Summary
カスパーゼ活性の低いレベルを含む全動物に健康な細胞を検出するために、CaspaseTracker指定された高感度バイオセンサーは、 ショウジョウバエのために生成されました。カスパーゼ依存性のバイオセンサーの活性は、死刺激の非存在下で最適化された条件下で飼育した成体動物の臓器全体長寿命健康な細胞で検出されます。
Introduction
カスパーゼは、キーアスパラギン残基の後に多くの細胞内のタンパク質を切断することにより、アポトーシス細胞死を仲介するシステインプロテアーゼです。例えば、イニシエーターカスパーゼは、エフェクターカスパーゼ、活性化するDNAヌクレアーゼ、切断する細胞骨格成分を活性化し、急速に細胞を分解し、細胞の死骸の処分隣接細胞によってそれらの認識と貪食を刺激するために、細胞膜の脂質組成を変化させる。1-4それが推定されます細胞数十億は、ヒトの体内で一日あたり死亡し、アポトーシスが化学療法誘発性腫瘍細胞死の重要なメカニズムである。5カスパーゼの異なるセットは、先天性免疫を刺激する別個の非アポトーシス過程による細胞死を引き起こす可能性があります。6ので、カスパーゼ上のほとんどの研究は、それらのプロ死の機能に焦点を当てています。
興味深いことに、フィールドの初期の証拠は、細胞死を促進する責任同じカスパーゼは、非死Fを有していることを明らかにしましたunctions。先駆的な研究では、カスパーゼは、胚形成の間の細胞の増殖および遊走の調節を含む正常細胞における多様な細胞機能に関与していることが示されている。7-9カスパーゼが代替ネクロトーシス細胞死経路を遮断するため、 ショウジョウバエ 10,11に精子細胞を個別に必要とされますマウス12,13で、およびマイクロRNAの処理のためにCでエレガンス 。おそらく最長寿命の細胞、ニューロン、カスパーゼおよび他のアポトーシス機構は、シナプス終末を剪定することによって神経活動の調節に学習や記憶のための他のシナプスを強化することが不可欠であると考えられてプロセスを関与している。16で14,15 18カスパーゼは、全細胞死なしで小さな神経突起のミニアポトーシスのタイプによってシナプス刈り込みを容易にすることが可能である。19しかし、カスパーゼはアポトーシスのようなイベントとは無関係の代替機能を有していてもよい。20,21二重の役割生と死でsがカスパーゼに固有のものではありません。 BCL-2ファミリータンパク質とシトクロムcは、健康な細胞における細胞エネルギー論における役割を持っているだけでなく、細胞ストレスの多くの種類によって活性化されるコアアポトーシス経路の一部である。22-25証明されていないが、進化は日がリンクされていることを論理的なようです不適当または望ましくない細胞のタイムリーな除去を確実にするために、同じ分子内の死ジョブに-jobs。
現在のところ、非アポトーシスカスパーゼ活性の分子メカニズムは理解されていない、および胚発生中および成体組織における非アポトーシスカスパーゼ活性の程度もまた知られていません。大きな課題は、カスパーゼの死の仕事から一日の仕事を区別するのが困難なことです。カスパーゼ活性は、タンパク質分解カスケードによって増幅された場合、アポトーシスおよびpyroptosisとは対照的に、カスパーゼの日の仕事は、多くの利用可能なTECHNによる検出以下おそらく、酵素活性の非常に低いレベルで発生することが予想されますologies。
ここで提示作業の前に、他のものは、異なる目的のためにカスパーゼバイオセンサの様々な開発しました。 SCATバイオセンサー（ 例えば 、ECFP-DEVD-金星）急速にFRETを用いて培養細胞や動物組織におけるリアルタイムのカスパーゼ活性を検出する。26,27カスパーゼ切断されると、Apolinerの核標的GFP部分（mCD8-RFP-DQVD- nucGFP）その形質膜テザーは、カスパーゼによって切断されるときに数分以内に細胞内再局在を受ける。28同様に、ApoAlert-pCaspase3センサー（NES-DEVD-YFP-NLS）は、カスパーゼ切断の際に核に細胞質ゾルからrelocalizes。29,30詳細最近、iCasperにおける発色団は、巧みショウジョウバエ胚のニューロンでリアルタイムにバイオセンサ活性の検出を可能にする、カスパーゼによって開裂が、主に発達、細胞死に関連したときに蛍光を発するように操作した。嗅覚ニューロンの31カスパーゼ依存性死たエージング中demonstCPVバイオセンサー（ 例えば、mCD8-PARP-金星）のカスパーゼ切断形の免疫検出することによって評価した。32,33重要なのは、カスパーゼ3の活性化形態は、棘に敏感な免疫染色による細胞死の非存在下で検出されましたこのように、新たなカスパーゼバイオセンサーを検出するために、培養神経細胞、および細胞体に核CellEventレポーター色素のカスパーゼ依存性蛍光を用いたが、細胞死は背骨除去後まで延期されたものの難しさが、原因フォト毒性に遭遇した。19を必要としていますおよびin vivoでの基礎カスパーゼ活性を有する細胞を追跡。
これらの困難を克服するために、我々はCaspaseTracker指定された新規のデュアルカラーカスパーゼバイオセンサーを、生成されました。この戦略は、恒久的に、in vivoで細胞を標識し、追跡するために、 ショウジョウバエ G-TRACE FRTリコンビナーゼ系34とショウジョウバエカスパーゼ敏感Apolinerバイオセンサー28の修正版を兼ね備えています。<> 35 SUP GAL4活性化G-TRACEシステムは、カスパーゼの非常に低いレベルが今までカスパーゼ活性を経験している任意の細胞で細胞質と恒久的な核標的GFP発現にRFPの発現をもたらす、CaspaseTrackerを活性化することができます。35このシステムはラベルを付けることができキイロショウジョウバエ 、カスパーゼおよび細胞死の研究のための扱いやすいと広く使用されているモデル系を用いて、動物全体での生活を通して細胞。36-38
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Protocol
CaspaseTrackerのハエの調製
- CaspaseTracker（DQVD）は実験のために飛ぶ準備するには、このクロスを行います。UBI-CaspaseTrackerは G-TRACE X（UAS-RFP; UAS-FLPを、ユービーアイ>停止> GFP-NLS）、7-10処女女性（または男性）を転送することにより、一緒に男性（または女性）の数が同じでユビキチンプロモーター35によって駆動されるカスパーゼのバイオセンサー基板mCD8-DIAP1-GAL4 G-のホモ接合組み合わせの致死性を回避するために、第2染色体CYOバランサを持つG-TRACEのハエを、運ぶハエTRACE（UAS-RFP、UAS-FLP、およびユービーアイ>停止> GFP-NLS）34。場所は、タンパク質源として新鮮な酵母ペーストで生鮮食品のバイアルに飛びます。
- 5〜7日（最大2週間）のために18℃でファイルをインキュベートし、新しい子孫で混雑を避けるために、新たな繁殖バイアルを設定するためにバイアルから親ハエを削除します。
- 子孫が孵化するハエまで18℃でインキュベーションを続けます。非CYOを選択し、[非CCaspaseTrackerとG-TRACE要素35のためのトランスジェニックでurly翼] CaspaseTrackerの正しい遺伝子型の子孫、。
- 同時に、制御親の非トランスジェニックw118ハエおよびカスパーゼ非感受性を生成する（DQVA）は、特定のCaspaseTrackerのRFPとGFP蛍光を確認するために、並行して飛びます。
- プライマーを用いてCaspaseTrackerでファイルを確認するために、PCR遺伝子型解析を実行します。5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC、3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA、3897 bpの産物を生産します。 G-トレース遺伝子座の遺伝子型を決定するために、GFPについては、以下のプライマー（474 bp）を使用し、5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G、3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; RFP（258 bp）のために、5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG、3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC。そして、Flpase（655 bp）の、5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG、3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. pUWRベクター中の遺伝子型判定のGal4（554 bp）の、5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATCのGCTについてCAGTCA CGC、3'-TGG AAT TGG GGT ACGのTCT AGA。
2.組織調製、染色および取り付け
- フライ解離のため、水に溶解し、1％ウシ血清アルブミン（BSA）を用いてプラスチックピペットチップや遠心管、コートチップ及びチューブに粘着切開組織を防止します。
- ピンセットを用いてシリコーンクッション上のハエを解剖。
- 組織切開を行う際に、ハード面に鉗子の先端の損傷を防ぐため、シリコン表面に解剖を行います。シリコーン解剖プレートを作製するため、製造業者の説明書（物質一覧）に従って市販のキットには、シリコンを溶かします。シリコンを溶融した後、直径60mmの組織培養皿に3〜4 mLを加え。シリコン皿を再利用することができます。
- CO 2でハエを麻酔し、冷PBS 1mLでシリコーンプレートに移します。ブローガンを使用してフライを含むバイアルにCO 2を導入し 、その後、麻酔フライトンを転送CO 2供給を持っているOAパッド。
- 頭部と前腸との間の接続を損傷することなく、カバー体からフライヘッドを切断する反対方向に胸郭を引っ張ってフライヘッドを保持するピンセット、鉗子の第二の対を使用してください。
- 胸部から翼と脚を除去するために、鉗子の2ペアを使用してください。
- 前腸と中腸の間の接続を損傷することなく、再び胸部からそれを分離するために腹部を引っ張って胸部、および鉗子の別のペアを保持するためにピンセットを使用してください。
- 以前に示されているように、脳、腸、マルピーギ細管および卵巣などの内臓を解剖。39-41
- これらの組織は強い自家蛍光を生成するようにピンセットでキューティクルのすべての部分と脂肪体を除去します。忍耐と実践が示すように、完全な臓器システムを準備する必要があります。
- 1.5 mL遠心管に解剖した組織を移し、組織ののwiを修正組織における漂白RFPおよびGFPを回避するために、暗所で回転させながら20〜30分間室温でPBS中の4％パラホルムアルデヒド（リン酸緩衝生理食塩水）の第0.5 mLです。その後の染色結果を損なう可能性が長期の固定を避けます。
- 穏やかなピペッティングによりパラホルムアルデヒドを外し、室温で0.5 mLのPBST（PBS + 0.1％トリトンX-100）で3回洗浄します。
- 穏やかに振盪しながら4℃で一晩0.5 mLのPBSTで組織を透過性。短いインキュベーションは不完全透過性と妥協染色結果を引き起こす可能性があります。
- それはバックグラウンド染色を低減する必要がある場合は、代わりにPBSを、1％BSAを用いて0.5mLのPBST中で組織をインキュベート考えます。
- 0.5 mLのPBSTで組織を3回洗浄。
- 、核および繊維状アクチン（F-アクチン）の染色を10μg/ mLのヘキストの33342ブルー核染料と0.3μMアレクサフルオロ633ファロイジンFアクチン染色で0.5 mLのPBSTを適用し、RTワットで1時間組織と同時にインキュベートするには暗闇の中で穏やかに回転さi番目。これは、バックグラウンドを増加させるように長時間の染色を避けてください。
- で一晩抗カスパーゼ3の200希釈：抗ELAV抗体のまたは1と100希釈：免疫染色のために、4°C、1と汚れで一晩0.5 mLのPBS中の0.1％トリトンX-100を有する組織を固定し、透過処理インキュベート4°C（300μL）。 100、室温で1~3時間インキュベートする：対応する二次抗体によってフォロー1に希釈しました。特定の抗体については、物質一覧を参照してください。
- 穏やかに回転と0.5 mLのPBSTで5分間それぞれ、組織を3回洗浄します。
- ピペットで、すべてのPBSTを削除してから、完全に一晩、室温で1〜3時間、または4°Cのための組織をカバーするために（資料を参照）200μL抗漂白剤封入剤を追加します。完全に封入剤を吸収した最適な組織をチューブの底に沈んでしまいます。
- 水または70％エタノールでガラススライドを事前にきれいにし、グラスに封入剤を有する組織を転送sのスライド。
- 組織の上にガラスカバースリップを慎重に配置します。過によって組織を壊さないようにスライドガラスとカバーガラスにワセリンを適用します。ティッシュペーパーで余分な封入剤を削除します。
- 組織から取り付け薬剤の漏れを避けるために、すべてのカバースリップの縁に沿ってマニキュアを適用することにより、カバースリップをシール。
3.共焦点顕微鏡
- 倒立共焦点落射蛍光顕微鏡を使用してください。しかしながら、直立顕微鏡を使用することもできます。タイルを用いた画像組織に起因部品の熱膨張及び収縮にフォーカスし、xy平面のシフトのドリフトを避けるために、安定した室温を維持します。環境制御システムとドリフト補償システムフォーカスによる顕微鏡システムの熱平衡の喪失に、この問題を回避するのに役立ちます。
- 顕微鏡のステージ上にスライドを置きます。低解像度（125×125ピクセル）ANを使用して、いくつかのテスト画像を撮影関心領域（ROI）の全領域をカバーするのに必要なタイルの適切な数を決定するDは
- スキャン解像度などの500×500画素の画像をキャプチャするために、顕微鏡走査システムを設定します。画像（タイル）のそれぞれは、すべての側面に20％重なるように、このような20X NA 0.8またはカバーガラスを介して組織を分析するための63X NA 1.4プランアポクロマート対物レンズとして対物レンズを選択します。
- 長波長の光が下の写真漂白の原因として、励起波長を最短する最長からイメージシーケンスを設定します。励起波長を最短にする最長の配列は：（ⅰ）ファロイジンFアクチンのために、活性化カスパーゼに対する抗体のための633nmで、RFPのための（ii）の561 nmで、GFPのための（iii）の488nmで、および（iv）405 nmのためのヘキスト核染色。
- 撮像中に、組織の高品質画像を得るために、レーザ強度を減少させることによって光退色を避けるために、画像形成プロセス中、蛍光レーザー励起への細胞の曝露を最小限に抑えます。
- 私の後メイジは、顕微鏡ソフトウェアを用いて画像をマージし、収集されます。
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Representative Results
CaspaseTrackerが通常の健康な細胞（ 図1a）でカスパーゼ活性を検出することを可能にする2つの主要なコンポーネントがあります。これらの最初は、カスパーゼバイオセンサーApoliner（ 図1b）をモデルにした146個のアミノ酸カスパーゼ切断可能なポリペプチドである。このポリペプチドは、典型的には、アポトーシスの間に切断された単一の天然に存在するカスパーゼ部位を含むDIAP1（アポトーシスのショウジョウバエの阻害剤）に由来する28カスパーゼによってDrICE。42,43 DrICEは、カスパーゼ3の哺乳類と切断する最も知られている細胞基質内に相当します。、DIAP1及びその誘導されたポリペプチドは、特定のアスパラギン酸後に切断され、Asp20カスパーゼ認識内に位置するカスパーゼの4,32特性シーケンス17-DQVD-20、およびAla（DQVA）への義務Asp20残基の変異は、切断を廃止。Apoliner、28と同様に42,43このDIAP1断片がanchoですマウスCD8（α鎖アミノ酸1-220）、 ショウジョウバエで一般的に使用されるツールを使用して、形質膜で細胞質中の赤。 CD8の膜アンカーは、カスパーゼ活性の非存在下での核への転位からの核移行配列（Apolinerの場合nucGFP）を有する任意の係留貨物を防ぐことができます。28 CaspaseTrackerの第二の重要な構成要素は、 ショウジョウバエのG-TRACEシステムであり、酵母転写因子Gal4のは、フリッパーゼ（FLP）リコンビナーゼの発現を誘導する（同時にRFPを誘発する）。34フリッパーゼはnucGFPの恒久的な発現をもたらす終止コドンを切除します。カスパーゼ活性へのG-TRACEが応答にするために、それはApolinerの形質膜結合型カスパーゼ切断可能なDIAP1フラグメント（ 図1a）に、G-TRACEを活性化するために必要とされたGal4を、テザリングによってApolinerシステムと組み合わせた。35
私たちは、追加のMODIFを作りましたユーティリティを向上させるためにCaspaseTrackerのApolinerコンポーネントにications。最も重要なのは、潜在的にそうでなければ死んでしまう細胞を保存、カスパーゼバイオセンサー自体はカスパーゼを阻害しないことが重要です。強力なカスパーゼ阻害剤に期待されるようにApoliner導入遺伝子は、 ショウジョウバエ 28で明らかな表現型を生じなかったが、細胞の時折保存はカスパーゼ活性と正常な細胞を同定の目的を台無しにしてしまいます。しかし、ApolinerでDIAP1フラグメントは、その後強力DrICE、Asp20 43カスパーゼ阻害機構で切断DIAP1は、結晶構造によって明らかにされた同一のカスパーゼを阻害することが示されたモチーフ（135 DICG-138）を含有するDIAP1でAsp135はカスパーゼ基質の模倣としてDrICE活性部位に結合している（ただし、切断されない）。43生化学的解析はAsp135のArg置換がDrICE抑制機能を消失させることを実証した。43ので、CaspaseTrackerはカスパーゼ阻害Apolinerと同様に（ 図1B）。35 を回避するために、同じD135R突然変異で設計された、Asp20での切断次のデノボ N末端に天然に存在するDIAP1のAsn-AsnでシーケンスがCaspaseTrackerでのGly-ヴァルに変更されましたカスパーゼ切断時のN末端則によりGAL4の劣化を防止する（ 図1B）。28。また、我々はCaspaseTracker式の準備を検出するためのGal4のC末端にmycタグを融合した。必要35、Apoliner自身RFPそして、nucGFPカセットはまた、RFPとnucGFPが含まれているG-TRACE、と互換性を持たせるために削除されました。28,35
Gal4のは、独自の核局在化シグナルを負担し、強力ショウジョウバエの他の導入遺伝子、Gal4のRELのおそらく唯一の少数の分子に融合した場合、その標的DNA応答エレメント（UAS）を介して転写を活性化するので細胞質カスパーゼによって緩和数時間（推定≤12の時間）以内にRFP発現をオンにするのに十分です。バイオセンサーの活性はRFPのデノボ転写および翻訳を必要とするので、リアルタイムの酵素活性を報告しません。カスパーゼ活性が停止した後CaspaseTracker RFPが大幅日以内に可能性が低下することになるが、nucGFPは、細胞およびその子孫の生活のためのユビキチンプロモーターによって発現されるであろう。
最初CaspaseTrackerがインビボでカスパーゼ活性化に応答性であることを実証するために、成人CaspaseTrackerバイオセンサーハエは、細胞死を誘導する刺激にさらされました。 ショウジョウバエ卵巣が卵室は動物は、生産を子孫を環境条件に合致する推定メカニズムを強調しているプログラムされた細胞死を受けるようによく研究された細胞死モデルである。37,44,45細胞死を誘導するために、バイオセンサーのハエは、コールドショックを受けました1時間で-7°C（動物を凍結）、および卵巣は翌日（ 図2a）生きた動物から解剖しました。未処理のバイオセンサーのハエとは対照的に、低温ショック後の卵室が著しく小さかったと細胞死刺激（ 図2b、マージ）した後、バイオセンサーの活性化を確認し、堅牢な赤（最近）と緑（永久）バイオセンサーの活性を示しました。バイオセンサーの活性だけ処理したハエでは、両方の生殖細胞の核（ナース細胞および卵母細胞）と卵室内の体細胞（卵胞細胞）で検出された。アポトーシスの35モルフォロジー特性も容易にバイオセンサー陽性卵室で観察されました核の断片化、DNA凝縮および分解（ブルー染色の損失）を含みます。バイオセンサー活性は核凝縮（ヘキスト）および活性カスパーゼ（免疫染色）の両方で同じ細胞で検出することができるが、活性カスパーゼのための最も強い染色は、核DNAとcaspas両方の領域で発生しました電子バイオセンサ信号は、減少または劣化（ 図2b）。低温ショック後に発生46,47の細胞死のメカニズムは十分に特徴付けされていない、その他の死のメカニズムは、プレイであってもよいしました。しかし、同様の結果が、アポトーシスを引き起こすことが知られているアミノ酸飢餓、以下が得られた。35
CaspaseTrackerは非アポトーシスカスパーゼ活性を検出できるかどうかを決定するために、健康的な1日齢のハエの内臓は、細心の注意を払って自家蛍光キューティクルと脂肪を除去することによって切開しました。単一の代表ハエからの組織は、筋細胞を検出するための核とF-アクチンのためのファロイジン染色とをマークするためにヘキストで染色し、マウントされ、固定しました。バイオセンサーの活性化を欠いている健康な卵室とは対照的に、卵のチャンバ間のF-アクチン染色筋細胞は、赤色と緑色の両方のバイオセンサー活性（ 図3a、挿入図）を有していました。しかし、それは可能であるビオースnsorはまた、他の細胞を標識します。他の多くの健康な組織や臓器が最適に1日齢のハエを飼育おそらく基礎非アポトーシスカスパーゼ機能（ 図3a）を反映した著名なカスパーゼバイオセンサーの活性を示しました。バイオセンサー陽性細胞は形態学的に正常に見えバイオセンサ陽性細胞の例ストライプは、後腸（ 図3a、挿入図）を包むために、細胞の特定のサブセットは、カスパーゼを活性化することを示唆している組織に組織化されたパターンで発生しました。
CaspaseTrackerはカスパーゼの特異的レポーターであることが最善の証拠は（DQVAにDQVDを変え、義務カスパーゼ切断部位での単一のAsp Alaへのアミノ酸変異を除いてCaspaseTrackerと同一である制御バイオセンサーを発現しているハエにおけるシグナルの欠如であり、 図1b及び3b）。非常にまれな細胞（ 図3b、緑色の矢印）、信号のみobservを除きDQVA制御バイオセンサーハエでedは、このような口の部品（ 図3b）と、他の場所摂取作物の食料と（ 図3bおよび4）、また、カスパーゼのバイオセンサーを欠く非トランスジェニック親のハエで観察されるような自己蛍光構造、です。 35 CaspaseTracker標識細胞はマルピーギ（腎臓）尿細管に沿って一定の間隔で発生し、多くの場合、同時に最近の（赤）と過去（緑）カスパーゼ活性化の両方を示す一方で、脳内の多くの細胞、視神経ローブ、噴門、作物、中腸と卵管（ 図4および図5a）赤または緑のいずれかです。
長命細胞はカスパーゼ活性を生き残ることができるという証拠のために、視葉は汎神経マーカーELAV（胚性致死視覚異常）について免疫染色した。48多くの神経細胞の核が二重CaspaseTrackerとELAVから核標的GFPで標識し、長命CEと一致してLLS非死亡機能のために使用してカスパーゼ（ 図5b）。バイオセンサーは、（Gal80tsを使用して）10日間オフになっている場合にさらに、バイオセンサー陽性細胞が他の腸内の時間（ 図6aおよびb）、脳および持続（図示せず）。カスパーゼバイオセンサーCaspaseTrackerを使用して、我々は動物全体における基礎カスパーゼ活性の最初の概要を説明します。
図1：非アポトーシスカスパーゼ活性を検出するためのCaspaseTrackerバイオセンサーシステム。 ショウジョウバエカスパーゼバイオセンサーの（a）のコンポーネント。（b）は CaspaseTrackerバイオセンサーシステムのカスパーゼ切断可能な部分は、プラズマ膜アンカー（mCD8）、Asp20はGAL4転写に融合した天然カスパーゼ切断部位を含むDIAP1の断片で構成されていますC末端の3倍-mycのタグが付けられた要因とユビキチンプロを経由して表現moter。カスパーゼ切断は、G-TRACEシステムを誘導するために核へのGal4の転座になります。対照バイオセンサーでは、4-アミノ酸カスパーゼ切断部位（DQVD）で必要なAsp20残基は、カスパーゼ切断を廃止するアラ（DQVA）に変更されます。トランスジェニックCaspaseTrackerのハエは4導入遺伝子を含んでいる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：CaspaseTrackerは、細胞死の間にカスパーゼによって活性化されます。 （a）は、コールドショック誘導性細胞死のためのショウジョウバエ卵巣及びフロー図の概略図。 ショウジョウバエ卵巣 （ポランサントスによって）描画および（ダレンObbardによる） ショウジョウバエの画像は許可を得て使用されている。（b）の卵室を6-卵巣から日女性CaspaseTrackerは、供給されたワットを飛びます 6日（未処理）または低温ショック後の1日のi番目の通常のフライ食品（-7 25続い°C、1時間、 24時間°C）は、卵のチャンバ内でカスパーゼ活性化を誘導します。冷処理した卵巣（右下フレーム）の拡大は、核凝縮（トップ卵室）の証拠、核の断片化（中央の卵室とインセット）や劣化の連鎖（約垂直方向に中央揃え）（下の卵を卵巣管の開発1に3の卵室を表示しますヘキストDNA染色（青）に基づい室）。活性カスパーゼ（抗カスパーゼ3、マゼンタ）を中下卵室で検出されます。 RFPとGFPバイオセンサー活性（赤、緑、黄色の矢印）は、多くの場合、拡散活性カスパーゼ（インセット）で染色核DNA凝縮と細胞内で起こります。白矢印は、バイオセンサーの活性及び活性カスパーゼの免疫染色の両方を欠く核をマークします。 *自家蛍光信号。これらのデータは、Tang らは 、2015年サイエンス担当者から許可を得て複製されています。source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：広範囲の生理カスパーゼ活性の証拠。 （a）は、解剖し、H33342で染色したF-アクチンの核とファロイジンのために（ピンク）、およびDICで画像化し、18℃で上昇させ、単一の新たeclosed flyからCaspaseTracker（DQVD）RFPとnucGFPの共焦点画像を吸収合併。ファロイジンは唯一の卵室のための挿入図に示されている。（b）は同じ手順と撮影条件を制御CaspaseTracker（DQVA）ハエ追跡しました。 *自己蛍光構造。これらのデータは、Tang らの許可を得て再現されている。、サイエンス議員2015年はの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図。
図4：多くの組織での基礎カスパーゼ活性 DICの高い倍率とGFPの蛍光共焦点画像（過去）とRFP（最近）CaspaseTracker（DQVD）活性および脳、噴門、作物、中腸、マルピーギ細管におけるヘキスト染色された核。 図3aから卵管。 *自己蛍光構造。これらのデータは、Tang らの許可を得て再現されている。、サイエンス議員2015年には、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： ショウジョウバエ の神経細胞における非アポトーシスカスパーゼ活性 視葉。（a） は、DICと脳内のRFP（最近）およびGFP（過去）CaspaseTracker（DQVD）活性およびヘキスト染色された核を有する共焦点画像。 RFP + GFP二重標識細胞（黄色矢印）。（b）の NucGFPは、脳を飛ぶCaspaseTracker（DQVD）の視葉でパン神経核ELAVタンパク質に対する免疫染色と共局在します。 NucGFPとELAVの共局在シグナルを有するニューロンは（白矢印）が示されています。 RFP標識ニューロンは、この特定の分野には存在しない、注意してください。これらのデータは、Tang らの許可を得て再現されている。、サイエンス議員2015年には、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、建設、健康な組織で広く基礎カスパーゼ活性の検出を容易CaspaseTrackerの内部動作を説明します。 生体内で非アポトーシスカスパーゼ活性を検出するための重要なステップは次のとおりです：1）2）適切なコントロールとカスパーゼ特異的レポーターの機能を検証すること、3）解剖の技術を練習する大人のショウジョウバエのすべての内部器官系を観察するために、バイオセンサーの導入遺伝子でハエを生成します、 4）自己蛍光アーチファクトからバイオセンサーの活性を区別する。
カスパーゼ特定のセンサとして機能する天然カスパーゼ切断可能なポリペプチドは、バイオセンサーによって任意のカスパーゼ阻害活性を避けるために変更されました。さらなる修飾は、急速GAL4転写因子の分解、およびエピトープタグの挿入を回避するために行われました。また、全身の臓器ハエの解剖、免疫染色、取り付けおよびフライ組織の共焦点顕微鏡を記述します非アポトーシスカスパーゼ活性を検出することです。
CaspaseTrackerはカスパーゼ活性の低いレベルの生存細胞を検出するために理想的であるが、いくつかの時間は、バイオセンサーをオンにするために必要とされるように、それは、リアルタイムの酵素活性のレポーターではありません。しかし、我々はここで説明するアプリケーションに必要なよりもはるかに短い可能性がある検出に最小時間を、決定していません。それらは、細胞死を研究するために主に設計されているようCaspaseTrackerとは対照的に、他のカスパーゼのバイオセンサーの主な制限は、カスパーゼ活性の低いレベルを検出することができないことです。カスパーゼ活性は、30分未満で大規模な細胞破壊を引き起こし、細胞死刺激次増幅される。49。したがって、カスパーゼ活性化の検出は、多くの場合、特定の細胞死のマーカーであることが想定される。50,51が、証拠を実装するカスパーゼを有することを示します非アポトーシス、健康な細胞であっても、非分解機能。7月21日 presuその日の仕事を行うカスパーゼの空間的かつ一時的に制限された酵素活性のMED低レベルの利用可能な技術によって検出以下の可能性があります。この問題は、おそらく強固な信号を生成するために、いくつかのカスパーゼ切断事象を必要とし、恒久的に生体内でこれらの細胞を標識するために進行中のカスパーゼの酵素活性を必要としないCaspaseTrackerによって克服されます。
提示された証拠は、我々は他の未同定のAsp特異的プロテアーゼがCaspaseTrackerを活性化できるという可能性を排除できないもののCaspaseTrackerは、カスパーゼに特異的であることを示しています。しかし、（未発表）カスパーゼ阻害剤ペプチドブロックCaspaseTracker活動のカクテルでハエを供給する。我々はまた、それ自体がカスパーゼを阻害するバイオセンサーを回避することの重要性を強調し、かつ制御バイオセンサーおよび非トランスジェニックハエの重要性は、昆虫のクチクラに固有の自己蛍光による誤った結論を回避するために、内部脂肪デポ食品または他の交絡因子を摂取し、座っています。
もう一つの課題は、カスパーゼのプロ死と非死の機能を区別されています。プロの死と非死亡機能は、例えば、免疫細胞の増殖が癌を防ぐために感染し、これらの細胞のその後の除去を撃退するために、適切にタイミング死に正常な生理状態との間の細胞の移行のために進化的にリンクすることができました。したがって、我々は内臓の観察された基礎カスパーゼ活性の一部ではなく、人間の体で毎日発生すると推定数十億の細胞死と一見矛盾し、細胞死を促進しようとする試みであるという可能性を排除することはできません。52しかし、健康的な形態をバイオセンサーを発現する細胞の強くCaspaseTrackerはカスパーゼの通常の日々の仕事のために意図されたカスパーゼ活性を検出することが可能であることを示しています。
カスパーゼは、細胞などの非死の役割を有することが示唆されています増殖。これは、安定に結合するウイルスタンパク質を発現する哺乳動物細胞株を作製し、直接細胞のカスパーゼを阻害する以前の試み（ 例えば、のCrmA）と一致しています。細胞コロニー数百の空のコントロールベクターでの薬剤選択の際に生じたが、予想外にゼロコロニーは、ベクターを発現するカスパーゼ阻害剤（未発表）でトランスフェクトされた並列培養物で形成されました。このように、カスパーゼはおそらく現在、過小評価されている正常細胞に広まった機能を持っています。これをさらにCaspaseTrackerフライにおける基礎バイオセンサー活性は健常ハエのニューロンを含む、ほとんどの器官系、全体の多くの細胞型で検出されたという知見によって支持されています。ニューロンにおける健康的なカスパーゼ活性は、アポトーシスの間と同じ基板を切断することにより、正常な脳機能を促進するためにシナプス終末を分解することができる、またはその日の仕事関数は、アポトーシス様の活動とは全く別個のものであります。アクティブの高い酵素レベルの対低い一方、カスパーゼは、この可能性をサポートする特定のカスパーゼ切断不可能な基質で数ノックイン変異動物があり、一日の仕事と細胞死の間の重要な違いであってもよい。17,53しかし、最近の進歩は、カスパーゼ8は、RIPKを切断することにより、おそらくネクロトーシスを阻害することを示しています54シナプスうつ病およびAMPA受容体エンドサイトーシスGAP43、55のカスパーゼ切断およびマイクロRNA処理によって調節されてもよいがダイサーのカスパーゼ切断によって調節することができる。14,15,56
このバイオセンサーの多くの追加のアプリケーションがあります。カスパーゼが特定の時刻に、または特定の組織で活性化されているかどうかを確認するには、バイオセンサーの発現が容易に（Gal80tsを使用して、 例えば ）時間的に調節することができ、特定の細胞型（ 例えば 、嗅覚固有のGal4ドライバー）インチ大人の出現はまだそのcaspasを示し、広範囲のバイオセンサーの活性をもたらし飛ぶまで、バイオセンサーの発現を抑制するためにGal80tsを使用しましたESは、成人期（ 図6cおよびd）で活性化することができる35の異なるカスパーゼに特異的なバイオセンサーを含むことができる他のカスパーゼ基質、他のアプリケーションとDIAP1フラグメントを置換することにより、特定の基質の切断を検出します。 CaspaseTrackerバイオセンサーは、非アポトーシスカスパーゼ活動の役割についての我々の理解を向上させます。
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Acknowledgments
我々は図中のショウジョウバエのイラストのためポランサントスとダレンObbardに感謝します。図2a、マルセロ・ジェイコブス - ロレーナJHMRIの昆虫館の使用のために。この作品は、香港のAoE / B-07/99の大学補助金委員会（MCF）、ライフサイエンス研究財団のフェローシップ（HLT）によって支持され、NIHはNS096677、NS037402とNS083373（JMH）を付与しました。ホーラム唐は、生命科学研究財団のShurlとケイクルチ財団フェローです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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