Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Cancer Research

Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için

doi: 10.3791/53990 Published: October 20, 2016

Abstract

Glioblastom (Evre IV glioma) 1 yıl sonrası tanı medyan sağkalım çok agresif bir insan kanser türüdür. glioblastoma doğuran moleküler olayların daha iyi anlaşılmasına rağmen, bu kanser halen geleneksel tedaviye son derece dirençli olmaya devam etmektedir. yüksek dereceli beyin tümörlerinin cerrahi rezeksiyon nedeniyle glioblastoma hücreleri son derece infiltratif doğaya nadiren tamamlandı. glioblastoma hücre işgali hafifletir tedavi yaklaşımları dolayısıyla cazip bir seçenektir. Laboratuvarımız ve diğerleri bu tümör ilişkili makrofajlar ve mikroglia (ikamet beyin makrofajlar) kuvvetle glioblastoma işgali teşvik göstermiştir. Bu yazıda anlatılan protokol in vitro kültür analizleri kullanılarak glioblastoma-makrofaj / mikroglia etkileşimi modellemek için kullanılır. Bu yaklaşım büyük ölçüde bu habis Behav sağlayan makrofajlar ile iletişimi bozan ilaçların geliştirilmesi ve / veya keşif kolaylaştırabilirIOR. 10 kat - Biz mikroglia / makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali teşvik iki güçlü kokültürünün işgali testleri kurduk. Bir flüoresan işaretleyici ya da yapısal olarak bir flüoresan proteini ifade ile etiketlenmiş glioblastoma hücrelerinin matris kaplı polikarbonat odası ekler üzerinde olmayan ve makrofajlar / mikroglia ile kaplama ya da üç boyutlu bir matris içinde yer almaktadır. Hücre işgali filtrenin alt sadece invaziv hücreler görüntü floresan mikroskopi kullanılarak ve saymak tarafından değerlendirilir. Bu tahliller kullanılarak, çeşitli farmakolojik inhibitörleri (JNJ-28.312.141, PLX3397, Gefitinib ve Semapimod) makrofaj blok tanımlanmıştır / mikroglia glioblastoma işgali uyarmıştır.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Glioblastom tanı 1,2 andan itibaren yaklaşık 12 aylık medyan sağkalım agresif bir insan beyin kanseri olduğunu. Glioblastoma standart kemoterapi ve cerrahi rezeksiyon refrakter olarak en ölümcül ve klinik zorlu kanserlerden biridir. glioblastoma yaygın doğası cerrahi tamamen rezeke gelişmiş tümör neredeyse imkansız hale normal beyinden yayılan tümör hücrelerini tanır. Bu son derece invaziv yönü glioblastoma ve diğer gelişmiş astrositomaların damgasını özelliğidir. Bu nedenle, bir çok çalışmanın odağıdır glioblastoma hücre istilası moleküler mekanizması olmuştur. Glioblastoma tümör mikro malignite 3-6 kurulmasında hayati bir rol oynar. Tümör ilişkili makrofajlar / mikroglia glioblastoma işgali 7,8 teşvik sorumlu olduğu gösterilmiştir. Bu çalışmaların çoğu, ancak kullanarak makrofajlar / mikroglia etkisini ölçtükfiziksel glioblastoma hücreleri ayırmak tahlilleri. Laboratuvarımız bize glioblastoma işgali cocultures makrofajlar / mikroglia bağlıdır nasıl çalışması ve işgali sırasında görüntü aralarındaki fiziksel etkileşimi sağlayacak izin geliştirilmiş tahlilleri üretmek için yola çıkmıştır.

Klasik deneyleri hücre işgali "standart" Boyden çemberinin kemotaksisini ve kemo-istila formatlarını içerir ölçmek için. çalışılacak Burada hücreler belirli bir boyutu (çapı genellikle arasında 0.4 ve 8 uM) gözeneklere sahip altında bir polikarbonat filtresi içeren plastik odasına yerleştirilir. hücrelerinin istilasını süreci genellikle hücre dışı matris proteini arasında oluşan fiziksel bir bariyer kapsar. kemo-istila deneyinde, kullanılan tercih edilen matris Matrigel (bundan böyle "matris" olarak anılacaktır), Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tarafından salgılanan bir hücre dışı matris proteini karışımı, fare sarkoma hücreleri ve büyük ölçüde col oluşmaktadırlagen tip IV ve laminin. Chambers, sonra ya da işgali uyarma şüphelenilen büyüme faktörleri olmaksızın hücre kültür ortamı ihtiva eden bir doku kültür çukuruna yerleştirilir. daha yüksek bir frekansta hücre dışı matris kaplı filtre ile istila ve filtrenin alt tarafına bağlı bir yüksek invaziv kapasitesine sahip hücreler. Biz glioblastoma hücre işgali üzerine mikroglia ve tümör ile ilişkili makrofajlar rolünü değerlendirmek için bu testte değiştirdiniz.

10 kat 9,10 - Biz mikroglia 5 iki glioblastoma hücre hatları işgali uyarabilir bu kağıt içinde açıklanan kokültürünün analizleri kullanılarak belirlemek mümkün olmuştur. Bu glioblastoma hayvan modellerinde gözlemlenmiştir yansıtan. Ayrıca, glioblastoma hücreleri ve makrofajlar arasındaki etkileşimler / mikroglia daha doğrudan incelenebilir üç boyutlu işgal tahlil geliştirildi. macropha ile uyarılan glioblastoma hücre invazyonu3D tahlilinde ges / mikroglia matrisi kaplı bölme yaklaşımı kullanılarak görülen şeyin karşılaştırılabilir. Benzer deneyler daha önce işgali 11-13 sırasında makrofajlar ile meme kanseri etkileşimleri incelemek için geliştirilmiştir. Bu yazıda anlatılan iki yöntem glioblastoma hücreleri makrofaj / mikroglia uyarılan işgali moleküler mekanizmasını (ler) incelemek yeteneği yardımcı olmalıdır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Hücre floresan etiketleme

NOT: floresan boyalar 9 Etiket glioblastoma hücre hatları ve mikroglia. Seçenek olarak ise, 14 de tarif edildiği gibi konstitütif GFP / RFP gibi floresan proteinleri ifade eden hücre hatları oluşturmak.

  1. boyama gününde% 80 konfluent - 6 gözenekli bir plakada Plaka hücreleri 70 olacak şekilde. Fare glioblastoma hücre hattı GL261 ve insan glioblastoma hücre hattı U87, plaka 1 x 10 6 ve 1.5 x 10 6 hücre, sırasıyla boyama önce 6 cm çanak 24 saat üzerinde.
  2. DMSO içinde floresan hücre leke boya çözeltisini hazırlayın ve ortama 5 uM boya ekleyin ya Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) veya makrofaj serum barındırmayan ortam (MSFM) de vorteks.
  3. 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 için boya ile inkübe hücreleri.
  4. boya içeren ortamı çıkarın ve hücrelere taze ortam (RPMI veya MSFM) ekleyin.
  5. 30 dakika boyunca hücreler inkübe edin. Not: Hücreler artıklekeli ve hazır denemede kullanılır.

2. Ön kaplı Matrix Odası Coculture Invasion Testi

  1. Forbol miristat asetat (PMA) 15 kullanılarak, THP-1 hücreleri ayırt.
    1. Plaka 2 - 6 bölmeli bir kültür tepsisi RPMI /% 10 FBS, 1.5 ml 3 x 10 5 THP-1 hücreleri. Kaplamadan hemen sonra, 100 nM PMA ekleme ve 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edilir.
      Not: 48 saat sonra, başarılı bir farklılaşma geçirmiş THP-1 hücreleri yapışkan olacak ve de yuvarlak bir morfolojisi alarak altına yayılır.
    2. 1x bir kez PBS ile yıkanarak PMA çıkarın ve taze RPMI /% 10 FBS ile değiştirin. Hücreler tayininde kullanıma hazır olana kadar başka bir 48 saat bekleyin.
  2. Bir tek başına medya 500 ul içeren (hiçbir serum) onları yerleştirerek ve üstüne tek başına medya 500 ul ekleyerek matris önceden kaplanmış odaları dengelenmesi. 37 ° C de 2 saat ve% 5 CO2 için bir oda inkübe edin.
    Malzemeleri / Ekipman Tabloya bakınız.
  3. yavaşça hücreler (floresan etiketli glioblastoma hücre hatları ve mikroglia / makrofajlar) çıkarmak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C'de bir hücre kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 CO2.
  4. % 0.3 Sığır Serum Albumin (BSA) ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri.
  5. 120 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
  6. MSFM /% 0.3 BSA ortam aspire supernatant ve tekrar süspansiyon pelet ya da (U87 ve THP-1 hücreleri için) RPMI /% 0.3 BSA (GL261 hücreleri ve mikroglia için) hücre konsantrasyonu 1 x 10 6 hücre / ml'ye eşit olduğu şekilde . hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
  7. 24 gözlü plakanın her bir kuyucuğu 500 ul ortam /% 0.3 BSA ekleyin.
  8. En az 2 saat (adım 2.2) için dengelenmiş olan odaları bulunan ortamı çıkarın. Yeri Chambeiyi 500 ul medya /% 0.3 BSA (adım 2.7) ihtiva eden rs.
  9. inhibitörleri makrofaj üzerindeki etkisini incelemek için kullanılıyorsa / mikroglia alt ve odanın üst kısımlarına hem uygun konsantrasyon ekleyin glioma işgali uyarılır.
    Not: CSF-1R konsantrasyonları GL261 glioblastoma istilası Referans 9 bulunabilir uyarılmış tam mikroglia inhibe etmek için kullanılır inhibitördür.
  10. Fare glioblastoma (2.10.1) ve insan glioblastoma (2.10.2) kullanılan hücre hatları bağlı olarak, aşağıdaki iki adımda tarif edildiği gibi üst bölmeye hücreleri ekleyin.
    1. 1.5 x 10 5 GL261 (glioblastoma) hücreleri (150 ul) ve 5 x 10 4 fare mikroglia (50 ul) (ortam detayları için adım 2.6) karıştırın. 300 ul MSFM /% 0.3 BSA eklenerek 500 ul hacim kazandırın. Üst bölmeye hücre karışımı ekleyin ve 48 st için 37 ° C,% 5 CO2 inkübe edilir.
      NOT: i tarif edildiği gibi Fare mikroglia yenidoğan farelerin izole edilmiştirn, 1 ila 6.

7.5 x 10 4 U87 (glioblastoma) hücreleri (75 ul) ve 2.5 x 10 4 THP1 (makrofaj) hücreleri (25 ul) karıştırın. 400 ul RPMI /% 0.3 BSA ilave edilerek 500 ul hacim getirin. üst bölmeye hücre karışımı ekleyin. 24 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 hücreleri inkübe edin.

  1. kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. görüntü analizi için bölüm 4 geçin.
    NOT: Deney şu anda durdurulmuş ve 1x PBS içinde görüntüleme için kaydedilebilir. Floresan boya sinyalleri tespit sonrasında en fazla 2 hafta tespit edilebilir.

Matrix glioma ve makrofajlar / mikroglia katıştırma 3. Invasion Testi "3D"

  1. gece boyunca 4 ° C'de çözülme matriks karışımı. kaputu buz üzerinde matris kullanarak tüm diğer manipülasyonlar gerçekleştirin.
  2. Buz üzerinde% 0.3 BSA ile ortam matrisin 10 mg / ml konsantrasyon (MSFM veya RPMI) hazırlayın.
    Not: matris stok konsantrasyonu tipik olarak yaklaşık 15 mg / ml'dir.
  3. matris içinde süspansiyon için (adım 1 'de etiketli) hücreler hazırlamak için, aspirasyon ile hücrelerden ortamı çıkarın. 2 mM EDTA / PBS ile yemeğin üzerine hücreleri yıkayın. Hücrelere 2 mM EDTA / 500 ul PBS ilave edin ve 5 inkübe edin - 37 ° C'de kuluçka makinesi içinde, 10 dakika ve% 5 CO2.
  4. % 0.3 BSA ihtiva eden ortam 5 ml içinde süspanse hücreleri.
  5. 120 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje.
  6. pelet Süpernatant aspire. Hücre konsantrasyonu 1 x 10 6 hücre / ml'ye eşit olduğu şekilde ortam /% 0.3 BSA içinde süspanse pelet. hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
  7. 1.5 ml mikrofüj tüpüne + 5 x 10 4 mikroglia hücreleri (50 ul) (150 ul) 1.5 x 10 5 GL261 hücreleri ekleyin.Ayrı bir 1.5 ml mikrofüj tüpe 2 x 10 5 GL261 hücreleri (200 ul) eklenir.
    Not: Tek başına mikroglia olmayan GL261 hücreleri, kontrol olarak hizmet eder.
  8. 120 x g'de 5 dakika boyunca mikrofuj Spin hücreleri.
  9. buz üzerinde 200 ul soğuk matris içinde süspanse edin hücreleri.
  10. 8 mcM gözenek boyutu odası ucun üst bölmesinin merkezi üzerine plakası 50 ul (50,000 hücreler).
  11. polimerizasyon meydana gelmesi için, 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  12. Alt de üst bölmesi ve 700 ul serum içeren hücre büyüme ortamına 200 ul serumsuz ortam ekleyin.
  13. 48 saat boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2 inkübe edin.
  14. kuluçkadan sonra hafif aspirasyon ile odasının üst hücreleri çıkarmak ve PBS içinde% 3.7 formaldehit içinde yerleştirerek odaları düzeltin. Chambers, oda sıcaklığında 15 dakika boyunca (ya da gece boyunca 4 ° C) sabitleştirici kalmasına izin verir. Nazik aspirasyonu ile Fiksatif çıkarın ve PBS 1x 500 ul ile değiştirin. bölüm 4 fo geçinr görüntü analizi.

4. Görüntüleme Tahliller

  1. % 3.7 formaldehit odaları çıkarın ve PBS 1x taze 500 ul içeren iyi yıkayın.
    NOT: odalar kurumasına izin vermeyin.
  2. bir pamuklu kullanarak, yavaşça filtre yüzeyi kazınarak filtrenin üst kısmı (yan bölmesinin içine bakan) için invazif olmayan hücreler temizleyin. yavaşça başlayın ve giderek basıncı artar. odasının başına bu en az 3 kez yapın.
  3. ya bir cam tabanlı çanak odaları yerleştirin veya 24 plaka bırakın.
  4. Kamera ve görüntü yakalama yazılımı 9,10 ile donatılmış bir epifluorescent veya lazer konfokal floresan mikroskop sahnede örnek yerleştirin.
  5. temsili alanların birkaç 10X veya 20X fotoğraf çekmek.
  6. Örneğin ImageJ gibi bir görüntü analiz yazılımı kullanarak, alt 9,10 filtreyi geçti glioblastoma hücrelerinin sayısını saymak.
  7. "3D görüntüleme Eğer. 4.6 Yukarıda açıklanan - "işgali tahlil (bölüm 3 açıklanan), bir floresan lazer konfokal mikroskop 5-6 kullanarak Z yığını serisi oluşturmak görüntü için filtrenin alt invaziv hücre popülasyonunu, protokolü takip 4.2 adımları.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, mikroglia ve makrofajlar esas glioblastoma hücre istilasını uyarabilir göstermiştir. İki farklı invazyon tahlilleri kullanılabilir ve Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Şekil 2'de, kurucu floresan proteini MCherry eksprese GL261 hücreler ve 48 saat mikroglia olmayan önceden kaplanmış odaları ekildi. mikroglia invaziv kapasitesi yaklaşık 10 kat artarak, ancak zaman kültür GL261 hücreleri kendi minimal invaziv idi.

Biz insan hücre hatları kullanılarak benzer bir etki gözlemlemek. Farklılaştırılmış THP-1 hücrelerine sahip kültive, Şekil 3'te, (5-chloromethylfluorescein diasetat (CMFDA) yeşil ile boyanmış) U87 hücrelerinin 5-6 kat daha yüksek istilası gösterir. THP-1 (akut monositik lösemi hastadan türetilmiş) insan monositik hücre hattı olabilir dıforbol miristat asetat (PMA) 15 kullanarak bir makrofaj benzeri duruma fferentiated. Farklılaştırılmış THP-1 hücreleri, sitokin salgılama ve fagositoz gerçekleştirmek için yeteneği insan makrofaj birçok özelliğini gösterir.

Alternatif olarak, hücre istilası matris içinde gömerek bir bölme ekine filtre üzerine doğrudan bu kaplama ile ölçülebilir. Lazer konfokal mikroskopi üç boyutlu bir gösterimini (z-yığın) üreten bir görüntü serisi üretmek için kullanılabilir. Matris kaplı odası deneyinde gözlemlenen ile benzer (Şekillerde gösterilen 2-3) geçti hücre sayısı ile ölçülen, (CMPTX kırmızı ile boyanmış) mikroglia Coculture işgal etmek için GL261 hücreler (CMFDA yeşil) harekete geçirir filtrenin alt (Şekil 4). Bu biçim glio arasındaki potansiyel hücre-hücre etkileşimleri görselleştirmek için güçlü olmak avantajına sahiptirişgali sırasında blastom hücreleri ve mikroglia. Nitekim, mikroglia yakından 3D matriks (Şekil 5) içinde süspanse glioma hücreleri ile ilişkilendirmek gibi görünüyor. Sadece son nokta analizi gerekli bir lazer konfokal kullanılabilir durumda değilse matris kaplı odaları için tarif edildiği gibi, hücre bölmeleri temizlenebilir. Daha sonra geri kalan (istilacı) hücre sayısı, standart epifluorescent mikroskop elde kullanarak görüntü sayılması ile tespit edilebilir. Film 1, böyle bir deneyde, üç boyutlu bir takımını göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1:. Mikroglia / Makrofaj-uyarılmış Glioblastoma Hücre denenmesi için İki Farklı Protokoller şematik Invasion Üst panel önceden kaplanmış matris odası işgali deneyi (Bölüm 2) göstermektedir. Alt panel 3D matris işgali deneyi (Bölüm 3) göstermektedir. Şekil uyarlanmıştır9. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2. Mikroglia (MG) GL261 Glioblastoma Hücre Invasion geliştirin. (A) yokluğunda GL261 hücreleri (mCherry eksprese) istila Örnek görüntüler (sol panel tek başına GL261) ya da mikroglia varlığı (sağ panel, GL261 + Mg), 48 saat için kuluçkalama yapılmıştır birleştirildi ve matris ile kaplanmış odaları ekildi HR ve filtre geçti hücre sayısının daha sonra değerlendirme. Görüntüler 10X objektif kullanılarak çekilen. Ölçek çubuğu = 400 uM. (B) deneyi sadece invaziv GL261 hücreleri (kırmızı) sayma kantitasyonu. Gösterilen veriler üç bağımsız deneyin ortalama ± SEM olarak. Presenc mikroglia uyarılmış GL261 istilası (C) kantitasyonufarmakolojik inhibitörlerinin gefitinib (5 uM), JNJ-28.312.141 (10 uM), PLX3397 (1 uM), PLX5562 (1 uM) e. Gösterilen veriler altı bağımsız deneyler ± SEM ortalama bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3. THP1 Makrofajlar U87 Glioblastoma Hücre Invasion geliştirin. Ya da farklı THP1 makrofajları ile (sağ panel, U87 + THP1), daha sonra, 24 saat ve değerlendirilmesi için kuluçkalama yapılmıştır (A) CMFDA yeşil ile boyanmış U87 hücrelerinin işgal Örnek görüntüler tek bir matris kaplı odalarına (U87 sol panel) kaplamalı filtreyi geçti hücre sayısı. Görüntüler 10X objektif kullanılarak çekilen. Ölçek çubuğu = 400 uM. (B) deneyi sadece sayma kantitasyonuinvaziv U87 hücreleri (yeşil). Gösterilen veriler on bağımsız deneyden ortalama ± SEM olarak.

Şekil 4,
. Ya da fare mikroglia ile (; gösterilmiştir GL261 ve Mikroglial Coculture Şekil 4. 3D Invasion Testi (A) Görüntüler tek başına matris içinde gömülü GL261 hücrelerin görüntüleri (CMFDA yeşil ile boyanmış) bir Z-serisi projeksiyonları (GL261 panelini sola) CMPTX kırmızı ile işaretlenmiş; sağ panel, GL261 + MG). Z-projeksiyonları hücreli filtre alt kapsayan görüntü yığını alt 4 dilim vardı ve bu nedenle invaziv hücreleri temsil eder. Ölçü bar = 200 uM. GL261 hücreler (yeşil) (B) kantitasyonu yukarıda tarif edildiği gibi, filtrenin alt kısmında olduğu tespit. işgal GL261 hücre sayısı belirlenmiş ve monokültürde GL261 hücrelerininkine göre normalize edildi. Gösterilen veriler ortalama ± S temsilYinelenen (10 uyarlanmıştır şekil) yapılan 3 bağımsız deneyler, EM. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
GL261 (yeşil) ve Matrix. GL261 ve mikroglia hücre etkileşimleri Gömülü Mikroglia (kırmızı) Coculture 3D Stack içinde Dilim Şekil 5. Image beyaz oklarla vurgulanır. Ölçek çubuğu = 100 uM.

Şekil 1
Film 1:. GL261 (yeşil) ve mikroglia (kırmızı) kokültürünün alınan görüntülerin tamamı Z serisi 3D projeksiyon X ekseni etrafında 3D Rotasyon glioblastoma ve mikroglia Etkileşim ma gömülütrix. Dilimler 5 mcM artışlarla vardır. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

yüksek dereceli astrositomların ve glioblastoma son derece invaziv doğası bu beyin kanserleri çok ölümcül olun. Bu glioblastoma işgali moleküler ve hücresel mekanizmaları anlamak nedenle büyük önem taşımaktadır. Çok glioblastoma işgali zaten 17 süreci hakkında öğrenilmiştir. 10 kat - Bu yazıda ayrıntılı tahlil formatları kullanarak, bizim laboratuvar tümörle ilişkili makrofajlar 5 ile glioma hücre işgali uyarabilir, hem fare ve insan modellerinde gösterilmiştir. Bu Coculture modeli sadakatle potansiyel arasında iki yönlü iletişime katılan (örneğin Çentik Delta ve efrin-Ephs olarak ligand-reseptör sistemleri aracılığıyla) parakrin ve juxtacrine etkileşimleri sağlayacak fiziksel makrofajlar / mikroglia ile etkileşim, glioblastoma hücrelerinin yeteneği çoğaltır tümör hücreleri ve makrofajlar. glioma hücre işgali üzerine makrofajlar etkisini keşfetmeye çalışmalıdır Diğer tahlil formatları genellikle hücrelerine sahipmakrofajlar Kuyunun alt kaplama glioblastoma hücreleri bölme 3,4 Hangi olarak fiziksel olarak ayrı. Sonuç olarak, bu çalışmalar makrofaj stimüle glioma işgali (2 kat) daha mütevazı bir artış göstermektedir. Bu kokültürünün tahlil bu etkinin geliştirir - olasılıkla makrofaj sırasında juxtacrine etkileşimlerinin önemini belirten (5 10 kat) / mikroglia glioblastoma işgali uyarılmış.

Bu yazıda belirtilen protokol tatmin edici sonuçlar elde etmek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır birkaç adımdan oluşur. Deney burada açıklandığı gibi yapılır ve hiçbir hücreleri istila görülürse, floresan boya çok zayıf veya varolmayan boyama yol açacaktır süresi dolmuş olabilir. Önceden kaplanmış odaları kullanarak işgal tahlilleri için, son kullanma tarihi geçmiş değildir ve deneyi gerçekleştirmek kadar süre boyunca donmuş muhafaza edilmiş taze işgali odaları kullanmak esastır. kalmıştı ChambersÜzerinde 12 saat boyunca oda sıcaklığında ve artık sağlam ve normal çok daha yüksek bir frekansta işgal hücre olacak matris bariyeri tatmin edici olduğu bulunmuştur. 3D deneyi için, buz üzerinde, tüm pipetleri ve tüpler tutmak için kesinlikle çok önemlidir. bir zaman süresi için oda sıcaklığında ise, matriks polimerize edecek ve içinde hücrelerin yeniden askıya almak için kullanılamaz. Buz dolu küçük bir tepsi matris ile temas edecek tüm malzemeleri tutmak için başlığı içinde kullanılması önerilmektedir. Protokol, ancak bu glioma istilası optimal etkisini görmek için gereken süreyi etkileyebilir, daha yüksek bir hücre yoğunluğu içerecek şekilde modifiye edilebilir. Diğer hücre tipleri kokültürünün deneyinde eklenebilir ve işgali üzerine potansiyel ne gibi etkileri olabilir görmek için ilgi olacaktır. Son olarak, biz beyin mikro-in vitro çoğaltmak için eşsiz ve zor olduğunu kabul ediyoruz. Bu protokolün bir sınırlama olduğunu işgali ch olduğunuBurada kullanılan amberleri glioblastoma hücreleri işgali sırasında karşılaşacağınız, normal beyin (yani, yoğun paketlenmiş nöronlar ve astrositler) tipik bileşenleri yoksundur. Bu uyarı, makrofaj uyarıcı etkisi ile, ancak / bu tahlilde mikroglia in vivo olarak görülmektedir ve inhibitörler ve / veya proteinler, bu işleme müdahale olabilir tahmin etmek için kullanılabilir ne tutarlıdır.

kültüründe tümör mikro taklit hücre tipleri ve matriks proteinleri malignite çeşitli aşamalarında tümörlerde bulunan kaç değişik verilen yıldırıcı bir iştir. Oysa mikroçevresinin bileşenleri ile tümör etkileşim in vitro modellerinde oldukça hassas ölçüde yeni tedavi caddeleri keşfini kolaylaştıracaktır. makrofajlar gibi hücreler anjiyogenez, işgali, bağışıklık kaçırma ve ilaç direnci de dahil olmak üzere malignite ilerleme ile ilişkili çeşitli yönleri kritik bir rol oynadığını Şimdi takdir edilmektedir. cocBurada açıklanan ulture işgali tahlil yüksek dereceli glioblastomalarda hastalarda görülmektedir makrofajlara tümör hücrelerinin oranı kullanır (yaklaşık 3: 1, 5). Bu glioblastoma istilası uyarma makrofajlar / mikroglia kabiliyeti CSF-1R ve kullanarak bu yolların farmakolojik inhibisyonu olarak EGFR sinyal bağımlı olduğu gösterilmiştir JNJ-28.312.141, PLX3397 (CSF-1R) ve gefitinib (EGFR) güçlü bir şekilde artış azaltır istilası 9. Bundan başka, gömülü matris deneyi kullanılarak, bu Semapimod da mikroglia engelleyebilir, makrofajlar ve mikroglia hedef bilinen küçük bir molekül, glioblastoma istilası 10 uyarılmış gösterilmiştir. Bu Coculture deneylerden elde edilen sonuçlar in vivo modeller kullanılarak bu bileşikleri doğrulamak için ivme kazandırmıştır. Bu yazıda anlatılan in vitro tayinlerde verilerle uyumlu olarak, (kan beyin bariyerini geçen) inhibitörü PLX3397 ile BOS-1R abluka büyük ölçüde engellenmişGL261 glioma hücrelerinin yeteneği C57BL / 6 farelerinin 9 beyinlerinde işgal etmek. Beyin invazyonu inhibe ettiği ve büyük ölçüde GL261 tümörleri 10 barındıran farelerin hayatta kalma süresinin uzatılması standart radyasyon tedavisi ile sinerji gösterilmiştir içine Benzer şekilde, Semapimod verdi. Bu yaklaşımların her ikisi de klinikte etkili olabilir.

Şimdi de makrofaj sistemi 3-6, 11-13 malignite çeşitli kanserlerin ilerlemesi için oldukça önemli olduğunu takdir edilmektedir. Bu açık bir şekilde tümör bağlantılı makrofajlar tümör hücre istilası ve metastaz için kritik olan, göğüs ve beyin kanseri modellerinde saptanmıştır. Buna ek olarak, makrofajlar enfeksiyon 18 yanıt olarak uyumlu bir bağışıklık orkestra profesyonel antijen sunan hücreler gibi immün makrofajlar gibi kaçış (ve dendritik hücreler gibi, ilgili soyunun hücrelerini) işlevini aracılık için çok önemli olması muhtemeldir. Şimdi, normal ph açıkça ortaya biridirAdaptif immün sisteminin ysiological fonksiyonları olarak anormal hücreleri yok ederek kontrolsüz proliferasyon önlemektir. Tümör hücrelerine karşı bağışıklık bağlı kanser hücresinin yüksek mutagenik doğası adaptif immün sistemi tarafından yabancı olarak tanınan, neo-antijenlerini gerçeğine muhtemeldir. Nitekim "bağışıklık kaçırma" süreci kanser hücreleri tümör yok etmesini (özellikle sitotoksik lenfositler, doğal öldürücü hücreler ve inflamatuvar makrofajlarda) bağışıklık sistemini önlemek gerekir olarak malignite önemli bir parçası olduğu kabul edilmektedir. Bu makrofajlar ile glioblastoma etkileşim çalışması kolaylaştırır ve potansiyel biz in vitro kültür deneyler kullanılarak malign kanseri hakkında adres olabilir soru türleri genişlemesini sağlayacak bu yazıda anlatılan tahlil umulmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix Corning/Fisher Scientific Cat: 354481
Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) Life Technologies 12065-074
CellTracker Red CMTPX Dye Life Technologies/Molecular Probes C34552
CellTracker Green CMFDA Dye Life Technologies/Molecular Probes C2925
GL261 cell line National Cancer Institute (NCI)
U87 cell line American Tissue Type Culture Collection HTB-14
THP-1 cell line American Tissue Type Culture Collection ATCC TIB-202
RPMI 1640 Medium (500 ml) Life Technologies/Gibco 11875-093
Formaldehyde solution Sigma Aldrich F1635
Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. Corning CLS3422
Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear Trevigen 3445-005-01
Fetal Calf Serum (FBS) Life Technologies Cat: 10500064
Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated Fisherscientific BP1600-100
0.5 M EDTA ThermoFisher Scientific 15575-020
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma Aldrich P8139-1MG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buckner, J. C., et al. Central nervous system tumors. Mayo Clin Proc. 82, (10), 1271-1286 (2007).
  2. Furnari, F. B., et al. Malignant astrocytic glioma: genetics, biology, and paths to treatment. Genes. Dev. 21, (21), 2683-2710 (2007).
  3. Charles, N. A., Holland, E. C., Gilbertson, R., Glass, R., Kettenmann, H. The brain tumor microenvironment. Glia. 60, (3), 502-514 (2012).
  4. Li, W., Graeber, M. B. The molecular profile of microglia under the influence of glioma. Neuro. Oncol. 14, (8), 958-978 (2012).
  5. Watters, J. J., Schartner, J. M., Badie, B. Microglia function in brain tumors. J. Neurosci. Res. 81, (3), 447-455 (2005).
  6. Zhai, H., Heppner, F. L., Tsirka, S. E. Microglia/macrophages promote glioma progression. Glia. 59, (3), 472-485 (2011).
  7. Bettinger, I., Thanos, S., Paulus, W. Microglia promote glioma migration. Acta Neuropathol. 103, (4), 351-355 (2002).
  8. Wesolowska, A., et al. Microglia-derived TGF-beta as an important regulator of glioblastoma invasion: an inhibition of TGF-beta-dependent effects by shRNA against human TGF-beta type II receptor. Oncogene. 27, (7), 918-930 (2008).
  9. Coniglio, S. J., et al. Microglial stimulation of glioblastoma invasion involves epidermal growth factor receptor (EGFR) and colony stimulating factor 1 receptor (CSF-1R) signaling. Mol Med. 18, 519-527 (2012).
  10. Miller, I. S., et al. Semapimod sensitizes glioblastoma tumors to ionizing radiation by targeting microglia. PLoS One. 9, (5), (2014).
  11. Goswami, S., et al. Macrophages promote the invasion of breast carcinoma cells via a colony-stimulating factor-1/epidermal growth factor paracrine loop. Cancer Res. 65, (12), 5278-5283 (2005).
  12. House, R. P., et al. Two functional S100A4 monomers are necessary for regulating nonmuscle myosin-IIA and HCT116 cell invasion. Biochemistry. 50, (32), 6920-6932 (2011).
  13. Wang, W., et al. The activity status of cofilin is directly related to invasion, intravasation, and metastasis of mammary tumors. J Cell Biol. 173, (3), 395-404 (2006).
  14. Zagzag, D. 1, Miller, D. C., Chiriboga, L., Yee, H., Newcomb, E. W. Green fluorescent protein immunohistochemistry as a novel experimental tool for the detection of glioma cell invasion in vivo. Brain Pathol. 13, (1), 34-37 (2003).
  15. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int. J. Cancer. 26, (2), 171-176 (1980).
  16. Dobrenis, K. Microglia in cell culture and in transplantation therapy for central nervous system disease. Methods. 16, (3), 320-344 (1998).
  17. Coniglio, S. J., Segall, J. E. Molecular mechanism of microglia stimulated glioblastoma invasion. Matrix Biol. 32, (7-8), 372-380 (2013).
  18. See, A. P., Parker, J. J., Waziri, A. The role of regulatory T cells and microglia in glioblastoma-associated immunosuppression. J Neurooncol. 123, (3), 405-412 (2015).
Coculture Tahliller Glioblastoma Invasion Makrofaj ve Mikroglia Stimülasyon Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coniglio, S., Miller, I., Symons, M., Segall, J. E. Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion. J. Vis. Exp. (116), e53990, doi:10.3791/53990 (2016).More

Coniglio, S., Miller, I., Symons, M., Segall, J. E. Coculture Assays to Study Macrophage and Microglia Stimulation of Glioblastoma Invasion. J. Vis. Exp. (116), e53990, doi:10.3791/53990 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter