Summary
Para detectar células saudáveis em animais inteiros que contêm baixos níveis de actividade de caspase, o biossensor altamente sensível designado CaspaseTracker foi gerado para Drosophila. biossensor actividade dependente de caspase é detectado em células saudáveis de vida longa ao longo dos órgãos internos dos animais adultos criados em condições optimizadas na ausência de estímulos de morte.
Introduction
As caspases são proteases de cisteína que medeiam a morte celular por apoptose por clivagem de muitas proteínas intracelulares após resíduos aspartato-chave. Por exemplo, caspases iniciadoras activar as caspases efectoras, as nucleases de ADN desreprimir, componentes do citoesqueleto e clivam alterar a composição lipídica das membranas celulares para desmantelar rapidamente as células e estimular o seu reconhecimento por células e imersão que eliminam os cadáveres célula vizinha. Estima-se 4/1 que milhares de milhões de células morrem por dia no corpo humano, e a apoptose é um importante mecanismo de morte de células tumorais induzida por quimioterapia. 5 um conjunto diferente de caspases podem causar morte celular por processos não apoptóticas distintas para estimular a imunidade inata. 6 Portanto, maioria das pesquisas sobre caspases tem se concentrado em suas funções pró-extermínio.
Curiosamente, os primeiros indícios no campo revelou que os mesmos caspases responsáveis pela morte celular promovendo também têm não-morte funções. Estudos pioneiros demonstraram que as caspases estão envolvidas em diversas funções celulares em células saudáveis, incluindo a regulação da proliferação e migração celular durante o desenvolvimento embrionário. 7-9 As caspases são necessários para a individualização espermátide em Drosophila 10,11, para o bloqueio de uma via de morte celular alternativa necroptotic em ratinhos 12,13, e para o processamento de microARN em C. elegans. 14,15 Em talvez o mais longevo células, neurônios, caspases e outra maquinaria apoptótica estão implicados na regulação da actividade neuronal pela poda terminações sinápticas, um processo que se acredita ser essencial reforçar outras sinapses de aprendizagem e memória. 16- 18 é possível que as caspases facilitar poda sináptica por um tipo de mini-apoptose de pequenas projecções neuronais sem morte de células inteiras. 19 No entanto, as caspases podem ter funções alternativas não relacionados com acontecimentos de apoptose semelhante. 20,21 papel duplos na vida e morte não são exclusivos para caspases; BCL-2 proteínas da família e citocromo c têm papéis em energetics celulares em células saudáveis, mas também são parte da via apoptótica núcleo que é ativado por muitos tipos de stress celular. 22-25 Embora não esteja provado, parece lógico que a evolução tem ligado dia -jobs to death-empregos dentro das mesmas moléculas para assegurar a eliminação atempada das células impróprias ou indesejáveis.
Actualmente, os mecanismos moleculares da actividade de caspase não apoptóticas não são compreendidas, e o grau de actividade de caspase não apoptótica, durante o desenvolvimento embrionário e em tecidos adultos, também não é conhecido. Um grande desafio é a dificuldade em distinguir dia-empregos da morte-empregos de caspases. Em contraste com a apoptose e pyroptosis, quando a actividade de caspase é amplificada por uma cascata proteolítica, é esperado que os trabalhos de dia-caspases para ocorrer a níveis muito mais baixos de actividade enzimática, provavelmente abaixo de detecção disponível por muitos Technologies.
Antes do trabalho aqui apresentado, outros desenvolveram uma variedade de biossensores de caspase para fins diferentes. Os biossensores SCAT (por exemplo, ECFP-DEVD-Vénus) detectar rapidamente a actividade da caspase em tempo real e em células em cultura de tecidos animais usando FRET 26,27. Após a clivagem de caspase, a porção da GFP dirigido ao núcleo de Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) sofre relocalização subcelular em poucos minutos quando o seu plasma membrana de tirante é clivada por caspases. 28 do mesmo modo, ApoAlert-pCaspase3-sensor (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes a partir do citosol para o núcleo por clivagem de caspase. 29,30 Mais recentemente, o cromóforo em iCasper foi habilmente manipulada para fluorescência quando clivada por caspases, que permite a detecção da actividade de biossensor em tempo real, nos neurónios de embriões de Drosophila, mas principalmente em associação com o desenvolvimento da morte celular. morte 31 de caspase-dependente de neurónios olfactivos durante o envelhecimento estava demonstavaliado por imuno-detecção da forma clivada da caspase-biossensores de CPV (por exemplo, mCD8-PARP-Vénus). 32,33 modo importante, a forma activada da caspase-3 foi detectada na ausência de morte celular por imunocoloração sensível nas espinhas de neurónios em cultura, e no soma utilizar a fluorescência dependente da caspase do corante repórter CellEvent nuclear, mas foram encontradas dificuldades devido a foto-toxicidade, embora a morte celular foi atrasada até depois da eliminação da coluna. 19 Assim, novos biossensores caspases são necessários para detectar e rastrear células com atividade caspase basal in vivo.
