Summary
Per rilevare le cellule sane in animali interi che contengono bassi livelli di attività delle caspasi, il biosensore altamente sensibile designato CaspaseTracker è stato generato per Drosophila. attività biosensore caspasi-dipendente viene rilevato in cellule sane lunga durata durante gli organi interni di animali adulti allevati in condizioni ottimizzate in assenza di stimoli morte.
Introduction
Caspasi sono proteasi cisteina che mediano la morte cellulare per apoptosi, con l'adesione molte proteine intracellulari dopo residui di aspartato chiave. Ad esempio, caspasi iniziatrici attivano le caspasi effettrici, nucleasi DNA derepress, componenti del citoscheletro Cleave e alterano la composizione lipidica delle membrane cellulari di smantellare rapidamente le cellule e stimolare il loro riconoscimento e engulfment da parte delle cellule che smaltiscono i cadaveri cellula vicina. 1-4 Si stima che miliardi di cellule muoiono al giorno nel corpo umano, e l'apoptosi è un importante meccanismo di morte delle cellule tumorali indotta da chemioterapia. 5 un diverso insieme di caspasi può causare la morte cellulare da processi non apoptotici distinte per stimolare l'immunità innata. 6 Perciò, maggior parte della ricerca sulle caspasi è concentrata sulla loro funzioni pro-morte.
È interessante notare che le prove nelle prime fasi del campo ha rivelato che gli stessi caspasi responsabili della promozione della morte cellulare hanno anche non-morte funzioni. Studi pionieristici hanno dimostrato che caspasi sono coinvolte in diverse funzioni cellulari in cellule sane, tra cui la regolazione della proliferazione cellulare e la migrazione durante l'embriogenesi. 7-9 Caspases sono necessari per l'individualizzazione spermatid in Drosophila 10,11, per bloccare un percorso di morte cellulare necroptotic alternativa nei topi 12,13, e per l'elaborazione microRNA in C. elegans. 14,15 In forse la più lunga vissuto cellule, i neuroni, caspasi e altri macchinari apoptotica sono implicati nella regolazione dell'attività neuronale da potatura terminazioni sinaptiche, un processo che si ritiene essere essenziale per rafforzare altri sinapsi per l'apprendimento e la memoria 16. 18 E 'possibile che caspasi facilitare la potatura sinaptica da un tipo di mini-apoptosi di minuscole proiezioni neuronali senza morte cellulare intero. 19 Tuttavia, caspasi possono avere funzioni alternative non correlati ad eventi apoptosi-like. 20,21 duplice ruolos nella vita e la morte non sono riservate caspasi; BCL-2 proteine della famiglia e citocromo c hanno ruoli in energetica cellulari in cellule sane, ma sono anche parte del nucleo via apoptotica che viene attivato da molti tipi di stress cellulare. 22-25 Anche se non è provato, sembra logico che l'evoluzione ha legato giorno : i processi di morte-posti di lavoro all'interno delle stesse molecole per garantire la tempestiva eliminazione delle cellule inadatti o indesiderabili.
Allo stato attuale, i meccanismi molecolari di attività caspasi non-apoptotica non sono comprese, e la misura dell'attività di caspasi non apoptotica durante lo sviluppo embrionale e nei tessuti adulti non è noto. Una sfida importante è la difficoltà nel distinguere giornaliere di posti di lavoro da death-lavori di caspasi. In contrasto con l'apoptosi e pyroptosis, quando l'attività delle caspasi è amplificato da una cascata proteolitica, si prevede che i giorno-lavori di caspasi che si verifichi a livelli molto più bassi di attività enzimatica, probabilmente al di sotto di rilevamento da molti Techn disponibileologies.
Prima del lavoro qui presentato, altri svilupparono una varietà di biosensori caspasi per scopi diversi. I biosensori SCAT (ad esempio, ECFP-DEVD-Venere) individuare rapidamente l'attività della caspasi in tempo reale in cellule in coltura e tessuti animali utilizzando FRET. 26,27 Al caspasi scissione, la frazione GFP nucleare mirato di Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) subisce rilocalizzazione subcellulare in pochi minuti quando la sua membrana plasmatica-tether viene scisso dalla caspasi. 28 allo stesso modo, ApoAlert-pCaspase3-Sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) rilocalizza dal citoplasma al nucleo su caspasi scissione. 29,30 Altro di recente, il cromoforo in iCasper è stato abilmente progettato per fluorescenza quando spaccati dalla caspasi, permettendo la rilevazione di attività biosensore in tempo reale nei neuroni di embrioni di Drosophila, ma soprattutto in associazione con la morte delle cellule di sviluppo. morte 31 caspasi-dipendente dei neuroni olfattivi durante l'invecchiamento, è stato demonstvotata da immuno-rilevamento della forma caspasi-spaccati di biosensori CPV (ad esempio, mCD8-PARP-Venere). 32,33 È importante sottolineare che la forma attiva della caspasi-3 è stato rilevato in assenza di morte cellulare da immunostain sensibile a spine di neuroni in coltura, e nel soma utilizzando la fluorescenza caspasi-dipendente del colorante CellEvent giornalista nucleare, ma sono stati riscontrati a causa di foto-tossicità difficoltà, anche se la morte cellulare è stata ritardata fino a dopo l'eliminazione della colonna vertebrale. 19 Pertanto, sono necessari nuovi biosensori caspasi per rilevare e tenere traccia delle cellule con l'attività delle caspasi basale in vivo.
Per superare queste difficoltà, abbiamo generato un romanzo a due biosensore colore caspasi, designato CaspaseTracker. Questa strategia combina una versione modificata del Drosophila caspasi-sensitive Apoliner biosensore 28 con la Drosophila G-TRACE sistema FRT ricombinasi 34 per etichettare definitivamente e monitorare le cellule in vivo. <sup> 35 Il sistema G-TRACE GAL4-attivato permette di livelli molto bassi di caspasi per attivare CaspaseTracker, con conseguente espressione RFP nel citoplasma e l'espressione GFP nucleare mirata permanente in una cella che ha mai sperimentato l'attività delle caspasi. 35 Questo sistema può etichettare cellule per tutta la vita in animali interi utilizzando Drosophila melanogaster, un sistema modello trattabili e ampiamente utilizzati per lo studio delle caspasi e morte cellulare. 36-38
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Protocol
1. Preparazione di mosche CaspaseTracker
- Per preparare CaspaseTracker (DQVD) vola per esperimenti, eseguire questa croce: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi> Arresto> GFP-NLS), trasferendo 7-10 femmina vergine (o maschio) mosche trasportano il substrato caspasi biosensore mCD8-DIAP1-GAL4 guidato dal promotore dell'ubiquitina 35 insieme con lo stesso numero di maschio (o femmina) linea G-TRACE, che hanno la seconda bilanciatore cromosoma cyo per evitare letalità della combinazione omozigote di G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi> Arresto> GFP-NLS) 34. Inserire vola in un flaconcino alimento fresco con pasta di lievito fresco come fonte proteica.
- Incubare i file a 18 ° C per 5 a 7 giorni (massimo 2 settimane) e quindi rimuovere il genitore aria dal flacone per evitare il sovraffollamento con la nuova progenie, e per impostare nuove fiale di allevamento.
- Continuare incubazione a 18 ° C fino a quando progenie vola Eclose. Selezionare la non cyo [non-cURLy ala] progenie della corretta genotipo di CaspaseTracker, che sono transgenici per CaspaseTracker e G-35 oligoelementi.
- Allo stesso tempo, generare controllo parentale mosche W118 non transgenici e caspasi-insensitive (DQVA) vola in parallelo per verificare specifiche RFP CaspaseTracker e GFP fluorescenza.
- Eseguire la PCR genotipizzazione per confermare i file con CaspaseTracker utilizzando i primer: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, producendo un prodotto di 3.897 bp. Per la genotipizzazione loci G-Trace, utilizzare i seguenti primer per GFP (474 bp), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC ATG GCC CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; per RFP (258 bp), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e per Flpase (655 bp), 5'-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TCT TTG CTG TCA C. Per la genotipizzazione GAL4 nel vettore pUWR (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA.
2. Preparazione del tessuto, colorazione e montaggio
- Per dissezioni mosca, evitare tessuti dissezionati di attaccarsi alle punte di plastica per pipette e provette da centrifuga, consigli cappotto e tubi con albumina 1% di siero bovino (BSA) disciolti in acqua.
- Dissect vola su un cuscinetto di silicone con pinze.
- Per evitare di danneggiare le punte delle pinze su una superficie dura quando si esegue la dissezione, eseguire la dissezione su una superficie di silicio. Per la realizzazione di lastre di dissezione silicone, sciogliere il silicio nel kit commerciale secondo le istruzioni del produttore (Materials List). Dopo la fusione il silicone, aggiungere 3 a 4 mL di un tessuto di diametro piatto di coltura 60mm. piatti di silicio possono essere riutilizzati.
- Anestetizzare una mosca con CO 2, e trasferirlo ad una piastra in silicone con 1 ml di PBS freddo. Introdurre la CO 2 ad un flacone contenente il volo usando una cerbottana, e quindi trasferire al volo t anestetizzatoOA Pad che ha una fornitura di CO 2.
- Utilizzare un paio di pinze per tenere la testa mosca, ed una seconda coppia di pinze per tirare torace nella direzione opposta per scollegare la testa mosca dal corpo di rivestimento senza danneggiare la connessione tra la testa e foregut.
- Usare 2 paia di pinze per rimuovere le ali e le gambe dal torace.
- Utilizzare un paio di pinze per tenere il torace, e un altro paio di pinze per tirare l'addome per separarlo dal torace di nuovo senza danneggiare la connessione tra il foregut e midgut.
- Sezionare organi interni compreso il cervello, intestino, tubuli malpighiani e le ovaie, come precedentemente dimostrato. 39-41
- Rimuovere tutti i pezzi della cuticola e gli organi di grasso con una pinza da questi tessuti producono forti autofluorescenza. La pazienza e la pratica sono tenuti a preparare un sistema di organi completo come mostrato.
- Trasferimento tessuti sezionati a 1,5 ml provette da centrifuga, e fissare i tessuti with 0,5 mL di 4% paraformaldeide in PBS (tampone fosfato salino) a temperatura ambiente per 20 a 30 minuti con rotazione al buio per evitare sbiancamento RFP e GFP nei tessuti. Evitare la fissazione prolungata che può compromettere le successive risultati di colorazione.
- Rimuovere la paraformaldeide delicatamente pipettando e lavare 3 volte con 0,5 mL di PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) a RT.
- Permeabilize i tessuti con 0,5 ml PBST a 4 ° C per una notte con un leggero scuotimento. incubazione più brevi possono causare permeabilizzazione e il compromesso di colorazione risultati incompleti.
- Se è necessario ridurre la colorazione di fondo, non incubando tessuti in 0,5 mL PBST con 1% BSA, invece di PBS.
- Lavare i tessuti 3 volte con 0,5 mL PBST.
- Per macchiare nuclei e filamentosa actina (F-actina), si applicano 0,5 ml PBST con 10 mg / mL di Hoechst 33342 blu colorante nucleare e 0,3 micron Alexa Fluor 633 falloidina F-actina macchia e incubare simultaneamente con i tessuti per 1 ora a RT with leggera rotazione nel buio. Evitare colorazione prolungata in quanto ciò aumenterà lo sfondo.
- Per immunocolorazione, incubare fisso e permeabilizzate tessuti con 0,1% Triton X-100 in 0,5 ml di PBS notte a 4 ° C, macchia con diluizione 1: 100 di anticorpi anti-ELAV o con diluizione 1: 200 di anticorpi anti-caspasi-3 notte a 4 ° C (300 mL). Seguire dal corrispondente anticorpo secondario diluito 1: 100 e incubare per 1 a 3 ore a RT. Vedere Materiali Lista per specifiche informazioni di anticorpi.
- Lavare i tessuti 3 volte, ognuna per 5 min in 0,5 mL PBST con rotazione dolce.
- Con una pipetta, rimuovere tutti PBST, e poi aggiungere 200 microlitri anti-candeggina agente di montaggio (vedi materiali) per coprire completamente i tessuti per 1-3 ore a temperatura ambiente, o 4 ° C durante la notte. tessuti ottimali che hanno completamente assorbito l'agente di montaggio si depositano sul fondo della provetta.
- Pre-pulire il vetrino con acqua o etanolo al 70% e trasferire i tessuti con l'agente di montaggio per i glass slitta.
- Posizionare con cura un vetrino di vetro sopra i tessuti. Applicare vaselina per il vetrino e la polizza di copertura per evitare di distruggere il tessuto da sovracompressione. Rimuovere l'agente di fissaggio in più con la carta velina.
- Sigillare la polizza di copertura mediante l'applicazione di smalto lungo i bordi del vetrino per evitare la fuoriuscita di agenti di montaggio dai tessuti.
3. Microscopia confocale
- Utilizzare un confocale epi-microscopio a fluorescenza invertito. Tuttavia, microscopi up-destra possono anche essere utilizzati. Per i tessuti di immagine utilizzando piastrelle, mantenere la temperatura ambiente stabile per evitare la deriva di messa a fuoco e spostamento del piano xy a causa della dilatazione termica e la contrazione dei componenti. sistemi di controllo ambientale e sistemi di compensazione attenzione deriva aiutano ad evitare questo problema a causa di perdita di termo-equilibrio del sistema microscopio.
- Posizionare il vetrino sul palco del microscopio. Prendete un paio di immagini di prova con bassa risoluzione (125 x 125 pixel) unad determinare il numero appropriato di piastrelle necessarie per coprire l'intera regione di interesse (ROI).
- Impostare il sistema di scansione microscopio per catturare immagini con risoluzione di scansione ad esempio 500 x 500 pixel. Selezionare l'obiettivo come un 20X NA 0.8 o un obiettivo Plan-Apochromat 63X NA 1.4 per analizzare i tessuti attraverso vetrino, in modo che ciascuna delle immagini (piastrelle) sovrapposizioni del 20% su tutti i lati.
- Impostare la sequenza di immagini da più lungo al più breve lunghezze d'onda di eccitazione, come la luce di lunghezza d'onda lunga provoca inferiore fotometabolismo. La sequenza dalla più lunga alla più corta lunghezza d'onda di eccitazione è: (i) 633 nm per falloidina F-actina e per gli anticorpi caspasi attivate, (ii) 561 nm per RFP, (iii) 488 nm per GFP, e (iv) 405 nm per Hoechst macchia nucleare.
- Durante l'imaging, minimizzare l'esposizione delle cellule alla eccitazione laser fluorescente durante il processo di imaging per evitare fotometabolismo riducendo l'intensità del laser per ottenere immagini di alta qualità di tessuti.
- Dopo iomaghi sono raccolti, l'unione delle immagini utilizzando il software microscopio.
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Representative Results
Ci sono due componenti fondamentali che permettono CaspaseTracker per rilevare l'attività delle caspasi nelle cellule sane normali (Figura 1A). Il primo di questi è un 146 aminoacidi polipeptide caspasi-cleavable modello della caspasi biosensore Apoliner (Figura 1b). 28 Questo polipeptide è derivato da DIAP1 (Drosophila inibitore di apoptosi) contenente un singolo sito caspasi naturale che è scisso durante l'apoptosi tipicamente dalla caspasi DrICE. 42,43 DrICE equivale a caspasi-3 nei mammiferi e si unirà più conosciute substrati cellulari. 4,32 caratteristico delle caspasi, DIAP1 e la sua polipeptide derivati sono spaccati dopo uno specifico acido aspartico, Asp20 trovano all'interno il riconoscimento caspasi sequenza di 17-DQVD-20, e la mutazione del obbligatoria Asp20 residuo di Ala (DQVA) abolisce scissione. 42,43 simile a Apoliner, 28 questo frammento DIAP1 è anchorosso nel citoplasma alla membrana plasmatica tramite il mouse CD8 (aminoacidi a catena alfa 1-220), uno strumento comunemente usato in Drosophila. L'ancoraggio della membrana CD8 impedisce qualsiasi carico legato con una stessa sequenza traslocazione nucleare (nucGFP nel caso di Apoliner) dal translocating al nucleo in assenza di attività caspasi. 28 Il secondo componente chiave del CaspaseTracker è il sistema G-TRACE Drosophila in cui la lievito fattore di trascrizione Gal4 induce l'espressione di flippase (FLP) ricombinasi (e induce simultaneamente RFP). 34 flippase accise un codone di stop che porta alla espressione permanente di nucGFP. Per rendere G-TRACE sensibile alle attività di caspasi, è stato combinato con il sistema Apoliner da legare GAL4, che è necessario per attivare G-TRACE, alla membrana plasmatica-ancorato caspasi-cleavable frammento DIAP1 di Apoliner (Figura 1a). 35
Abbiamo fatto ulteriore modifications alla componente Apoliner di CaspaseTracker per migliorare l'utilità. Più importante, è fondamentale che la caspasi biosensore per sé non inibisce caspasi, potenzialmente conservare le cellule che altrimenti sarebbero morti. Anche se il transgene Apoliner non ha causato fenotipi evidenti in Drosophila 28, come ci si aspetterebbe di un inibitore della caspasi potenti, anche la conservazione occasionale di cellule sarebbe vanificato l'obiettivo di identificare le cellule normali con l'attività delle caspasi. Tuttavia, il frammento DIAP1 in Apoliner contiene un motivo (135-DICG-138), che è stato successivamente dimostrato di inibire potentemente DrICE, lo stesso caspasi che si unirà DIAP1 a Asp20. 43 Il meccanismo di inibizione caspasi è stato rivelato da una struttura di cristallo in cui DIAP1 Asp135 è legato nel sito attivo DrICE come mimica substrato caspasi (ma non viene scissa). 43 le analisi biochimiche hanno dimostrato che una sostituzione Arg a Asp135 abolisce la funzione DrICE-inibitoria. 43 Pertanto, CaspaseTracker è stato progettato con la stessa mutazione D135R per evitare l'inibizione della caspasi (Figura 1b). 35 Simile a Apoliner, la naturale sequenza di DIAP1 Asn-Asn a de novo N-terminale in seguito scissione in Asp20 è stato cambiato a Gly-Val in CaspaseTracker impedire il degrado del GAL4 dalla regola N-end su caspasi scissione (Figura 1b). 28 Inoltre, abbiamo fuso un myc-tag al C-terminale di GAL4 per la rilevazione immediata di espressione CaspaseTracker. 35 di necessità, proprio RFP Apoliner e cassette nucGFP sono stati cancellati per renderlo compatibile con il G-TRACE, che contiene anche RFP e nucGFP. 28,35
Perché GAL4 reca il proprio segnale di localizzazione nucleare e attiva potentemente trascrizione attraverso l'elemento di risposta DNA bersaglio (UAS) quando fuso ad altri transgeni in Drosophila, presumibilmente solo poche molecole di rel GAL4facilitato dalla caspasi citoplasmatici sono sufficienti per accendere espressione RFP entro poche ore (stimato ≤12 h). Poiché l'attività biosensore richiede de novo trascrizione e traduzione di RFP, non segnala l'attività enzimatica in tempo reale. Sebbene CaspaseTracker RFP sarà notevolmente degradata probabile entro un giorno dopo l'attività della caspasi cessa, nucGFP sarà espresso dal promotore dell'ubiquitina per la vita della cellula e la sua progenie.
Per dimostrare prima che CaspaseTracker è sensibile alla attivazione delle caspasi in vivo, mosche biosensori adulto CaspaseTracker sono stati esposti ai telefoni stimoli che inducono la morte. L'ovaio Drosophila è un modello morte cellulare ben studiato come le camere di uova subiscono la morte cellulare programmata quando gli animali sono stressati, un presunto meccanismo di corrispondenza condizioni ambientali alla progenie di produzione. 37,44,45 Per indurre la morte delle cellule, mosche biosensori erano fredde-shock 1 h a -7° C (congelamento degli animali), e le ovaie sono stati sezionati da animali vivi il giorno successivo (Figura 2a). In contrasto con le mosche biosensori non trattati, le camere di uova dopo il colpo di freddo erano notevolmente più piccoli ed esposti rosso robusto (recente) e verde attività biosensore (permanente), la verifica di attivazione biosensore dopo una morte cellulare stimolo (Figura 2b, merge). Attività biosensore è stata rilevata nei nuclei delle due cellule germinali (cellule nutrici e ovociti) e le cellule somatiche (cellule del follicolo) in camere d'uovo, ma solo nelle mosche trattati. 35 Morfologie caratteristica dell'apoptosi sono stati anche facilmente osservata in camere d'uovo biosensori-positivi tra cui la frammentazione nucleare, la condensazione del DNA e il degrado (perdita di macchia blu). attività biosensore può essere rilevato nelle stesse cellule sia con condensazione nucleare (Hoechst) e caspasi attive (immunostain), ma la colorazione più intensa per la caspasi attive si è verificato nelle zone in cui sia il DNA nucleare e caspassegnali biosensori e sono state diminuite o degradato (Figura 2b). 46,47 I meccanismi di morte cellulare che si verificano dopo freddo-shock non sono ben caratterizzati, e altri meccanismi di morte potrebbero essere in gioco. Tuttavia, risultati simili sono stati ottenuti applicando inedia aminoacido, che è noto per provocare l'apoptosi. 35
Per determinare se CaspaseTracker potrebbe rilevare l'attività della caspasi non apoptotica, gli organi interni di sani 1-giorno-vecchi mosche erano meticolosamente sezionati rimuovendo la cuticola autofluorescenti e grassi. I tessuti di una mosca rappresentante sono state fissate, montato, macchiato con Hoechst per segnare nuclei e con falloidina macchia di F-actina per rilevare le cellule muscolari. In contrasto con le camere di uova sane, che mancano di attivazione biosensori, le cellule muscolari F-actina-macchiato tra le camere d'uovo avevano entrambi rosso e verde biosensore-attività (Figura 3a, nel riquadro). Tuttavia, è possibile che il biosensor etichette anche altre cellule. Molti altri tessuti sani e gli organi di modo ottimale allevati 1-giorno-vecchi mosche esposti prominente attività biosensore caspasi riflettendo presumibilmente basale funzione caspasi non apoptotica (Figura 3a). Cellule biosensore-positivo apparivano morfologicamente normale e si sono verificati nei modelli organizzati in tessuti che suggeriscono che specifici sottoinsiemi di cellule attivano caspasi, ad esempio strisce di cellule biosensore-positive che avvolgono il hindgut (Figura 3a, nel riquadro).
La migliore evidenza che CaspaseTracker è un reporter specifico delle caspasi è la mancanza di segnale nelle mosche esprimono il biosensore di controllo, che è identico al CaspaseTracker eccezione di un unico Asp Ala mutazione amminoacido nel sito di clivaggio della caspasi obbligatoria, cambiando DQVD per DQVA ( Figura 1b e 3b). Fatta eccezione per una cella estremamente rara (Figura 3b, freccia verde), l'unico segnale osservatiEd in mosche biosensori controllo DQVA sono strutture autofluorescenti, come parti della bocca (figura 3b) e cibo ingerito nelle colture e altrove (figura 3b e 4), che sono anche osservati in mosche parentali non transgenici che mancano il biosensore caspasi. 35 le cellule CaspaseTracker-marcate si verificano a intervalli regolari lungo le (rene) tubuli malpighiani e spesso mostrano contemporaneamente sia recente (rosso) e passato (verde) attivazione delle caspasi, mentre molte cellule del cervello, lobi ottici, Cardia, ritagliare, midgut e oviduct sono rossi o verdi (figure 4 e 5 bis).
Per la prova che le cellule lunga durata possono sopravvivere l'attività delle caspasi, il lobo ottico è stato immunostained per la ELAV marcatore pan-neuronale (embrionali visione anormale letale). 48 I nuclei di molti neuroni sono stati doppio etichettati con GFP nucleare mirati da CaspaseTracker e ELAV, coerente con CE di lunga durataLLS utilizzando caspasi per le funzioni non-morte (figura 5b). Inoltre, se il biosensore viene spento per 10 giorni (utilizzando Gal80ts), cellule biosensore-positive persistono per la durata nell'intestino (figura 6a e b), cervello e altre parti (non mostrati). Utilizzando il CaspaseTracker caspasi biosensore, forniamo la prima panoramica delle attività di caspasi basale negli animali interi.
Figura 1: Sistema di biosensore CaspaseTracker per rilevare l'attività della caspasi non apoptotica. (a) Componenti del caspasi biosensore Drosophila. (b) La porzione caspasi-cleavable del sistema biosensore CaspaseTracker è composto da un ancoraggio della membrana plasmatica (mCD8), un frammento di DIAP1 contenente naturale sito caspasi-clivaggio Asp20 fusa alla trascrizione Gal4 fattore con un tag 3x-myc C-terminale ed espressa tramite la ubiquitina promoter. Caspase scissione si traduce in traslocazione di GAL4 al nucleo di indurre il sistema G-TRACE. In un biosensore di controllo, il requisito residuo Asp20 nel sito caspasi scissione acido 4-amino (DQVD) viene modificata per Ala (DQVA) di abolire caspasi scissione. Mosche transgenico CaspaseTracker contengono 4 transgeni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: CaspaseTracker è attivato da caspasi durante la morte delle cellule. (a) Schema di Drosophila ovaie e diagramma di flusso per la morte cellulare indotta shock freddo. Drosophila ovaio disegno (da Polan Santos) e l'immagine Drosophila (da Darren Obbard) vengono utilizzati con il permesso. (b) camere uovo dalle ovaie di 6- femmina giorno CaspaseTracker vola Fed w cibo mosca normale esimo per 6 giorni (non trattati) o 1 giorno dopo la scossa fredda (-7 ° C, 1 h, seguito da 25 ° C per 24 h) per indurre attivazione delle caspasi in camere d'uovo. Ingrandimenti di ovaio trattati a freddo (fotogrammi basso a destra) mostrano tre camere di uova in uno sviluppo ovariole catena (centrato circa verticalmente) con evidenza di condensazione nucleare (camera di uovo in alto), la frammentazione nucleare (camera di uovo centrale e inserti) e il degrado (uovo in basso camera) sulla base di Hoechst DNA macchia (blu). caspasi attivi (anti-caspasi-3, magenta) vengono rilevati nelle camere medio e basso di uova. RFP e GFP attività biosensore (rosso, verde e giallo frecce) si verificano in cellule con DNA nucleare condensa che spesso macchiano diffusamente con caspasi attive (inserti). frecce bianche indicano nuclei privi sia l'attività biosensore e caspasi immunostain attiva. * Segnali autofluorescenza. Questi dati vengono riprodotti con il permesso di Tang et al., Sci Rep 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Prove per una diffusa attività di caspasi fisiologica. (a) immagine confocale di CaspaseTracker (DQVD) RFP e nucGFP uniti da una mosca nuova eclosed sollevata a 18 ° C, sezionato e colorati con H33342 per nuclei e falloidina per F-actina (rosa), e ripreso con DIC. Falloidina viene visualizzata solo nel cestello per camere d'uovo. (B) la procedura di imaging e stesse condizioni sono stati seguiti per CaspaseTracker di controllo (DQVA) vola. * Strutture autofluorescenti. Questi dati vengono riprodotti con il permesso di Tang et al., Sci Rep 2015. Clicca qui per vedere una versione più grandequesta figura.
Figura 4:. Caspasi attività basale in molti tessuti ingrandimenti elevati di DIC e fluorescenza immagini confocale di GFP (passato) e RFP (recente) CaspaseTracker (DQVD) attività e di nuclei Hoechst-macchiati nel cervello, cardias, ritagliare, midgut, tubuli malpighiani e ovidotti di Figura 3a. * Strutture autofluorescenti. Questi dati vengono riprodotti con il permesso di Tang et al., Sci Rep 2015. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: caspasi attività non-apoptotica nei neuroni del Drosophila lobo ottico. (a) DIC e immagini confocali con RFP (recente) e GFP attività (passato) CaspaseTracker (DQVD) e nuclei Hoechst-macchiati nel cervello. Cellule dual-etichettato RFP + GFP (frecce gialle). (B) NucGFP colocalizza con immunostain per pan di proteine ELAV nucleare neuronale nel lobo ottica di CaspaseTracker (DQVD) volare cervello. I neuroni con segnali co-localizzate di NucGFP e ELAV sono mostrati (frecce bianche). Si noti, i neuroni RFP marcato non sono presenti in questo particolare settore. Questi dati vengono riprodotti con il permesso di Tang et al., Sci Rep 2015. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui illustriamo la costruzione e funzionamento interno di CaspaseTracker che facilitano il rilevamento di una diffusa attività di caspasi basale nei tessuti sani. I passaggi critici per rilevare l'attività della caspasi non apoptotica in vivo sono: 1) la generazione di mosche con il transgene biosensore, 2) verificare la funzione giornalista specifiche caspasi con opportuni controlli, 3) praticando tecniche di dissezione di osservare tutti i sistemi di organi interni di adulti Drosophila, e 4) attività distintivo biosensore dagli artefatti autofluorescenti.
Il polipeptide naturale caspasi-cleavable che funge da sensore specifico caspasi è stata modificata per evitare qualsiasi attività caspasi-inibitrice dal biosensore. Ulteriori modifiche sono state apportate per evitare una rapida degradazione del fattore di trascrizione GAL4, e l'inserimento di un epitopo. Abbiamo anche descrivere tutta la dissezione del corpo organo di mosche, immunostaining, il montaggio e la microscopia confocale del tessuto flys per rilevare l'attività della caspasi non apoptotica.
Mentre CaspaseTracker è ideale per rilevare le cellule che sopravvivono con bassi livelli di caspasi attività, non è un reporter di attività enzimatica in tempo reale, come diverse ore sono richieste per accendere il biosensore. Tuttavia, non abbiamo determinato il tempo minimo di rilevamento, che è probabilmente molto più breve di quella necessaria per le applicazioni descritte qui. In contrasto CaspaseTracker, la principale limitazione di altri biosensori caspasi è la loro incapacità di rilevare bassi livelli di caspasi attività, in quanto sono progettati principalmente per studiare la morte cellulare. Attività di Caspase è amplificato dopo uno stimolo morte delle cellule, causando massiccia demolizione delle cellule in meno di 30 min. 49 Pertanto, l'individuazione di attivazione delle caspasi è spesso presume essere un marker di certa morte cellulare. 50,51 Tuttavia, le prove di montaggio indica che caspasi hanno non apoptotica, anche le funzioni non degradativi in cellule sane. 7-21 Il presumed bassi livelli di attività enzimatica spazialmente temporaneamente ristretto di caspasi che svolgono le loro giorno di posti di lavoro rischiano di sotto di rilevamento dalle tecnologie disponibili. Questo problema viene superato CaspaseTracker, che probabilmente richiede pochi eventi caspasi scissione per generare segnali robusti, e non richiede continuo caspasi attività enzimatica per etichettare definitivamente queste cellule in vivo.
Le prove presentate indicano che CaspaseTracker è specifico per caspasi, anche se non possiamo escludere la possibilità che altre proteasi Asp-specifici identificati potrebbero attivare CaspaseTracker. Tuttavia, l'alimentazione vola con un cocktail di caspasi-inibitori peptidi blocchi attività CaspaseTracker (inedito). Sottolineiamo inoltre l'importanza di evitare biosensori che si inibiscono caspasi, e l'importanza di biosensori di controllo e le mosche non transgenici per evitare conclusioni errate a causa di autofluorescenza inerente alla cuticola dell'insetto, depo grasso internosiede, cibo o altri fattori confondenti ingerito.
Un'altra sfida sta distinguendo le funzioni pro-morte e la non-morte delle caspasi. funzioni Pro-morte e non-morte possono essere collegati evolutivamente ai fini della transizione cellule tra uno stato fisiologico normale ad una morte opportunamente temporizzato, per esempio l'espansione di cellule immunitarie di combattere l'infezione e la successiva eliminazione di tali cellule per prevenire il cancro. Così, non si può escludere che alcune delle caspasi attività basale osservata negli organi interni è invece un tentativo di promuovere la morte delle cellule, apparentemente coerente con le decine stimati di morte cellulare miliardi verificano giornalmente nel corpo umano. 52 Tuttavia, la morfologia sano di cellule che esprimono il biosensore indica fortemente che CaspaseTracker è in grado di rilevare l'attività delle caspasi destinate al normale giornata-lavori di caspasi.
Caspasi sono suggeriti per avere ruoli non-morte, come celluleproliferazione. Questo è coerente con precedenti tentativi per generare linee cellulari di mammifero che esprimono stabilmente proteine virali che legano e direttamente inibire caspasi cellulari (per esempio, CRMA). Mentre centinaia di colonie di cellule sono sorte durante la selezione della droga con il vettore di controllo vuota, inaspettatamente a zero colonie formate di colture in parallelo trasfettate con gli inibitori della caspasi vettore che esprime (non pubblicati). Così, caspasi probabilmente hanno funzioni diffuse in cellule normali che sono attualmente sottovalutati. Ciò è ulteriormente supportata dalla scoperta che l'attività biosensore basale nel volo CaspaseTracker viene rilevata in molti tipi di cellule nella maggior parte dei sistemi di organi, compresi i neuroni, in normali mosche sani. attività di caspasi sano nei neuroni può smantellare terminazioni sinaptiche per promuovere la funzione normale del cervello, con l'adesione degli stessi substrati come durante l'apoptosi, o le relative funzioni giornata di lavoro può essere del tutto distinta da attività di apoptosi-like. Mentre basso rispetto a elevati livelli enzimatici di attivocaspasi possono essere una distinzione fondamentale tra giorno-posti di lavoro e la morte cellulare, ci sono pochi Knockin animali mutanti con specifici substrati caspasi-uncleavable che supportano questa possibilità. 17,53 Tuttavia, i recenti progressi indica che la caspasi-8 inibisce necroptosi possibilmente, con l'adesione RIPK, 54 depressione sinaptica e AMPA dei recettori endocitosi possono essere regolate da caspasi scissione di GAP43, 55 e l'elaborazione microRNA può essere regolato dalla caspasi scissione di Dicer. 14,15,56
Ci sono molte applicazioni aggiuntive di questo biosensore. Per determinare se caspasi sono attivati in momenti specifici o in tessuti specifici, espressione del biosensore può essere facilmente regolata temporalmente (ad esempio, utilizzando Gal80ts) e in tipi cellulari specifici (ad esempio, driver GAL4 olfattivo-specifici). Utilizzando Gal80ts per sopprimere l'espressione biosensore fino emergere di adulti vola ancora portato ad una diffusa attività di biosensore, indicando che caspases possono essere attivati in fasi adulti (figura 6c e D). 35 Sostituendo il frammento DIAP1 con altri substrati caspasi, altre applicazioni possono includere biosensori specifici per le diverse caspasi e per la rilevazione di scissione di substrati specifici. Il biosensore CaspaseTracker migliorerà la nostra comprensione del ruolo delle attività di caspasi non apoptotici.
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Acknowledgments
Ringraziamo Polan Santos e Darren Obbard per le illustrazioni di Drosophila in Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena per l'uso del insectary JHMRI. Questo lavoro è stato sostenuto dalla borsa di studio Fondazione Life Science Research (HLT), Comitato Università assegni di Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF), e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang è un Shurl e Kay Curci Foundation Fellow della Fondazione Life Sciences Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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