Summary
Gezonde cellen in gehele dieren die lage niveaus van caspase activiteit bevatten detecteren, de aangewezen CaspaseTracker gevoelige biosensor werd gegenereerd voor Drosophila. Caspase-afhankelijke biosensor activiteit gedetecteerd in langlevende gezonde cellen in de inwendige organen van volwassen dieren onder geoptimaliseerde omstandigheden gekweekt bij afwezigheid van dood stimuli.
Introduction
Caspasen zijn cysteïne proteasen die apoptotische celdood bemiddelen door het splitsen van een groot aantal intracellulaire eiwitten na sleutel aspartaat residuen. Bijvoorbeeld, initiator caspases te activeren effector caspasen, derepresseren DNA nucleasen, splitsen cytoskelet componenten en de lipide samenstelling van celmembranen veranderen om snel te ontmantelen cellen en hun erkenning en engulfment stimuleren door naburige cellen die beschikken over de cel lijken. 1-4 Er wordt geschat dat miljarden cellen sterven per dag in het menselijk lichaam, en apoptose is een belangrijk mechanisme van door chemotherapie geïnduceerde tumorceldood. 5 een andere groep caspasen kan celdood dan veroorzaken bij verschillende niet-apoptotische processen aangeboren immuniteit stimuleren. 6, het meeste onderzoek op caspases is gericht op hun pro-dood functies.
Interessant vroeg bewijs op het gebied bleek dat dezelfde caspasen verantwoordelijk voor het bevorderen celdood ook niet dood fzalven. Baanbrekende studies hebben aangetoond dat caspasen zijn betrokken bij diverse cellulaire functies in gezonde cellen, waaronder de regulering van celproliferatie en celmigratie tijdens embryogenese. 7-9 Caspasen zijn vereist voor spermatide individualisering in Drosophila 10,11, voor het blokkeren van een alternatieve necroptotic celdood in muizen 12,13, en microRNA verwerking in C. elegans. 14,15 In misschien de langste duur cellen, neuronen, caspasen en andere apoptotische mechanisme betrokken zijn bij de regulering van de neuronale activiteit van snoeien synaptische uiteinden, een proces vermoedelijk essentieel zijn andere synapsen voor leren en geheugen versterken. 16- 18 Het is mogelijk dat caspases pruning een soort mini-apoptose kleine neuronale uitsteeksels niet met hele celdood bevorderen. 19 echter caspasen kunnen alternatieve functies verbonden moeten apoptose-achtige verschijnselen. 20,21 dubbelrols in het leven en de dood zijn niet uniek voor caspases; BCL-2 familie eiwitten en cytochroom c zijn rol in cellulaire energetica in gezonde cellen, maar maken ook deel uit van de kern apoptotische route die geactiveerd wordt door veel celtypen stress. 22-25 Hoewel niet bewezen, lijkt het logisch dat de evolutie dag is gekoppeld -Jobs dood-banen binnen dezelfde moleculen om tijdig eliminatie van ongeschikte of ongewenste cellen te waarborgen.
Op dit moment worden de moleculaire mechanismen van apoptotische caspase activiteit begrepen, en de mate van niet-apoptotische caspase activiteit tijdens embryonale ontwikkeling en in volwassen weefsels is ook niet bekend. Een belangrijke uitdaging is de moeilijkheid in het onderscheiden van dag-banen van de dood-banen van caspases. In tegenstelling tot apoptose en pyroptosis wanneer caspase-activiteit wordt versterkt door een proteolytische cascade worden de dag-banen van caspases verwacht bij veel lagere niveaus van enzymatische activiteit, vermoedelijk beneden detectie plaatsvinden door vele beschikbare technologies.
Voor de hier gepresenteerde werk, anderen ontwikkeld diverse caspase biosensoren voor verschillende doeleinden. De SCAT biosensoren (bijv ECFP-DEVD-Venus) snel op te sporen real-time caspase-activiteit in gekweekte cellen en dierlijke weefsels met behulp van FRET. 26,27 Bij caspase decollete, de kern gerichte GFP deel van Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) ondergaat subcellulaire herlokalisatie binnen enkele minuten wanneer de plasmamembraan-tether wordt gesplitst door caspases. 28 Evenzo NES-DEVD-YFP-NLS ApoAlert-pCaspase3-Sensor () herlokaliseert van het cytoplasma naar de kern op caspase decollete. 29,30 Meer voor kort werd de chromofoor in iCasper slim ontworpen om fluoresceren wanneer gesplitst door caspases, waardoor de detectie van biosensor in real-time in neuronen van Drosophila embryo's, maar vooral in combinatie met een ontwikkelingsstoornis celdood. 31 caspase-afhankelijke dood van olfactorische neuronen tijdens veroudering was demonstbeoordeeld door immunodetectie van de caspase-gesplitste vorm van CPV biosensoren (bijvoorbeeld mCD8 PARP-Venus). 32,33 Belangrijk is dat de geactiveerde vorm van caspase-3 in afwezigheid van celdood gedetecteerd door gevoelige immunostain in stekels van gekweekte neuronen, en in het soma via caspase-afhankelijke fluorescentie van het nucleaire CellEvent reporterkleurstof, maar probleemgevallen door foto-toxiciteit, hoewel celdood werd uitgesteld tot na wervelkolom eliminatie. 19 Aldus nieuwe caspase biosensoren nodig detecteren en volgen basale cellen met caspase-activiteit in vivo.
Om deze moeilijkheden te overwinnen, genereerden wij een nieuwe tweekleurige caspase biosensor, aangewezen CaspaseTracker. Deze strategie combineert een aangepaste versie van de Drosophila caspase-gevoelige Apoliner biosensor 28 met de Drosophila G-TRACE FRT recombinasesysteem 34 permanent labelen en volgen cellen in vivo. <sup> 35 Het Gal4-geactiveerde G-trace systeem maakt het mogelijk zeer lage niveaus van caspases tot CaspaseTracker activeren, wat resulteert in RFP expressie in het cytoplasma en permanente GFP expressie nucleair doelwit in een cel die ooit caspase activiteit heeft meegemaakt. 35 Dit systeem kan labelen cellen in leven in gehele dieren met behulp van Drosophila melanogaster, een soepel en veel gebruikt model voor de studie van caspases en celdood. 36-38
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van CaspaseTracker Flies
- Ter voorbereiding CaspaseTracker (DQVD) vliegt voor experimenten uit te voeren deze kruising: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP; Ubi> Stoppen> GFP-NLS), door de overdracht van 7-10 maagd vrouw (of man) vliegen die de caspase biosensor substraat mCD8-DIAP1 Gal4-gedreven door de ubiquitine-promoter 35 tezamen met eenzelfde aantal mannelijke (of vrouwelijke) G-TRACE vliegen, waarbij het tweede chromosoom Cyo balanceerinrichting moet letaliteit van de homozygote combinatie van G- voorkomen TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, en Ubi> Stoppen> GFP-NLS) 34. Plaats vliegt in een vers voedsel flacon met verse gist plakken als eiwitbron.
- Incubeer bestanden bij 18 ° C gedurende 5 tot 7 dagen (maximum 2 weken) en verwijder vervolgens de bovenliggende vliegt uit het flesje te vermijden overbezetting met nieuwe nageslacht, en het opzetten van nieuwe veredelingstechnieken flesjes.
- Verder incubatie bij 18 ° C tot nageslacht vliegt Eclose. Selecteer de niet-Cyo [non-curly vleugel] nageslacht van de juiste genotype van CaspaseTracker, die transgeen voor CaspaseTracker en G-TRACE elementen 35 zijn.
- Tegelijkertijd genereren controle ouderlijke niet-transgene w118 vliegen en caspase-ongevoelige (DQVA) vliegen parallel aan specifieke CaspaseTracker RFP en GFP-fluorescentie te controleren.
- Voer PCR genotypering om bestanden met CaspaseTracker met behulp van de primers te bevestigen: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, het produceren van een 3897 bp product. Voor genotypering van de G-Trace loci, gebruik maken van de volgende primers voor GFP (474 bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; voor RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG AAG GTG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; en voor Flpase (655 bp), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TTG TCT TCT CTG TCA C. Voor genotypering Gal4 in de pUWR vector (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.
2. Tissue Voorbereiding, kleuring en Montage
- Voor fly dissecties, voorkomen ontleed weefsel van het vasthouden aan plastic pipet tips en centrifugebuizen, jas tips en buizen met 1% runderserumalbumine (BSA), opgelost in water.
- Ontleden vliegt op een siliconen kussen behulp van een tang.
- Om beschadiging van de uiteinden van de forceps op een hard oppervlak bij het uitvoeren van het weefsel dissectie voorkomen, mag dissectie op een siliciumoppervlak. Voor het maken van siliconen dissectie platen, smelt het silicium in de commerciële kit volgens instructies van de fabrikant (Materials List). Na smelten van de siliconen, voeg 3-4 ml van een 60 mm weefselkweekplaat. Silicon gerechten kunnen worden hergebruikt.
- Verdoven een vlieg met CO 2, en overgebracht naar een silicagel platen met 1 ml koude PBS. Introduceer de CO 2 om een flacon met het vliegen met behulp van een blaaspijp, en vervolgens over het verdoofd vlieg toa Pad dat een CO 2 aanbod heeft.
- Gebruik een tang om de vlieg greep hoofd, en een tweede tang de thorax trekken in de tegenovergestelde richting van de vlieg kop los te koppelen van het lichaam die zonder de verbinding tussen de kop en voordarm.
- Gebruik 2 paar tang om de vleugels en poten van de thorax te verwijderen.
- Gebruik een tang om de thorax te houden en een tang om de buik te trekken om het opnieuw scheiden van de thorax zonder beschadiging van de verbinding tussen de voordarm en middendarm.
- Ontleden inwendige organen, inclusief de hersenen, darmen, Malpighian buisjes en de eierstokken, zoals eerder aangetoond. 39-41
- Verwijder alle stukken van de cuticula en het vet lichamen met een tang als deze weefsels te produceren sterke autofluorescentie. Geduld en oefening moeten een compleet orgaansysteem bereiden zijn.
- Transfer ontleed weefsels tot 1,5 ml centrifuge buizen, en bevestig weefsels wiste 0,5 ml 4% paraformaldehyde in PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) bij kamertemperatuur gedurende 20 tot 30 min met rotatie in het donker bleken RFP en GFP in de weefsels voorkomen. Vermijd langdurige fixatie die volgende kleuring resultaten in gevaar kunnen brengen.
- Verwijder de paraformaldehyde door voorzichtig pipetteren en was 3 maal met 0,5 ml PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) bij kamertemperatuur.
- Permeabilize de weefsels met 0,5 ml PBST bij 4 ° C geïncubeerd onder zacht schudden. Kortere incubaties kunnen onvolledig permeabilisatie en compromissen vlekken resultaten opleveren.
- Als het nodig is om achtergrondkleuring te verminderen, overwegen incuberen weefsels in 0,5 ml PBST met 1% BSA in plaats van PBS.
- Was de weefsels 3 maal met 0,5 ml PBST.
- Kernen en filamenteus actine (F-actine) vlek toepassen 0,5 ml PBST met 10 ug / ml Hoechst 33342 kleurstof en blauw nucleaire 0,3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-actine kleurstof en incubeer gelijktijdig met weefsels gedurende 1 uur bij kamertemperatuur wie zachte rotatie in het donker. Vermijd langdurig kleuring omdat dit de achtergrond zal toenemen.
- Voor immunokleuring Incubeer gefixeerd en gepermeabiliseerd weefsels met 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml PBS overnacht bij 4 ° C, vlek met 1: 100 verdunning van anti-Elav antilichaam of 1: 200 verdunning van anti-caspase-3 nacht bij 4 ° C (300 ui). Volg de overeenkomstige secundaire antilichaam verdund 1: 100 en incubeer gedurende 1 tot 3 uur bij kamertemperatuur. Zie Materialen List voor specifiek antilichaam informatie.
- Was de weefsels 3 maal, telkens 5 min in 0,5 ml PBST met zachte rotatie.
- Met een pipet, verwijder alle PBST en voeg 200 ul anti-bleekmiddel montagemiddel (zie materialen) volledig te bedekken weefsels gedurende 1-3 uur bij kamertemperatuur of 4 ° C overnacht. Optimale weefsels die volledig zijn opgenomen het montagemiddel zal zinken naar de bodem van de buis.
- Pre-Clean het glaasje met water of 70% ethanol en de overdracht van de weefsels met montage agent om het glass glijbaan.
- Plaats een glazen afdekplaat slip over de weefsels voorzichtig. Solliciteer vaseline aan het glaasje en het deksel slip te voorkomen dat het vernietigen van het weefsel door overkompressie. Verwijder extra bevestiging agent met vloeipapier.
- Dicht de dekglas door toepassing nagellak langs de randen van het dekglas om lekkage montage stoffen uit de weefsels voorkomen.
3. Confocale microscopie
- Gebruik een omgekeerde confocale epi-fluorescentie microscoop. Echter, rechtopstaande microscopen worden gebruikt. Om het gebruik van weefsels tiling handhaven stabiele kamertemperatuur drift van focus en verschuiving van xy vlak voorkomen door de thermische uitzetting en krimp van de componenten. Milieu-controle systemen en aandacht driftcompensatie systemen helpen om dit probleem te voorkomen als gevolg van het verlies van thermo-evenwicht van de microscoop systeem.
- Plaats het preparaat op het podium van de microscoop. Neem een paar testbeelden met behulp van lage resolutie (125 x 125 pixels), eend het juiste aantal tegels nodig bestrijken het gehele gebied van belang (ROI) te bepalen.
- Stel de microscoop scansysteem om beelden met scanresolutie zoals 500 x 500 pixels vast te leggen. Selecteer het doel zoals een 20x NA 0,8 of een 63x NA 1,4 Plan-Apochromat doelstelling voor het analyseren van weefsel door glazen dekglaasjes, zodat elk van de afbeeldingen (tegels) overlapt 20% aan alle kanten.
- Stel de afbeelding sequentie uit langste excitatiegolflengten kortste als de lange golflengte van licht veroorzaakt lagere foto-bleken. De sequentie van het langste tot excitatiegolflengte kortste is: (i) 633 nm voor Phalloidin F-actine en antilichaam tegen geactiveerde caspasen, (ii) 561 nm voor RFP, (iii) 488 nm voor GFP, en (iv) 405 nm voor Hoechst nucleaire vlek.
- Tijdens de beeldvorming, minimaliseren de blootstelling van cellen aan fluorescente laser excitatie bij beeldvormend proces foto-bleken voorkomen doordat de laserintensiteit om beelden van hoge kwaliteit van weefsels te verkrijgen.
- Nadat ikmages worden verzameld, het samenvoegen van de beelden met behulp van microscoop software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er zijn twee belangrijke componenten waarmee CaspaseTracker om caspase-activiteit te detecteren in de normale gezonde cellen (figuur 1a). De eerste is een 146 aminozuur caspase afsplitsbare polypeptide gemodelleerd naar de caspase biosensor Apoliner (figuur 1b). 28 Deze polypeptide is afgeleid van DIAP1 (Drosophila remmer van apoptose) met een natuurlijk voorkomend caspase plaats die wordt gesplitst tijdens apoptose typisch door caspase DrICE. 42,43 DrICE overeenkomt met caspase-3 in zoogdieren en klieft bekendste cellulaire substraten. 4,32 Kenmerkend voor caspases, DIAP1 en daarvan afgeleide polypeptide worden gesplitst na een bepaalde asparaginezuur, Asp20 gelegen binnen het caspase erkenning sequentie 17-DQVD-20, en mutatie van de verplichte Asp20 residu Ala (DQVA) afschaft splitsing. 42,43 Net als Apoliner, 28 dit DIAP1 fragment is anchorood in het cytoplasma naar het plasmamembraan via muis CD8 (alfa-keten aminozuren 1-220), een veelgebruikt instrument in Drosophila. De CD8 membraananker voorkomt gebonden lading die van een nucleair translocatie sequentie (nucGFP bij Apoliner) vanaf translocatie naar de kern in afwezigheid van caspaseactiviteit. 28 De tweede belangrijke component van CaspaseTracker is de Drosophila G-TRACE systeem waarin de gist transcriptiefactor Gal4 induceert de expressie van flippase (FLP) recombinase (en tegelijkertijd induceert RFP). 34 flippase accijnzen een stopcodon leidt tot blijvende expressie van nucGFP. G-TRACE reageren op caspaseactiviteit maken, werd gecombineerd met het Apoliner systeem aangebonden Gal4, die nodig is om G-TRACE activeren om de plasmamembraan verankerd caspase-splitsbare DIAP1 fragment van Apoliner (figuur 1a). 35
We hebben extra modifnicatieorganisatie de Apoliner component van CaspaseTracker om nut te verbeteren. Het belangrijkste is het essentieel dat de caspase biosensor zelf niet caspases remt potentieel behouden cellen die anders zouden sterven. Hoewel de Apoliner transgen niet duidelijk fenotypen veroorzaakten in Drosophila 28, als een krachtige remmer caspase zou worden verwacht, zouden zelfs af behoud van cellen ter identificatie van normale cellen met caspase activiteit verslaan. De DIAP1 fragment Apoliner bevat een motief (135-DICG-138) die vervolgens werd aangetoond mate remmen DrICE dezelfde caspase dat splitst DIAP1 op Asp20. 43 Het mechanisme van caspase remming werd aangetoond door een kristalstructuur waarin DIAP1 Asp135 is gebonden in de DrICE actieve site als een caspase-substraat na te bootsen (maar is niet gesplitst). 43 Biochemische analyse toonde aan dat een Arg substitutie bij Asp135 afschaft DrICE-remmende functie. 43 Daarom, CaspaseTracker werd ontworpen met dezelfde D135R mutatie caspase remming (figuur 1b). 35 vergelijkbaar met Apoliner voorkomen, de natuurlijk voorkomende DIAP1 Asn Asn sequentie aan de de novo N-terminus na klieving op Asp20 werd veranderd naar Gly-Val in CaspaseTracker om afbraak van Gal4 te voorkomen door het N-eind regel bij caspase klieving (figuur 1b). 28 Daarnaast hebben we gefuseerd een myc-tag aan de C-terminus van Gal4 voor gemakkelijke detectie van CaspaseTracker expressie. 35 noodzakelijkerwijs Apoliner eigen RFP en nucGFP cassettes werden geschrapt het compatibel is met G-TRACE, dat ook RFP en nucGFP te maken. 28,35
Omdat Gal4 draagt zijn eigen nucleair lokalisatiesignaal en krachtig transcriptie activeert via het doel-DNA responselement (UAS) indien gefuseerd aan andere transgenen in Drosophila, vermoedelijk enkele moleculen van Gal4 relverlicht door cytoplasmatische caspases voldoende op RFP expressie te schakelen binnen enkele uren (ongeveer ≤12 h). Omdat biosensor activiteit vereist de novo transcriptie en translatie van RFP, is het niet rapporteren realtime enzymatische activiteit. Hoewel CaspaseTracker RFP aanzienlijk zal waarschijnlijk worden afgebroken binnen een dag na het caspase activiteit beëindigt, zal nucGFP worden uitgedrukt door de ubiquitine-promotor voor het leven van de cel en zijn nageslacht.
Eerst aan te tonen dat CaspaseTracker reageert op caspase activering in vivo, werden volwassen CaspaseTracker biosensor vliegt blootgesteld aan-dood-inducerende stimuli cel. De Drosophila eierstok is een goed bestudeerd celdood model als ei kamers ondergaan geprogrammeerde celdood bij dieren gestresst, een vermoedelijke mechanisme overeenkomende omgevingsomstandigheden productie nageslacht. 37,44,45 celdood induceren biosensor vliegen waren koud geschokt 1 uur bij -7° C (bevriezen van de dieren) en eierstokken werden uitgesneden uit levende dieren de volgende dag (figuur 2a). In tegenstelling tot onbehandelde biosensor vliegen, het ei kamers na koude shock waren beduidend kleiner en tentoongesteld robuuste rode (recente) en groen (permanent) biosensor activiteit, het verifiëren van biosensor activering na een celdood stimulus (Figuur 2b, samen te voegen). Biosensor activiteit werd gedetecteerd in de kernen van beide kiemcellen (verpleegkundige cellen en eicellen) en somatische cellen (follikelcellen) in ei kamers, maar alleen in de behandelde vliegen. 35 morfologieën kenmerk van apoptose werden ook direct waargenomen bij biosensor-positieve ei kamers met inbegrip van nucleaire fragmentatie, DNA condensatie en degradatie (verlies van blauwe vlek). Biosensor activiteit kan worden gedetecteerd in dezelfde cellen met zowel nucleaire condensatie (Hoechst) en actieve caspasen (immunostain), maar de meest intense kleuring voor actieve caspasen trad in gebieden waar nucleair DNA en caspase biosensor signalen werden verminderd of afgebroken (Figuur 2b). 46,47 De celdood mechanismen die zich na koude-shock zijn niet goed gekarakteriseerd, en andere mechanismen dood kunnen zijn in het spel. Echter vergelijkbare resultaten verkregen na aminozuur verhongering, waarvan bekend is dat ze apoptose veroorzaken. 35
Om te bepalen of CaspaseTracker niet-apoptotische caspase activiteit kan detecteren, werden de interne organen van gezonde 1 dag oude vliegen zorgvuldig ontleed door het verwijderen van autofluorescente cuticula en vet. Weefsel van een enkele vertegenwoordiger vlieg werden vastgesteld, gemonteerd, gekleurd met Hoechst om kernen en met Phalloidin vlek voor de F-actine te markeren om spiercellen te detecteren. In tegenstelling tot gezonde ei kamers, waarvan biosensor activering missen, de F-actine gekleurde spiercellen tussen ei kamers had zowel rood en groen biosensor-activiteit (Figuur 3a, inzet). Het is echter mogelijk dat de biosensor labels ook andere cellen. Vele andere gezonde weefsels en organen van optimaal gekweekte 1 dag oude vliegen vertoonde prominente biosensor caspase activiteit waarschijnlijk reflecterende basale niet-apoptotische caspase-functie (figuur 3a). Biosensor-positieve cellen leken morfologisch normaal en opgetreden in georganiseerde patronen in weefsels voorgesteld specifieke subsets van cellen te activeren caspases, bijvoorbeeld stroken van biosensor-positieve cellen inpakken van de dikke darm (Figuur 3a, bijvoegsel).
Het beste bewijs dat CaspaseTracker een reporter van caspases is het ontbreken van signaal in vliegen expressie controle biosensor, die identiek is aan CaspaseTracker behalve voor een Asp in Ala aminozuur mutatie in de verplichte caspase splitsingsplaats, veranderen DQVD naar DQVA ( figuur 1b en 3b). Behalve voor een uitzonderlijk zeldzame cel (figuur 3b, groene pijl), het enige signaal OBSERVed in de DQVA control biosensor vliegen zijn autofluorescerend structuren zoals monddelen (figuur 3b) en ingenomen voedsel in het gewas en elders (figuur 3b en 4), die ook waargenomen in niet-transgene ouderlijke vliegen die de caspase biosensor missen. 35 de CaspaseTracker gelabelde cellen met regelmatige intervallen langs de Malpighian (nier) tubuli en vertonen vaak zowel Language (rood) en langs (groen) caspase activatie gelijktijdig, terwijl veel cellen in de hersenen, optische kwabben, cardia, gewas, middendarm en eileider zijn rood of groen (figuren 4 en 5a).
Voor het bewijs dat langlevende cellen caspase activiteit kan overleven, werd de optische kwab immunostained voor het pan-neuronale marker Elav (embryonaal dodelijk abnormaal zicht). 48 De kernen van vele neuronen werden dubbel gelabeld met nucleaire gerichte GFP van CaspaseTracker en Elav, consistent met langlevende cells caspasen gebruikt voor niet-death functies (figuur 5b). Bovendien, als de biosensor wordt uitgeschakeld voor 10 dagen (met Gal80ts) biosensor-positieve cellen blijven gedurende de duur in de darm (Figuur 6a en b), hersenen en elders (niet getoond). Met behulp van de caspase biosensor CaspaseTracker, bieden wij de eerste overzicht van de basale caspase-activiteit in gehele dieren.
Figuur 1: CaspaseTracker Biosensor voor het detecteren van niet-apoptotische caspase activiteit. (a) Componenten van het Drosophila caspase biosensor. (b) De caspase-splitsbare gedeelte CaspaseTracker biosensor systeem bestaat uit een plasma membraananker (mCD8), een fragment van DIAP1 dat een natuurlijke caspase-splitsings- plaats Asp20 gefuseerd aan het Gal4-transcriptie factor met een C-terminaal 3x-myc tag en sprak via de ubiquitine promoter. Caspase splitsing resulteert in translocatie van Gal4 de kern naar het G-TRACE systeem induceren. In een controle-biosensor, wordt de vereiste Asp20 residu in de 4 aminozuren caspase splitsingsplaats (DQVD) veranderd in Ala (DQVA) caspase klieving schaffen. Transgene CaspaseTracker vliegen bevatten 4 transgenen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: CaspaseTracker wordt geactiveerd door caspasen tijdens celdood. (a) Schematische voorstelling van Drosophila eierstok en stroomschema voor koude-shock-geïnduceerde celdood. Drosophila eierstok tekening (door Polan Santos) en het imago Drosophila (door Darren Obbard) worden met toestemming gebruikt. (b) Egg Chambers uit de eierstok van 6- dag vrouwelijke CaspaseTracker vliegt fed w ie normaal vlieg voedsel voor 6 dagen (onbehandeld) of 1 dag na koude shock (-7 ° C, 1 h, gevolgd door 25 ° C gedurende 24 uur) om caspase activatie induceren in ei kamers. Uitbreidingen van koude-behandelde ovarium (rechtsonder frames) tonen drie ei kamers in één ontwikkelingsland ovariole keten (gecentreerd ongeveer verticaal) met tekenen van nucleaire condensatie (top ei kamer), nucleaire fragmentatie (midden ei kamer en inzetstukken) en afbraak (lagere ei kamer) op basis van Hoechst DNA vlek (blauw). Actieve caspasen (anti-caspase-3, magenta) worden gedetecteerd in de middelste en onderste ei kamers. RFP en GFP biosensor activiteit (rood, groen en geel pijlen) voorkomen in cellen met nucleair DNA condensatie vlekken die vaak diffuus met actieve caspasen (bijvoegsels). Witte pijlen markeren kernen ontbreekt zowel biosensor en actief caspase immunostain. * Autofluorescentie signalen. Deze gegevens worden gereproduceerd met toestemming van Tang et al., Sci Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Bewijs voor wijdverspreide fysiologische caspase activiteit. (a) confocale beeld van CaspaseTracker (DQVD) RFP en nucGFP Samengevoegd uit een enkel nieuw Bijlage In fly verhoogd bij 18 ° C, ontleed en gekleurd met H33342 voor kernen en Phalloidin voor F-actine (roze), en afgebeeld met DIC. Phalloidin wordt alleen weergegeven in de inzet voor ei kamers. (B) Dezelfde procedure en imaging omstandigheden werden gevolgd voor de controle CaspaseTracker (DQVA) vliegt. * Autofluorescente structuren. Deze gegevens worden gereproduceerd met toestemming van Tang et al., Science Rep 2015. Klik hier om een grotere versie te bekijkendit figuur.
Figuur 4:. Basal caspase activiteit in vele weefsels sterkere vergrotingen van DIC en fluorescentie confocale beelden van GFP (verleden) en RFP (recente) CaspaseTracker (DQVD) activiteit en Hoechst-gekleurde kernen in de hersenen, cardia, gewas, middendarm, Malpighian buisjes en eileiders uit figuur 3a. * Autofluorescente structuren. Deze gegevens worden gereproduceerd met toestemming van Tang et al., Science Rep 2015. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Niet-apoptotische caspase activiteit in neuronen van de Drosophila optische kwab. (a) en DIC confocale beelden met RFP (recente) en GFP (verleden) CaspaseTracker (DQVD) activiteit en Hoechst-gekleurde kernen in de hersenen. RFP + GFP dual-gelabelde cellen (gele pijlen). (B) NucGFP colocalizes met immunostain voor pan neuronale nucleaire Elav eiwit in de optische kwab van CaspaseTracker (DQVD) vliegen hersenen. Neuronen met co-gelokaliseerde signalen van NucGFP en Elav worden getoond (witte pijlen). Let op, RFP-gemerkte neuronen zijn niet aanwezig in dit specifieke gebied. Deze gegevens worden gereproduceerd met toestemming van Tang et al., Science Rep 2015. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier illustreren we de bouw en de innerlijke werking van CaspaseTracker dat de detectie van een brede basale caspase-activiteit in gezonde weefsels te vergemakkelijken. De kritische stappen voor het detecteren van niet-apoptotische caspase activiteit in vivo zijn: 1) het genereren van vliegen met de biosensor transgen 2) na caspase-reporter functie met geschikte controles, 3) de toepassing dissectie technieken om alle interne orgaansystemen van de volwassen Drosophila observeren, en 4) onderscheiden biosensor activiteit van autofluorescente artefacten.
De natuurlijke caspase-splitsbare polypeptide dat dient als caspase-specifieke sensor is aangepast om alle caspase-remmende activiteit van de biosensor voorkomen. Verdere modificaties werden gemaakt om snelle afbraak van transcriptiefactor Gal4 en het inbrengen van een epitooplabel voorkomen. We beschrijven ook het hele lichaam orgel dissectie van vliegen, immunokleuring, montage en confocale microscopie van vlieg weefsels die niet-apoptotische caspase te detecteren.
Terwijl CaspaseTracker is ideaal voor het detecteren van cellen die overleven met lage niveaus van caspase-activiteit, is het geen reporter realtime enzymactiviteit, zoals enkele uren nodig zijn om op de biosensor. Echter, we hebben niet de minimumtijd detectie, die waarschijnlijk veel korter dan die voor de beschreven toepassingen bepaald. In tegenstelling tot CaspaseTracker, de belangrijkste beperking van andere caspase biosensoren is hun onvermogen om lage niveaus van caspase-activiteit te detecteren, zij hoofdzakelijk bedoeld om celdood. Caspase activiteit geamplificeerd na een stimulus celdood, waardoor grote cel afbraak in minder dan 30 min. 49 Daarom is de detectie van caspase activatie vaak aangenomen dat een marker bepaalde celdood. 50,51 echter toenemend bewijs geeft aan dat caspasen hebben niet-apoptotische, zelfs niet-afbrekende functies in gezonde cellen. 7-21 De presumed lage niveaus van ruimtelijk en tijdelijk beperkte enzymatische activiteit van caspasen die hun dag-banen uit te voeren zijn waarschijnlijk onder detectie door de beschikbare technologieën. Dit probleem wordt overwonnen door CaspaseTracker, die waarschijnlijk vereist weinig caspase klieving gebeurtenissen robuuste genereren, en vereist geen lopende caspase enzymatische activiteit permanent worden deze met cellen in vivo.
De gepresenteerde gegevens blijkt dat CaspaseTracker specifiek is voor caspases, hoewel we de mogelijkheid dat andere niet-geïdentificeerde Asp-specifieke proteases CaspaseTracker kon activeren niet kan uitsluiten. Echter, het voeden vliegt met een cocktail van caspase-remmer peptiden blokken CaspaseTracker activiteit (niet gepubliceerd). Wij benadrukken ook het belang van het vermijden van biosensoren die zichzelf remmen caspasen, en het belang van controle biosensoren en niet-transgene vliegen naar verkeerde conclusies te voorkomen als gevolg van autofluorescentie die inherent zijn aan het insect cuticula, interne vet depozit, ingenomen voedsel of andere verstorende variabelen.
Een andere uitdaging is het onderscheiden van pro-dood en niet-dood functies van caspases. Pro-dood en niet dood functies kan evolutionair worden gekoppeld ten behoeve van de overgang cellen tussen een normale fysiologische toestand naar een geschikt getimed dood, bijvoorbeeld de uitbreiding van immuuncellen om te vechten tegen infectie en daaropvolgende eliminatie van deze cellen om kanker te voorkomen. We kunnen dus niet uit dat sommige van de waargenomen basale caspase activiteit in inwendige organen plaats een poging om celdood bevorderen, schijnbaar in overeenstemming met de geschatte tientallen miljarden celdood wordt elke dag in het menselijk lichaam echter elimineren. 52, de gezonde morfologie van cellen die de biosensor sterke aanwijzingen dat CaspaseTracker is voor het opsporen caspaseactiviteit bedoeld voor normale dag-banen van caspases.
Caspasen worden voorgesteld om niet-dood rollen, zoals celproliferatie. Dit is consistent met eerdere pogingen om zoogdiercellijnen die stabiel virale eiwitten die binden genereren en direct remmen cellulaire caspasen (bijvoorbeeld CrmA). Terwijl honderden celkolonies tijdens geneesmiddelselectiemerker de lege controlevector ontstaan, onverwacht nul kolonies gevormd parallel kweken getransfecteerd met de vector die caspase remmers (ongepubliceerd). Aldus caspasen hebben waarschijnlijk wijdverbreid functies in normale cellen die momenteel ondergewaardeerd. Dit wordt verder ondersteund door de bevinding dat biosensor basale activiteit in de CaspaseTracker vlieg gedetecteerd in vele celtypen in de meeste orgaansystemen, met inbegrip van neuronen in normale gezonde vliegt. Gezonde caspase-activiteit in neuronen kunnen synaptische eindes te ontmantelen om de normale werking van de hersenen te bevorderen door het splitsen van het dezelfde substraten als tijdens apoptose, of hun dagelijkse job functies kunnen geheel verschillend van apoptose-achtige activiteiten. Terwijl de lage versus hoge enzymatische niveaus van actievecaspasen kan een kritische onderscheid tussen dag-banen en celdood, er weinig knockin mutante dieren specifieke caspase-uncleavable substraten die deze mogelijkheid ondersteunen. 17,53 Uit recente vooruitgang aan dat caspase-8 remt necroptose eventueel door splitsing RIPK, 54 synaptische depressie en AMPA-receptor endocytose kan worden gereguleerd door caspase splitsing van Gap43, 55 en microRNA verwerking kan worden geregeld door caspase splitsing van Dicer. 14,15,56
Er zijn vele andere toepassingen van deze biosensor. Om te bepalen of caspasen geactiveerd op bepaalde tijden of in bepaalde weefsels, expressie van de biosensor kan gemakkelijk tijdelijk worden gereguleerd (bijvoorbeeld door het gebruik Gal80ts) en in specifieke celtypen (bijv olfactorische specifieke Gal4 drivers). Met behulp van Gal80ts om biosensor expressie te onderdrukken tot opkomst van volwassen vliegen nog steeds geleid tot grootschalige biosensor activiteit, wat aangeeft dat caspases kunnen worden geactiveerd adulte (figuur 6c en d). 35 Door vervanging van de DIAP1 fragment met andere caspase substraten, andere toepassingen kunnen biosensoren specifiek voor de verschillende caspases te nemen en voor het detecteren van splitsing van specifieke substraten. De CaspaseTracker biosensor zal ons begrip van de rol van niet-apoptotische caspase-activiteiten te verbeteren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Wij danken Polan Santos en Darren Obbard voor Drosophila illustraties in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena voor het gebruik van de JHMRI insectary. Dit werk werd ondersteund door het Life Science Research Foundation fellowship (HLT), University Grants Committee van de Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), en NIH subsidies NS096677, NS037402 en NS083373 (JMH). Ho Lam Tang is een Shurl en Kay Curci Foundation Fellow van de Life Sciences Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
References
- Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
- Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
- Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
- Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
- Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
- Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
- Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
- Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
- Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
- Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
- Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
- Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
- Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
- Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
- Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
- Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
- Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
- Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
- Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
- Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
- Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
- Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
- Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
- Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
- Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
- Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
- Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
- Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
- Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
- To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
- Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
- Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
- Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
- Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
- Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
- Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
- Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
- Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
- Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
- Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
- Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
- Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
- Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
- Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
- Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
- Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
- Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
- Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
- Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
- Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
- Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
- Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).