Para superar essas dificuldades, geramos um romance dupla biossensor cor caspase, designado CaspaseTracker. Esta estratégia combina uma versão modificada da Drosophila sensível caspase-Apoliner biossensor 28 de Drosophila com o G-rastreio do sistema de recombinase FRT 34 para etiquetar de forma permanente e acompanhar as células in vivo. <sup> 35 O sistema G-TRACE Gal4-activado permite níveis muito baixos de caspases para ativar CaspaseTracker, resultando na expressão RFP no citoplasma e permanente expressão GFP nuclear-alvo em qualquer célula que já experimentou a atividade da caspase 35 Este sistema pode rotular. células ao longo da vida em animais inteiros utilizando Drosophila melanogaster, um sistema modelo tratável e amplamente usados para o estudo de caspases e morte celular 36-38.
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Protocol
1. Preparação de Moscas CaspaseTracker
- Para preparar CaspaseTracker (DQVD) voa para experimentos, executar esta cruz: UBI-CaspaseTracker x G-TRACE (UAS-RFP; UAS-FLP; Ubi> Parar> GFP-NLS), através da transferência de 7-10 fêmea virgem (ou masculino) moscas que transporta o substrato da caspase-biossensor mCD8 DIAP1-Gal4 dirigido pelo promotor de ubiquitina de 35 em conjunto com o mesmo número do macho (ou fêmea) G-moscas de rastreio, que têm o segundo equilibrador cromossoma CYO para evitar letalidade da combinação homozigótica do G- TRACE (UAS-RFP, UAS-FLP, e Ubi> Parar> GFP-NLS) 34. Lugar voa num frasco de alimentos frescos com pasta de fermento fresco como fonte de proteína.
- Incubar arquivos a 18 ° C durante 5 a 7 dias (máximo de 2 semanas) e em seguida, remover o pai voa a partir do frasco para evitar a superlotação com a nova descendência, e para configurar novos frascos de melhoramento.
- Continuar a incubação a 18 ° C até que a descendência voa eclose. Seleccione a não-CYO [não cURLy asa] progênie do genótipo correto de CaspaseTracker, que são transgénicos para CaspaseTracker e G-35 oligoelementos.
- Ao mesmo tempo, gerar controlo parental moscas W118 não-transgênicas e caspase-insensitive (DQVA) voa em paralelo para verificar a RFP CaspaseTracker específico e fluorescência da GFP.
- Realizar genotipagem por PCR para confirmar os ficheiros com CaspaseTracker utilizando os primers: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA, produzindo um produto de 3897 pb. Para genotipagem do loci G-Trace, use os seguintes primers para GFP (474 pb), 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; para RFP (258 pb), 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; e para Flpase (655 pb), 5'CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG, 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. Para genotipagem Gal4 no vector pUWR (554 pb), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT CAGTCA CGC, 3'-TGG TGG AAT GGT ACG TCT AGA.
2. Preparação de tecidos, Coloração e montagem
- Para dissecções mosca, evitar tecidos dissecados de degola para pontas de plástico para pipetas e tubos de centrífuga, dicas revestimento e tubos com albumina 1% de soro bovino (BSA) dissolvidos na água.
- Dissecar voa sobre uma almofada de silicone usando uma pinça.
- Para evitar danificar as pontas de pinça sobre uma superfície rígida quando se realiza a dissecção de tecidos, realizar dissecção sobre uma superfície de silício. Para fazer placas de silicone de dissecação, derreta o silício no kit comercial de acordo com as instruções do fabricante (lista de materiais). Depois de derreter o silicone, adicionar 3 a 4 ml de uma cultura de tecido de diâmetro prato de 60 mm. pratos de silício pode ser reutilizado.
- Anestesiar uma mosca com CO 2, e transferi-lo para uma placa de silicone com 1 ml de PBS frio. Introduzir o CO 2 para um frasco contendo a mosca usando uma zarabatana, e depois transferir a mosca anestesiados toa Pad que tem uma fonte de CO 2.
- Utilizar um par de pinças para segurar a cabeça da mosca, e um segundo par de fórceps para puxar o tórax na direcção oposta para desligar a cabeça mosca do corpo de cobertura, sem danificar a ligação entre a cabeça e o intestino anterior.
- Use 2 pares de pinças para remover as asas e pernas do tórax.
- Utilizar um par de pinças para segurar o tórax, e um outro par de fórceps para puxar o abdómen para separá-lo do tórax de novo sem danificar a ligação entre o intestino anterior e do intestino médio.
- Dissecar órgãos internos incluindo cérebro, intestino, túbulos de Malpighi e os ovários como demonstrado anteriormente. 39-41
- Remova todas as peças do cutícula e os corpos gordos com uma pinça como estes tecidos produzir forte autofluorescência. Paciência e prática são necessários para preparar um sistema de órgão completo, como mostrado.
- Transferir tecidos dissecados para 1,5 tubos de centrífuga ml e corrigir tecidos with 0,5 ml de paraformaldeído a 4% em PBS (solução salina tamponada com fosfato), à TA, durante 20 a 30 minutos com rotação no escuro para evitar RFP e GFP de branqueamento em tecidos. Evite fixação prolongada que pode comprometer os resultados da coloração subsequentes.
- Remover o paraformaldeído por pipetagem suave e lavagem 3 vezes com 0,5 ml de PBST (PBS + 0,1% de Triton X-100) à TA.
- Permeabilizar as tecidos com 0,5 ml de PBST a 4 ° C durante a noite com agitação suave. incubações mais curtos pode causar incompletos permeabilização e coloração compromisso resultados.
- Se é necessário para reduzir a coloração de fundo, considere incubando tecidos em 0,5 ml de PBST com 1% de BSA, em vez de PBS.
- Lavar os tecidos por 3 vezes com 0,5 ml de PBST.
- Para corar núcleos e actina filamentosa (F-actina), aplicam-se 0,5 ml de PBST com 10 ug / ml de Hoechst 33342 corante azul nuclear e 0,3 uM Alexa Fluor 633 faloidina F-actina mancha e incubar em simultâneo com os tecidos durante 1 h, à RT wom rotação suave no escuro. Evitar manchar prolongado como este vai aumentar o fundo.
- Para a imunocoloração, incubar fixadas e permeabilizadas tecidos com 0,1% de Triton X-100 em 0,5 mL de PBS durante a noite a 4 ° C, mancha com diluição 1: 100 de anticorpo anti-elav ou com diluição 1: 200 de anti-caspase-3 durante a noite a 4 ° C (300 mL). Seguir por o anticorpo secundário correspondente diluída 1: 100 e incubar durante 1 a 3 h à TA. Veja Lista de Materiais para obter informações anticorpo específico.
- Lavar os tecidos 3 vezes, cada uma durante 5 minutos em 0,5 ml de PBST com rotação suave.
- Com uma pipeta, remover todos PBST, e, em seguida adicionar 200 uL de montagem agente anti-branqueador (ver materiais) para cobrir completamente os tecidos durante 1-3 h à TA ou a 4 ° C durante a noite. tecidos que têm óptimas totalmente absorvidas o agente de montagem irá afundar para o fundo do tubo.
- Pré-limpar a lâmina de vidro com água ou com etanol a 70% e transferir os tecidos com agente de montagem para os Glass slide.
- Com cuidado, coloque uma lamela de vidro sobre os tecidos. Aplique vaselina para a lâmina de vidro ea tampa de deslizamento para evitar a destruição do tecido por overcompression. Remover agente de montagem extra com papel de seda.
- Selar a lamela, aplicando unha polonês ao longo das bordas da lamínula para evitar vazamento de agentes de montagem dos tecidos.
3. Microscopia Confocal
- Use um confocal epi-fluorescência microscópio invertido. No entanto, microscópios up-direito pode ser também utilizado. Para tecidos de imagem usando ladrilhos, manter a temperatura ambiente estável para evitar desvio de foco e deslocamento do plano xy devido à expansão e contração térmica dos componentes. sistemas de controle ambiental e sistemas de compensação foco deriva ajudar a evitar esse problema devido à perda de termo-equilíbrio do sistema de microscópio.
- Coloque o slide no palco do microscópio. Tome algumas imagens de teste utilizando baixa resolução (125 x 125 pixels) de umd determinar o número apropriado de peças necessárias para cobrir toda a região de interesse (ROI).
- Definir o sistema de digitalização microscópio para capturar imagens com resolução de digitalização, como 500 x 500 pixels. Selecione o objetivo, como um 20X NA 0.8 ou 63X NA 1.4 objetivo Plan-Apochromat para analisar tecidos através de lamelas de vidro, de modo que cada uma das imagens (telhas) sobrepõe-se em 20% de todos os lados.
- Configurar a sequência de imagens de maior para o menor comprimento de onda de excitação, como a luz de comprimento de onda provoca menor de foto-branqueamento. A sequência de maior para o menor comprimento de onda de excitação é: (i) 633 nm para faloidina F-actina e para anticorpos para as caspases activadas, (ii) 561 nm para RFP, (III) a 488 nm para GFP, e (iv) a 405 nm durante mancha nuclear Hoechst.
- Durante a gravação, minimizar a exposição das células à excitação laser fluorescente durante o processo de imagiologia para evitar a foto-branqueamento, reduzindo a intensidade do laser para obter imagens de alta qualidade dos tecidos.
- Depois que eumagos são recolhidas, fundir as imagens usando o software microscópio.
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Representative Results
Existem dois componentes principais que permitem CaspaseTracker para detectar a actividade da caspase em células saudáveis normais (Figura 1A). O primeiro deles é um polipéptido de caspase-clivável 146 aminoácidos modelada após a caspase biossensor Apoliner (Figura 1b) 28 Este polipéptido é derivado de DIAP1 (inibidor de Drosophila de apoptose), contendo um único local de caspase de ocorrência natural que é clivado durante a apoptose normalmente. pela caspase drice. 42,43 drice é equivalente a caspase-3 em mamíferos e cliva substratos celulares mais conhecidos. 4,32 Característica das caspases, e a sua DIAP1 polipéptido derivado são clivadas após um ácido aspártico específica, Asp20 localizado dentro do reconhecimento de caspase sequência 17-DQVD-20, e a mutação do resíduo Asp20 obrigatória para Ala (DQVA) suprime a clivagem. 42,43 Semelhante a Apoliner, 28 este fragmento é DIAP1 anchovermelha no citoplasma na membrana plasmática através do rato CD8 (aminoácidos 1-220 da cadeia alfa), uma ferramenta utilizada em Drosophila. A âncora na membrana de CD8 impede qualquer carga com amarras tendo uma sequência de translocação nuclear (nucGFP no caso de Apoliner) de translocar para o núcleo na ausência de actividade da caspase. 28 O segundo componente essencial da CaspaseTracker é o sistema G-TRACE de Drosophila em que a factor de transcrição de levedura Gal4 induz a expressão de flipase (FLP) recombinase (e ao mesmo tempo induz RFP). 34 flipase extirpa um codão de paragem que conduz a expressão permanente de nucGFP. Para fazer com que o G-TRACE responsiva à actividade de caspase, que foi combinado com o sistema Apoliner amarrados Gal4, que é necessária para activar a L-TRACE, ao fragmento DIAP1 plasma ancorada à membrana da caspase-clivável de Apoliner (Figura 1a) 35.
Fizemos modif adicionalications para o componente Apoliner de CaspaseTracker para melhorar a utilidade. O mais importante, é crítico que o próprio biossensor caspase não inibir caspases, as células que, de outro modo potencialmente preservando morrem. Embora o transgene Apoliner não causar fenótipos óbvias em Drosophila 28, como seria de esperar de um inibidor de caspase potente, mesmo a preservação ocasional de células anularia o propósito de identificar as células normais com a actividade da caspase. No entanto, o fragmento DIAP1 em Apoliner contém um motivo (135-DICG-138) que foi subsequentemente demonstrado que inibem potentemente drice, o mesmo caspase, que cliva DIAP1 em Asp20. 43 O mecanismo da inibição de caspases foi revelada por uma estrutura cristalina na qual DIAP1 Asp135 está ligado no sítio activo drice como um mímico substrato de caspase (mas não é clivado). 43 a análise bioquímica demonstrou que uma substituição de Arg na Asp135 abole drice função inibidora. 43 Portanto, CaspaseTracker foi concebido com a mesma mutação D135R para evitar a inibição de caspases (Figura 1b). 35 Semelhante ao Apoliner, o que ocorre naturalmente sequência DIAP1 Asn-Asn no de novo N-terminal após a clivagem em Asp20 foi mudado para Gly-Val em CaspaseTracker para evitar a degradação da Gal4 pela regra N-end após clivagem caspase (Figura 1b) 28 Além disso., nós fundidos um myc-tag para o C-terminal de Gal4 para a detecção imediata de expressão CaspaseTracker. 35 de necessidade, própria RFP de Apoliner e cassetes nucGFP foram excluídos para torná-lo compatível com G-TRACE, que também contém RFP e nucGFP 28,35.
Porque Gal4 possui o seu próprio sinal de localização nuclear e potentemente activa a transcrição através do seu elemento de resposta de ADN alvo (UAS), quando fundido com outros transgenes em Drosophila, presumivelmente, apenas algumas moléculas de rel Gal4facilitado pela caspases citoplasmáticos são suficientes para ligar expressão RFP dentro de algumas horas (estimado ≤12 h). Porque a actividade de biossensor de novo requer a transcrição e tradução de SDP, não relatam a actividade enzimática em tempo real. Embora CaspaseTracker RFP será significativamente degradada provavelmente dentro de um dia após a atividade da caspase cessa, nucGFP será expresso pelo promotor de ubiquitina para a vida da célula e a sua progenitura.
Para demonstrar pela primeira vez que CaspaseTracker é responsiva à activação da caspase in vivo, moscas biossensor adulto CaspaseTracker foram expostas à célula estímulos indutores de morte. O ovário de Drosophila é um modelo de morte celular bem estudado como câmaras de ovo sofrem morte celular programada, quando os animais são forçados, um mecanismo presumível de condições ambientais correspondentes à progenitura de produção. 37,44,45 para induzir a morte celular, moscas biossensores foram chocados a frio 1 h a -7° C (congelando os animais), e os ovários foram dissecados a partir de animais vivos no dia seguinte (Figura 2A). Em contraste com moscas biossensores não tratadas, as câmaras de ovos após choque frio eram visivelmente menor e exibiu tinto robusto (recente) e da atividade biossensor verde (permanente), verificando-se a activação biossensor após um estímulo a morte celular (Figura 2b, fundir). Actividade biossensor foi detectado nos núcleos de ambas as células germinativas (células de enfermagem e oócitos) e células somáticas (células foliculares) em câmaras de ovo, mas apenas nas moscas tratadas. 35 Morfologias característica de apoptose foram também facilmente observado em câmaras de ovo biossensor-positiva incluindo fragmentação nuclear, condensação de ADN e degradação (perda de mancha azul). actividade de biossensor pode ser detectado nas mesmas células com ambos condensação nuclear (Hoechst) e caspases activas (imunocoloração), mas a coloração mais intensa para as caspases activas ocorreu em áreas em que tanto o DNA nuclear e caspassinais e biossensores foram diminuídos ou degradada (Figura 2b). 46,47 Os mecanismos de morte celular que ocorrem após a frio choque não estão bem caracterizados, e outros mecanismos de morte pode estar em jogo. No entanto, resultados semelhantes foram obtidos seguindo inanição de aminoácidos, que é conhecido por causar a apoptose 35.
Para determinar se CaspaseTracker pode detectar a actividade da caspase não apoptóticas, os órgãos internos de moscas saudáveis um dia de idade foram meticulosamente dissecados, removendo a cutícula autofluorescente e gordura. Os tecidos de uma única mosca representante foram fixados, montado, corados com Hoechst para marcar núcleos e com mancha faloidina para F-actina para detectar células musculares. Em contraste com as câmaras de ovos saudáveis, que carecem de activação biossensor, as células de músculo-F-actina coradas entre as câmaras de ovos tinha actividade biossensor-vermelho e verde (Figura 3a, inserção). No entanto, é possível que o biosensor também rótulos outras células. Muitos outros tecidos e órgãos do optimamente criadas moscas 1 dia de idade saudáveis exibiram actividade de caspase biossensor proeminente presumivelmente reflectindo a função da caspase não apoptóticas basal (Figura 3a). Células de biossensor positivo apareceu morfologicamente normais e ocorreu em padrões organizados em tecidos, sugerindo que subconjuntos específicos de células ativar caspases, por exemplo, faixas de células de biossensor-positivas envolvendo o intestino posterior (Figura 3a, inserir).
A melhor evidência que CaspaseTracker é um repórter específica de caspases é a falta de sinal nas moscas que expressam o biossensor de controlo, que é idêntico ao CaspaseTracker excepto para um único Asp para Ala mutação de aminoácidos no local de clivagem da caspase obrigatória, mudando DQVD para DQVA ( Figura 1b e 3b). Exceto por uma célula excepcionalmente raro (Figura 3b, seta verde), o único sinal de observed nas moscas biossensores controle DQVA são estruturas autofluorescentes, como partes da boca (Figura 3B) e dos alimentos ingeridos na cultura e em outros lugares (Figura 3B e 4), que também são observados nas moscas parentais não transgênicas que não possuem o biossensor caspase. 35 as células CaspaseTracker-rotulados ocorrer em intervalos regulares ao longo dos túbulos de Malpighi (rim) e muitas vezes exibem tanto recente (vermelho) e passado (verde) a ativação caspase simultaneamente, enquanto muitas células no cérebro, lóbulos ópticos, cárdia, da cultura, do intestino médio e oviduto são ou vermelhos ou verdes (Figuras 4 e 5A).
Para a evidência de que as células de longa vida pode sobreviver atividade caspase, o lobo óptico foi histoquímica para o elav marcador pan-neuronal (embrionárias visão anormal letal). 48 Os núcleos de muitos neurônios foram duplamente marcadas com GFP nuclear-alvo de CaspaseTracker e elav, consistente com ce de longa duraçãolls usando caspases para funções não-morte (Figura 5B). Além disso, se o biossensor está desligado, durante 10 dias (usando Gal80ts), células de biossensor-positivo persistir durante a duração no intestino (Figura 6a e b), e em outros locais do cérebro (não mostrado). Usando o CaspaseTracker caspase biossensor, nós fornecemos a primeira visão geral da atividade caspase basal em animais inteiros.
Figura 1: sistema biossensor CaspaseTracker para detectar a actividade de caspase não apoptóticas. (a) Os componentes da caspase biossensor de Drosophila. (b) A porção de caspase-clivável de sistema biossensor CaspaseTracker é composto de uma âncora na membrana de plasma (mCD8), um fragmento de DIAP1 contendo um sítio natural de caspase-clivagem Asp20 fundido com a transcrição Gal4 fator com uma etiqueta de 3x-myc C-terminal e expressou através do pro ubiquitinamoter. clivagem caspase resulta em translocação de Gal4 para o núcleo para induzir o sistema G-TRACE. Em um biossensor de controlo, o resíduo Asp20 requisito no sítio de clivagem de caspase ácido 4-amino (DQVD) é mudado para Ala (DQVA) para suprimir a clivagem de caspases. Moscas transgênica CaspaseTracker contêm 4 transgenes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: CaspaseTracker é activada por caspases durante a morte celular. (a) Esquema de Drosophila ovário e diagrama de fluxo para a morte celular induzida pelo choque frio. image Drosophila (por Darren Obbard) Drosophila ovário desenho (por Polan Santos) e são usadas com permissão. (b) câmaras óvulo do ovário de 6- dia fêmea CaspaseTracker moscas alimentados w alimentos mosca normais om durante 6 dias (não tratados) ou 1 dia após choque frio (-7 ° C, 1 h, seguido por 25 ° C durante 24 h) para induzir activação de caspases em câmaras de ovo. Ampliações de ovário tratados frio (quadros inferior direito) mostram três câmaras de ovo em um desenvolvimento ovaríolo corrente (aproximadamente centradas verticalmente) com evidência de condensação nuclear (câmara de ovo em cima), a fragmentação nuclear (câmara de ovo meio e inserções) e degradação (ovo menor câmara) com base em corante de ADN Hoechst (azul). caspases activas (anti-caspase-3, magenta) são detectados nas câmaras de ovo médio e inferior. atividade RFP e GFP biossensor (vermelho, setas verdes e amarelos) ocorrem em células com condensação DNA nuclear, que muitas vezes mancha difusa com caspases ativos (inserir). As setas brancas marcar núcleos que faltam ambas as actividades de biossensor e imunocoloração da caspase activa. * Sinais autofluorescência. Estes dados são reproduzidas com a permissão de Tang et al., Sci Rep de 2015.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Evidência para a atividade da caspase fisiológica generalizada. (a) Incorporada imagem confocal de CaspaseTracker (DQVD) RFP e nucGFP a partir de uma única mosca recém eclosed elevou a 18 ° C, dissecados e corados com H33342 para núcleos e faloidina para F-actina (rosa), e fotografada com DIC. Phalloidin é mostrado apenas na inserção de câmaras de ovos. (B) As mesmas condições de procedimento e de imagem foram acompanhados por CaspaseTracker controle (DQVA) voa. * Estruturas autofluorescente. Estes dados são reproduzidas com a permissão de Tang et al., Sci Rep 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maioresta figura.
Figura 4:. Atividade caspase Basal em muitos tecidos ampliações de DIC e fluorescência imagens confocal de GFP (passado) e atividade RFP (recente) CaspaseTracker (DQVD) e núcleos Hoechst-manchado no cérebro, cárdia, Colheita, intestino, túbulos de Malpighi e tubas uterinas de Figura 3a. * Estruturas autofluorescente. Estes dados são reproduzidas com a permissão de Tang et al., Sci Rep 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: A actividade de caspase não-apoptótica em neurónios da Drosophila lóbulo óptico. (a) DIC e imagens confocal com RFP (recente) e da actividade GFP (passado) CaspaseTracker (DQVD) e núcleos Hoechst-manchadas no cérebro. RFP + GFP células duplamente marcadas (setas amarelas). (B) NucGFP colocaliza com imunocoloração para a proteína elav nuclear neuronal pan no lobo óptica de CaspaseTracker (DQVD) Voa cérebro. Neurônios com sinais co-localizados de NucGFP e elav são mostrados (setas brancas). Nota, os neurônios marcados com RFP não estão presentes neste campo particular. Estes dados são reproduzidas com a permissão de Tang et al., Sci Rep 2015. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui ilustramos da construção e interiores funcionamento do CaspaseTracker que facilitam a detecção de atividade de caspase basal generalizada nos tecidos saudáveis. Os passos críticos para detectar a actividade de caspase não apoptótica in vivo são os seguintes: 1) a geração de moscas com o transgene biossensor, 2) verificar a função repórter específicos da caspase com controlos adequados, 3) praticando técnicas de dissecação para observar todos os sistemas de órgãos internos de adulto de Drosophila, e 4) a atividade biossensor diferencial de artefatos autofluorescentes.
O polipéptido da caspase-clivável natural que serve como o sensor específico da caspase foi modificada para evitar qualquer actividade inibidora de caspase-pelo biossensor. Outras modificações foram feitas para evitar a rápida degradação do factor de transcrição Gal4, e a inserção de um marcador de epítopo. Descrevemos também dissecção corpo inteiro órgão de moscas, imunocoloração, montagem e microscopia confocal de tecido moscas para detectar a actividade da caspase não apoptóticas.
Enquanto CaspaseTracker é ideal para células que sobrevivem, com baixos níveis de actividade da caspase detecção, não é um repórter da actividade da enzima em tempo real, como são necessárias várias horas para ligar o biossensor. No entanto, não se ter determinado o tempo mínimo necessário para a detecção, que é provavelmente muito mais curto do que o necessário para as aplicações aqui descritas. Em contraste com CaspaseTracker, a principal limitação de outros biossensores caspase é a sua incapacidade para detectar níveis baixos de actividade de caspase, visto que são principalmente concebidos para estudar a morte celular. Actividade de caspase é amplificado na sequência de um estímulo morte celular, causando demolição celular massiva em menos de 30 min. 49 Por isso, a detecção da activação da caspase é geralmente assumido como sendo um marcador de certos morte celular 50,51. No entanto, a evidência de montagem indica que as caspases têm não apoptóticas, mesmo funções não-degradativas em células saudáveis. 21/07 A presubaixos níveis med de atividade enzimática espacial e temporalmente restrito de caspases que realizam seu dia-emprego são susceptíveis abaixo detecção por tecnologias disponíveis. Este problema é superado pelo CaspaseTracker, que provavelmente requer poucos eventos de clivagem de caspase para gerar sinais robustos, e não requer a actividade da caspase enzimática permanente para marcar permanentemente tais células in vivo.
A evidência apresentada indica que CaspaseTracker é específico para caspases, embora não podemos excluir a possibilidade de que outras proteases Asp-específicas não identificados poderia ativar CaspaseTracker. No entanto, a alimentação voa com um cocktail de caspase-péptidos inibidores blocos actividade CaspaseTracker (não publicado). Ressaltamos também a importância de evitar biossensores que se inibem caspases, ea importância de biossensores de controle e moscas não-transgênicas para evitar conclusões errôneas devido a autofluorescência inerente à cutícula do inseto depo gordura internasenta-se, ingerido alimentos ou outros fatores de confusão.
Outro desafio é distinguir funções pró-morte e não de morte de caspases. funções Pro-morte e não a morte poderia ser ligada evolutivamente com a finalidade de fazer a transição de células entre um estado fisiológico normal para uma morte adequadamente programado, por exemplo, a expansão de células do sistema imunológico para combater infecções e subsequente eliminação destas células para prevenir o cancro. Assim, não se pode eliminar a possibilidade de que alguma da actividade de caspase basal observada em órgãos internos em vez disso é uma tentativa de promover a morte de células, aparentemente consistente com as estimadas dezenas de mortes celulares biliões ocorrendo diariamente no corpo humano. 52 No entanto, a morfologia saudável de células que expressam o biossensor indica fortemente que CaspaseTracker é capaz de detectar a actividade da caspase destina-se a dia-postos de trabalho normais de caspases.
Caspases são sugeridas para ter papéis não-morte, como celularproliferação. Isto é consistente com as tentativas anteriores para gerar linhas celulares de mamíferos que expressam de forma estável proteínas virais que se ligam e inibem directamente caspases celulares (por exemplo, crmA). Enquanto centenas de colônias de células surgiu durante a seleção da droga com o vector de controlo vazio, inesperadamente de zero colônias formada em culturas paralelas transfectadas com os inibidores de caspases vetor expressando (não publicados). Assim, caspases provavelmente tem funções generalizadas em células normais que estão atualmente subvalorizado. Isto é ainda apoiada pela descoberta de que a actividade basal biossensor na mosca CaspaseTracker é detectado em muitos tipos celulares na maioria dos sistemas de órgãos, incluindo os neurónios, em moscas normais e saudáveis. atividade caspase saudável nos neurônios pode desmantelar terminações sinápticas para promover a função normal do cérebro por clivagem os mesmos substratos como durante a apoptose, ou as suas funções do dia de trabalho pode ser inteiramente distinto de atividades apoptose-like. Enquanto baixo contra os níveis enzimáticos elevados de ativoscaspases pode ser uma distinção fundamental entre o dia-empregos e morte celular, há poucos knockin animais mutantes com substratos específicos caspase-uncleavable que suportam esta possibilidade. 17,53 No entanto, o progresso recente indica que a caspase-8 inibe necroptosis possivelmente por clivagem RIPK, 54 depressão sináptica e endocitose do receptor de AMPA pode ser regulamentada por clivagem caspase de GAP43, 55 e processamento de microRNA podem ser regulados por clivagem caspase de Dicer. 14,15,56
Existem muitas aplicações adicionais desta biossensor. Para determinar se as caspases são activados em momentos específicos ou em tecidos específicos, a expressão do biossensor pode ser facilmente regulada temporariamente (por exemplo, usando Gal80ts) e em tipos específicos de células (por exemplo, condutores de GAL4-específicos olfactiva). Usando Gal80ts para suprimir a expressão biossensor até a emergência dos adultos ainda voa resultou em atividade biossensor generalizada, indicando que caspasES pode ser activado em fases adultas (Figura 6C e D). 35 por substituição do fragmento DIAP1 com outros substratos de caspases, outras aplicações podem incluir biossensores específicos para diferentes caspases e para a detecção de clivagem de substratos específicos. O biossensor CaspaseTracker irá melhorar a nossa compreensão do papel das actividades de caspase não-apoptóticos.
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Acknowledgments
Agradecemos Polan Santos e Darren Obbard para Drosophila ilustrações Fig. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena para a utilização do insetário JHMRI. Este trabalho foi apoiado pela irmandade Fundação Life Science Research (HLT), University Grants Comissão do Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) e NIH concede NS096677, NS037402 e NS083373 (JMH). Ho Lam Tang é um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de Pesquisa Ciências da Vida.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Consumables and Reagents | |||
| Vectashield | Vector Products | H-1000 | Mounting medium |
| Forceps | Ted Pella | #505 (110mm, #5) | Dumont tweezer biology grade, stainless steel |
| Hanging Drop Slides | Fisher Scientific | 12-565B | Glass slides |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes | H1399 | DNA stain |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Molecular Probes | A22284 | Actin stain |
| Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | Antibody Registry ID: AB_528218 | Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV |
| Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody | Cell Signaling Technology | #9661 | Stain for active fragment of caspase-3 |
| ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36934 | to preserve fluorophores |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Life Technologies | P36961 | to preserve fluorophores |
| SylGard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Product code: 0001023934 | for dissection plates |
| Equipment | |||
| LSM780 confocal microscope | Carl Zeiss | N/A | Imaging |
| Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 | Carl Zeiss | N/A | Drosophila dissection |
| AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W | AmScope | WBM99316 | Light source |
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