Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

In Vivo Biyosensör Drosophila olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks

Published: November 27, 2016 doi: 10.3791/53992
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

Summary

Kaspaz aktivitesi düşük seviyelerini ihtiva Tüm hayvanlarda sağlıklı hücreleri saptamak için, CaspaseTracker belirlenen son derece hassas biyosensör Drosophila için hazırlandı. Kaspaz bağımlı biyosensör aktivitesi ölüm uyarımının olmaması durumunda optimum koşullar altında yetiştirilen yetişkin hayvan iç organlar içinde uzun ömürlü, sağlıklı hücrelerde tespit edilir.

Introduction

Kaspazlar önemli aspartat kalıntısı sonra uzun hücre içi proteinleri bölünmesiyle apoptotik hücre ölümüne aracılık sistein proteazlardır. Örneğin, başlatıcı kaspaz efektör Kaspaz, baskılanmasını durdurmak DNA nükleazlar, bölen iskelet parçaları etkinleştirmek ve hücreleri hızla demontaj ve hücre cesetlerin imha komşu hücreler tarafından kendi tanıma ve yutulmasına uyarmak için hücre zarlarının lipit kompozisyonunu değiştirmek. 1-4 tahmin edilmektedir hücrelerin milyarlarca insan vücudunda günde ölür, ve apoptoz kemoterapi kaynaklı tümör hücre ölümünün önemli bir mekanizması olduğunu. 5 caspases farklı bir dizi doğal bağışıklığı uyarmak için farklı olmayan apoptotik süreçler tarafından hücre ölümüne neden olabilir. 6 bu nedenle, kaspaslara çoğu araştırma yanlısı ölüm fonksiyonları üzerine yoğunlaşmıştır.

İlginç bir şekilde, alanda dair kanıtlar teşvik hücre ölümünden sorumlu olan kaspaz non ölüm f olduğunu ortayaonksiyonlar ı. Öncü çalışmalar kaspazlar embriyojenez esnasında hücre çoğalması ve göçünün düzenlenmesinde dahil olmak üzere sağlıklı hücrelerde çeşitli hücresel fonksiyonları yer aldığını göstermiştir. 7-9 Kaspazlar alternatif necroptotic hücre ölüm yolunu bloke etmek için, Drosophila 10,11 spermatid Kişiselleştirme için gereklidir farelerde 12,13 ve mikroRNA işleme C. elegans. 14,15 belki de en uzun ömürlü hücreler, nöronlar, kaspaz ve diğer apoptotik makine sinaptik sonlar budama yoluyla nöronal aktivitenin düzenlenmesinde rol olan, inanılan bir süreç öğrenme ve hafıza için diğer sinaps güçlendirmek için önemli olduğu. 16- 18 kaspazlar bütün hücre ölümü olmadan minik nöronal projeksiyonları mini apoptoz bir türüne göre sinaptik budama kolaylaştırmak mümkündür. 19 Bununla birlikte, kaspaz apoptoz gibi olaylara ilgisiz alternatif işlevlere sahip olabilir. 20,21 Çift rolüyaşam ve ölüm s caspases özgü değildir; Kanıtlanmış olmasa da BCL-2 ailesi proteinleri ve sitokrom-c sağlıklı hücrelerde hücresel enerji endüstrisinde rol var ama aynı zamanda hücre stres birçok türleri tarafından aktive edilir çekirdek apoptotik yolun bir parçasıdır. 22-25, evrim gün bağlantılı olduğu mantıklı görünüyor uygun olmayan veya istenmeyen hücrelerin zamanında eleme sağlamak için aynı moleküllerden içinde ölüm işlere -iş.

Şu anda, apoptotik olmayan kaspaz etkinliğinin moleküler mekanizmalar anlaşılmamıştır ve embriyonik gelişim sırasında ve yetişkin dokularda apoptotik olmayan kaspaz aktivitesi bulunması da bilinmemektedir. Büyük bir meydan okuma caspases ölüm işlerden gün işleri ayırmada zorluk olduğunu. kaspaz aktivitesi bir proteolitik akışı ile amplifiye edilir apoptoz ve pyroptosis, aksine, kaspaz günlük iş mevcut olan birçok techn göre büyük olasılıkla algılanan değer altına enzimatik aktivite çok daha düşük seviyelerde olması beklenmektedirologies.

Burada sunulan çalışma öncesinde, diğerleri farklı amaçlar için kaspaz biyosensörler çeşitli geliştirdi. SCAT biyosensörler (örneğin, ECFP-DEVD-Venüs) hızla FRET kullanarak kültürlü hücrelerde ve hayvan dokularında gerçek zamanlı kaspaz aktivitesini algılar. 26,27 kaspaz bölünme üzerine, Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nükleer hedefli GFP kısmı nucGFP) plazma membran bağlama caspase'lar tarafından yarılır dakika içinde hücre içi yerini değiştirmesi geçirmektedir. 28 Benzer şekilde, ApoAlert-pCaspase3 Sensör (NES-DEVD-YFP NLS) kaspaz yarılma üzerine çekirdeğe sitosolden relocalizes. 29,30 fazlası son zamanlarda, iCasper içinde kromofor akıllıca Drosophila embriyo nöronların gerçek zamanlı olarak biyosensör etkinliğinin bulgulanması izin kaspaz parçalanabilen, ancak öncelikle gelişimsel hücre ölümü ile ilişkili olarak kaldığında parlayan şekilde işleme sokuldu. koku nöronların 31 Kaspaz bağımlı ölüm olduğu yaşlanma sırasında demonstGBM biyosensörler (örneğin, bunun ardından mCD8-PARP Venüs) kaspaz-klivaj formunun immüno-algılama derecelendiren. 32,33 Önemli olarak, kaspaz-3 aktive edilmiş şekli dikenler duyarlı immunostain hücre ölümünün kaybolması saptandı kültürlü nöronlar ve soma nükleer CellEvent raportör boyanın kaspaz-bağımlı floresan kullanılarak, ancak hücre ölümü omurga eleme sonrasına kadar ertelendi olmasına rağmen zorluklar nedeniyle foto-toksisite rastlanmıştır içinde. 19 Böylece, yeni kaspaz biyosensörler algılamak için gerekli olan ve in vivo bazal kaspaz aktivitesi ile hücreleri izlemek.

