra avvikande celler. Immunitet mot tumörcellerna beror sannolikt på det faktum att den mycket mutagena naturen hos cancercellen genererar neo-antigener som känns igen som främmande av det adaptiva immunsystemet. Faktum är att processen av "immun skatteflykt" antas vara en viktig del av malignitet som cancerceller behöver för att förhindra immunsystemet (i synnerhet cytotoxiska lymfocyter, naturliga mördarceller och inflammatoriska makrofager) från att förstöra tumören. Förhoppningen är den analys som beskrivs i detta dokument kommer att underlätta studier av glioblastom interaktion med makrofager och potentiellt tillåta utbyggnaden av de typer av frågor som vi kan ta itu med om elakartad cancer med odling in vitro-analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5 M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
References
- Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82 (10), 1271-1286 (2007).
- Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21 (21), 2683-2710 (2007).
- Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60 (3), 502-514 (2012).
- Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14 (8), 958-978 (2012).
- Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81 (3), 447-455 (2005).
- Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59 (3), 472-485 (2011).
- Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103 (4), 351-355 (2002).
- Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27 (7), 918-930 (2008).
- Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
- Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9 (5), (2014).
- Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65 (12), 5278-5283 (2005).
- House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50 (32), 6920-6932 (2011).
- Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173 (3), 395-404 (2006).
- Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13 (1), 34-37 (2003).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16 (3), 320-344 (1998).
- Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32 (7-8), 372-380 (2013).
- See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123 (3), 405-412 (2015).
