Coculture Analyser å studere macrophage og Microglia Stimulering av Glioblastoma Invasion

Abstract

Glioblastoma multiforme (grad IV gliomer) er en svært aggressiv kreft hos mennesker med en median overlevelse på ett år etter diagnose. Til tross for økt forståelse for de molekylære hendelser som gir opphav til glioblastomas, fortsatt denne kreftformen svært motstandsdyktig for konvensjonell behandling. Kirurgisk reseksjon av hjernesvulster høy klasse er sjelden fullstendig på grunn av den svært infiltrerende natur glioblastom celler. Terapeutiske tilnærminger som demper glioblastom celle invasjon er derfor et attraktivt alternativ. Vårt laboratorium og andre har vist at tumor assosiert makrofager og microglia (bosatt hjernemakrofager) sterkt stimulere glioblastom invasjon. Protokollen som er beskrevet i dette dokumentet brukes til å modellere glioblastom-makrofag / mikroglia interaksjon ved hjelp av in vitro kulturanalyser. Denne tilnærmingen kan i stor grad legge til rette for utvikling og / eller funn av narkotika som forstyrrer kommunikasjonen med makrofagene som gjør at dette ondartet Behavior. Vi har etablert to robuste coculture invasjon analyser hvor microglia / makrofager stimulerer glioma celle invasjon av 5-10 ganger. Glioblastom celler merket med et fluoriserende fargestoff eller som konstitutivt uttrykker et fluorescent protein er belagt uten og med makrofager / mikroglia på matrise-belagt polykarbonat kammerinnsatser eller innleiret i en tredimensjonal matrise. Celle invasjon bestemmes ved hjelp av fluorescens mikroskopi av bildet og telle bare invaderende celler på undersiden av filteret. Ved hjelp av disse analysene, flere farmakologiske hemmere (JNJ-28312141, PLX3397, Gefitinib, og Semapimod), har blitt identifisert som blokkerer makrofag / microglia stimulert glioblastom invasjon.

Introduction

Glioblastoma multiforme er en aggressiv menneskelige hjernekreft med en median overlevelse på ca 12 måneder fra tidspunktet for diagnosen ^1,2. Glioblastom er en av de mest dødelige og klinisk utfordrende kreft som det ikke kan behandles med standard kjemoterapi og kirurgisk reseksjon. Den diffuse natur glioblastom gjør kreftceller sprer seg i hele normal hjerne gjør avansert tumor praktisk talt umulig å kirurgisk resect helt. Denne svært invasiv aspektet er et kjennetegn trekk ved glioblastom og andre avanserte astrocytomas. Derfor har fokuset for mye forskning vært på den molekylære mekanismen for glioblastom celle invasjon. Den glioblastom svulsten mikromiljøet spiller viktige roller i å etablere malignitet ^3-6. Tumorassosierte makrofager / microglia ble vist å være ansvarlig for å fremme glioblastom invasjon ^7,8. De fleste av disse studiene imidlertid målt effekt av makrofager / mikroglia ved hjelpanalyser som fysisk skiller dem fra glioblastom celler. Vårt laboratorium har satt ut for å generere bedre analyser som tillater oss å studere hvordan glioblastom invasjon er avhengig av makrofager / microglia i cocultures og gjøre oss i stand til å avbilde fysisk interaksjon mellom dem under invasjonen.

Klassiske analyser for å måle celle invasjon inkludere "standard" Boyden kammer kjemotakse og chemoinvasion formater. Her cellene som skal studeres blir sådd ut i en plastkammer som inneholder et polykarbonatfilter i bunnen som har porer med en bestemt størrelse (generelt mellom 0,4 og 8 um i diameter). Prosessen med celle invasjon innebærer en fysisk barriere, vanligvis sammensatt av ekstracellulær matriks protein. I chemoinvasion assay er den foretrukne matrisen som anvendes er Matrigel (heretter referert til som "matrise"), en ekstracellulær matriks proteinblanding som utskilles av Engelbreth-Holm-sverm (HMS) mus sarkomceller og består i hovedsak av collagen type IV og laminin. Kamrene blir deretter plassert i en vevskultur vel som inneholder cellekulturmedium med eller uten vekstfaktorer som er mistenkt for å stimulere invasjon. Celler som har en høyere kapasitet invasiv skal trenge gjennom den ekstracellulære matriks belagt filter ved en høyere frekvens og holder seg til undersiden av filteret. Vi har endret dette assay for å vurdere rollen til mikroglia og tumorassosierte makrofager på glioblastoma celle invasjon.

Vi har vært i stand til å bestemme ved hjelp av coculture testene beskrevet i dette papir som mikroglia kan stimulere invasjonen av to glioblastoma cellelinjer ved 5 - 10 ganger ^9,10. Dette skyldes hva som er observert i dyremodeller av glioblastom. Videre har vi utviklet en tredimensjonal invasjon analysen hvor samspillet mellom glioblastom celler og makrofager / microglia kan undersøkes mer direkte. Omfanget av glioblastom celle invasjon stimuleres av macrophages / mikroglia i 3D-analysen er sammenlignbare med det som er sett ved hjelp av matrisen belagt kammeret tilnærming. Lignende analyser ble tidligere utviklet for å studere brystkreft interaksjoner med makrofager under invasjonen ^11-13. Begge metodene er beskrevet i dette dokumentet skal hjelpe til med evnen til å dissekere den molekylære mekanisme (r) for makrofag / mikroglia-stimulert invasjon av glioblastom celler.

Protocol

1. Fluorescent Merking av celler

MERK: Etikett glioblastom cellelinjer og microglia med fluorescerende fargestoffer ^9. Alternativt kan generere cellelinjer som konstitutivt uttrykker fluorescerende proteiner slik som GFP / RFP som beskrevet i ^14.

1. Plate-celler på en 6 brønners plate, slik at de vil utgjøre 70 - 80% sammenflytende på dagen for farging. For den murine glioblastoma cellelinje GL261 og human glioblastoma cellelinje U87, platen 1 x 10 ⁶ og 1,5 x 10 ⁶ celler, henholdsvis på en 6 cm plate 24 timer før farging.
2. Forbered fluorescerende celle flekken fargeløsning i DMSO og legge til 5 mikrometer fargestoff til media, enten Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) eller macrophage Serum Gratis Medium (MSFM), Vortex godt.
3. Inkuber cellene med fargestoff i 30 minutter ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Fjern dye inneholder media og tilsett frisk media (RPMI eller MSFM) til cellene.
5. Inkuber cellene i 30 min. Merk: Cellene er nåfarget og klar til å bli brukt i eksperimentet.

2. Pre-belagt Matrix Chamber coculture invasjon analysen

1. Differensiere THP-1-celler ved hjelp av forbolmyristatacetat (PMA) ^15.
   1. Plate 2 - 3 x 10 ⁵ THP-1-celler i 1,5 ml RPMI / 10% FBS i en 6 brønners kulturplate. Umiddelbart etter plating tilsettes 100 nM PMA og inkuber ved 37 ° C, _5% CO2 i 48 timer.
      MERK: Etter 48 timer, vil THP-1 celler som har blitt gjennomgått differensiering være tilhenger og spredte seg til bunnen av brønnen tar på seg en runde morfologi.
   2. Fjern PMA ved å vaske en gang med 1x PBS og erstatte med frisk RPMI / 10% FBS. Vent en annen 48 timer før cellene er klar til bruk i analysen.
2. Ekvilibrere matrise pre-belagte kamrene ved å plassere dem i en brønn som inneholder 500 ul media alene (uten serum) og tilsetning av 500 ul av mediet alene til toppen. Inkuber kamre i 2 timer ved 37 ° C og _5% CO2.
   tabell for material / utstyr.
3. Å forsiktig løsne celler (fluorescensmerkede glioblastom cellelinjer og microglia / makrofager), fjerne media fra cellene ved aspirasjon. Vask cellene på fatet med 2 mM EDTA / PBS. Legg 500 pl 2 mM EDTA / PBS og inkuberes i 5 - 10 min i en celleinkubator ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Resuspender celler i 5 ml av medium inneholdende 0,3% bovint serumalbumin (BSA).
5. Sentrifuger i 5 min ved 120 x g.
6. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i MSFM / 0,3% BSA media (for GL261 celler og mikroglia) eller RPMI / 0,3% BSA (for U87 og THP-1-celler) slik at konsentrasjonen av celler er lik 1 x 10 ⁶ celler / ml . Bruk en hemocytometer å telle cellene.
7. Legg 500 mL media / 0,3% BSA per brønn av 24 brønners plate.
8. Ta ut mediet fra kammer som er i likevekt i minst 2 timer (trinn 2.2). Place chambers i tillegg inneholder 500 mL media / 0,3% BSA (trinn 2.7).
9. Hvis inhibitorer blir brukt til å undersøke deres effekt på makrofag / mikroglia stimulert glioma invasjon, tilsett passende konsentrasjon til både den nedre og øvre partier av kammeret.
   MERK: Konsentrasjonene av CSF-1R hemmer som brukes til å fullt hemme microglia stimulert GL261 glioblastom invasjon kan bli funnet i referanse ^9.
10. Avhengig av cellelinjer som benyttes, legger celler til toppen kammer som beskrevet i de neste to trinn: mus glioblastom (2.10.1) og menneskelig glioblastom (2.10.2).
    1. Bland 1,5 x 10 ⁵ GL261 (glioblastom) celler (150 mL) og 5 x 10 ⁴ mus microglia (50 pl) (se trinn 2.6 for medie detaljer). Bringe volumet til 500 pl ved tilsetning av 300 ul MSFM / 0,3% BSA. Legg celleblanding til den øverste kammeret og inkuber ved 37 ° C, _5% CO2 i 48 timer.
       MERK: Murine microglia er isolert fra neonatale mus som beskrevet in ^{1 6.}

Bland 7,5 x 10 ⁴ U87 (glioblastom) celler (75 mL) og 2,5 x 10 ⁴ THP1 (makrofag) celler (25 mL). Ta med volum på 500 mL ved å tilsette 400 ul RPMI / 0,3% BSA. Legg celleblandingen på toppen kammeret. Inkuber cellene ved 37 ° C, _5% CO2 i 24 timer.

1. Etter inkubasjon fjerne celler fra toppen av kammeret ved forsiktig aspirasjon og fikse kamre ved å plassere i 3,7% formaldehyd i PBS. Tillat kamre for å forbli i fiksativ i 15 minutter ved romtemperatur (eller over natten ved 4 ° C). Fjern fiksativ ved forsiktig aspirasjon og erstatte med 500 mL 1x PBS. Fortsett til avsnitt 4 for bildeanalyse.
   MERK: Eksperimenter kan bli stanset i dette øyeblikk og lagret for bildebehandling i 1x PBS. Fluorescerende fargestoff signaler kan detekteres i opptil 2 uker etter fiksering.

3. Invasjon analysen "3D" -embedding Glioma og makrofager / Microglia i Matrix

1. Tine matrix mix ved 4 ° C over natten. Utfør alle videre manipulasjoner ved hjelp av matrise på is i panseret.
2. Fremstille 10 mg / ml konsentrasjon av matrisen i media (MSFM eller RPMI) med 0,3% BSA på is.
   MERK: Stock konsentrasjon av matrisen er typisk rundt 15 mg / ml.
3. For å forberede celler (merket i trinn 1) for suspensjon i matrise, fjerne media fra cellene ved aspirasjon. Vask cellene på fatet med 2 mM EDTA / PBS. Legg 500 pl 2 mM EDTA / PBS til cellene og inkuberes i 5 - 10 min i inkubator ved 37 ° C og _5% CO2.
4. Resuspender celler i 5 ml av medium inneholdende 0,3% BSA.
5. Sentrifuger i 5 min ved 120 x g.
6. Aspirer supernatanten fra pellet. Resuspender pellet i media / 0,3% BSA, slik at konsentrasjonen av celler er lik 1 x 10 ⁶ celler / ml. Bruk en hemocytometer å telle cellene.
7. Tilsett 1,5 x 10 ⁵ celler GL261 (i 150 ul) + 5 x 10 ⁴ celler microglia (i 50 pl) inn i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.Tilsett 2 x 10 ⁵ celler GL261 (200 pl) inn i et separat 1,5 ml mikrofuge-rør.
   MERK: GL261 celler alene uten mikroglia tjener som en kontroll.
8. Spin-celler i mikrosentrifuge i 5 minutter ved 120 x g.
9. Resuspender celler i 200 ul kald matrise på is.
10. Platen 50 ul (50.000 celler) på midten av topprommet til 8 um porestørrelse kammeret innsats.
11. Inkuber ved 37 ° C i 30 minutter for polymeriseringen å skje.
12. Tilsett 200 ul serumfritt medium til det øvre kammer og 700 ul serum inneholdende cellevekstmedium til den nedre brønnen.
13. Inkuber ved 37 ° C, _5% CO2 i 48 timer.
14. Etter inkubasjon fjerne celler fra toppen av kammeret ved forsiktig aspirasjon og fikse kamre ved å plassere i 3,7% formaldehyd i PBS. Tillat kamre for å forbli i fiksativ i 15 minutter ved romtemperatur (eller over natten ved 4 ° C). Fjern fiksativ ved forsiktig aspirasjon og erstatte med 500 mL 1x PBS. Fortsett til § 4 for bildeanalyse.

4. Imaging Analyser

1. Fjern kamre fra 3,7% formaldehyd og vask i tillegg inneholder frisk 500 mL 1x PBS.
   MERK: Ikke la kamre for å tørke.
2. Ved hjelp av en bomulls tippet applikator, forsiktig rense ikke-invasive celler fra den øverste del av filter (siden som vender mot innsiden av kammeret) ved skraping på filteroverflaten. Begynn forsiktig og øk trykket gradvis. Gjør dette minst 3 ganger per kammer.
3. Plasser kamre i enten en glassbunn tallerken eller la i en 24 brønners plate.
4. Plasser prøven på scenen av en epifluorescent eller laser konfokal fluorescerende mikroskop utstyrt med kamera og bildeopptak programvare ^9,10.
5. Ta flere 10X eller 20X bilder av representative felt.
6. Ved hjelp av et bildeanalyse programvare, for eksempel ImageJ, telle antall glioblastom celler som har krysset filteret til under ^9,10.
7. Hvis imaging "3D. "Invasjon analysen (beskrevet i kapittel 3), generere en Z stabel serie bruker en fluorescerende laser konfokalmikroskop ^5-6 image invasiv cellepopulasjon på undersiden av filteret, følger protokollen trinn 4.2 til 4.6 som er beskrevet ovenfor.

Representative Results

Ved hjelp av metodene beskrevet her, har vi vist at microglia og makrofager kan vesentlig stimulere glioblastom celle invasjon. To forskjellige invasjons analyser er anvendt og er avbildet i figur 1. I figur 2, ble GL261 celler som konstitutivt uttrykker den fluorescerende protein mCherry sådd ut på forbelagte kammere med og uten mikroglia i 48 timer. GL261 celler var minimal invasiv på egenhånd, men når dyrket med microglia invasiv kapasiteten økte med om lag 10 ganger.

Vi observerer en lignende virkning ved bruk av humane cellelinjer. I figur 3, U87-celler (farget med 5-chloromethylfluorescein diacetat (CMFDA) grønn) viser 5-6 ganger høyere invasjon når cocultured med differensierte THP-1-celler. THP-1 er en human monocyttisk cellelinje (avledet fra en akutt monocytisk leukemipasient) som kan være differentiated inn en makrofag-lignende tilstand ved hjelp forbolmyristatacetat (PMA) ^15. Differensierte THP-1-celler viser mange av de samme egenskapene av humane makrofager slik som cytokin sekresjon og evnen til å utføre fagocytose.

Alternativt kan celle invasjon måles ved å inkludere dem i matrisen, og denne plettering direkte på filteret i et kammer innsats. Laser konfokal mikroskopi kan anvendes for å fremstille en serie av bilder som frembringer en tredimensjonal representasjon (Z-stabel). I likhet med hva som er observert i den matriks-belagte kammer-analyse (vist i figurene 2 - 3), den coculture av mikroglia (farget med CMPTX rød) stimulerer GL261 celler (CMFDA grønn) for å invadere målt med antall celler som har krysset til undersiden av filteret (figur 4). Dette formatet har den ekstra fordelen av å kunne visualisere potensielle celle-celle interaksjoner mellom glioblastoma celler og microglia under invasjonen. Faktisk, mikroglia synes å nøye knyttes til de glioma-celler suspendert i 3D-matrise (figur 5). Hvis bare sluttpunktanalyse er nødvendig, og en laser konfokal ikke er tilgjengelig for bruk, kan cellekammerene renses som beskrevet for de matrise belagte kamre. Da antallet av de gjenværende (invasive) celler kan bli bestemt ved telling ved bruk av bilder som oppnås fra en standard epifluorescent mikroskop. Film 1 viser den tredimensjonale sammenstillingen av en slik analyse.

Figur 1:. Skjematisk av to forskjellige protokoller for bestemmelse Microglia / Makrofagindusert stimulert Glioblastoma Cell Invasion Top panel illustrerer pre-belagt matrise kammer invasjon analysen (§ 2). Nedre panel viser 3D matrise invasjon analysen (§ 3). Figur tilpasset fra9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Microglia (MG) Forbedre GL261 Glioblastoma Cell invasjon. (A) Representative bilder av invaderende GL261 celler (som uttrykker mCherry) i fravær (venstre panel; GL261 alene) eller nærvær av mikroglia (høyre panel; GL261 + MG) ble kombinert og sådd ut på matrise-belagte kamre, etterfulgt av inkubasjon i 48 time og deretter evaluering av antall celler som har krysset filteret. Bilder tatt med 10X objektiv. Scale bar = 400 mikrometer. (B) Kvantifisering av analysen teller bare invasive GL261 celler (rød). Viste data er gjennomsnitt ± SEM fra tre uavhengige forsøk. (C) Kvantifisering av microglia stimulert GL261 invasjonen i presence farmakologisk hemmere gefitinib (5 mm), JNJ-28312141 (10 mm), PLX3397 (1 mm), PLX5562 (1 mm). Viste data er gjennomsnitt ± SEM fra seks uavhengige eksperimenter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. THP1 Makrofager Forbedre U87 Glioblastoma Cell invasjon. (A) Representative bilder av invaderende U87-celler farget med CMFDA grønn sådd ut på matrise-belagte kamre alene (venstre panel, U87) eller med differensierte THP1 makrofager (høyre panel; U87 + THP1), etterfulgt av inkubasjon i 24 timer og deretter evaluering av antall celler som har krysset filteret. Bilder tatt med en 10X objektiv. Scale bar = 400 mikrometer. (B) Kvantifisering av analysen teller bareinvasive U87 celler (grønt). Viste data er gjennomsnitt ± SEM fra ti uavhengige forsøk.

. Figur 4. 3D Invasion analysen av GL261 og microglial coculture (A) Bildene er anslag fra en Z-serie bilder av GL261 celler (farget med CMFDA grønn) innebygd i matrisen alene (venstre panel; GL261) eller med murine microglia ( merket med CMPTX rød, panel høyre; GL261 + MG). Z-fremspring var av de nederste 4 stykker av bildestabel som omfatter i bunnen av kammer-filter og representerer derfor invaderende celler. Målestokk = 200 uM. (B) Kvantitering av GL261 celler (grønn) bestemt til å være på undersiden av filteret som er beskrevet ovenfor. Det totale antall invaderende GL261 celler ble bestemt og normalisert til den av GL261 celler i monokultur. Viste data representerer Mean ± SEM for 3 uavhengige forsøk, utført i duplikat (figur tilpasset fra ^10). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Bilde fra en Slice i 3D Stack av GL261 (grønn) og Microglia (rød) coculture Embedded i Matrix. GL261 og microglia celle-interaksjoner er markert med hvite piler. Scale bar = 100 mikrometer.

Film 1:. Glioblastoma og Microglia Interaksjon i 3D Rotasjon rundt X-aksen av en 3D-projeksjon av hele Z serie med bilder tatt fra GL261 (grønn) og microglia (rød) coculture innebygd i matrix. Slices er på 5 mikrometer intervaller. Klikk her for å se denne videoen.

Discussion

Den svært invasiv art høy klasse astrocytomas og glioblastom gjøre disse hjernen kreft svært dødelig. Det er derfor av avgjørende betydning for å forstå de molekylære og cellulære mekanismer for glioblastom invasjon. Mye har blitt lært om prosessen med glioblastom invasjon allerede ^17. Bruk av analyseformater er beskrevet i denne artikkelen, har vårt laboratorium vist i både mus og menneskelige modeller som tumorassosierte makrofager kan stimulere glioma celle invasjon av 5-10 ganger. Dette coculture modell trofast gjenskaper evne glioblastom celler til fysisk samhandle med makrofager / microglia som ville tillate for parakrine og juxtacrine interaksjoner (via ligand-reseptor systemer som Notch-Delta og Efrin-Ephs) som potensielt involvert i toveiskommunikasjon mellom tumorceller og makrofager. Andre analyseformater som søker å utforske effekten av makrofagene på gliom celle invasjon vanligvis har cellenefysisk adskilt som makrofagene blir platet ut på bunnen av brønnen og glioblastom cellene er i kammeret ^3,4. Følgelig er det disse studiene viser en mer beskjeden økning i makrofag-stimulert glioma invasjon (2 ganger). Dette coculture analysen forbedrer på denne effekten (5-10 ganger) sannsynlig som indikerer viktigheten av juxtacrine interaksjoner under makrofag / microglia stimulert glioblastom invasjon.

Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen omfatter flere trinn som må utføres omhyggelig for å oppnå tilfredsstillende resultater. Hvis forsøket utføres som beskrevet her og ikke invaderende celler som er sett, kan det fluorescerende fargestoff er utløpt som vil føre til meget svak eller ikke-eksisterende farging. For invasjonen analyser ved hjelp av pre-belagt kamre, er det viktig å bruke friske invasjon kamre som ikke er forbi utløpsdato og har blitt holdt frosset hele tiden opp til å utføre eksperimentet. Chambers som var igjenved værelsestemperatur i løpet av 12 timer ble funnet å være utilfredsstillende ved at matrisen barrieren ikke lenger var intakt, og cellene invaderte ved en mye høyere frekvens enn normalt. For 3D-analysen, er det helt avgjørende å holde alle pipetter og rør på is. Hvis ved romtemperatur i en betydelig lengre tid, vil matrisen polymerisere og kan ikke brukes for å resuspendere cellene i den. Det anbefales at en liten brett fylt med is anvendes i hetten for å holde alle materialer som kommer i kontakt med grunnmassen. Protokollen kan modifiseres til å omfatte en høyere celletetthet, men dette kan påvirke lengden av tiden som kreves for å få optimal effekt på glioma invasjon. Det ville være interessant å se om andre celletyper kan legges i coculture analysen og hva potensielle effekter de kan ha på invasjon. Til slutt, erkjenner vi at hjernen mikromiljøet er unik og vanskelig å gjenskape in vitro. En begrensning av denne protokollen er at invasjonen chAmbers brukt her mangler de typiske komponentene i normal hjerne som glioblastom celler vil møte i løpet av invasjon (dvs. tettpakkede nevroner og astrocytter). Selv med det forbeholdet, den stimulerende effekt av makrofager / mikroglia i denne analysen er i samsvar med hva som er observert in vivo, og kan bli brukt til å forutsi hvilke inhibitorer og / eller proteiner kan forstyrre denne prosessen.

Ligne svulsten mikromiljøet i kultur er en krevende oppgave gitt hvor mange varierte celletyper og matrix proteiner er til stede i tumorer på ulike stadier av kreft. Likevel rimelig nøyaktig in vitro modeller av tumor interaksjon med komponenter av mikromiljøet vil i stor grad forenkle oppdagelse av nye terapeutiske muligheter. Det er nå forstås at celler som makrofager spiller en kritisk rolle i flere aspekter forbundet med progresjon til malignitet inkludert angiogenese, invasjon, immunsvik og medikamentresistens. COCruk invasjon assayet beskrevet her bruker forholdet mellom tumorceller til makrofager som er observert hos pasienter med høy grad av glioblastomer (ca. 3: 1; ^5). Det har vist seg at evnen til makrofager / mikroglia å stimulere glioblastom invasjon er avhengig av CSF-1R og EGFR-signalering som farmakologisk inhibering av disse reaksjonsveier ved hjelp JNJ-28312141, PLX3397 (CSF-1R) og gefitinib (EGFR) demper sterkt økningen i invasjonen ^9. Videre, ved hjelp av den innebygde matrise-analysen, ble det vist at Semapimod, et lite molekyl kjent for å målrette makrofager og mikroglia, kan også blokkere mikroglia stimulert glioblastoma invasjon ^10. Resultater fra disse coculture forsøkene ga støtet til å validere disse forbindelsene ved hjelp av in vivo-modeller. I samsvar med data fra in vitro-analyser som er beskrevet i denne artikkelen, blokade av CSF-1R med inhibitor PLX3397 (som krysser blod-hjerne barrieren) i stor grad blokkertevne GL261 glioma celler til å invadere i hjernen til C57BL / 6 mus ^9. På samme måte leveres Semapimod inn i hjernen ble vist å hemme invasjon og for å virke synergistisk med standard strålebehandling i stor grad forlenge overlevelse av mus som bærer GL261 tumorer ^10. Begge disse fremgangsmåter kan vise seg å være effektiv i klinikken.

Det er nå vel forstått at makrofagen systemet er ganske viktig for progresjon av ulike kreftformer til malignitet ^{3-6, 11-13.} Det har vært klart etablert i bryst og kreft i hjernen modeller som tumor-assosiert makrofager er kritiske for tumorcelle invasjon og metastasering. I tillegg, makrofager er sannsynlig å være svært viktig for formidling av immun flukt som makrofager (og celler av beslektet linjen, slik som dendritiske celler) funksjon som profesjonell antigen-presenterende celler som arrangerer adaptiv immunitet som respons på infeksjon ^18. Det er nå klart at en av de normale physiological funksjoner av det adaptive immunsystemet er å hindre ukontrollert formering ved å ødelegge avvikende celler. Immunitet mot tumorceller, er sannsynligvis på grunn av det faktum at sterkt mutagen arten av kreftcellen genererer ny-antigener som gjenkjennes som fremmed av det adaptive immunsystemet. Faktisk er prosessen med "immunsvik" er antatt å være en viktig del av ondartethet som kreftceller trenger å forhindre immunsystemet (særlig cytotoksiske lymfocytter, naturlige dreperceller og inflammatoriske makrofager) fra å ødelegge svulsten. Håpet er analysen beskrevet i denne artikkelen vil letter studiet av glioblastom interaksjon med makrofager og potensielt tillate utvidelse av hvilke typer spørsmål vi kan løse om ondartet kreft ved hjelp av in vitro kultur analyser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix	Corning/Fisher Scientific	Cat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml)	Life Technologies	12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye	Life Technologies/Molecular Probes	C34552
CellTracker Green CMFDA Dye	Life Technologies/Molecular Probes	C2925
GL261 cell line	National Cancer Institute (NCI)
U87 cell line	American Tissue Type Culture Collection	HTB-14
THP-1 cell line	American Tissue Type Culture Collection	ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml)	Life Technologies/Gibco	11875-093
Formaldehyde solution	Sigma Aldrich	F1635
Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack.	Corning	CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear	Trevigen	3445-005-01
Fetal Calf Serum (FBS)	Life Technologies	Cat: 10500064
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated	Fisherscientific	BP1600-100
0.5 M EDTA	ThermoFisher Scientific	15575-020
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma Aldrich	P8139-1MG