Bu zorlukları aşmak için, biz CaspaseTracker belirlenen yeni çift renkli kaspaz biyosensör, oluşturulan. Bu strateji kalıcı etiket ve in vivo hücreleri izlemek için Drosophila G-İZ FRT rekombinaz sistemi 34 ile Drosophila kaspaz-duyarlı Apoliner biyosensör 28 değiştirilmiş bir sürümü birleştirir. <sup> 35 Gal4 aktive G-TRACE sistemi. caspases çok düşük seviyelerde hiç kaspaz aktivitesini yaşadı herhangi bir hücrede sitoplazma ve kalıcı bir nükleer hedefli GFP ifade RFP ifade sonuçlanan CaspaseTracker etkinleştirmek için izin verir 35 Bu sistem etiketleyebilirsiniz Drosophila melanogaster, kaspaz ve hücre ölümü çalışma için izlenebilir ve yaygın olarak kullanılan bir model sistemi kullanarak tüm hayvanlarda ömrü boyunca hücreleri. 36-38

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

CaspaseTracker Sineklerin hazırlanması 1.

  1. Bu haç gerçekleştirmek, CaspaseTracker (DQVD) hazırlamak deneyler için uçar için: 7-10 bakire kadın aktarılması (ya da erkek) tarafından, UBI-CaspaseTracker G-İZ (Ubi> Dur> GFP-nls;; UAS-FLP UAS-RFP) x kaspaz biyosensör substrat mCD8-DIAP1-Gal4 taşıyan erkek (ya da kadın) aynı sayıda ubikutin destekleyicisi 35 araya tarafından G- homozigot kombinasyonu ölümcül önlemek için ikinci kromozom CYO dengeleyici olan G-İZ sinekler, tahrik sinekler İZ (UAS-RFP, UAS-FLP ve Ubi> Dur> GFP-nls) 34. Bir yerde bir protein kaynağı olarak taze maya macun ile bir taze gıda flakon uçar.
  2. 5 ila 7 gün (en fazla 2 hafta) 18 ° C'de dosyaları inkübe ve sonra da üst yeni döl ile aşırı kalabalık önlemek için, ve yeni ıslah şişeleri kurmak için tüpten uçar kaldırın.
  3. döl Eclose uçar kadar 18 ° C'de inkübasyon devam edin. olmayan CYO seçin [non-cCaspaseTracker ve G-TRACE elemanları 35 için transgenik olan CaspaseTracker doğru genotip, bir urly kanat] döl.
  4. Aynı zamanda, belirli CaspaseTracker RFP ve GFP floresan doğrulamak için kontrol ebeveyn transgenik olmayan w118 sinekler ve kaspaz-duyarsız (DQVA) paralel sinekler oluşturmak.
  5. primerler kullanılarak CaspaseTracker dosya teyit etmek için PCR genotipleme gerçekleştirmek: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC, 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA bir 3,897 bp ürünü üretir. G-İz lokusların genotipleme için GFP (474 ​​bp) için aşağıdaki primerler kullanın, 5'-CAC GAC TTC TTC AAG TCC GCC ATG CCC G, 3'-CTT GTA CAG CTC GTC CAT GCC GAG AGT GAT C; RFP (258 bp) için, 5'-GGC TGC TTC ATC TAC AAG GTG AAG TTC ATC GG, 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC; ve Flpase (655 bp), 5'-CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG için 3'-GCC TAC TAA CGC TTG TCT TTG TCT CTG TCA C. pUWR vektörü olarak genotiplendirme Gal4 (554 bp), 5'-GAA GCA CAC CTT CGC ATC GCT için CAGTCA CGC, 3'-TGG AAT TGG GGT ACG TCT AGA.

2. Doku Hazırlama, Boyama ve Montaj

  1. Uçucu disseksiyonlar için, su içinde eritildi,% 1 sığır serum albümini ile plastik pipet uçları ve santrifüj tüpleri, kaplama uçları ve borular (BSA) yapışmasını kesilerek dokuların engeller.
  2. Teşrih forseps kullanarak bir silikon yastık üzerinde uçar.
    1. doku diseksiyonu yaparken sert bir yüzeye forseps ipuçları zarar görmesini önlemek için, bir silikon yüzey üzerinde diseksiyon. Silikon diseksiyon plakaları yapmak için, üreticinin talimatlarına (Malzeme Listesi) göre ticari kit silikon eritebilir. silikon erime sonra, 60 mm çapında bir doku kültürü çanağı 3 ila 4 mL ekleyin. Silikon yemekleri yeniden kullanılabilir.
    2. CO2 ile bir sinek anestezisi, ve soğuk 1 mL PBS ile bir silikon plaka aktarın. Bir blowgun kullanarak anında ihtiva eden bir şişeye CO2 giriş, ve daha sonra anestezi uçucu t aktarmakCO 2 kaynağı vardır oa Pad.
    3. Baş ve foregut arasındaki bağlantıyı zarar vermeden vücudu örten uçucu kafasını kesmek için ters yönde toraks çekmek için sinek kafa tutmak için forseps bir çift ve forseps ikinci bir çift kullanın.
    4. toraks kanatlarını ve bacaklarını kaldırmak için forseps 2 çift kullanın.
    5. toraks tutmak için forseps bir çift kullanın ve forseps başka çift foregut ve midgut arasındaki bağlantıyı zarar vermeden tekrar toraks ayırmak için karın çekin.
    6. Daha önce gösterildiği gibi, beynin, gut, Malpighi tüplerinin ve yumurtalıkların da dahil olmak üzere iç organlarını teşrih. 39-41
    7. Bu dokular, güçlü otofloresans üretmek olarak forseps ile manikür tüm parçaları ve yağ organları çıkarın. Sabır ve pratik gösterildiği gibi tam bir organ sistemini hazırlamaları gerekmektedir.
  3. 1.5 ml santrifüj tüplerine disseke dokuların aktarın ve dokular wi düzeltmek20 karanlıkta rotasyonu ile 30 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 4 paraformaldehit 0.5 mL (fosfat-tamponlu tuzlu su) inci dokularda ağartıcı RFP ve GFP'yi önlemek için. sonraki boyama sonuçları tehlikeye düşürebilecek uzun süreli fiksasyon kaçının.
  4. yumuşak bir pipetleme paraformaldehid çıkartın ve oda sıcaklığında, 0.5 mL PBST (PBS +% 0.1 Triton X-100) ile 3 kez yıkanır.
  5. hafifçe çalkalanarak bir gece boyunca 4 ° C'de 0.5 mL PBST ile dokuların geçirgenliği. Kısa inkubasyon eksik permeabilization ve uzlaşma boyama sonuçlara neden olabilir.
    1. Bu arka plan boyama azaltmak için gerekli ise, yerine PBS,% 1 BSA ile 0.5 mL PBST dokuları inkübe düşünün.
  6. 0.5 mL PBST ile dokular 3 kere yıkayın.
  7. , Çekirdek ve filamentli aktin (F-aktin) leke / ml Hoechst 33342 mavi çekirdek boyası ve 0.3 uM Alexa Fluor 633 Phalloidin F-aktin boya ile boyanırken 10 ug, 0.5 mL PBST uygulamak ve oda sıcaklığında 1 saat w doku ile eş zamanlı olarak kuluçkalanmasıKaranlıkta Ith nazik dönme. Bu arka plan artacak olarak uzun süreli boyama kaçının.
    1. immün için, dokuya sabit ve geçirgen inkübe% 0.1 Triton X-100, 0.5 ml PBS içinde bir gece boyunca 4 ° C, 1 lekeye: Anti-ELAV antikorun veya 1 100 seyreltme: Anti-kaspaz-3 200 seyreltme gece boyunca 4 ° C (300 uL). 100 ve oda sıcaklığında 1 ila 3 saat süre ile inkübe: 1 seyreltilmiştir karşılık gelen ikincil antikor devam edin. Belirli antikor bilgi için Malzeme Listesi bakın.
  8. yavaşça döndürülerek 0.5 mL PBST 5 dakika boyunca dokular 3 defa, her bir yıkama.
  9. Bir pipet ile, tüm PBST kaldırın ve sonra tamamen gece boyunca oda sıcaklığında 1-3 saat ya da 4 ° C için dokular kapsayacak şekilde (malzeme bakınız) 200 uL, anti-ağartıcı montaj ajanı ekleyin. Tam montaj ajan absorbe Optimal dokular tüpün dibine batar.
  10. Ön temizlemek, su ya da% 70 etanol ile cam slayt ve glas ajan montaj dokuları transferis slayt.
  11. Dikkatle dokular üzerinde bir cam kapak kayma yerleştirin. cam slayt ve overcompression dokuyu tahrip önlemek için kapak kayma vazelin uygulayın. kağıt mendil ile ekstra montaj ajan çıkarın.
  12. dokulardan maddeleri montaj sızıntısını önlemek için tüm kapak kayma kenarları boyunca oje uygulayarak kapak kayma mühür.

3. Konfokal Mikroskop

  1. ters konfokal epi-floresan mikroskop kullanarak. Bununla birlikte, yukarı doğru mikroskoplar da kullanılabilir. döşeme kullanarak görüntü dokulara nedeniyle bileşenlerin ısıl genleşme ve daralma nedeniyle odaklanma ve xy düzleminin kayması sürüklenme önlemek için kararlı oda sıcaklığını korumak. Çevresel kontrol sistemleri ve odak kayması ücret sistemleri nedeniyle mikroskop sistemi termo-denge kaybına, bu sorunu önlemek için yardımcı olur.
  2. mikroskop sahnede slayt yerleştirin. Düşük çözünürlük kullanarak birkaç test görüntüleri çekmek (125 x 125 piksel) birFaiz (ROI) tüm bölgeyi kapsayacak şekilde gerekli karoların uygun sayısını belirlemek d.
  3. tarama çözünürlüğü gibi 500 x 500 piksel ile görüntü yakalamak için mikroskop tarama sistemini ayarlayın. görüntüleri (çini) her her tarafta% 20 örtüşür ki, böyle bir 20X NA 0.8 veya cam lamelleri ile dokuları analiz etmek için bir 63X NA 1.4 Plan-Apochromat hedef olarak hedef seçin.
  4. uzun dalga boyu ışık düşük foto-ağartma neden olarak, uyarma dalga boylarını kısaya uzun görüntü dizisi ayarlayın. dalgaboyu kısaya uzun sekansı şöyledir: (i) Phalloidin F-aktin ve aktive kaspazlara karşı antikorları saptamak için 633 nm, RFP (ii) 561 nm, GFP (iii) 488 nm, ve (iv) 405 nm için Hoechst nükleer leke.
  5. görüntüleme sırasında, dokuların yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için lazer yoğunluğu azaltarak foto-ağartma önlemek için işlemi görüntüleme sırasında floresan lazer uyarma hücrelerin maruziyeti en aza indirmek.
  6. i sonramages mikroskop yazılımını kullanarak görüntüleri birleştirmek, toplanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

CaspaseTracker normal sağlıklı hücreleri (Şekil 1a) kaspaz aktivitesini algılamasına izin iki önemli bileşeni vardır. Bunlardan ilki, kaspaz biyosensör Apoliner (Şekil 1b) örnek alınarak 146 amino asit kaspaz-bölünebilir polipeptiddir. Bu polipeptid tipik olarak apoptoz sırasında bölünen tek bir doğal olarak oluşan kaspaz bölgesi içeren DIAP1 (apoptoz Drosophila inhibitörü) türetilir 28 kaspaz ile drice. 42,43 drice kaspaz-3 memeli ve böler en çok bilinen hücresel substratlarda eşdeğerdir., DIAP1 ve bundan türetilmiş bir polipeptid, belirli bir aspartik asit sonrasında klivaj, Asp20 kaspaz tanıma içinde yer alan bir kaspaz 4,32 Karakteristik dizisi 17 DQVD-20 ve Ala (DQVA) zorunlu Asp20 kalıntısının mutasyonunun ortadan kaldıran bölme. Apoliner, 28 benzer şekilde 42,43 Bu DIAP1 fragmanı Ancho olanfare CD8 (alfa zincir amino asitler 1-220), Drosophila yaygın olarak kullanılan bir aracı ile plazma membranında sitoplazma kırmızı. CD8 membran ankraj kaspaz etkinliğinin olmaması nükleusa translokasyonunu den (Apoliner halinde nucGFP) bir nükleer translokasyon sekansı taşıyan bir gergin yükleri önlemektedir. 28 CaspaseTracker ikinci temel bileşeni Drosophila G-izleme sistemi olduğu maya transkripsiyon faktörü GAL4 flippase (FLP) rekombinazın ifadesine sebep olmaktadır (ve aynı zamanda TTT indükler). 34 Flippase nucGFP sürekli ekspresyonuna yol açan bir durak kodonu özel Tüketim vergisi. Kaspaz aktivitesi G-TRACE duyarlı hale getirmek için, bu Apoliner (Şekil 1a) plazma zara-sabitlenmiş kaspaz-bölünebilir DIAP1 fragmanına G-TRACE aktif hale getirmek için gerekli olan Gal4, cepheye göre Apoliner sistemi ile bir araya getirilmiştir. 35

Biz ek MODIF yapılanCaspaseTracker bölgesinin Apoliner bileşenine ications programı geliştirmek. En önemlisi, kaspaz biyosensör kendisi potansiyel aksi öleceğini hücrelerin korunması, kaspazlan inhibe etmediğini kritik öneme sahiptir. Güçlü bir kaspaz inhibitörü beklendiği gibi Apoliner transgen, Drosophila 28 bariz fenotipleri neden olmasa da, hücrelerin hatta zaman zaman koruma kaspaz aktivitesinin normal hücrelerin belirlenmesi amacı yenilgi olacaktır. Bununla birlikte, Apoliner bölgesindeki DIAP1 parçası, daha sonra kuvvetli drice, Asp20. 43 kaspaz inhibisyon mekanizması olarak böler DIAP1 bir kristal yapı tarafından ortaya aynı kaspaz engellediği gösterilmiştir bir motifi (135 DICG-138) ihtiva eden DIAP1 bölgesindeki Asp135 bir kaspaz alt-tabaka benzeri olarak drice aktif bir bölge bağlı olduğu (ancak bölünmemiştir). 43 Biyokimyasal analizi Asp135 bir Arg ikamesi drice önleyici işlevi bozduğunu göstermektedir. 43 Dolayısıyla, CaspaseTracker kaspaz inhibisyonu Apoliner benzer (Şekil 1b). 35 önlemek için aynı D135R mutasyonu ile tasarlanmış olan, Asp20 bölünmeye Aşağıdaki de novo N-ucunda doğal olarak oluşan DIAP1 Asn-Asn sekansı CaspaseTracker bölgesindeki Gly-Val değiştirildi kaspaz yarılma üzerine N-ucu kuralı ile Gal4 bozulmasını önlemek için (Şekil 1b). 28 ek olarak, CaspaseTracker ifadenin hemen saptanması için Gal4 C terminaline, bir myc-etiketi kaynaşık. zorunlu olarak 35, Apoliner kendi RFP ve nucGFP kasetleri de RFP ve nucGFP içeren G-TRACE ile uyumlu hale getirmek için silindi. 28,35

Gal4 kendi nükleer lokalizasyon sinyali taşıyan ve Drosophila diğer transgenlerin, Gal4 rel muhtemelen sadece bir kaç molekül kaynaşmış zaman kuvvetli hedef DNA tepki elemanı (UAS) üzerinden transkripsiyonunu aktive çünküsitoplazmik kaspazlarm tarafından hafifletti birkaç saat (tahmini ≤12 h) içinde RFP ifade açmak için yeterlidir. Biyosensör etkinliği de novo transkripsiyonu ve RFP çevirisini gerektirdiğinden, gerçek zamanlı enzimatik aktivite bildirmez. kaspaz aktivitesi durduktan sonra CaspaseTracker TTT anlamlı bir gün içinde muhtemelen bozulmuş olsa da, nucGFP hücre ve döl ömrü boyunca ubikuitin promotörü ile ifade edilecektir.

İlk CaspaseTracker canlı ortam içinde kaspaz aktivasyonuna yanıt olduğunu göstermek için, yetişkin CaspaseTracker biyosensör sinek ölümü indükleyici uyaranlara hücre maruz bırakıldı. Drosophila yumurtalık yumurta odaları hayvanlar, üretim döl için çevre koşullarına uyan bir tahminlere mekanizma stresli programlanmış hücre ölümünü geçmesi gibi iyi çalışılmış hücre ölümü modelidir. 37,44,45 hücre ölümünü teşvik etmek için, biyosensör sinekler soğuk şaşırdılar 1 saat at -7° C (donma hayvanlar), ve yumurtalıklar canlı hayvan ertesi gün (Şekil 2a) kesilerek çıkarıldı. Tedavi edilmeyen biyosensör sinekleri aksine, soğuk şoktan sonra yumurta odaları hayli küçük ve (birleştirme Şekil 2b) bir hücre ölümü uyaran sonra biyosensör aktivasyonu doğrulayarak, (yeni) sağlam kırmızı ve yeşil (kalıcı) biyosensör aktivitesini sergiledi. Biosensor aktivitesi sadece tedavi sinekler, her iki germ hücre çekirdekleri (hemşire hücreleri ve oosit) ve yumurta odaları somatik hücrelerin (folikül hücreleri) tespit edilmiştir. Apoptoz 35 morfolojileri özelliği de hali hazırda biyosensör pozitif yumurta odaları gözlenmiştir nükleer parçalanma, DNA yoğuşma ve yıkımı (mavi leke kaybı) da dahil olmak üzere. Biyosensör etkinliği hem nükleer yoğuşma (Hoechst) ve aktif kaspaz (immunostain) ile aynı hücrelerde algılandı, ancak aktif kaspaz için en yoğun boyama alanlarında nükleer DNA hem de caspas meydana edilebilire biyosensör sinyalleri azalmış veya bozulmuş (Şekil 2b). soğuk şoktan sonra meydana gelen 46,47 hücre ölüm mekanizmaları iyi karakterize değildir ve diğer ölüm mekanizmaları oynayan olabilir bulundu. Bununla birlikte, benzer sonuçlar apoptozu neden olduğu bilinen amino asit açlık aşağıdaki elde edilmiştir. 35

CaspaseTracker olmayan apoptotik kaspaz aktivitesini tespit eğer belirlemek için, sağlıklı 1-günlük sineklerin iç organları titizlikle autofluorescent manikür ve yağ kaldırarak disseke edildi. Tek bir temsilci sinek Dokular kas hücreleri algılamak için çekirdek ve F-aktin için Phalloidin leke ile işaretlemek için Hoechst ile boyandı, monte, tespit edildi. Biyosensör aktivasyonunu eksikliği sağlıklı yumurta odaları, aksine, yumurta oda arasında F-aktin lekeli kas hücreleri, kırmızı ve yeşil hem biyosensör-aktivitesi (Şekil 3a, ek) vardı. Bununla birlikte, mümkün olduğu bioseNsor diğer hücreleri etiketler. Birçok diğer sağlıklı doku ve optimal yetiştirilen 1-günlük sinek organları muhtemelen bazal olmayan apoptotik kaspaz fonksiyonunu (Şekil 3a) yansıtan belirgin kaspaz biyosensör aktivitesini sergiledi. Biyo-algılayıcı pozitif hücreler morfolojik olarak normal çıktı ve hücrelerin spesifik alt hindgut (Şekil 3a, ek) sarma biyosensör-pozitif hücre, örneğin çizgiler için, kaspazları aktive olduğunu gösteren dokularda organize desen meydana geldi.

CaspaseTracker kaspaz belirli bir raportör olduğu en iyi kanıtı (DQVA için DQVD değiştirilmesi zorunlu kaspaz bölünme yerinde tek Asp Ala amino asit mutasyon haricinde CaspaseTracker aynıdır kontrol biyosensör eksprese sinekler sinyal olmaması Şekil 1b ve 3b). Son derece nadir bir hücreye (Şekil 3b, yeşil ok), sadece sinyal Observ hariçDQVA kontrol biyosensör sinekler Ed örneğin ağız parçaları (Şekil 3b) ve başka bir yerde yutulur üründe Gıda ve (Şekil 3b ve 4), ayrıca, kaspaz biyosensör eksikliği transgenik olmayan ebeveyn sinekler gözlenen gibi otofloresan yapılardır. 35 CaspaseTracker etiketli hücreler Malpighian (böbrek) tübüllerden boyunca düzenli aralıklarla meydana gelen ve çoğunlukla, aynı anda son (kırmızı) ve geçmiş (yeşil) kaspaz aktivasyonu hem de sergi sırasında beyinde birçok hücre, optik loblar, kardiya, kırpma, orta bağırsak ve yumurtalık kırmızı veya yeşil (Şekil 4 ve 5a) bulunmaktadır.

Uzun ömürlü hücreler kaspaz aktivitesini hayatta olduğunu kanıtlar, optik lob pan-nöronal belirteç ELAV (embriyonik öldürücü anormal görme) için immunohistokimyasal edildi. 48 birçok nöronların çekirdekleri çift CaspaseTracker ve ELAV nükleer hedefli GFP ile etiketlenmiş, uzun ömürlü ce ile tutarlırf olmayan ölüm fonksiyonları kullanılarak kaspaz (Şekil 5b). Biyosensör (Gal80ts kullanılarak) 10 gün boyunca kapalı Ayrıca, eğer, biyosensör-pozitif hücreler başka gut süresi (Şekil 6A ve B), beyin ve daha devam (gösterilmemiştir). kaspaz biyosensör CaspaseTracker kullanarak, bütün hayvanlarda bazal kaspaz aktivitesinin ilk bakış sağlar.

Şekil 1
Şekil 1: apoptotik olmayan, kaspaz aktivitesini tespit etmek için CaspaseTracker biyosensör sistemi. (a), Drosophila kaspaz biyosensör bileşenleri. (b) CaspaseTracker biyosensör sisteminin kaspaz-bölünebilir kısmı plazma membran takıntısı (mCD8) oluşmaktadır, doğal kaspaz-bölme sitesi Asp20 ihtiva DIAP1 bir fragmanı Gal4 transkripsiyon kaynaşmış bir C-terminali 3x-myc takısının faktör ve ubiquitin Pro ile ifademoter. Kaspaz bölünme G-TRACE sistemi ikna etmek için çekirdeğe Gal4 translokasyonu ile sonuçlanır. Bir kontrol biyosensör olarak, 4-amino asidi kaspaz ayrılma sitesinin (DQVD) 'de gerekli Asp20 Tortu, kaspaz bölünmesini ortadan kaldırmak için, Ala (DQVA) olarak değiştirilir. Transgenik CaspaseTracker sinekler 4 transgenlerin içerir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: CaspaseTracker hücre ölümü esnasında caspase'lar tarafından aktive edilir. (a) soğuk şok kaynaklı hücre ölümü için Drosophila yumurtalık ve akış diyagramı şematik. Drosophila yumurtalık (Polan Santos tarafından) çizim ve (Darren Obbard) tarafından Drosophila görüntü izni ile kullanılır. (b) Yumurta odaları 6- yumurtalıktan gün kadın CaspaseTracker w beslenen sinekler 6 gün (işlenmemiş) veya soğuk şoktan sonra 1 gün i, normal sinek gıda (-7 25, ardından ° C, 1 saat, 24 saat boyunca ° C) yumurta odaları kaspaz aktivasyonu uyarmak için. soğuk muamele yumurtalık (sağ alt çerçeveler) Genişlemesi nükleer yoğunlaşması (üst yumurta odası), nükleer parçalanma (orta yumurta odası ve ilavelerde) ve yıkımı (alt yumurta delil ile (yaklaşık dikey merkezli) zinciri ovaryol gelişmekte birinde üç yumurta odaları göstermek odacık) Hoechst DNA leke (mavi) dayalı. Aktif kaspazlar (anti-kaspaz-3, eflatun) orta ve alt yumurta odaları tespit edilmiştir. RFP ve GFP biyosensör aktivitesi (kırmızı, yeşil ve sarı oklar) genellikle diffüz aktif kaspaz (takmalar) ile leke nükleer DNA yoğunlaşması ile hücrelerde meydana gelir. Beyaz oklar biyosensör aktivitesi ve aktif kaspaz immunostain iki eksik çekirdekleri işaretleyin. * Otoflöresans sinyaller. Bu veriler Tang ve ark., 2015 Sci Rep izni ile yeniden üretilir.source.jove.com/files/ftp_upload/53992/53992fig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3: yaygın fizyolojik kaspaz aktivitesi için kanıt. (a) 18 ° C 'de ortaya tek, yeni eclosed sinek CaspaseTracker (DQVD) RFP ve nucGFP konfokal görüntü birleştirilmiş kesilerek ve F-aktin (pembe) için çekirdekler ve Phalloidin için H33342 ile boyanmış ve DIC ile görüntülendi. Phalloidin. Sadece yumurta odaları için içerlek gösterilmiştir (b) Aynı prosedür ve görüntüleme koşulları kontrol CaspaseTracker takip edildi (DQVA) uçar. * Otofloresan yapıları. Bu veriler Tang ve ark izni ile yeniden üretilir., Sci Rep 2015 büyük halini görmek için tıklayınızbu figür.

Şekil 4,
Şekil 4:. Birçok dokuda Bazal kaspaz aktivitesi DIC Yüksek büyütme ve GFP (geçmiş) ve RFP (yeni) CaspaseTracker (DQVD) faaliyet ve floresan konfokal görüntüleri beyin, kardia, kırpma, midgut, Malpighi tüplerinin çekirdekleri Hoechst boyalı Şekil 3a yumurta kanalları. * Otofloresan yapıları. Bu veriler Tang izni ile yeniden üretilir ve diğ., Sci Cum 2015 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5:-apoptotik kaspaz aktivitesi Drosophila nöronlarda optik lob. (a) DIC ve beyinde RFP (yeni) ve GFP (son) CaspaseTracker (DQVD) aktivitesi ve Hoechst lekeli çekirdekleri ile konfokal görüntüler. RFP + GFP çift etiketli hücreler (sarı oklar). (B) NucGFP beyin kalkan CaspaseTracker (DQVD) optik lobunda pan nöronal nükleer ELAV protein immunostain ile colocalizes. NucGFP ve ELAV eş lokalize sinyallerle nöronların (beyaz oklar) gösterilmiştir. RFP etiketli nöronlar bu özel alanda mevcut değildir, unutmayın. Bu veriler Tang izni ile yeniden üretilir ve diğ., Sci Cum 2015 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada sağlıklı dokularda yaygın bazal kaspaz aktivitesinin saptanmasını kolaylaştırmak CaspaseTracker inşaat ve iç işleyişini göstermektedir. In vivo olmayan apoptotik kaspaz aktivitesini tespit etmek için kritik adımlar şunlardır: 1) 2) uygun kontroller ile kaspaz-özel raportör fonksiyonu doğrulayarak, 3) diseksiyon tekniklerini uygulayarak yetişkin Drosophila tüm iç organ sistemlerini gözlemlemek, biyosensör transgen ile sinekleri üreten, autofluorescent eserler gelen ve 4) ayırt edici biyosensör etkinliği.

kaspaz-özel sensör olarak görev doğal kaspaz-bölünebilir polipeptidi biyosensör herhangi kaspaz engelleyici aktivitesi önlemek için modifiye edilmiştir. Başka modifikasyonlar hızlı Gal4 transkripsiyon faktörünün bozulmasını ve bir epitop etiketi sokulmasını engellemek için yapılmıştır. Biz de tüm vücut organı sineklerin diseksiyonu, immün, montaj ve sinek dokusunun konfokal mikroskopi tarifs olmayan apoptotik kaspaz aktivitesini tespit etmek için.

CaspaseTracker kaspaz aktivitesi seviyesi düşük hayatta hücrelerin tespit edilmesi için ideal olsa da birkaç saat biyosensör açmak için gerekli olduğu gibi, bu, gerçek zamanlı enzim aktivitesinin bir raportör değildir. Ancak, biz burada açıklanan uygulamalar için gerekli daha kısadır muhtemeldir algılama minimum zaman, tespit değil. Onlar hücre ölümünü incelemek için öncelikle tasarlanmıştır olarak CaspaseTracker aksine, diğer kaspaz biyosensörler önemli bir sınırlama, kaspaz aktivitesinin düşük seviyelerde tespit etme yetersizliğidir. Kaspaz aktivitesi. Bu nedenle, kaspaz aktivasyonunun tespiti, genellikle kabul edilir 49 belirli bir hücre ölümünün bir göstergesi olduğu. En az 30 dakika içinde büyük hücre yıkım neden olarak hücre ölümü güdünün ardından amplifiye 50,51 Ancak kanıt montaj kaspaz sahip olduğunu belirtir olmayan apoptotik, sağlıklı hücrelerde bile olmayan yıpratıcı fonksiyonlar. 7-21 presuonların gün-iş yürütmek caspases mekansal ve geçici sınırlı enzimatik aktivite med düşük seviyeleri mevcuttur teknolojilerle tespiti altında muhtemeldir. Bu sorun, büyük olasılıkla, sağlam sinyallerini üretmek için birkaç kaspaz bölünmesi olayları gerektirir CaspaseTracker tarafından aşılır ve kalıcı olarak in vivo bu hücreleri etiketlemek için devam eden kaspaz enzimatik aktivitesi gerektirmez.

sunulan deliller diğer tanımlanamayan Asp özgü proteazlar CaspaseTracker aktive olasılığını gözardı edilemez olsa CaspaseTracker, caspases için spesifik olduğunu gösterir. Ancak, besleme kaspaz-inhibitör peptitler blokları CaspaseTracker aktivitesinin bir kokteyl (yayımlanmamış) ile uçar. Biz de kendilerini Kaspaz inhibe biyosensörler kaçınmanın önemini vurgulamak ve kontrol biyosensörlerde ve transgenik olmayan sineklerin önemi böcek manikür doğasında otofloresans nedeniyle, iç yağ Depo'nun hatalı sonuçlar önlemek içinyiyecek ya da diğer karıştırıcıların yutulur, oturur.

Diğer bir zorluk caspases yanlısı ölüm ve non-ölüm fonksiyonlarını ayırt edilir. Pro-ölümü ve olmayan ölüm fonksiyonları kanseri önlemek için, bu hücrelerin enfeksiyonunu ve daha sonra eleme defetmek için, örneğin, uygun bir şekilde zamanlanmış ölüm normal fizyolojik durumu ile bağışıklık hücrelerinin genişlemesini hücrelerin geçişini amacıyla evrimsel bağlanabilir. Böylece, iç organlarda görülen bazal kaspaz aktivitesinin bazı yerine milyarlarca hücre ölümlerinin tahmini onlarca insan vücudunda günlük meydana gelen görünüşte tutarlı hücre ölümünü teşvik için bir girişim olduğunu olasılığını ortadan kaldırmak mümkün değil. 52 Bununla birlikte, sağlıklı morfolojisi biyosensör ifade eden hücrelerin güçlü CaspaseTracker kaspaz normal günlük işler için tasarlanmıştır, kaspaz aktivitesini tespit yeteneğine sahip olduğunu belirtir.

Kaspaz gibi hücrenin olmayan ölüm role sahip tavsiye edilirçoğalma. Bu stabil olarak bağlanan viral proteinleri ifade eden memeli hücre çizgileri yaratmak ve direkt olarak hücre Kaspaz engellenmesi için önceki girişimi (ör CRMA) ile tutarlıdır. hücre kolonilerinin yüzlerce boş kontrol vektörü ile ilaç seçimi sırasında ortaya çıkan ederken, beklenmedik bir şekilde sıfır koloni vektör ifade kaspaz inhibitörleri (yayımlanmamış) ile transfekte paralel kültürlerde kurdu. Böylece kaspazlar olasılıkla henüz underappreciated, normal hücrelerde yaygın işlevleri vardır. Bu daha CaspaseTracker sinek bazal biyosensör aktivitesi normal sağlıklı sinekler nöronlar da dahil olmak üzere pek çok organ sistemlerinin, genelinde birçok hücre tipinde tespit edildiğinde bulgu tarafından desteklenmektedir. nöronlarda sağlıklı kaspaz aktivitesi apoptoz sırasında aynı alt tabakaları bölünmesiyle normal beyin fonksiyonlarını geliştirmek için sinaptik uçlarının söküp olabilir, ya da gün iş fonksiyonları apoptoz gibi faaliyetlerden tamamen farklı olabilir. Aktif yüksek enzimatik seviyelerde karşı düşük olmakla birliktekaspazlar bu olasılığı destekleyen özel kaspaz-bölünmeyen substratları ile birkaç knockin mutant hayvanlar vardır, gün iş ve hücre ölümü arasındaki kritik fark olabilir. 17,53 Ancak, son ilerleme kaspaz-8 RIPK bölünmesiyle muhtemelen necroptosis inhibe ettiğini gösterir, 54 sinaptik depresyon ve AMPA reseptör endositoz Dicer kaspaz yarılmasıyla düzenlenebilir GAP43, 55 ve mikroRNA işleme kaspaz yarılmasıyla düzenlenebilir. 14,15,56

Bu biyosensör birçok ek uygulamaları vardır. Kaspazlar belirli zamanlarda veya belirli dokularda, biyosensör ifadesi kolaylıkla (Gal80ts kullanarak, örneğin) zamansal düzenlenebilir ve özel hücre tipleri (örneğin, koku özgü Gal4 sürücüleri) aktive olup olmadığını belirlemek için. caspas belirten yetişkin ortaya çıkması hala yaygın biyosensör etkinliği sonuçlandı sinekler kadar biyosensör ifadesini bastırmak için Gal80ts kullanmaES erginleri (Şekil 6c, d) aktif hale getirilebilir. 35 farklı kaspazlara özel biyosensörler içerebilir diğer kaspaz substratları diğer uygulamalarla DIAP1 fragmanını değiştirilmesi ve belirli alt tabakalar bölünmesini tespit edilmesi için. CaspaseTracker biyosensör olmayan apoptotik kaspaz aktivitelerinin rolü anlayışımızı artıracaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Biz Şekil Drosophila çizimler için Polan Santos ve Darren Obbard teşekkür ederiz. 2a, Marcelo Jacobs-Lorena JHMRI insectary kullanımı için. Bu çalışma Hayat Bilim Araştırma Vakfı bursu (HLT) tarafından desteklenmiştir, Üniversite Ödenekler Komitesi Hong Kong AoE / B-07/99 (MCF) ve NIH NS096677, NS037402 ve NS083373 (JMH) verir. Ho Lam Tang Yaşam Bilimleri Araştırma Vakfı Shurl ve Kay Curci Vakfı üyesidir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Consumables and Reagents
Vectashield Vector Products H-1000 Mounting medium
Forceps Ted Pella #505 (110mm, #5) Dumont tweezer biology grade, stainless steel
Hanging Drop Slides Fisher Scientific 12-565B Glass slides
Hoechst 33342 Molecular Probes H1399 DNA stain
Alexa Fluor 633 Phalloidin Molecular Probes A22284 Actin stain
Rat-Elav-7E8A10 anti-elav antibody Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) Antibody Registry ID:  AB_528218  Stain for Drosophla pan-neuronal ELAV
Cleaved caspase-3 (Asp175) antibody Cell Signaling Technology #9661 Stain for active fragment of caspase-3
ProLong Gold antifade reagent Life Technologies P36934 to preserve fluorophores 
ProLong Diamond Antifade Mountant Life Technologies P36961 to preserve fluorophores 
SylGard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  Product code: 0001023934 for dissection plates
Equipment
LSM780 confocal microscope Carl Zeiss N/A Imaging
Carl Zeiss Stereomicroscope Stemi 2000 Carl Zeiss N/A Drosophila dissection
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscope Illuminator, 150 W AmScope WBM99316 Light source

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8 (2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265 (2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15 (2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437 (2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015 (2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52 (2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223 (2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408 (2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 117 Kaspaz biyosensör, Apoptoz sigara apoptotik beyin nöronlar CaspaseTracker
<em>In Vivo</em> Biyosensör <em>Drosophila</em> olmayan apoptotik Kaspaz Aktivite Tracks
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M.… More

Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In Vivo Biosensor Tracks Non-apoptotic Caspase Activity in Drosophila. J. Vis. Exp. (117), e53992, doi:10.3791/53992 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter