Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

في فيفو جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في ذبابة الفاكهة

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

للكشف عن الخلايا السليمة في الحيوانات كلها التي تحتوي على مستويات منخفضة من النشاط كاسباس، تم إنشاء جهاز الاستشعار البيولوجي حساسة للغاية المعينة CaspaseTracker لذبابة الفاكهة. تم الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي التي تعتمد على كاسباس في الخلايا السليمة عاش فترة طويلة في جميع أنحاء الأعضاء الداخلية للحيوانات الكبار تربى في ظل ظروف الأمثل في ظل غياب المحفزات الموت.

Introduction

Caspases هي البروتياز السيستين التي تتوسط موت الخلايا أفكارك التي كتبها الشق العديد من البروتينات داخل الخلايا بعد مخلفات اسبارتاتي الرئيسية. على سبيل المثال، caspases البادئ تفعيل caspases المستجيب، nucleases الحمض النووي derepress، مكونات هيكل الخلية يلتصق وتغير تكوين الدهون أغشية الخلايا لتفكيك بسرعة الخلايا وتحفيز الاعتراف بها والغمر من الخلايا التي تتخلص من الجثث الخلية المجاورة. 1-4 ويقدر أن المليارات من الخلايا تموت يوميا في جسم الإنسان، وموت الخلايا المبرمج هو آلية هامة من موت الخلايا السرطانية الناجمة عن العلاج الكيميائي. 5 مجموعة مختلفة من caspases يمكن أن يسبب موت الخلايا عن طريق العمليات غير أفكارك واضحة لتنشيط المناعة الفطرية. 6 لذلك، وقد ركزت معظم البحوث حول caspases على وظائف الموالية للموتهم.

ومن المثير للاهتمام، كشفت أدلة في وقت مبكر في الحقل الذي نفس caspases المسؤولة عن تعزيز موت الخلايا أيضا غير الموت وunctions. وقد أثبتت الدراسات الرائدة التي caspases يشاركون في الوظائف الخلوية المتنوعة في الخلايا السليمة، بما في ذلك تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة خلال مرحلة التطور الجنيني. مطلوبة 7-9 Caspases لتفريد النطف في ذبابة الفاكهة 10،11، من أجل الحيلولة دون وnecroptotic مسار موت الخلايا البديل في الفئران 12،13، وتجهيز الرنا الميكروي في C. ايليجانس. 14،15 في ربما تورط الأطول عمرا الخلايا، الخلايا العصبية، caspases والآلات أفكارك أخرى في تنظيم نشاط الخلايا العصبية عن طريق تقليم النهايات متشابك، وهي عملية يعتقد أنه ضروري لتعزيز نقاط الاشتباك العصبي الأخرى للتعلم والذاكرة. 16- 18 فمن الممكن أن caspases تسهل التقليم متشابك من نوع مصغرة موت الخلايا المبرمج للتوقعات العصبية صغيرة دون موت الخلايا كله. 19 ومع ذلك، caspases قد يكون لها وظائف بديلة لا علاقة لها بأحداث مثل موت الخلايا المبرمج. 20،21 الدور المزدوجفي الحياة والموت ليست فريدة من نوعها لcaspases. بي سي إل-2 البروتينات الأسرة والسيتوكروم ج لها أدوار في قطاع الطاقة الخلوية في الخلايا السليمة ولكن هي أيضا جزء من مسار أفكارك الأساسية التي يتم تفعيلها من خلال أنواع كثيرة من الإجهاد خلية 22-25 على الرغم من أن لم يثبت، فإنه يبدو من المنطقي أن تطور ربطت اليوم -jobs إلى الموت فرصة عمل خلال نفس الجزيئات لضمان القضاء في الوقت المناسب من الخلايا غير صالحة أو غير مرغوب فيها.

في الوقت الحاضر، ليست مفهومة الآليات الجزيئية النشاط كاسباس غير أفكارك، وأيضا لا يعرف مدى النشاط كاسباس غير أفكارك أثناء التطور الجنيني وفي أنسجة البالغين. ويتمثل التحدي الرئيسي هو صعوبة في التمييز أيام عمل من الموت ظائف caspases. وعلى النقيض من الخلايا وpyroptosis، عندما يتم تضخيمه النشاط كاسباس التي كتبها شلال بروتين، ومن المتوقع أن تحدث على مستويات أدنى من النشاط الأنزيمي، على الأرجح دون الكشف عن العديد من ميتاليك يتوفر-وظائف اليوم من caspasesاذكر.

قبل العمل المقدم هنا، وضعت غيرها من مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار كاسباس لأغراض مختلفة. وأجهزة الاستشعار SCAT (على سبيل المثال، ECFP-DEVD-الزهرة) كشف بسرعة في الوقت الحقيقي النشاط كاسباس في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية باستخدام الحنق. 26،27 وبعد انشقاق كاسباس، شاردة GFP المستهدفة النووية من Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) يخضع لإعادة المركزية التحت خلوية في غضون دقائق عند المشقوق في البلازما غشاء حبل من caspases. 28 وبالمثل، ApoAlert-pCaspase3 الاستشعار (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes من العصارة الخلوية إلى النواة على الانقسام كاسباس. 29،30 أكثر في الآونة الأخيرة، وحامل اللون في iCasper تم هندستها بذكاء ليتألق عندما المشقوق من قبل caspases، والسماح الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي في الوقت الحقيقي في الخلايا العصبية للأجنة ذبابة الفاكهة، ولكن في المقام الأول بالتعاون مع موت الخلايا التنموي. فاة 31 كاسباس التي تعتمد على الخلايا العصبية الشمية خلال الشيخوخة كان demonstقام بتقييمه المناعية الكشف عن شكل المشقوق كاسباس من أجهزة الاستشعار CPV (على سبيل المثال، mCD8-PARP فينوس). 32،33 الأهم من ذلك، تم الكشف عن شكل تفعيلها من كاسباس 3 في غياب موت الخلايا التي immunostain حساس في العمود الفقري لل الخلايا العصبية مثقف، وفي سوما باستخدام مضان تعتمد كاسباس من الصبغة مراسل CellEvent النووي، ولكن واجه صعوبات بسبب الصور سمية، على الرغم من موت الخلايا تأخر حتى بعد إزالة العمود الفقري. 19 وهكذا، هناك حاجة إلى أجهزة الاستشعار كاسباس جديدة للكشف عن وتعقب الخلايا مع النشاط كاسباس القاعدية في الجسم الحي.

للتغلب على هذه الصعوبات، ولدت لنا رواية المزدوج جهاز الاستشعار البيولوجي اللون كاسباس، المعين CaspaseTracker. هذه الاستراتيجية يجمع بين نسخة معدلة من ذبابة الفاكهة كاسباس الحساسة Apoliner جهاز الاستشعار البيولوجي 28 مع ذبابة الفاكهة G-TRACE نظام FRT recombinase 34 لتسمية بشكل دائم وتعقب الخلايا في الجسم الحي. <سوب> 35 نظام G-TRACE تنشيط GAL4-يسمح مستويات منخفضة جدا من caspases لتفعيل CaspaseTracker، مما أدى إلى التعبير طلب تقديم العروض في السيتوبلازم والتعبير GFP المستهدفة النووي دائم في أي خلية التي شهدت من أي وقت مضى النشاط كاسباس 35 يمكن هذا النظام تسمية الخلايا في جميع أنحاء الحياة في الحيوانات كلها باستخدام ذبابة الفاكهة، نظام نموذجي لين العريكة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة caspases وموت الخلايا. 36-38

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الذباب CaspaseTracker

  1. لإعداد CaspaseTracker (DQVD) يطير للتجارب، تنفيذ هذا الصليب: يو بي آي-CaspaseTracker ز س-TRACE (UAS-طلب تقديم العروض، UAS-FLP، يو بي آي> وقف> GFP-NLS)، عن طريق نقل 7-10 إناث البكر (أو الذكور) الذباب يحمل كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي الركيزة mCD8-DIAP1-GAL4 مدفوعا المروج اليوبيكويتين 35 جنبا إلى جنب مع نفس العدد من الذكور (أو أنثى) الذباب G-الشحيحة، التي لديها ثاني موازن كروموسوم CYO لتجنب الفتك من مزيج متماثل من ز- TRACE (UAS-طلب تقديم العروض، UAS-FLP، ويو بي آي> وقف> GFP-NLS) 34. مكان الذباب في قارورة المواد الغذائية الطازجة مع عجينة الخميرة الطازجة كمصدر للبروتين.
  2. احتضان الملفات عند 18 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام (بحد أقصى 2 أسابيع) ثم قم بإزالة الأم الذباب من القنينة لتجنب الاكتظاظ مع ذرية جديدة، وإقامة قارورة تربية جديدة.
  3. تستمر الحضانة عند 18 درجة مئوية حتى الذباب ذرية eclose. حدد غير CYO-[غير جعنوان urlY الجناح] ذرية من النمط الجيني الصحيح من CaspaseTracker، والتي هي المعدلة وراثيا لCaspaseTracker وG-العناصر النزرة 35.
  4. في وقت واحد، وتوليد الرقابة الأبوية الذباب w118 غير المعدلة وراثيا وكاسباس حساسة (DQVA) الذباب في موازاة ذلك للتحقق من طلب تقديم العروض CaspaseTracker محددة ومضان GFP.
  5. أداء PCR التنميط الجيني لتأكيد الملفات مع CaspaseTracker باستخدام بادئات: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC، 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA، إنتاج منتج 3،897 سنة مضت. لالتنميط الجيني مواضع G-تتبع، واستخدام البادئات التالية لGFP (474 ​​بي بي)، 5'-CAC GAC عقاري عقاري مجموعة الاهلي TCC دول مجلس التعاون الخليجي ATG CCC G، 3'-CTT GTA CAG جنة مكافحة الإرهاب GTC CAT دول مجلس التعاون الخليجي GAG AGT GAT C. لطلب تقديم العروض (258 بي بي)، 5'-GGC TGC عقاري ATC TAC مجموعة الاهلي GTG مجموعة الاهلي عقاري ATC GG، 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC. وFlpase (655 بي بي)، 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG، 3'دول مجلس التعاون الخليجي TAC TAA شركة الخليج المتحدة TTG تكت TTG تكت CTG TCA C. على التنميط الجيني GAL4 في ناقلات pUWR (554 بي بي)، 5'-غا الائتلاف CAC CTT CGC ATC الهيئة العامة للضرائب CAGTCA شركة الخليج المتحدة، 3'-TGG AAT TGG GGT ACG تكت AGA.

2. الأنسجة إعداد وتلطيخ والتركيب

  1. لتشريح ذبابة، ومنع الأنسجة تشريح من الالتصاق على نصائح من البلاستيك ماصة وأنابيب الطرد المركزي، نصائح معطف وأنابيب مع الزلال 1٪ المصل البقري (BSA) الذائب في الماء.
  2. تشريح الذباب على وسادة سيليكون باستخدام ملقط.
    1. لتجنب إتلاف نصائح من ملقط على سطح صلب عند إجراء تشريح الأنسجة، نفذ تشريح على سطح السيليكون. لصنع لوحات السيليكون تشريح، تذوب السيليكون في عدة التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (قائمة المواد). بعد ذوبان السيليكون، إضافة 3-4 مل إلى 60 ملم الأنسجة صحن قطره الثقافة. يمكن إعادة استخدامها أطباق السيليكون.
    2. تخدير ذبابة مع CO 2، وتحويلها إلى لوحة سيليكون مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. إدخال CO 2 إلى قارورة تحتوي على الطاير باستخدام blowgun، ومن ثم نقل ر ذبابة تخديرالزراعة العضوية الوسادة التي لديها امدادات CO 2.
    3. استخدام زوج من ملقط لعقد رئيس الطاير، والزوج الثاني من الملقط لسحب الصدر في الاتجاه المعاكس لقطع رأس ذبابة من الجسم تغطي دون الإضرار العلاقة بين الرأس والمعى الأمامي.
    4. استخدام 2 أزواج من الملقط لإزالة الأجنحة والأرجل من القفص الصدري.
    5. استخدام زوج من ملقط لعقد الصدر، وزوج آخر من الملقط لسحب البطن لفصلها عن الصدر مرة أخرى دون الإضرار العلاقة بين المعى الأمامي والمعي المتوسط.
    6. تشريح الأعضاء الداخلية بما في ذلك الدماغ، الأمعاء، الأنابيب المالبيغية والمبايض كما هو موضح سابقا. 39-41
    7. إزالة كل قطعة من إهاب والهيئات الدهون مع ملقط كما تنتج هذه الأنسجة تألق ذاتي قوي. ويلزم الصبر والممارسة لإعداد نظام الجهاز كامل كما هو مبين.
  3. نقل الأنسجة تشريح إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي، وإصلاح الأنسجة واي0.5 مل من 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) في RT لمدة 20 إلى 30 دقيقة مع التناوب في الظلام عشر لتجنب طلب تقديم العروض تبيض وGFP في الأنسجة. تجنب تثبيت لفترة طويلة التي يمكن أن تعرض النتائج تلطيخ لاحقة.
  4. إزالة امتصاص العرق من قبل pipetting لطيف ويغسل 3 مرات مع 0.5 مل PBST (PBS + 0.1٪ تريتون X-100) في RT.
  5. Permeabilize الأنسجة مع 0.5 مل PBST في 4 درجات مئوية خلال الليل مع اهتزاز لطيف. قد يسبب حضانات أقصر ناقصة permeabilization وتلطيخ تسوية النتائج.
    1. إذا كان ذلك ضروريا للحد من تلوين الخلفية، والنظر في احتضان الأنسجة في 0.5 مل PBST مع 1٪ BSA، بدلا من برنامج تلفزيوني.
  6. غسل الأنسجة 3 مرات مع 0.5 مل PBST.
  7. وصمة عار النوى والأكتين الخيطية (F-الأكتين)، وتطبيق 0.5 مل PBST مع 10 ميكروغرام / مل من هويشت 33342 صبغ النووي الأزرق و 0.3 ميكرومتر اليكسا فلور وصمة عار 633 Phalloidin F-أكتين واحتضان في وقت واحد مع الأنسجة لمدة 1 ساعة على RT ثإيث تناوب لطيف في الظلام. تجنب تلطيخ لفترات طويلة حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة الخلفية.
    1. لالمناعية، واحتضان الأنسجة الثابتة وpermeabilized مع 0.1٪ تريتون X-100 في 0.5 مل PBS بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وصمة عار مع 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة لمكافحة ELAV أو مع 1: 200 التخفيف من معاداة كاسباس 3 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (300 ميكرولتر). متابعة من قبل الأجسام المضادة الثانوية المقابلة المخفف 1: 100 واحتضان لمدة 1-3 ساعة عند RT. انظر قائمة المواد للحصول على معلومات الأجسام المضادة المحددة.
  8. غسل الأنسجة 3 مرات، في كل لمدة 5 دقائق في 0.5 مل PBST مع دوران طيف.
  9. مع الماصة، وإزالة جميع PBST، ثم قم بإضافة 200 ميكرولتر مكافحة التبييض وكيل تصاعد (انظر المواد) لتغطية كامل الأنسجة لمدة 1-3 ساعة عند RT، أو 4 درجات مئوية خلال الليل. سوف الأنسجة المثلى التي استوعبت تماما وكيل تصاعد تنزل الى قاع الأنبوب.
  10. قبل تنظيف شريحة زجاجية مع الماء أو 70٪ من الإيثانول ونقل الأنسجة مع تصاعد وكيل إلى الزجاجالصورة الشرائح.
  11. المكان بعناية زلة غطاء زجاجي على الأنسجة. تطبيق الفازلين على شريحة زجاجية وانزلاق الغطاء لتفادي تدمير الأنسجة عن طريق زيادة في الضغط. إزالة عامل إضافي المتصاعدة مع المناديل الورقية.
  12. ختم زلة تغطية من خلال تطبيق طلاء الأظافر على طول حواف غطاء زلة لتجنب تسرب من تصاعد وكلاء من الأنسجة.

3. متحد البؤر المجهري

  1. استخدام متحد البؤر برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر المقلوب. ومع ذلك، المجاهر يصل الصحيحة يمكن أن تستخدم أيضا. إلى الأنسجة الصورة باستخدام بلاط، والحفاظ على استقرار درجة حرارة الغرفة لتجنب الانجراف التركيز والتحول من الطائرة س ص بسبب التمدد الحراري والانكماش من المكونات. نظم التحكم البيئي ونظم التعويض التركيز الانجراف تساعد على تجنب هذه المشكلة بسبب فقدان التوازن الحراري للنظام المجهر.
  2. وضع الشريحة على مرحلة من مراحل المجهر. تأخذ بعض الصور اختبار باستخدام دقة منخفضة (125 × 125 بكسل) لد تحديد العدد المناسب من البلاط اللازم لتغطية المنطقة بأسرها من الفائدة (ROI).
  3. ضبط نظام المجهر لالتقاط الصور مع دقة المسح الضوئي مثل 500 × 500 بكسل. تحديد الهدف مثل 20X NA 0.8 أو 63X NA 1.4 هدف الخطة-امزيغ لتحليل الأنسجة من خلال coverslips الزجاج، بحيث أن كل الصور (البلاط) تداخل بنسبة 20٪ على جميع الأطراف.
  4. إعداد تسلسل الصور من أطول لأقصر موجات الإثارة، كما يتسبب في ضوء الطول الموجي الطويل أقل الصور وتبييض. تسلسل من أطول لأقصر الإثارة الطول الموجي هو: (ط) 633 نانومتر لPhalloidin F-الأكتين وعن الأجسام المضادة لcaspases تفعيلها، (ب) 561 نانومتر لطلب تقديم العروض، (ج) 488 نانومتر لGFP، و (د) 405 نانومتر ل وصمة عار النووية هويشت.
  5. أثناء التصوير، وتقليل التعرض للخلايا لإثارة الليزر الفلورسنت خلال عملية التصوير لتجنب الصور وتبييض عن طريق الحد من كثافة الليزر للحصول على صور ذات جودة عالية من الأنسجة.
  6. بعدييتم جمع السحراء، دمج الصور باستخدام برنامج المجهر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هناك نوعان من العناصر الرئيسية التي تسمح CaspaseTracker للكشف عن النشاط كاسباس في الخلايا السليمة العادية (الشكل 1A). وأول هذه هو 146 حمض أميني كاسباس شطورة ببتيد على غرار كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي Apoliner (الشكل 1B). 28 ويستمد هذا ببتيد من DIAP1 (ذبابة الفاكهة المانع من موت الخلايا المبرمج) التي تحتوي على طبيعيا الموقع كاسباس واحد هو المشقوق خلال الخلايا عادة من كاسباس DrICE. 42،43 DrICE ما يعادل كاسباس 3 في الثدييات ويشق ركائز الخلوية الأكثر شهرة. 4،32 مميزة من caspases، والمشقوق DIAP1 وببتيد المشتقة منها بعد حمض الأسبارتيك معين، Asp20 تقع داخل الاعتراف كاسباس تسلسل 17 DQVD-20، وتحور في بقايا Asp20 اجبة إلى علاء (DQVA) تلغي الانقسام. 42،43 مماثلة لApoliner، 28 هذا جزء DIAP1 هو anchoالأحمر في السيتوبلازم في غشاء البلازما عن طريق الماوس CD8 (الأحماض الأمينية سلسلة ألفا 1-220)، وهي أداة تستخدم عادة في ذبابة الفاكهة. مرساة الغشاء CD8 يمنع أي حمولة المربوطة تحمل تسلسل النبات النووي (nucGFP في حالة Apoliner) من translocating إلى النواة في غياب النشاط كاسباس 28 المكون الرئيسي الثاني من CaspaseTracker هو نظام G-TRACE ذبابة الفاكهة التي ل الخميرة عامل النسخ GAL4 الحث على التعبير عن flippase (FLP) recombinase (ويدفع في وقت واحد طلب تقديم العروض). 34 flippase المكوس وقف كودون مما يؤدي إلى التعبير دائم من nucGFP. لجعل G-الشحيحة استجابة إلى النشاط كاسباس، وترافق ذلك مع نظام Apoliner من خلال توصيل GAL4، وهو مطلوب لتنشيط G-الشحيحة، إلى البلازما الراسية غشاء كاسباس شطورة DIAP1 جزء من Apoliner (الشكل 1A). 35

التي قطعناها على أنفسنا modif إضافيةications إلى مكون Apoliner من CaspaseTracker لتحسين المرافق. الأهم من ذلك، فمن الأهمية بمكان أن جهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس نفسها لا تمنع caspases، ويحتمل أن الحفاظ على الخلايا التي سيموت خلاف ذلك. على الرغم من أن التحوير Apoliner لم تتسبب الظواهر واضحة في ذبابة الفاكهة 28، كما هو متوقع من مثبط كاسباس قوية، فإن حتى الحفاظ عرضية من خلايا يبطل الغرض من تحديد الخلايا الطبيعية مع النشاط كاسباس. ومع ذلك، فإن جزء DIAP1 في Apoliner يحتوي على عزر (135 DICG-138) الذي تم عرضه في وقت لاحق لمنع بشكل فعال DrICE، نفس كاسباس أن يشق DIAP1 في Asp20 43 آلية تثبيط كاسباس تم الكشف من قبل التركيب البلوري الذي DIAP1 لا بد Asp135 في الموقع DrICE نشيطا مثل تقليد كاسباس الركيزة (ولكن ليس هو المشقوق). أظهر تحليل 43 البيوكيميائية أن استبدال الارجنتين في Asp135 يلغي وظيفة DrICE المثبطة. 43 لذلك، تم تصميم CaspaseTracker مع نفس التحور D135R لتجنب تثبيط كاسباس (الشكل 1B). 35 على غرار Apoliner، تم تغيير طبيعيا تسلسل DIAP1 الأسباراجين-الأسباراجين في دي نوفو N-محطة التالية انشقاق في Asp20 إلى الغليسين-فال في CaspaseTracker لمنع تدهور GAL4 بحكم N-النهاية على الانقسام كاسباس (الشكل 1B). 28 وبالإضافة إلى ذلك، نحن تنصهر في MYC العلامة لمحطة سي من GAL4 للكشف عن استعداد التعبير CaspaseTracker 35 من الضرورة، طلب تقديم العروض Apoliner نفسه وتم حذف أشرطة nucGFP لجعلها متوافقة مع G-الشحيحة، الذي يحتوي أيضا على طلب تقديم العروض وnucGFP. 28،35

لأن GAL4 يتحمل الخاصة إشارة توطين النووية وينشط بشكل فعال النسخ عبر عنصره الهدف استجابة الحمض النووي (UAS) عندما تنصهر في الجينات المحورة أخرى في ذبابة الفاكهة، ويفترض سوى عدد قليل من جزيئات يختلط GAL4خفف من caspases هيولي تكفي لتشغيل التعبير طلب تقديم العروض في غضون بضع ساعات (تقدر ≤12 ح). لأن النشاط جهاز الاستشعار البيولوجي يتطلب دي نوفو النسخ والترجمة من طلب تقديم العروض، فإنه لا يعلم في الوقت الحقيقي النشاط الأنزيمي. على الرغم من أن CaspaseTracker طلب تقديم العروض سيتم تدهورت بشكل كبير على الأرجح في غضون يوم بعد توقف النشاط كاسباس، سيتم أعرب nucGFP من قبل المروج اليوبيكويتين لحياة الخلية ونسله.

لإثبات أولا أن CaspaseTracker تستجيب لتفعيل كاسباس في الجسم الحي، تعرضت الذباب جهاز الاستشعار البيولوجي CaspaseTracker الكبار إلى الخلية محفزات الذي يحفز الموت. المبيض ذبابة الفاكهة هو نموذج موت الخلايا المدروس كغرف البيض الخضوع لموت الخلايا المبرمج عندما وشدد الحيوانات، ويفترض آلية مطابقة الشروط البيئية لذرية الإنتاج. 37،44،45 للحث على موت الخلايا، وكانت الذباب جهاز الاستشعار البيولوجي الباردة صدمت 1 ساعة عند -7° C (تجميد الحيوانات)، وتم تشريح المبيض من الحيوانات الحية في اليوم التالي (الشكل 2A). وعلى النقيض من الذباب جهاز الاستشعار البيولوجي غير المعالجة، والمخادع البيض بعد الصدمة الباردة أصغر بشكل ملحوظ وأظهرت أحمر قوي (الأخير) والأخضر (دائم) النشاط جهاز الاستشعار البيولوجي، والتحقق من تفعيل جهاز الاستشعار البيولوجي بعد التحفيز موت الخلايا (الشكل 2B، دمج). تم الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي في نوى كل الخلايا الجرثومية (خلايا ممرضة والبويضات) والخلايا الجسدية (خلايا بصيلات) في غرف البيض، ولكن فقط في الذباب المعالجة. كما لوحظت 35 الأشكال التضاريسية المميزة لموت الخلايا المبرمج بسهولة في غرف البيض جهاز الاستشعار البيولوجي إيجابي بما في ذلك تجزئة النووي، والتكثيف الحمض النووي وتدهور (فقدان وصمة عار الزرقاء). ويمكن الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي في الخلايا نفسها مع كل من التكثيف النووي (هويشت) وcaspases النشطة (immunostain)، ولكن حدث تلطيخ على أشده لcaspases النشطة في المناطق حيث كل من الحمض النووي النووي وcaspasوقد تضاءلت إشارات جهاز الاستشعار البيولوجي الإلكتروني أو المتدهورة (الشكل 2B). 46،47 آليات موت الخلايا التي تحدث بعد صدمة البرد لا تتميز بشكل جيد، ويمكن أن تكون آليات وفاة أخرى في اللعب. ومع ذلك، وتم الحصول على نتائج مماثلة بعد المجاعة الأحماض الأمينية، والذي يعرف أن يسبب موت الخلايا المبرمج. 35

لتحديد ما إذا CaspaseTracker يمكن الكشف عن النشاط كاسباس غير أفكارك، والأعضاء الداخلية من الذباب القديمة 1-اليوم-صحية تم تشريح بدقة عن طريق إزالة إهاب autofluorescent والدهون. تم إصلاح الأنسجة من ذبابة تمثيلية واحدة، المركبة، ملطخة هويشت بمناسبة نوى ومع Phalloidin وصمة عار لF-الأكتين للكشف عن خلايا العضلات. وعلى النقيض من غرف البيض الصحية، التي تفتقر إلى تفعيل جهاز الاستشعار البيولوجي، كانت خلايا العضلات الملون F-الأكتين بين الدوائر البيض على حد سواء حمراء وخضراء وجهاز الاستشعار البيولوجي النشاط (الشكل 3A، أقحم). ومع ذلك، فمن الممكن أن بيوزأيضا تسميات nsor الخلايا الأخرى. العديد من الأنسجة والأعضاء من تربى على النحو الأمثل الذباب القديمة 1-اليوم-صحية أخرى أظهرت بارز نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس يفترض يعكس القاعدية وظيفة كاسباس غير أفكارك (الشكل 3A). ظهرت خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي إيجابي طبيعية شكليا وقعت في أنماط المنظمة في الأنسجة مما يشير إلى أن مجموعات فرعية معينة من الخلايا تفعيل caspases، على سبيل المثال المشارب من خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي إيجابي التفاف المعى المؤخر (3A الشكل، الشكل).

أفضل دليل على أن CaspaseTracker هو مراسل معين من caspases هو عدم وجود إشارة في الذباب معربا عن جهاز الاستشعار البيولوجي السيطرة، وهو مطابق لCaspaseTracker إلا لآسيا والمحيط الهادئ لعلاء طفرة حمض أميني واحد في اجبة الموقع انشقاق كاسباس، وتغيير DQVD إلى DQVA ( الشكل 1B و3B). باستثناء خلية نادرة بشكل استثنائي (الشكل 3B، السهم الأخضر)، إشارة observ الوحيدإد في الذباب جهاز الاستشعار البيولوجي السيطرة DQVA هي هياكل autofluorescent، مثل أجزاء الفم (الشكل 3B) وتناولها الطعام في المحاصيل وغيرها (الشكل 3B و 4)، والتي لوحظت أيضا في الذباب الأبوية غير المعدلة وراثيا التي تفتقر إلى جهاز الاستشعار البيولوجي كاسباس. تحدث 35 الخلايا المسمى CaspaseTracker على فترات منتظمة على طول (الكلى) الأنابيب المالبيغية وغالبا ما يحمل على حد سواء الأخير (الأحمر) والماضي (الأخضر) تفعيل كاسباس في وقت واحد، في حين أن العديد من الخلايا في الدماغ، الفص البصري، الفؤاد، والمحاصيل، المعي المتوسط و قناة البيض إما حمراء أو خضراء (الأرقام 4 و 5A).

وللتدليل على ذلك أن الخلايا طويلة العمر يمكن أن يعيش النشاط كاسباس، كان immunostained الفص البصري للELAV علامة عموم العصبية (الجنينية الرؤية غير الطبيعية القاتلة). 48 نواة للعديد من الخلايا العصبية وصفت مزدوجة مع GFP المستهدفة النووية من CaspaseTracker وELAV، بما يتفق مع اوربا عمرا طويلاLLS باستخدام caspases لوظائف غير الموت (الشكل 5B). وعلاوة على ذلك، إذا تم تشغيل جهاز الاستشعار البيولوجي خارج لمدة 10 يوما (باستخدام Gal80ts)، خلايا جهاز الاستشعار البيولوجي الإيجابية تستمر لمدة في القناة الهضمية (الشكل 6A و ب) والدماغ وغيرها (لا يظهر). باستخدام CaspaseTracker كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي، ونحن نقدم نظرة الأولى من النشاط كاسباس القاعدية في الحيوانات كلها.

شكل 1
الشكل 1: CaspaseTracker نظام جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن النشاط كاسباس غير أفكارك. (أ) مكونات كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي ذبابة الفاكهة. (ب) يتكون الجزء كاسباس شطورة من نظام جهاز الاستشعار البيولوجي CaspaseTracker من مرساة غشاء البلازما (mCD8)، وهو جزء من DIAP1 تحتوي على الطبيعي الموقع كاسباس الشق Asp20 تنصهر إلى النسخ GAL4 عامل مع علامة-3X MYC C-محطة وأعرب عن طريق اليوبيكويتين المواليةmoter. النتائج كاسباس انشقاق في النبات من GAL4 إلى نواة لحمل نظام G-الشحيحة. في جهاز الاستشعار البيولوجي تحكم، يتم تغيير بقايا Asp20 المطلوبة في الموقع كاسباس انشقاق حامض 4-الأمينية (DQVD) لعلاء (DQVA) لإلغاء كاسباس الانقسام. الذباب المعدلة وراثيا CaspaseTracker تحتوي على 4 الجينات المحورة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
يتم تنشيط CaspaseTracker التي كتبها caspases خلال موت الخلايا: الرقم 2. (أ) رسم تخطيطي للذبابة الفاكهة المبيض ومخطط تدفق لالناجم عن الصدمة الباردة موت الخلايا وتستخدم ذبابة الفاكهة المبيض رسم (عن طريق POLAN سانتوس) وصورة ذبابة الفاكهة (عن طريق دارين Obbard) بإذن (ب) غرف البيض من المبيض من 6- يوم الأنثى CaspaseTracker الذباب تغذية ث إيث الغذاء الطيران العادي لمدة 6 أيام (غير المعالجة) أو 1 بعد يوم من صدمة البرد (-7 ° C، 1 ساعة، تليها 25 درجة مئوية لمدة 24 ساعة) للحث على تفعيل كاسباس في غرف البيض. التوسعات المبيض تعامل الباردة (إطارات اليمنى السفلى) تظهر ثلاث غرف البيض في واحدة تطوير ovariole سلسلة (توسيط حوالي عموديا) مع دليل على التكثيف النووي (أعلى غرفة البيض)، والتجزؤ النووي (غرفة البيض المتوسط ​​والأشكال) والتحلل (أقل البيض غرفة) على أساس هويشت صمة عار الحمض النووي (الأزرق). تم الكشف عن caspases النشطة (المضادة للكاسباس 3، أرجواني) في غرف بيضة الوسطى والدنيا. طلب تقديم العروض وGFP نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي (الأحمر والأخضر والأصفر السهام) تحدث في الخلايا مع التكثيف الحامض النووي، التي غالبا ما صمة عار منتشرة مع caspases النشطة (إدراجات). السهام البيضاء علامة نوى تفتقر إلى كل من النشاط جهاز الاستشعار البيولوجي ونشط immunostain كاسباس. * إشارات تألق ذاتي. وترد هذه البيانات بإذن من تانغ وآخرون، علوم التشيك 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: الأدلة على النشاط كاسباس الفسيولوجية على نطاق واسع. (أ) مدموجة صورة مبائر من CaspaseTracker (DQVD) طلب تقديم العروض وnucGFP من ذبابة واحدة eclosed حديثا التي أثيرت في 18 درجة مئوية، وتشريح وملطخة H33342 للنوى وPhalloidin لF-الأكتين (وردي)، وتصويرها مع مدينة دبي للإنترنت. يظهر Phalloidin فقط في أقحم لغرف البيض. (ب) وتلت نفس الظروف الداخلي والتصوير لCaspaseTracker التحكم (DQVA) الذباب. * الهياكل Autofluorescent. وترد هذه البيانات بإذن من تانغ وآخرون، علوم النائب العام 2015. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر منهذا الرقم.

الشكل (4)
الرقم 4: النشاط كاسباس القاعدية في العديد من الأنسجة تكبير أعلى من مدينة دبي للإنترنت ومضان الصور مبائر من GFP (الماضي) وطلب تقديم العروض (الأخيرة) CaspaseTracker (DQVD) النشاط ونوى هويشت الملون في الدماغ، الفؤاد، والمحاصيل، المعي المتوسط، الأنابيب مالبيغي وناقلة البيضات من الشكل 3A. * الهياكل Autofluorescent. وترد هذه البيانات بإذن من تانغ وآخرون، علوم النائب العام 2015. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: النشاط كاسباس غير أفكارك في الخلايا العصبية في ذبابة الفاكهة الفص البصري. (أ) مدينة دبي للإنترنت والصور مبائر مع طلب تقديم العروض (الأخير) وGFP (الماضي) CaspaseTracker (DQVD) النشاط ونوى ملطخة هويشت في الدماغ. طلب تقديم العروض + GFP خلايا مزدوجة المسمى (الأسهم الصفراء). (ب) colocalizes NucGFP مع immunostain لعموم العصبية البروتين ELAV النووية في الفص البصري من CaspaseTracker (DQVD) يطير الدماغ. وتظهر الخلايا العصبية مع إشارات مترجمة شارك من NucGFP وELAV (السهام البيضاء). ملاحظة الخلايا العصبية التي تحمل علامات طلب تقديم العروض ليست موجودة في هذا المجال بالذات. وترد هذه البيانات بإذن من تانغ وآخرون، علوم النائب العام 2015. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نحن هنا توضيح البناء والداخلية عمل من CaspaseTracker التي تسهل الكشف عن النشاط كاسباس القاعدية على نطاق واسع في الأنسجة السليمة. الخطوات الحاسمة للكشف عن النشاط كاسباس غير أفكارك في الجسم الحي هي: 1) توليد الذباب مع التحوير جهاز الاستشعار البيولوجي، 2) التحقق من وظيفة مراسل كاسباس محددة مع الضوابط المناسبة، 3) ممارسة تقنيات تشريح لمراقبة جميع أجهزة الجسم الداخلية من الكبار ذبابة الفاكهة، و4) النشاط المميز جهاز الاستشعار البيولوجي من القطع الأثرية autofluorescent.

تم تعديل ببتيد كاسباس شطورة الطبيعي التي هي بمثابة جهاز استشعار كاسباس محددة لتجنب أي نشاط كاسباس المثبطة من قبل جهاز الاستشعار البيولوجي. وقدمت المزيد من التعديلات لتجنب تدهور السريع للعامل النسخ GAL4، وإدخال علامة حاتمة. نحن أيضا وصف الجسم كله الجهاز تشريح الذباب، المناعية و التركيب و الفحص المجهري متحد البؤر من الأنسجة ذبابةالصورة للكشف عن النشاط كاسباس غير أفكارك.

في حين CaspaseTracker مثالية للكشف عن الخلايا التي البقاء على قيد الحياة مع انخفاض مستويات النشاط كاسباس، فإنه ليس لأحد الصحفيين من نشاط انزيم في الوقت الحقيقي، كما يطلب من عدة ساعات لتشغيل جهاز الاستشعار البيولوجي. ومع ذلك، فإننا لم تحدد الحد الأدنى من الوقت للكشف، والتي من المرجح أقصر بكثير من الذي تحتاج إلى التطبيقات هو موضح هنا. وعلى النقيض من CaspaseTracker، فإن القيود الرئيسية من أجهزة الاستشعار كاسباس أخرى هو عدم قدرتها على كشف مستويات منخفضة من النشاط كاسباس، كما أنها مصممة في المقام الأول لدراسة موت الخلية. يتم تضخيمه النشاط كاسباس بعد التحفيز موت الخلايا، مما تسبب في هدم خلية ضخمة في أقل من 30 دقيقة. 49 لذلك، والكشف عن تفعيل كاسباس وغالبا ما يفترض أن تكون علامة لبعض موت الخلايا. 50،51 ومع ذلك، أدلة متزايدة تشير إلى أن caspases لها غير أفكارك، وحتى الوظائف غير الهادمة في الخلايا السليمة. 7-21 وpresuومن المرجح دون الكشف عن مستويات منخفضة ميد النشاط الأنزيمي تقتصر مكانيا وبشكل مؤقت من caspases التي تقوم بها اليوم وظيفة بحلول التكنولوجيات المتاحة. والتغلب على هذه المشكلة عن طريق CaspaseTracker، والتي من المرجح يتطلب بعض الأحداث كاسباس الانقسام لتوليد إشارات قوية، ولا تتطلب النشاط كاسباس الأنزيمية المستمر لتسمية بشكل دائم هذه الخلايا في الجسم الحي.

الأدلة المقدمة إلى أن CaspaseTracker غير محددة لcaspases، على الرغم من أننا لا يمكن استبعاد احتمال أن البروتياز مجهولة أخرى الحية محددة يمكن تفعيل CaspaseTracker. ومع ذلك، تغذية الذباب مع كوكتيل من كاسباس المانع الببتيدات كتل النشاط CaspaseTracker (غير منشورة). كما نؤكد على أهمية تجنب أجهزة الاستشعار التي أنفسهم تمنع caspases، وأهمية هذه الأجهزة الرقابة والذباب غير المعدلة وراثيا لتجنب الاستنتاجات الخاطئة بسبب تألق ذاتي متأصل في إهاب الحشرات، والدهون الداخلي ديبويجلس، تناولها الطعام أو الإرباك الأخرى.

وهناك تحد آخر هو التمييز بين وظائف المؤيدة للموت وعدم الموت من caspases. ويمكن ربط وظائف المؤيدة للموت وعدم الموت تطويريا لغرض الانتقال خلايا بين الحالة الفسيولوجية الطبيعية للموت توقيت مناسب، على سبيل المثال التوسع في الخلايا المناعية على محاربة العدوى والقضاء لاحق من هذه الخلايا على الوقاية من السرطان. وبالتالي، فإننا لا يمكن القضاء على إمكانية أن بعض النشاط كاسباس القاعدية التي لوحظت في الأعضاء الداخلية هو بدلا من ذلك محاولة لتعزيز موت الخلايا، بما يتفق على ما يبدو مع عشرات التقديرية للموت الخلايا المليارات التي تحدث يوميا في جسم الإنسان. 52 ومع ذلك، فإن التشكل صحي الخلايا معربا عن جهاز الاستشعار البيولوجي يشير بقوة إلى أن CaspaseTracker قادر على الكشف عن النشاط كاسباس المعدة للالعادية يوم ظائف caspases.

واقترح Caspases إلى أدوار غير الموت مثل خليةتكاثر. وهذا يتفق مع محاولات سابقة لتوليد خطوط الخلايا الثديية معربا عن مستقر البروتينات الفيروسية التي تربط وبشكل مباشر تمنع caspases الخلوية (على سبيل المثال، CrmA). في حين ظهرت مئات المستعمرات الخلية خلال اختيار الدواء مع مكافحة ناقلات فارغة، بشكل غير متوقع الصفر المستعمرات شكلت في الثقافات موازية transfected مع ناقلات معربا عن مثبطات كاسباس (غير منشورة). وهكذا، caspases المرجح لها وظائف واسعة الانتشار في الخلايا الطبيعية التي يتم تقدير كما في الوقت الحالي. ويدعم هذا أيضا من الحقائق التي تم الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي القاعدية في الطيران CaspaseTracker في العديد من أنواع الخلايا في معظم أجهزة الجسم، بما في ذلك الخلايا العصبية، في الذباب صحية طبيعية. النشاط كاسباس صحي في الخلايا العصبية قد تفكيك النهايات متشابك لتعزيز وظيفة المخ المعتادة التي كتبها الشق نفس ركائز كما حدث أثناء موت الخلايا المبرمج، أو وظائف اليوم وظائفهم قد يكون مختلفا تماما من الأنشطة مثل موت الخلايا المبرمج. في حين منخفضة مقابل مستويات الأنزيمية عالية النشطةقد يكون caspases التمييز الحاسم بين يوم عمل وموت الخلايا، وهناك عدد قليل knockin الحيوانات متحولة مع ركائز كاسباس uncleavable محددة تدعم هذا الاحتمال. 17،53 ولكن التقدم الذي أحرز مؤخرا يشير إلى أن كاسباس 8 يمنع necroptosis ربما عن طريق الشق RIPK، يمكن تنظيمها 54 الاكتئاب متشابك وأمبا مستقبلات الإلتقام من الانقسام كاسباس من Gap43 و 55 و تجهيز الرنا الميكروي يمكن تنظيمها من قبل انشقاق كاسباس من المقامر. 14،15،56

هناك العديد من التطبيقات الإضافية لهذا جهاز الاستشعار البيولوجي. لتحديد ما إذا كان يتم تنشيط caspases في أوقات محددة أو في أنسجة معينة، تعبيرا عن جهاز الاستشعار البيولوجي يمكن أن تنظم بسهولة زمنيا (على سبيل المثال، وذلك باستخدام Gal80ts) وفي أنواع معينة من الخلايا (على سبيل المثال، والسائقين GAL4 حاسة الشم محددة). باستخدام Gal80ts لقمع التعبير جهاز الاستشعار البيولوجي حتى ظهور الكبار الذباب لا يزال أسفرت عن النشاط جهاز الاستشعار البيولوجي على نطاق واسع، مشيرا إلى أن caspasوفاق يمكن تفعيلها في مراحل الكبار (الشكل 6C ود). 35 عن طريق استبدال جزء DIAP1 مع ركائز كاسباس الأخرى، وتطبيقات أخرى قد تشمل أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المحددة للcaspases مختلفة وللكشف عن انشقاق من ركائز محددة. فإن جهاز الاستشعار البيولوجي CaspaseTracker تعزيز فهمنا لدور الأنشطة كاسباس غير أفكارك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

نشكر POLAN سانتوس ودارين Obbard عن الرسوم التوضيحية ذبابة الفاكهة في الشكل. 2A، مارسيلو جاكوبس-لورينا لاستخدام insectary JHMRI. وأيد هذا العمل من قبل زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (فرقة العمل الرفيعة المستوى)، لجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة)، والمعاهد الوطنية للصحة منح NS096677، NS037402 وNS083373 (JMH). هو لام تانغ هو زميل مؤسسة Shurl وكاي كورتشي من مؤسسة أبحاث علوم الحياة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Tags

علم الأحياء الجزيئي، العدد 117، كاسباس، جهاز الاستشعار البيولوجي،
<em>في فيفو</em> جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في <em>ذبابة الفاكهة</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M.… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter