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Biology

体内生物传感器跟踪非凋亡胱天蛋白酶的活动在果蝇

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

以检测健康细胞在包含蛋白酶的活性水平低的整体动物， 果蝇生成指定CaspaseTracker高度敏感的生物传感器。依赖性的caspase-生物传感器的活性在长寿命的健康细胞中检测遍布在没有死亡刺激的最佳条件下饲养成年动物的内部器官。

Introduction

胱天蛋白酶是由天门冬氨酸键后残留许多裂解细胞内蛋白介导的细胞凋亡的半胱氨酸蛋白酶。例如，引发剂胱天蛋白酶激活效应器半胱天冬，derepress的DNA核酸酶，裂开细胞骨架元件和改变细胞膜的脂质组合物迅速拆除细胞和由邻近该处置细胞尸体细胞刺激它们的识别和吞噬1-4据估计数十亿的细胞每天死于在人体内，与细胞凋亡是化疗诱发的肿瘤细胞死亡的一个重要机制。5一组不同胱天蛋白酶可以通过不同的非凋亡进程会导致细胞死亡，刺激先天免疫6因此，对半胱天冬大多数研究都集中在其促死亡功能。

有趣的是，在该领域早期证据表明，负责促进细胞死亡同一半胱氨酸蛋白酶也具有非死亡˚Functions。先驱研究表明，胱天蛋白酶涉及健康细胞不同的细胞功能，包括细胞增殖和迁移的胚胎发育过程中的调节。7-9胱天蛋白酶所需的精子细胞个体在果蝇 10,11，用于阻断的替代necroptotic细胞死亡途径小鼠12,13，和用于微RNA加工中C.线虫 14,15在或许是最长寿的细胞，神经元，半胱天冬等凋亡机制在神经元活动的调节通过修剪突触末梢牵连，认为过程是必须加强其他突触学习和记忆。16 18这是可能的半胱氨酸蛋白酶促进由类型没有全细胞死亡微小神经突起的小细胞凋亡的突触修剪。19然而，胱天蛋白酶可具有无关的替代功能凋亡样的事件。20,21双重作用在生活中和死亡不是唯一的胱天蛋白酶; BCL-2家族的蛋白和细胞色素C在健康细胞的细胞能量学的作用，但也芯凋亡途径是受许多类型的细胞应激的激活的一部分。22-25尽管没有证明，逻辑上似乎进化联天 - 工作在同一分子内死亡的作业，以确保不适宜或不良细胞及时消除。

目前，非凋亡胱天蛋白酶活性的分子机制尚不了解，和非凋亡胱天蛋白酶活性的胚胎发育过程中和在成体组织中的程度也没有已知的。一个主要挑战是从半胱氨酸蛋白酶的死亡区分工作一天工作的难度。在对比凋亡和pyroptosis，当caspase活性是由一种蛋白水解级联放大，胱天蛋白酶的天作业，预计通过许多可用TECHN发生在低得多的水平的酶活性，可能低于检测ologies。

在此之前这里介绍的工作，其他人开发出了多种生物传感器的caspase为不同的目的。该生物传感器SCAT（ 例如 ，ECFP-DEVD金星）使用快速检测FRET实时caspase活性在培养细胞和动物组织。26,27经蛋白酶裂解，Apoliner（mCD8-RFP-DQVD-核针对性GFP部分nucGFP）发生时，其细胞膜系绳是由半胱天冬裂解分钟内的亚细胞重新定位。28同样，ApoAlert-pCaspase3传感器（NES-DEVD-YFP-NLS）从胞浆到在蛋白酶裂解细胞核relocalizes。29,30更多最近，在iCasper生色被巧妙地设计的，当由胱天蛋白酶主要在发育性细胞死亡关联裂解，允许生物传感器的活性检测在实时在果蝇胚胎神经元，但发荧光。嗅觉神经元的31胱天蛋白酶依赖的死亡过程中老化demonst通过每次收看生物传感器（ 例如，mCD8-PARP-金星）的胱天蛋白酶切割形式的免疫检测评分，32,33重要的是，在不存在的细胞死亡中的棘检测由敏感免疫染色的caspase-3的活化形式培养的神经元，并在使用核CellEvent报告染料的胱天蛋白酶依赖的荧光，但困难遇到由于光毒性，虽然细胞死亡被推迟，直到脊柱消除后的体细胞。19因此，需要新的胱天蛋白酶的生物传感器，以检测和跟踪与体内基底caspase活性的细胞。

为了克服这些困难，我们产生了新的双色蛋白酶的生物传感器，指定CaspaseTracker。这一策略结合果蝇胱天蛋白酶敏感Apoliner生物传感器28与果蝇的G-TRACE FRT重组酶系统34的修改版本以永久标记和跟踪细胞在体内 。<SUP> 35 Gal4的激活的G-TRACE系统允许胱天蛋白酶的非常低的水平，以激活CaspaseTracker，导致RFP的表达在已经历过caspase活性的任何细胞的细胞质和永久核靶向GFP的表达。35该系统可标记细胞在整个使用果蝇 ，对胱天蛋白酶和细胞死亡研究的易于处理的和广泛使用的模型系统整体动物的生命。36-38

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Protocol

1. CaspaseTracker苍蝇的制备

  1. 为了准备CaspaseTracker（DQVD）为飞行实验，执行此交叉：UBI-CaspaseTracker×g的-TRACE（UAS-RFP; UAS-FLP;育碧>停止> GFP-NLS），转增7-10处女女（或男性）通过泛素启动子35一起苍蝇携带的caspase生物传感器基底mCD8-DIAP1-Gal4的驱动具有相同数目的男性（或女性）的G-TRACE苍蝇，其具有第二染色体CYO平衡器避免G-的纯合组合的杀伤力TRACE（UAS-RFP，UAS-FLP和育碧>停止> GFP-NLS）34。地方苍蝇与鲜酵母膏作为蛋白质来源新鲜食物小瓶。
  2. 在18℃孵育文件5至7天（最多2周），然后删除父从小瓶苍蝇，以避免与新的后代人满为患，并成立新的养殖瓶。
  3. 在18℃的孵化持续直到后代过得E关闭。选择非CYO [非C网址Y翼]后代CaspaseTracker正确的基因型，这是转基因CaspaseTracker和G-微量元素35。
  4. 同时，产生控制亲非转基因果蝇w118和caspase不敏感（DQVA）苍蝇并行核实具体CaspaseTracker RFP和绿色荧光。
  5. 进行PCR基因分型，以确认用引物与CaspaseTracker文件：5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC，3'- TGGAATTGGGGTACGTCTAGA，产生3,897 bp的产物。对于基因分型的G-跟踪轨迹，使用以下引物GFP（474基点），5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G，3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT℃;对于RFP（258基点），5'- GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG TTC AAG ATC GG，3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC;和Flpase（655基点），5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG，3'-GCC TAC TAA CGC TTG TTG TCT TCT CTG TCA C.对于基因分型Gal4的在pUWR向量（554基点），5'-GAA GCA CAC CTT CGC GCT ATC CAGTCA CGC，3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA。

2.组织准备，染色与安装

  1. 对于飞解剖，防止解剖组织粘附到溶解于水的塑料吸头和离心管，外套提示和管以1％牛血清白蛋白（BSA）。
  2. 解剖上的飞行使用镊子硅胶垫。
    1. 为了避免在执行组织解剖时损坏钳提示在坚硬的表面，在硅表面上进行清扫。用于制备有机硅夹层板，根据制造商的说明（材料清单）熔融硅中的商业试剂盒。熔化硅氧烷后，放入3至4毫升到60毫米直径组织培养皿中。硅菜肴可重复使用。
    2. 麻醉用CO 2的苍蝇，并将其与1毫升冷的PBS转移到硅胶板。引入CO 2用吹箭筒含有苍蝇的小瓶，然后转移麻醉苍蝇ŤOA垫具有CO 2的供应。
    3. 使用一对镊子保持飞头，以及第二对钳子的拉胸部在相反的方向上从主体覆盖而不损坏磁头和前肠之间的连接断开飞头。
    4. 使用2对镊子从胸部取出翅膀和腿。
    5. 用一对镊子保持胸部，和另一对镊子的拉腹部，将其从胸部再次而不损坏前肠和肠之间的连接分离。
    6. 如以前证明解剖内脏器官包括脑，肠，马氏管和卵巢39-41
    7. 除去角质层的所有作品和脂肪体用钳子因为这些组织产生强烈的自发荧光。耐心和实践都需要准备一个完整的器官系统，如图所示。
  3. 解剖转移组织对1.5毫升离心管中，并修复组织的Wi个0.5毫升的4％多聚甲醛的PBS（磷酸盐缓冲盐水）在RT 20至30分钟，在黑暗中旋转，以避免在组织漂白RFP和GFP。避免长时间固定会危及随后的染色效果。
  4. 通过温和移液除去多聚甲醛，用0.5ml PBST（PBS + 0.1％的Triton X-100）在室温下洗涤3次。
  5. 在4℃下轻轻摇动透用0.5mL PBST组织过夜。较短的孵化可能导致不完整的通透性和妥协染色结果。
    1. 如果有必要，以减少背景染色，考虑在0.5毫升的PBST孵育组织用1％BSA，代替PBS中。
  6. 用0.5毫升PBST洗涤组织3次。
  7. 染色细胞核和丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白），应用0.5毫升的PBST以10微克/毫升的Hoechst的33342蓝色核染料和0.3μM的Alexa Fluor 633鬼笔环肽F-肌动蛋白染色和组织同时在室温下孵育瓦特1小时第i个温柔的转动在黑暗中。避免长时间染色，因为这会增加背景。
    1. 对于免疫染色，孵育固定和透化组织用0.1％的Triton X-100在0.5毫升PBS中过夜，在4℃下，染色用1：100稀释的抗ELAV抗体或以1：抗caspase-3的200稀释过夜4°C（300μL）。通过稀释1相应的次级抗体如下：100和在室温下孵育1至3小时。请参阅材料清单特异性抗体的信息。
  8. 洗组织3次，每次在0.5毫升的PBST 5分钟以慢速转动。
  9. 用移液管，取出所有的PBST，然后添加200微升抗漂白安装剂（见材料）完全覆盖组织在RT 4℃1-3小时，或过夜。已充分吸收了安装剂最佳组织会沉到试管底部。
  10. 预清洁与水或70％乙醇的玻璃片上，并与安装剂加入到GLAS转移组织小号幻灯片。
  11. 小心地在组织盖玻片。适用凡士林在载玻片和盖玻片，以避免过压缩破坏组织。用纸巾除去多余的固定剂。
  12. 密封通过施加指甲油所有沿盖玻片的边缘，以避免组织安装剂泄漏盖玻片。

3.共聚焦显微镜

  1. 使用倒置共焦落射荧光显微镜。然而，上右显微镜也可使用。使用平铺图像的组织，保持稳定的室温，以避免聚焦和xy平面的偏移漂移由于部件的热膨胀和收缩。环境控制系统和焦点漂移补偿系统有助于避免这个问题由于显微镜系统的热平衡的损失。
  2. 放置在显微镜阶段的幻灯片。使用低分辨率采取一些测试图像（125×125像素）的ð确定以覆盖感兴趣区域（ROI）的整个区域所需的瓦片的适当数量。
  3. 设置显微镜扫描系统以捕获与扫描分辨率，如500×500像素的图像。选择目标诸如20X NA 0.8或63X NA 1.4计划复消色差透镜目标为通过盖玻片分析组织中，以便在各方面每个图像（瓷砖）的重叠了20％。
  4. 从最长的建立图像序列至最短激发波长，作为长波长光会导致低光漂白。从最长至最短激发波长的顺序是：（i）用于鬼笔环肽F-肌动蛋白和抗体来活化胱天633纳米，（ii）用于RFP 561纳米，（ⅲ）的GFP 488纳米，和（iv）405nm处为赫斯特核染色。
  5. 在成像过程中，成像过程通过降低激光强度，以获得组织的高品质的图像，以避免光致漂白期间最小化细胞的荧光激光激发的曝光。
  6. 我后法师收集，合并使用显微镜的软件图像。

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Representative Results

有允许CaspaseTracker检测正常健康的细胞（ 图1a）caspase活性的两个关键部件。的第一个是对胱天蛋白酶的生物传感器Apoliner（ 图1b）建模的146个氨基酸的caspase-裂解多肽。28，该多肽被从包含被凋亡过程中典型地切割的单一天然存在的半胱天冬站点DIAP1（细胞凋亡的果蝇抑制剂）衍生由胱天蛋白酶DrICE。42,43 DrICE相当于胱天蛋白酶-3在哺乳动物和裂解大多数已知的蜂窝基材。4,32特征半胱氨酸蛋白酶，DIAP1和其衍生的多肽是一个特定天冬氨酸后裂解，Asp20位于胱天蛋白酶识别内序列17 DQVD-20，以及强制性Asp20剩余物为Ala（DQVA）的突变消除切割。42,43至Apoliner，28类似的本DIAP1片段是安乔红色在经由小鼠CD8（α链氨基酸1-220），在果蝇一个常用的工具质膜的细胞质。的CD8膜锚防止任何拴系货物轴承（在Apoliner的情况下nucGFP）一个核易位序列从在不存在半胱天冬酶活性的易位到细胞核。28 CaspaseTracker的第二个关键组分是果蝇的G-TRACE系统，其中的酵母转录因子GAL4诱导翻转酶（FLP）重组酶的表达（并同时诱导RFP）。34翻转酶切除一个终止密码子，导致nucGFP的永久表达。为了使G-TRACE响应于胱天蛋白酶活性，将其与所述Apoliner系统通过圈养Gal4的，这是需要激活的G-TRACE，以Apoliner（ 图1a）的血浆膜锚定的caspase-裂解DIAP1片段相结合。35

我们做了额外的改性的ications到CaspaseTracker的Apoliner组件，以提高效用。最重要的，这是至关重要的胱天蛋白酶的生物传感器本身不抑制胱天蛋白酶，潜在地保留，否则将死的细胞。虽然Apoliner转基因未在果蝇 28引起明显的表型，如所预期的有力胱天蛋白酶抑制剂，甚至细胞偶尔保存会破坏识别正常细胞与caspase活性的目的。然而，在Apoliner的DIAP1片段包含随后显示出强效抑制DrICE，劈开DIAP1在Asp20 43胱天蛋白酶抑制的机理揭示的晶体结构相同的胱天蛋白酶的基序（135-DICG-138），其中DIAP1 Asp135绑定到DrICE活性部位作为胱天蛋白酶底物模拟物（但不裂解）。43生物化学分析表明，在Asp135一个精氨酸取代废除DrICE抑制功能。43因此，CaspaseTracker用相同D135R突变工程化以避免胱天蛋白酶抑制（ 图1b）。35〜Apoliner类似，以下在Asp20裂解在从头 N-末端的天然存在的DIAP1的Asn-ASN序列改变为甘氨酸-缬氨酸在CaspaseTracker防止Gal4的降解通过对蛋白酶裂解N端法则（ 图1b）。28此外，我们融合的MYC标记与GAL4的C端为CaspaseTracker表达准备检测。35必要性中，Apoliner自己的RFP和nucGFP盒被删除，使其与G-TRACE，其中还包含RFP与nucGFP兼容。28,35

因为Gal4的承载其自身的核定位信号，并通过它的目标DNA反应元件（UAS）时稠合到在果蝇其他转基因，Gal4的相对的大概只有几个分子有力地激活转录通过胞质半胱氨酸蛋白酶缓解足以几小时（估计≤12高）内打开RFP的表达。因为生物传感器活性需要从头转录和RFP的翻译，它不报告实时酶活性。虽然CaspaseTracker RFP将显著可能在一天之内降解caspase活性停止后，nucGFP将由泛素启动子的细胞及其后代的寿命来表示。

到第一证明CaspaseTracker是响应于caspase激活体内 ，成人CaspaseTracker生物传感器蝇暴露于细胞死亡诱导的刺激。 果蝇卵巢是蛋室经受当动物被强调，匹配的环境条件下，以子代生产的推定机制程序性细胞死亡一个充分研究的细胞死亡的模式。37,44,45为了诱导细胞死亡，生物传感器苍蝇冷休克1小时在-7℃（冷冻只动物），和卵巢从活体动物第二天（ 图2a）解剖。在对比未处理的生物传感器苍蝇，冷休克后蛋室均明显较小，显示出强大的红色（最近的）和绿（永久）生物传感器的活性，证实细胞死亡刺激物后的生物传感器的激活（ 图2b，合并）。在这两个生殖细胞的细胞核中（滋养细胞和卵母细胞），并在卵腔体细胞（毛囊细胞）检测生物传感器的活性，但是只有在处理过的苍蝇。凋亡35形貌特征也容易在生物传感器阳性蛋室观察包括核碎裂，DNA凝聚和降解（蓝染色的损失）。生物传感器的活性可以与两个核缩合（Hoechst公司）和活性胱天蛋白酶（免疫染色）相同的细胞中检测到，但对活性胱天蛋白酶的最强烈的染色发生在区域其中两个核DNA和caspasË生物传感器的信号均减弱或退化（ 图2b）。46,47冷休克后发生的细胞死亡机制没有得到很好的特点，和其他死亡的机制可能会在作怪。然而，下列氨基酸饥饿，这是已知的导致细胞凋亡，得到类似的结果。35

要确定是否CaspaseTracker能检测非凋亡蛋白酶的活性，健康的1日龄苍蝇的内脏器官通过去除角质层萤光和脂肪都是经过精心解剖。从单一的代表性苍蝇组织固定，安装，用Hoechst染色标记的细胞核和鬼笔环肽染色的F-肌动蛋白检测肌肉细胞。在对比健康蛋室，缺乏生物传感器的激活，蛋室之间的F-肌动蛋白染色的肌肉细胞具有红色和绿色的生物传感器的活性（ 图3a，插图）。然而，可能的是，乙糖nsor还标签其它细胞。许多其他的健康组织和优化饲养1日龄苍蝇机关展出突出蛋白酶生物传感器活动大概反映了基础非凋亡蛋白酶功能（ 图3a）。生物传感器阳性细胞出现正常形态和发生在组织中暗示有组织图案，细胞的特异性亚群激活胱天，对于生物传感器阳性细胞包裹肠（ 图3a，插图）的示例条纹。

最好的证据是CaspaseTracker是半胱氨酸蛋白酶的特定记者在表达对照生物传感器，它等同于CaspaseTracker除了在强制性的蛋白酶裂解位点单天冬氨酸阿拉氨基酸突变果蝇缺乏的信号，改变DQVD到DQVA（ 图1b和3b）。除了非常罕见细胞（ 图3b，绿色箭头），唯一的信号OBSERV编在DQVA控制生物传感器苍蝇自身荧光的结构，如口部位（ 图3b）和在作物摄取食物和其他地方（ 图3b和4），这是在缺乏对胱天蛋白酶的生物传感器的非转基因亲本蝇也观察到。 35 CaspaseTracker标记的细胞发生在沿马氏（肾）小管定期和经常同时表现出这两种最近（红色）和过去的（绿色）胱天蛋白酶的活化，而许多细胞在脑，视叶，贲门，作物，肠和输卵管是红色或绿色（ 图4和图5a）。

对于证据表明，长寿命的细胞能够存活蛋白酶的活性，视叶被免疫染色泛神经元标记ELAV（胚胎致死视觉异常）。48许多神经元细胞核双核针对性GFP标记从CaspaseTracker和ELAV，与长寿命策一致LLS使用胱天蛋白酶非死亡函数（ 图5b）。此外，如果生物传感器是关闭的10天（使用Gal80ts），生物传感器阳性细胞持续在肠道的持续时间（ 图6a和b），脑和其他地方（未示出）。使用蛋白酶生物传感器CaspaseTracker，我们提供基础caspase活性在整体动物的第一个概述。

图1
图1：用于检测非凋亡胱天蛋白酶活性CaspaseTracker生物传感器系统。 （a）该果蝇胱天蛋白酶的生物传感器的组件。（二）CaspaseTracker生物传感器系统的蛋白酶裂解的部分是由等离子体膜锚定（mCD8）的，DIAP1的含有天然蛋白酶切割位点Asp20的片段融合到Gal4的转录用C-末端三倍myc标记因子和通过泛素亲表示MOTER。胱天蛋白酶裂解导致Gal4的易位至细胞核以诱导G-TRACE系统。在控制生物传感器，在4氨基酸胱天蛋白酶切割位点（DQVD）所需Asp20残基改变为丙氨酸（DQVA）废除胱天蛋白酶裂解。转基因CaspaseTracker苍蝇包含4转基因。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2：CaspaseTracker由半胱氨酸蛋白酶的细胞死亡过程中激活。 （一） 果蝇卵巢和流程图冷休克诱导的细胞死亡的示意图。 果蝇卵巢图纸（由拾破烂桑托斯）和果蝇的图像（由Darren Obbard）的使用许可。（B）蛋室从6-卵巢天女CaspaseTracker苍蝇喂养W¯¯第i个正常的飞食品6天（未处理）或冷休克后1天（-7 ℃，1小时，接着25 ℃，24小时）诱导蛋室caspase激活。冷处理卵巢（右下帧）的放大显示了三种蛋室于一体的发展卵巢管核凝结（顶部卵室），核碎裂（中蛋室和插图）和降解（下鸡蛋的证据链（约垂直居中）室）的基础上的Hoechst的DNA染色（蓝色）。活性胱天蛋白酶（抗caspase-3，品红色）的中间和下部蛋室进行检测。 RFP和GFP的生物传感器的活性（红色，绿色和黄色箭头）发生在与核DNA缩合细胞经常漫与活性半胱氨酸蛋白酶（插图）染色。白色箭头标记都缺乏生物传感器的活性和活性胱天蛋白酶免疫染色细胞核。 *自体荧光信号。这些数据被从Tang等人 ，科学代表2015年再现许可。source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3：证据广泛生理胱天蛋白酶活性。 （一）合并CaspaseTracker（DQVD）RFP与nucGFP的共焦图像从18℃升温单个新eclosed飞，解剖并用H33342染色细胞核和鬼笔环肽对F-肌动蛋白（粉红色），并用DIC成像。鬼笔仅显示在嵌入蛋室。（b）有相同的程序和成像条件随访控制CaspaseTracker（DQVA）苍蝇。 *自体荧光结构。这些数据再现唐等人的许可，科技众议员2015年请点击此处查看大图这个数字。

图4
图4：基础caspase活性在许多组织 DIC的高倍率和GFP（过去）和RFP（近期的）CaspaseTracker（DQVD）活性和荧光共聚焦图像的Hoechst染色核在大脑中，贲门，农作物，中肠，马氏管从图3a输卵管。 *自体荧光结构。这些数据再现唐许可等 ，科学众议员2015年请点击此处查看该图的放大版本。

图5
图5： 在果蝇的神经元非凋亡胱天蛋白酶活性 视叶（a）中 DIC和与RFP（最近的）和GFP（过去）CaspaseTracker（DQVD）活性和Hoechst的染色细胞核在大脑中的共焦图象。 RFP +双GFP标记的细胞（黄色箭头）。（二）NucGFP在CaspaseTracker（DQVD）的视叶的免疫荧光染色神经锅核ELAV蛋白共定位飞大脑。与NucGFP和ELAV的共定位信号的神经元显示（白色箭头）。注意，RFP标记的神经元中不存在这一特定领域。这些数据再现唐许可等 ，科学众议员2015年请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

在这里，我们说明CaspaseTracker的建设和内部运作促进健康组织的广泛基础caspase活性的检测。 用于体内检测非凋亡胱天蛋白酶活性的关键步骤是：1）产生苍蝇与生物传感器的转基因，2）验证与适当的控制的具体的caspase-记者功能，3）练解剖技术观察成年果蝇的所有内部器官系统，和4）从自体荧光的工件识别生物传感器的活性。

在作为具体的caspase-传感器天然蛋白酶裂解的多肽被修改，以避免由生物传感器的任何胱天蛋白酶的抑制活性。进一步的修改进行，以避免在Gal4的转录因子的快速降解，和表位标签的插入。我们还描述苍蝇全身器官的解剖，染色，安装和飞组织的共聚焦显微镜s至检测非凋亡胱天蛋白酶活性。

而CaspaseTracker是理想的检测，与胱天蛋白酶活性水平低的存活细胞，它是不是实时的酶活性的报告，如几个小时，需要开启生物传感器。但是，我们并没有确定的最小时间来检测，这可能比所需要的此处描述的应用短得多。在对比CaspaseTracker，其他胱天蛋白酶的生物传感器的主要限制是它们不能检测胱天蛋白酶活性的低水平，因为它们被设计主要是为了研究细胞死亡。胱天蛋白酶活性被放大之后的细胞死亡的刺激，在不到30分钟造成大规模细胞拆除49因此，胱天蛋白酶活化的检测通常假设为某些细胞死亡的标志物。50,51然而，越来越多的证据表明，胱天蛋白酶有非凋亡，在健康的细胞甚至非降解功能。7-21的presu即开展日常工作的胱天蛋白酶和空间上暂时限制酶活性的MED较低水平可能低于检出受可用的技术。这个问题是由CaspaseTracker，这可能需要一些蛋白酶切割事件以产生强大的信号克服，并且不需要持续胱天蛋白酶的酶活性，以在体内永久性标记这些细胞。

提出的证据表明CaspaseTracker特异于胱天蛋白酶，虽然我们不能排除其它未鉴定天冬氨酸特异性蛋白酶可激活CaspaseTracker的可能性。然而，饲养与caspase抑制剂多肽块CaspaseTracker活动的鸡尾酒（未发表）苍蝇。我们也强调避免本身抑制胱天蛋白酶的生物传感器的重要性，以及控制生物传感器和非转基因苍蝇的重要性，以避免错误的结论，由于自体荧光固有的昆虫角质层，内部脂肪depo的坐镇，摄入的食物或其他干扰因素。

另一个挑战是有区别的半胱天冬促死亡和非死亡的功能。促死亡和非死亡功能可以进化为正常的生理状态之间转变的细胞的适当定时的死亡，例如免疫细胞的扩张，以对抗感染和随后的消除这些细胞的预防癌症的目的相联系。因此，我们不能排除一些在内部器官的观察基础caspase活性的是代替以促进细胞死亡的尝试，有发生每日在人体中的估计数百亿细胞死亡的貌似一致的可能性。52然而，健康形态表达该生物传感器细胞的强烈表明CaspaseTracker能够检测用于胱天蛋白酶的正常日常作业caspase活性。

胱天蛋白酶是建议有非死亡角色，例如电池增殖。这是与先前的尝试产生的哺乳动物细胞系稳定表达结合病毒蛋白和直接抑制细胞胱天蛋白酶（ 例如，CrmA的）相一致。而数百细胞集落的药物选择与空对照载体中产生的，形成为与向量表达蛋白酶抑制剂（未公布的）转染的平行培养出乎意料零菌落。因此，胱天蛋白酶可能必须在正常细胞中的广泛的功能当前低估。这是由在CaspaseTracker飞基础的生物传感器的活性在许多细胞类型在大多数器官系统，包括神经元，在正常的健康的苍蝇检测出的发现进一步支持。在神经元健康caspase活性可拆除突触末梢细胞凋亡过程中切割相同的基板，以促进正常的脑功能，或者他们的日常工作职责可能与凋亡样的活动完全不同。虽然与低活性酶较高水平胱天蛋白酶可以是每天的作业和细胞死亡之间的关键区别，很少有敲入突变动物与支持这种可能性特定胱天蛋白酶不可切割的底物。17,53然而，最近的进展表明，胱天蛋白酶8通过切割RIPK可能抑制坏死的， 54突触抑郁和AMPA受体的内吞作用可能GAP43，55和微RNA加工的蛋白酶裂解调节可以通过Dicer酶的蛋白酶裂解进行调节。14,15,56

有此传感器的许多其他应用程序。以确定是否胱天都在特定的时间或在特定组织中，生物传感器的表达可以容易地短暂调节（ 例如 ，使用Gal80ts），并在特定的细胞类型（ 例如 ，嗅特异性Gal4的驱动程序）激活。使用Gal80ts抑制生物传感器的表达，直到成年苍蝇的出现仍然造成了普遍的生物传感器的活动，表明caspasES可在成年阶段（ 图6c和d）被激活。35通过与其他胱天蛋白酶底物，其它应用程序取代DIAP1片段可包括特异于不同胱天蛋白酶的生物传感器和用于检测的特异性底物的裂解。该生物传感器CaspaseTracker将加强我们的非凋亡蛋白酶活动中的作用的理解。

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Acknowledgments

我们感谢拾破烂桑托斯和达伦Obbard在图果蝇插图。 2A，马塞洛雅各布 - 洛雷纳使用的JHMRI昆虫饲养的。这项工作是由生命科学研究基金会奖学金（HLT）的支持下，大学教育资助委员会，香港的AoE / B-07/99（MCF），和NIH授予NS096677，NS037402和NS083373（江铃控股）。何林堂是生命科学研究基金会的Shurl和凯库尔奇基金会研究员。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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<em>体内</em>生物传感器跟踪非凋亡胱天蛋白酶的活动在<em>果蝇</em>
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Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

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