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Medicine

Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren

Published: May 14, 2016 doi: 10.3791/53994
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

Abstract

Die Reaktion von einzelnen Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente trägt wesentlich die Bevölkerung Antwort bei der Bestimmung, und ist daher ein wichtiger Faktor in dem Gesamtergebnis. Immunoblotting, die Durchflusszytometrie und fixierte Zellexperimente werden oft verwendet, zu untersuchen, wie Zellen auf Anti-Krebs-Medikamente reagieren. Diese Verfahren sind wichtig, aber sie haben verschiedene Nachteile. Variability in der Arzneimittelreaktionen zwischen Krebszellen und normalen Zellen und zwischen Zellen verschiedener Krebs Ursprungs und transiente und seltene Reaktionen sind schwierig mit Bevölkerung Lungs Assays zu verstehen und ohne direkt in der Lage zu verfolgen und sie in Längsrichtung zu analysieren. Das Mikroskop ist besonders gut geeignet, um Bild lebenden Zellen. Fortschritte in der Technologie ermöglichen es uns, bei einer Auflösung routinemäßig Zellen Bild, das nicht nur Zellverfolgung ermöglicht, sondern auch die Beobachtung einer Vielzahl von zellulären Reaktionen. Wir beschreiben einen Ansatz im Detail, die für die kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung ermöglicht es derZellen während der Arzneimittelantwort für im wesentlichen so lange wie gewünscht, in der Regel bis zu 96 Stunden. Mit Variationen des Ansatzes können die Zellen für Wochen überwacht werden. Mit dem Einsatz von genetisch Fluoreszenzbiosensoren codiert zahlreiche Prozesse, Wege und Reaktionen können verfolgt werden. Wir zeigen Beispiele, die Verfolgung und die Quantifizierung von Zellwachstum und die Zellzyklusprogression, Chromosomendynamik, DNA-Schädigung und Zelltod sind. Wir diskutieren auch Variationen der Technik und ihrer Flexibilität und typische Fehler hervorzuheben.

Introduction

Live-Zell-Mikroskopie und Längsverfolgung einzelner Zellen ist keine neue Technik. Von den frühesten Mikroskope haben Enthusiasten und Wissenschaftler beobachteten , und einzelne Zellen und Organismen untersucht, ihr Verhalten und die Entwicklung 1-3. Ein berühmtes Beispiel aus dem späten David Rogers an der Vanderbilt University in den 1950er Jahren zeigt eine menschliche Neutrophilen in einem Blutausstrich ein Bakterium Staphylococcus aureus und schließlich den Prozess der Phagozytose 4 jagen. Diese Live-cell-Film ist ein ausgezeichnetes Beispiel dafür, wie mehrere Prozesse können in einem einzigen Experiment beobachtet und korreliert werden: Erfassen eines chemischen Gradienten, der Mechanik und der Geschwindigkeit der Zellbewegung, Zellformen Dynamik, Adhäsion und Phagozytose eines Pathogens.

Das Aufkommen der vollautomatischen Mikroskope und hochempfindliche Digitalkameras hat sich in einer wachsenden Zahl von Ermittlern führte Mikroskopie grundlegende Fragen in der Zellbiologie bis hin f fragen mitrom , wie Zellen 5,6 und 7,8 dividieren zu Organell Dynamik und Membrantransport 11.09 bewegen. Nicht fluoreszierende, Hellfeldmikroskopie, einschließlich Phasenkontrast (PC), die den Nobelpreis für Frits Zernike 1953 sammelte und Differentialinterferenzkontrast (DIC) für die Beobachtung von Zellen und Zellkerne erlauben, sondern auch subzellulärer Strukturen einschließlich Mikrotubulus-Bundles , Chromosomen, Kernkörperchen, Organell Dynamik und dicke Aktinfasern 12. Genetisch kodierte fluoreszierende Proteine ​​und die Entwicklung von Fluoreszenzfarbstoffen gegen Organellen haben sich dramatisch Zeitraffer-Mikroskopie 13-15 beeinflusst. Zwar nicht der Schwerpunkt dieses Artikels, Bildgebung in der Zelle Sphäroiden und in situ (Intravitalmikroskopie) mit Hilfe einer konfokalen und Multiphotonen - Mikroskopie stellen eine weitere Ausweitung des Ansatzes, und es gibt hervorragende Artikel , die diese Ansätze 16-19 verwenden und zu diskutieren.

Die Antworten von Zellen auf Anti-cancer Drogen oder natürliche Produkte werden auf der molekularen und zellulären Skala bestimmt. Verständnis Zellantworten und Schicksal nach der Behandlung beinhaltet häufig Population Lungs Assays (z. B. Immunoblotting, ganz gut Maßnahmen) oder festen Zeitpunkten mit Immunofluoreszenz - Nachweis und Durchflusszytometrie, die einzelnen Zellen zu messen. Heterogeneity in Einzelzellreaktionen auf Arzneimittel innerhalb einer Population, insbesondere in Tumoren, können einige der Variabilität in Reaktion auf Zelllinien und Tumoren gesehen erklären, die mit dem gleichen Medikament bei Sättigung behandelt. Langzeitlängs Ansätze einer gegebenen einzelnen Zelle oder einer Population von Zellen zu folgen ist ein seltener , aber sehr leistungsfähigen Ansatz, der für die direkte Untersuchung der molekularen Reaktionswege, verschiedene Phänotypen (z. B. den Zelltod oder die Zellteilung) ermöglicht es , die Beobachtung von Zell-zu-Zell - Variabilität innerhalb einer Population, und wie diese Faktoren tragen zur Bevölkerung Ansprechdynamik 20-22. Optimistisch, in der Lage zu seinzu beobachten und einzelne Zell-Reaktionen zu quantifizieren wird unser Verständnis von zu verbessern, wie Medikamente wirken, warum sie manchmal scheitern, und wie man sie am besten nutzen.

Die Technik der langfristigen Zeitraffer-Mikroskopie, Längs - Tracking und Analyse von Arzneimittelreaktionen zu vielen Forschern zur Verfügung und kann einfach sein, nur im Durchlicht - Phänotyp Antworten 20,21 zu beobachten. Die Hauptkomponenten des Ansatzes sind: eine angemessene Vorbereitung der Zellen von Interesse, ein automatisiertes Mikroskop mit Klimakammer, eine Kamera mit einem Computer integriert, um die Bilder zu erfassen und zu speichern, und Software, die im Zeitraffer und zu messen und zu analysieren, um die Zellen zu überprüfen und alle Fluoreszenzbiosensoren. Wir bieten ein detailliertes Protokoll mit vielen Tipps für die Durchführung von Zeitraffer-Mikroskopie von kultivierten Zellen so lange wie mehrere Tage mit Hell- und / oder Weitfeld Epifluoreszenzmikroskopie. Dieses Protokoll kann für jede Zelllinie verwendet werden, die in Kultur gezüchtet werden können,ihre Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapien zu untersuchen. Wir stellen Beispiele von Daten erfasst und unter Verwendung mehrerer verschiedener genetisch kodierten Fluoreszenz Biosensoren und ein Beispiel für Phasenkontrast-Mikroskopie, kurz verschiedene Arten von Sonden, die Vor- und Nachteile der langfristigen Zeitraffer und Längs Tracking diskutieren, was sein kann für diesen Ansatz gelernt, die aus nicht-direkten Ansätze zu verstehen, und einige Variationen, die wir hoffen, dass sein Interesse und Wert für unerfahrene Forscher, die nicht als mit dem Ansatz, und erfahrene Forscher schwierig ist.

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Protocol

Das folgende Protokoll verwendet Parameter , die von den Experimenten definiert in den 4 und 6 zu Akquisitionseinstellungen und Versuchsbedingungen. Viele dieser Parameter können modifiziert werden , um andere Experimente zu passen (dh Belichtungszeiten, Binning, fluoreszierende Kanäle usw.). Alle Verfahren müssen den institutionellen Richtlinien und Vorschriften einhalten und von der institutionellen Biosicherheitskommission genehmigt werden. Mikroskop-Hersteller-Websites enthalten ausgezeichnete Informationen für Live Cell Imaging.

1. Mikroskope und Imaging Software

  1. Führen Sie Live-Cell-Imaging auf einer Vielzahl von invertierten Mikroskopen. Die am häufigsten verwendeten Mikroskope sind Epifluoreszenz und Spinnscheiben-konfokale Weitfeld-. Hier verwenden eine automatisierte und motorisierte Weitfeld- Epifluoreszenz-Mikroskop mit 200-Watt-Metall-Halogen-Lichtquelle.
  2. Besorgen Sie sich eine Bühne-Top-oder Mikroskop Klimakammer. Hier verwenden, um eine Stufe-top Klimakammer.
  3. Verwenden Sie kommerzielle Software zu betreiben Mikroskope mit Dienstprogramme Zeitraffer-Mikroskopie auszuführen.
  4. Verwenden Sie handelsübliche Software oder ImageJ für die Bildanalyse. Viele andere Analysetools sind im Handel erhältlich, und es gibt maßgeschneiderte Programme von denen viele 8,18 veröffentlicht wurden.

2. Visualisierung zellulärer Prozesse und phänotypische Antworten

  1. Visualisieren Zellen mit Hellfeldmikroskopie. Differentialinterferenzkontrast und Phasenkontrast allein kann sehr informativ sein Antworten zu studieren, um Anti-Krebs-Medikament Antworten. Diese Prozesse können Mitose, Zellbeweglichkeit und Apoptose umfassen.
  2. Visualisieren Zellstrukturen, Organellen und Prozesse mit Fluoreszenzbiosensoren. Fluoreszenzsonden sind informativ in bestimmten subzellulären Prozesse zu verfolgen. Diese können die Dynamik der Mikrotubuli sind, mitochondriale und endoplasmatischen Reticulum Dynamik, Proteinakkumulation und Lokalisierung, undMolekular Signalisierung (z. B. Phosphorylierung, Calcium).

3. Herstellung der Proben

  1. Wachsen Zellen in Zellkulturschalen in einer zertifizierten Standard befeuchteten Zellkulturbrutschrank (beispielsweise 37 ° C, 5% CO 2, 80% relative Luftfeuchtigkeit).
    1. Wachsen HT1080-Zellen in MEM mit EBSS. Ergänzen die Medien mit 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v Natriumpyruvat und 1% v / v nicht-essentiellen Aminosäuren.
  2. Zwei Tage vor der Bildgebung, Platte 50.000 HT1080 Fucci Zellen in 3 Vertiefungen einer 12-Well # 1.5 Glasbodenschale in einem zertifizierten sterilen Laminar-Flow-Haube. Stellen Sie die Anzahl von Zellen ausplattiert ~ 60% Konfluenz für den Beginn des Experimentes zu erreichen. Abhängig von der Zelllinie und der Natur des Experiments kann die Zelldichte geringer sein.
    Anmerkung: Die Zelldichte haben großen Einfluss auf das Wachstum der Zelllinie und auf den experimentellen Ergebnissen. Zählen von Zellen zu minimieren Experiment zu Experiment variability aufgrund der Dichte.
    1. In Abhängigkeit von der Umgebungskammer und die notwendigen Bedingungen für das Experiment, Platte Zellen in einzelnen Well-Platten (in der Regel 35- oder 60-mm), 4 gut 35-mm-Schalen, 6-, 12- oder 24-Well-Zellkulturplatten oder Deckglas-Folien in verschiedenen Formaten. Verwenden Sie Glasbodenplatten mit # 1.5 Glas, da die meisten Objektive für diese Dicke des Glases optimiert sind, und Bildgebung durch Zellkultur-Plastik ist sehr schlecht.
      Hinweis: Einige Zelllinien wachsen nicht und überleben auf Glas. In diesen Fällen kann das Glas , um Anhaftung zu verbessern Zelle beschichtet werden (z. B. Poly-Lysin oder Kollagen). Einige Unternehmen stellen optische Zellkultur-Plastik, muss es empirisch ermittelt werden, ob dies ein gangbarer Weg ist.

4. Umweltkammer Set-up

  1. Vor jedem Experimentieren, Aufbau der Klimakammer , so dass es bei ~ 80% Luftfeuchtigkeit arbeitet und so die Temperatur an der Probenposition ist 37 o C. Die meisten kultivierten Zellen wachsen in 5% CO 2 / Balance Luftatmosphäre aufgrund Natriumbicarbonat - Puffer in dem Medium. Je nach Set-up : entweder die Umgebungsregler auf 5% CO 2 , und es wird zu 100% CO 2 mit Luft mischen, oder verwenden Sie vorgemischten, zertifiziert 5% CO 2 / Balance - Luft - Gas. Folgen Sie den Herstelleranweisungen für die Gasdurchflussraten.
    Hinweis: Einige Zelllinien wachsen in CO 2 -unabhängigen Medium in diesem Fall können sie ohne CO 2 aufrechterhalten werden. Speziell Bildmedien ist auch, dass die Zugabe von autofluoreszenten Verbindungen begrenzt. Das Wachstum in Thesen Medien für den gewünschten Zelltyp empirisch vorher bestimmt werden.
  2. Vor der Bildgebung gewährleistet ist, der Wasserbehälter gefüllt (nach Anweisungen des Herstellers) mit sterilem destilliertem Wasser. Schalten Sie die Klimakammer auf die gewünschte Temperatureinstellung und legen Sie sie in den Mikroskoptisch Einsatz. So speichern Sie Gas, nicht anfangen, den Fluss an dieser Stelle.
    Hinweis: Wenn es einen freien Raum zwischen Bühne-Top-Kammer und Bühneneinsatz und / oder jede Spannung auf Verbindungskabel an die Kammer kann es Bewegungsartefakte in das Experiment vorstellen.
    1. Legen Sie Stücke von Paraffinfilm über die Kanten der Bühne Einstellöffnung vor die Kammer hinein zu koppeln, um die Kammer auf die Bühne Einsetzen und stellen Sie sicher, dass keine Anschlüsse an der Kammer ziehen.
  3. Ermöglichen die Kammer auf 37 o C äquilibrieren Achten Sie auf eine stabile Temperatur Temperaturschwankungen während der Bildgebung zu verhindern, die die Zellphysiologie beeinflussen können und Drift einzuführen. Erreichen Temperaturausgleich erfordert typischerweise 30 min bis 1 h, je nach der Umgebung.
    1. Legen Sie eine "Dummy" Schüssel mit Wasser in den Brunnen in die Kammer unter Erwärmung. Eine Abbildungsschale mit Wasser ahmt die Probe gefüllt, die Kammer hilft sicherzustellen, dass ausreichend erwärmt und stabilisiert. Füllen der Kammer mit vorgewärmten sterilem Wasserreduziert die zur Temperaturstabilisierung erforderliche Zeit minimiert und bei der Zugabe der experimentellen Probe, die die Temperaturabnahme.

5. Mikroskop Set-up

  1. Schalten Sie das Mikroskop, zugehörigen Computer, und alle erforderlichen Peripheriegeräte.
    1. In Abhängigkeit von der Lichtquelle, warten , um ihn einzuschalten , bis sie benötigt (z. B. LED).
  2. Mit dem Objektivrevolver in einer niedrigen Position, wählen Sie die 20X 0,7 NA-Objektiv verwendet werden.
  3. Positionieren Sie die Probe auf das Ziel - das macht es einfacher, die Zellen zu finden, wenn die Probe in der Kammer ist.
  4. Definieren Abbildungsparameter in dieser Zeit, wenn sie von früheren Experimenten bekannt sind.

6. Der Transport von Zellen an ein Mikroskop und in die Kammer

  1. Transportieren Sie die Zellen aus dem Inkubator in die Klimakammer abgebildet werden. Stellen Sie sicher , dass dies schnell getan wird , um die Auswirkungen einer vergleichsweise niedrigen CO 2 zu begrenzen ,
  2. Legen Sie die Zellen in einem verschlossenen Behälter Styropor oder isolierte Tasche große Veränderungen der Umwelt zu vermeiden.
  • Legen Sie die Probenabbildung Schale in die Kammer Anweisungen des folgenden Herstellers.
  • Nachdem die Zellen innerhalb der Klimakammer, dichten die Kammer zu halten, ein stabiles Umfeld und gleich wieder auf die Quelle (n) des atmosphärischen Gas gesichert wurden.
    1. Da einige Klimakammern, keine engen, versiegelte Deckel nutzen zu verzögern Verdunstung, Schicht steril, Embryo-zertifizierte Mineralöl auf der Oberseite des Wachstumsmediums. Gas-permeant Paraffinfilm Wickeln um den Umfang Kanten der Probenschale vorsichtig das Glas nicht Imaging-Bereich zu behindern. Lokalisierte können sekundäre Befeuchtung Verfahren eingesetzt werden. Kondensation auf dem Deckel der Probenschale kann perfor verringernmance von Hellfeldmikroskopie.
  • Um die Auswirkungen der thermischen Drift früh während des Experiments zu minimieren, warten, 30 Minuten vor der Zeitraffer beginnen. Die benötigte Zeit hängt von Imaging-Schüssel Größe und andere Faktoren. Bestimmen Sie empirisch.

    • 7. Einstellen der Imaging up

    1. Wählen Sie Abbildungsbedingungen, die am besten die Daten darstellen. Treffen Sie Vorkehrungen Phototoxizität zu vermeiden, indem Belichtungszeiten zu begrenzen, mit geringerer Intensität Licht und Auswahl von Sonden, die durch längere Wellenlängen des Lichts angeregt werden.
    2. Definieren x, y und z-Ebene und der gewünschten Wellenlänge (n) für jede Position abgebildet werden. Die Zeitauflösung ist durch die Anzahl von Positionen und Wellenlängen beschränkt. Für langfristige Zeitraffer der meisten zellulären Prozesse, erwerben ein Bild alle 10 - 20 min; höhere Zeitauflösung (kurzen Intervallen, z. B. 1 min) mehr Datenpunkte liefert und damit robuster Zellverfolgung, sondern führt auch zu stärker integriertenBelichtung und größere Datenmengen.
      1. Als HT1080 Fucci dynamische grün und rot fluoreszierende Proteine ​​(Repräsentative Ergebnisse sehen), verwenden Sie die folgenden Belichtungszeiten: FITC / GFP - 50 ms, Texas Rot / TRITC - 40 ms, Hellfeld - 20 ms. Verwenden Sie ein 2 x 2 bin.
    3. Aktivieren Software gesteuert automatische Scharfeinstellung die Standardparameter in den erweiterten Einstellungen. Definieren Sie ein Autofokus-Bereich von 10 & mgr; m mit der empfohlenen Schrittgröße. Achten Sie darauf, dies zu tun, bevor die Zeitraffer beginnen. Autofokus mit Hell- Bilder und nie mit Fluoreszenzphototoxizität und Photobleaching zu reduzieren.
      1. Softwaregesteuerte Systeme Autofokus auf jedem Mikroskop mit einem motorisierten Tisch und direkt konzentrieren sich auf die Probe. Sie können jedoch die Erfassungsgeschwindigkeit des Experiments begrenzen. Hardware gesteuert Dauerfokussierart Systeme funktionieren gut für Zeitraffer-Mikroskopie und Geschwindigkeit zu verbessern, für mehr Positionen ermöglicht abgebildet oder eine höhere Rate des Erwerbs werden. Aber siestützen sich auf Detektion der Grenzfläche Luft-Glas und kann Mittelpunkt der Probe mit Variationen in der Glasdicke über die gut verlieren.
    4. Ersetzen Sie die Hälfte der Medien mit Medien die gewünschte Wirkstoffkonzentration enthält , die auf 37 ° C erwärmt wurde Teil Medien Austausch hilft thermische Drift zu reduzieren. Die Bedingungen, die in diesem Experiment sind Vehikel (DMSO), 1 & mgr; M selinexor und 10 uM PD0332991.
      Anmerkung: Dieser Schritt kann auch durch Anhalten und Neustarten des Experimentes nach dem Start der Übernahme erfolgen. Dies ermöglicht eine Längs Verfolgung von Pre- und Post-drug-Antworten einzelner Zellen. Wenn der Arzneimittelstabilität oder Stoffwechsel ist ein Anliegen, Pausieren und ersetzt die Medien können mit dem gleichen Verfahren durchgeführt werden. Um zu testen, für die Arzneimittel Abbau oder Metabolismus, Medien von behandelten Zellen können auch auf naive Zellen platziert werden Arzneimittelwirkung zu testen.
    5. Starten Sie den Zeitraffer.
    6. Da die Zeitraffer läuft, stellen Sie sicher, dass die abgebildeten Felder im Fokus bleiben und die chamber hält ein feuchtes 37 o C.
      1. Stellen Sie den Fokus, wie durch Anhalten der Erwerb während der Zeitabstand zwischen den Zeitpunkten benötigt.
    7. Falls erforderlich, fügen Sie Wasser in die Kammer bei längeren Experimenten. Vermeiden Sie die Kühlkammer durch Zugabe von vorgewärmten, steriles destilliertes Wasser bei 37 ° C

    8. Beenden der Time-lapse

    1. Wenn das Experiment zu Ende ausgeführt wurde, beenden Sie den Erwerb, wenn es nicht automatisch zu stoppen, wurde eingestellt.
    2. Stellen Sie sicher, dass die Zeitraffer richtig auf der Festplatte gespeichert wurde, obwohl die meisten Softwarepakete automatisch während der Aufnahme zu speichern, wenn nicht ordnungsgemäß Daten fertig verloren gehen kann.
    3. Entfernen Sie die Kammer aus dem Mikroskop und entsorgen Sie die Zellen in biologisch gefährlichen Abfall folgende zugelassene institutionelle Biosicherheit Verfahren.

    9. Longitudinal-Tracking und Analyse von Zeitraffer-Daten

    1. Wählen Sie die Methode für die Analyse, die istGeeignet für die biologischen Prozesse von Interesse. Viele Plugins für ImageJ, Programme mit Matlab und benutzerdefinierte Plattformen wurden für spezifische Anwendungen hergestellt. Die folgende Methodik umfasst Tracking von Kernen und Analyse von Kernfluoreszenzsonden , wie in den 4 und 5 gezeigt.
    2. Öffnen Sie die .tif Bildstapel für die verwendeten Kanäle in ImageJ. Alternativ öffnen Sie native Dateien aus dem Erwerb Programm direkt in ImageJ das Bioformats Plugin.
    3. Zeichnen Sie eine Region of Interest (ROI) innerhalb des Kerns einer Zelle die Hell- Bild oder das Kernetikettenkanal verwendet (falls verwendet), und fügen Sie den ROI-Manager. Hinweis: Wenn die abgebildeten Zellen , die ein Kern Etikett (zB Histone H2B-EGFP.), Dann wird die automatische Zellverfolgung genutzt werden können Regionen von Interesse (ROIs) , die einzelnen Kerne durch die Zeit zu erstellen.
    4. Fahren Sie mit dem nächsten Punkt und positionieren Sie den ROI innerhalb des gleichen nucleus. Fügen Sie den ROI zu dem ROI-Manager.
    5. Weiter zu verfolgen und zu machen ROIs für die einzelne Zelle , bis eine Zellereignis ist (Mitose, Apoptose, etc.) , Oder die Zelle nicht mehr nachgeführt werden kann (dh., Bewegt sich aus dem Rahmen oder der Versuch beendet).
    6. Wenn ROIs sind für Zellen durch die Zeit, die sie im Feld sind, überlagern sie auf die Fluoreszenzkanäle von Interesse etabliert. Messen Sie die mittlere Intensität der Fluoreszenz in jedem Kanal für jeden Zeitpunkt. Speichern Sie die ROI-Liste für die spätere Verwendung.
      1. Verschiedene Messungen können innerhalb der ROI für Anwendungen in verschiedenen Experimenten durchgeführt werden. Klicken Sie Analyse → Set Messungen ... ein Menü zu öffnen , um die Analysemethode wählen (z. B. mittlere Intensität innerhalb des ROI, integrierte Intensität, etc.).
    7. Hinweis Zellschicksale für einzelne Zellen (z. B. Apoptose, Teilung, Überleben) , während Tracking. Dies ermöglicht die Schaffung von Überlebenskurven und further Populationsanalyse.
    8. Mit der mittleren Intensität für beide Kanäle, erstellen Sie ein Streudiagramm zu Zellzyklusdynamik in Reaktion auf Therapeutika (5B, C) ​​anzuzeigen.
      Hinweis: Die Grundstücke können für einzelne Zellen im Laufe der Zeit oder gemittelt über eine Population von Zellen verfolgt erstellt werden. Quantitative Bildgebung kann für den Aufbau komplexer Reaktionen und Zell Beziehungen in Reaktion auf Krebstherapeutika kritisch sein. Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie, Längsverfolgung und Datenanalyse ist ein mehrstufiger Prozess, mit vielen Optionen für die Art der Mikroskopie und Analyse - Tools, und folgt dem allgemeinen Umriss versehen in Abbildung 1.

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    Representative Results

    Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie und direkte Längs Tracking ermöglicht die Untersuchung von vielen Anti-Krebs-Wirkung während der Arzneimittelantwort. Nach dem allgemeinen Umriß in Figur 1, werden mehrere Beispiele für Zellen gezeigt validierten fluoreszierenden Reporter exprimieren , das mit Anti-Krebs - Medikamenten behandelt, verfolgt und analysiert werden verschiedene Ansätze verwendet.

    Phasenkontrast - Mikroskopie allein ist sehr informativ und robust berichtet über Interphase im Vergleich zu der Mitose, Mitose - Dauer und Verhaftung, anormale Zellteilung und Zelltod 21,23,24. Medikamente , die die Zellteilung Target, oft als antimitotische Arzneimittel, weiter entwickelt werden, Fig . 2 und Filme 1 und 2 zeigen Beispiele für ein Paar angepaßter Brustkrebs abgeleitete MCF7 - Zelllinien , die nur in ihrem p53 - Status unterscheiden, behandelt mit 500 nM einer Art von Anti-Krebs-Medikament, dass die Zieleund hemmt die mitotischen Motor - Protein, Kinesin-5 (KSP1, Kif11, Eg5), was zu langwierigen Mitose 20. Wildtyp - MCF7 - Zellen (2A) sind ein Paradigma 25-27 p53-abhängigen Zellzyklusarrest zu studieren. Wildtypzellen geben Mitose, bleiben für mehrere Stunden, schließlich verlassen und weitgehend mit der Induktion von p53 25 verhaften. Wenn p53 durch stabile p53 Knockdown (MCF7 sh p53) entfernt wird, anstatt zu verhaften , nachdem sie die Mitose verlassen, gehen die Zellen durch wiederholte Zyklen (2B). Zellen wurden manuell und der Mitoseindex und der Prozentsatz der Zellen verfolgt , die eine zweite Mitose wurden erzielt (2C, D) ein. Wir beobachten, dass die sh p53 Zelle teilt verfolgt, wenn es eine zweite Runde der Mitose eintritt, anstatt zu verhaften und ohne Teilung der Mitose zu verlassen. Während hier nicht die Dauer der mitotische Ereignisse gezeigt, die Zeit zwischen aufeinanderfolgenden Mitosen Prozent der Zellteilungen, und die damit verbundenen Ereignisse Zelltod kann auch s seinentkernt 20,21.

    Taxane, zB Paclitaxel und Docetaxel, sind häufig einer Chemotherapie für viele Krebsarten, einschließlich derer, die schwer sind wie Pankreas- und fortgeschrittenem Brustkrebs zu behandeln. Paclitaxel bindet an das dynamische Plus-Ende von Mikrotubuli und stabilisiert sie, ihre normale Funktion zu verhindern. Paclitaxel hat dosisabhängige Wirkungen festgestellt, und selbst bei niedrigen Konzentrationen können 16 normalen mitotischen Progression und Chromosomensegregation stören. Faithful Segregation von Chromosomen ist wesentlich für die normale Zellproliferation und wenn abnormal in Aneuploidie führen , die Zellzyklusarrest auslösen kann, sondern auch als Motor der Krebsprogression handeln. Abbildung 3 und Movie 3 zeigen Zervixkarzinom abgeleiteten HeLa - Zellen stabil das Chromatin exprimieren Marker Histon-2b mCherry verschmolzen und beta-Tubulin zu EGFP fusioniert in Medium normales Wachstum (nicht gezeigt) behandelt, mit 1 nM Paclitaxel. In diesemBeispiel den Eintritt in und Progression durch Mitose können verfolgt werden. Der Zeitpunkt der Mitose erscheint in dieser Zelle normal, aber Chromosom Ausrichtung und Segregation ist nicht, was zu einer nuklearen Ausbuchtungen und Mikronuklei, die Strukturen sind was eine schlechte Chromosomensegregation. Mikrokerne sind anfällig für DNA - Schäden und Chromothripsis, die die große Fragmentierung der Chromosomen oder Chromatin - dies 28,29 wichtige Implikationen bei der Tumorentwicklung hat. Während hier nicht dargestellt, kann der Ursprung von Mikronuklei mit Bezug auf andere mitotischen Strukturen und das Schicksal dieser Zellen direkt verfolgt werden, unter Verwendung von langfristigen Zeitraffer. Ferner äußerte ein Chromatin-Marker mit einer DNA-Schädigung Reporter verwendet werden könnten, um die Beziehung zwischen Chromosomensegregation, Mikronuklei und DNA-Schäden vorhanden.

    Fluorescent Reporter ermöglichen enumerable Zellprozesse verfolgt werden und neue Reporter entwickelt ständig zu werden. Für die exWeise besteht die Zellzyklus - Phasen , die bei der Entwicklung von gezielten Anti-Krebs - Therapeutika von besonderem Interesse sind. Abbildung 4 und Film 4 zeigt eine Fibrosarkom abgeleitete Zelllinie (HT1080) , die stabil koexprimiert zwei Reporter bezeichnet, Indikatoren fluoreszierende Ubiquitin Zellzyklus (Fucci) 30. In dem System hier ist ein Teil des Cdt1 Polypeptid mKO2 fusioniert (monomer Kusabira orange 2) und steigt in G1-Phase und wird in der frühen S-Phase abgebaut, und ein Teil des Geminin wird mAG (monomer Azami grün) verschmolzen und steigt Mitte S-Phase und wird bei der Anaphase abgebaut. Diese Zelle ist in normalem Wachstumsmedium und schreitet durch den Zellzyklus in 15 Std. 5A, B und Film 5 zeigen die gleichen Zellen in normalem Medium , behandelt mit 10 & mgr; M PD0332991, einem Cdk4 / 6 - Inhibitor. Die Zellen Fortschritte durch G2-Phase und dividieren normalerweise und in der nachfolgenden G1-Phase stark arretieren, was das Potenzial für die Wirkungive cytostatischen Effekte in wachsenden Tumoren. 5C, D und Film 6 die gleichen Zellen in normalem Medium mit einem kleinen Molekül namens selinexor (KPT-330), ein potenter Inhibitor der Kernexportprotein behandelt zeigen, Exportin-1 (XPO1, auch bekannt als CRM1 ). Diese Verbindungen werden als selektive Inhibitoren der Kernexport (SINE) und ihre Anti-Krebs - Wirkung werden derzeit untersucht 31,32. SINE Behandlung führt zu einer starken Zellzyklus - Phänotypen und Zelltod 33,34. Dieses Beispiel zeigt eine Zelle, die durch die G1-Phase mit normaler Kinetik (ca. 6 h) fortschreitet, aber erfährt Verzögerung in S-Phasenprogression, wie durch die Zeit sowohl mit Rot- und Grün-Signal (ca. 3 h in der Kontrolle, aber 10 in SINE angegeben behandelt ). Diese Zelle stirbt in späten S- oder G2-Phase nach 21 h 30 min; eine normale Zellzyklus beträgt ca. 15 h. Die Auswirkungen von selinexor werden für verschiedene Blut- und soliden Tumoren untersucht 35.

    Abbildung 6 und 7 zeigen Film HT1080 - Zellen , die stabil mit einem Doppelstrang - DNA - Schäden Reporter exprimieren, mCherry-BP1-2 36 in das normale Wachstum Medium mit 10 & mgr; M Etoposid (VP-16) behandelt, einem Topoisomerase-II-Giftes. Dieser Reporter aus einem Teil des DNA-Doppelstrangbruchstelle Protein umfasst, 53BP1, die mCherry fusioniert ist. Der Kern dieser Zelle wurde usi verfolgtng das Analysieren Partikel Plugin in ImageJ und dem integrierten mCherry-BP1-2 Signal wurde in jedem Rahmen gemessen, nachdem Werte Schwellwertbildung aus, die lösliche Nuklearsonde eliminiert. DNA-Schaden ist minimal für die ersten 10 Stunden und dann erhöht sich stetig. Topoisomerase - II - Inhibitoren bekannt sind , besonders S- und G2-Phase beeinflussen, wenn das Enzym am aktivsten 37,38 ist. Die Kinetik in diesem Beispiel beobachtet könnten Zellzyklus assoziiert Schaden anzuzeigen; mCherry-BP1-2 mit Fucci Reportern Kombination könnte das Timing des Schadens zeigen, die verknüpft werden können dann das Schicksal der Zelle.

    Abbildung 1
    Abbildung 1. Übersicht über die Verwendung Langzeit Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal - Tracking - Anti-Krebs - Medikament Antwort zu studieren. Die Zellen in den entsprechenden Live-Cell - Imaging Gerichte markiert , wie gewünscht abgebildet werden, Zellen oder Bereiche von Interesse verfolgt werden, und die Daten analysiert. Es gibt viele Verfahren Zellen zu verfolgen und zu quantifizieren, einige sind hier angezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 2
    Abbildung 2. Phasenkontrast - Zeitraffer-Mikroskopie zeigt p53-Abhängigkeit nach Anti-mitotische Drug Treatment. Wildtyp (A) und p53-Zuschlag (B) MCF7 - Zellen mit 500 nM Kinesin-5 - Hemmer behandelt wurden und bebildert alle 10 min für 96 h unter Verwendung von Phasenkontrast-Mikroskopie mit einem 20X PH2 0,70 NA Objektiv. Einzelne Zellen wurden manuell und der Prozentsatz der Mitose verfolgt und, wenn die Zelle wieder in einen anderen Mitose fortschreitet während der Zeitraffer wurden erzielt. Die Pfeile zeigen die Zelle, die verfolgt wird. Die sh p53 Zelle (B) teilt auf eine zweite Mitose eintritt. (C) Beide Zellinien show verlängerte mitotischen Arrest, wie durch die hohe Spitzen Prozent Mitose (erste blaue und rote Pfeile) angezeigt. (C, D) Fast 90% der Zellen ohne p53 (sh p53, n = 87) zeigen weiterhin Progression (rote Pfeile) im Vergleich zu 20% der Wildtyp (n = 130). Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung. Bar = 20 & mgr; m. Filme 1 und 2. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 3
    Abbildung 3. Die Chromatin Marker Histone 2b zeigt : Der Nachweis der Chromosome Segregation Abnormalitäten nach Niedrig dosierte Paclitaxel - Behandlung. Paclitaxel ist ein Mikrotubulus-bezogene Medikament , das in komplexen, konzentrationsabhängige Defekte in Zellwachstum und Zellteilung führt. Die Organisation des Chromatins informiert auf verschiedenen Zellzuständen, einschließlich der Bühneder Mitose und Zelltod. exprimierenden HeLa-Zellen, die stabil sowohl H2b-mCherry und β-Tubulin-EGFP mit 1 nM Paclitaxel behandelt wurden. Diese Zelle ist zunächst in der Interphase, schreitet durch die Stadien der Mitose und dividieren. Während der Zeit, in der Mitose normal erscheint, gibt es Hinweise auf Chromosom Anhaftung und Segregation Fehler, die behoben werden (Pfeile). Das Schicksal dieser Zellen kann direkt durch Längsverfolgung bestimmt werden. Phasen-Kontrast (nicht gezeigt) und Fluoreszenzbilder wurden bei 1 Bild pro 10 min mit einer 20X Ph2 0,70 NA Objektiv erfasst. Bar = 10 & mgr; m. Movie 3. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Abbildung 4
    Abbildung 4. Fluoreszierende Cell Cycle - Marker erlauben für die direkte Überwachung der Progression des Zellzyklus.(A) Ein Bereich der Live-HT1080-Fibrosarkom-Zellen die Fucci System durch Phasenkontrast und Fluoreszenz abgebildet exprimieren. (B, C) ​​Die mitotische Zelle in der gestrichelten Kasten in Feld A folgt. Normalerweise in etwa 15 Stunden des Zellzyklus Fortschritte durch. Nach der Mitose werden die Zellen kurz dunkel, und dann rot werden, wie sie in und durch G1-Phase voranschreiten. Wenn die Zellen S-Phase eintreten, ist die rote Cdt1 Sonde abgebaut und die grünen Geminin Sonde erhöht. Die kurze etwa 3 Stunden Zeit, wo beide Sonden vorhanden sind, zeigt frühe S-Phase. Wenn Zellen durch S- und G2-Phase und in die nächste Mitose Fortschritte bleiben sie grün. Die grüne Sonde wird auf der Anaphase der Zellteilung abgebaut. Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder wurden bei 1 Bild pro 10 min mit einer 20X PH2 0,70 NA Objektiv erfasst. Bar = 10 & mgr; m. Film 4. Bitte hier klicken , um view eine größere Version dieser Figur.

    Abbildung 5
    Abbildung 5. Zellzyklus spezifische Effekte und den mitwirkenden Zelltod. Die gleiche Zelllinie , wie in Abbildung 4 , jedoch mit zwei unterschiedlichen Molekülen behandelt , die verschiedene Anti-Krebs - Ziele darstellen. Zeiten nach der Behandlung angegeben. (A, B) nach Behandlung einer späten S / G2-Phasen - Zellen mit 10 uM PD0332991 Cdk4 / 6 - Inhibitor, Zell sie fortschreitet , normal zu der Mitose (M) und dividieren. Eine Tochterzelle wird durch Messen roten und grünen Fluoreszenzintensitäten in dem interessierenden Bereich in den Zellkern verfolgt. Die Zelle bleibt in der G1-Phase für etwa 40 Stunden verhaftet. (C, D) Nach der Behandlung einer späten G2-Phasen - Zellen mit 1 uM selinexor, Zell sie fortschreitet , normal zu der Mitose (M) und dividieren. Eine Tochterzelle wird verfolgt, und es tritt G1-Phase, schreitet durchein langwieriger frühen S-Phase (rot und grün-Signal), geht auf nur grün und stirbt nach 21 h 30 min. Die Daten legen nahe S-Phase Progression durch selinexor Behandlung betroffen ist. Phasenkontrast und Fluoreszenzbilder wurden bei 1 Bild pro 10 min mit einer 20X PH2 0,70 NA Objektiv erfasst. Bar = 10 & mgr; m. Filme 5 und 6. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Figur 6
    Abbildung 6. DNA - Schäden Dynamics nach medikamentöse Behandlung. Viele Anti-Krebs - Therapien führen zu DNA - Schäden , die zutiefst Zellantwort beeinflussen können und den Behandlungserfolg. HT1080-Zellen stabil exprimieren sowohl die Doppelstrang-DNA-Schaden-Marker mCherry BP1-2 und H2b-EGFP (nicht gezeigt) wurden mit 10 uM des Topoisomerase II Medikament Etoposid und DNA dAmage wurde verfolgt. (A) Die Anzahl und Intensität der Brennpunkte Anstieg nach Etoposid. Es ist zunächst eine Verzögerung, die auf mögliche Zellzyklus-Effekte im Einklang mit dem bekannten Mechanismus von Etoposid. Mit 22 h 50 min wurde diese Zelle ein hohes Maß an Schaden angesammelt. Während hier nicht gezeigt, kann das Schicksal dieser Zellen durch die direkte Verfolgung bestimmt werden. (B) Ein ROI auf die durch das H2b-EGFP Signal erhalten Kern entspricht , wurde unter Verwendung des Particle Trackings in ImageJ verfolgt und die integrierte BP1-2 mCherry Signal wurde quantifiziert und aufgetragen über die Zeit. Die Verzögerung in dem Signal, bis etwa 10 Stunden wird festgestellt, gefolgt von einem anhaltenden Anstieg. Fluoreszenzbilder wurden bei 1 Bild pro 10 min mit einem 40-fach PH2 0,75 NA Objektiv erworben. Bar = 10 & mgr; m. Film - 7. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


    Film 1. Phasenkontrast - Zeitraffer-Mikroskopie der Wildtyp MCF7 Zellen nach Anti-mitotische Drug Treatment. Wildtyp MCF7 - Zellen wurden mit 500 nM Kinesin-5 - Hemmer behandelt und bebildert alle 10 min für 96 Stunden unter Verwendung von Phasenkontrast - Mikroskopie mit einem 20X PH2 0,70 NA Objektiv. Längerer mitotischen Arrest und Austritt aus der Mitose kann beobachtet werden, wie in Abbildung 2 beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.

    moive 2
    Film 2. Phasenkontrast - Zeitraffer-Mikroskopie der p53-Knockdown MCF7 Zellen nach Anti-mitotische medikamentöse Behandlung. MCF7 Zellen , die stabil eine kleine Haarnadel RNA - Targeting p53 für den Abbau exprimieren , wurden mit 500 nM Kinesin-5 - Hemmer und alle 10 min für 96 Stunden unter Verwendung von Phasenkontrast-Mikroskopie mit einem 20X PH2 0,70 NA Objektiv abgebildet wird. Längerer mitotischen Arrest und mehrere Runden der Mitose beobachtet werden, wie in Abbildung 2 beschrieben. Bitte klicken Sie hier , um diese Datei herunterzuladen.

    moive 3
    Film 3. Fluorescent Zeitraffer-Mikroskopie von HeLa - Zellen nach Niedrig dosierte Paclitaxel - Behandlung. HeLa - Zellen stabil exprimieren H2B-mCherry und β-Tubulin-EGFP wurden mit 1 nM Paclitaxel behandelt. Chromosome Befestigung und Segregation Probleme zu beobachten, wie in Abbildung 3 beschrieben. Bilder erworben wurden alle 10 min mit einer 20X PH2 0,70 NA Objektiv. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> moive 4
    Film 4. Fluoreszierende Cell Cycle - Marker erlauben für Direct Monitoring des Zellzyklus. HT1080 - Zellen die Fucci System zum Ausdruck längs während Zeitraffermikroskopie verfolgt wurden. Die Zelle geht dim nach Mitose Austritt aus und wird dann rot, wenn die Zelle durch G1-Phase fortschreitet. Da die Zelle S-Phase eintritt, wird es gelb wie die grünen Geminin Sonde erhöht und die rote Cdt1 Sonde abgebaut wird. Die Zelle bleibt grün, wie es durch S- und G2-Phase fortschreitet. Die grüne verschlechtert sich die Zellen anaphase eintritt. Die Quantifizierung dieser Zelle in Abbildung 4 dargestellt ist. Bilder alle 10 Minuten mit einer 20X PH2 0,70 NA Objektiv erworben wurden. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

    Moive 5 "src =" / files / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    Film 5. HT1080 Zellen Fluorescent Cell Cycle - Marker nach der Behandlung dem Ausdruck mit einem G1-Phase Inhibitor. HT1080 - Zellen die Fucci System exprimieren , wurden mit 10 & mgr; M PD0332991 behandelt, ein Cdk4 / 6 - Hemmer. Das verfolgte Zelle schreitet normalerweise zu Mitose und dividieren. Eine Tochter ist nachverfolgt, und bleibt in G1 für die Dauer des Films rot. Die Quantifizierung erfolgt in 5 gezeigt. Die Bilder wurden erworben alle 10 Minuten mit einem 20X PH2 0,70 NA Objektiv. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

    moive 6
    Film 6. HT1080 Zellen Fluorescent Cell Cycle - Marker nach der Behandlung dem Ausdruck mit dem Exportin-1 - Inhibitor, Selinexor. HT1080 - Zellen die Fucci System exprimieren , wurden treated mit 1 uM selinexor. Diese späte G2-Phase Zelle wurde durch Mitose verfolgt. Eine Tochterzelle schreitet dann durch G1-Phase (rot) und tritt in die S-Phase (gelb). Die Zelle schreitet langsam durch S-Phasen, bis er nach 21 h 30 min Behandlungs late-S / G2-Phase und stirbt eintritt. Die Quantifizierung erfolgt in 5 gezeigt. Die Bilder wurden erworben alle 10 Minuten mit einem 20X PH2 0,70 NA Objektiv. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

    moive 7
    Film 7. DNA Damage Dynamics nach Behandlung mit einem Topoisomerase II - Inhibitor. HT1080 Zellen , die stabil die Doppelstrang - DNA - Schaden-Marker exprimieren mCherry BP1-2 und H2B-EGFP wurden mit 10 & mgr; M Etoposid, einem Topoisomerase - II - Inhibitor behandelt. Die mCherry-BP1-2 wird im Film angezeigt. Da die Behandlung fortsetzens, das Signal von mCherry-BP1-2 erhöht, was auf Doppelstrang-DNA-Schaden erhöht. Die Quantifizierung erfolgt in 6 gezeigt. Die Bilder wurden erworben alle 10 Minuten mit einem 40 - fach PH2 0,75 NA Objektiv. Bitte hier klicken , um diese Datei herunterzuladen.

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    Discussion

    Vorteile der Zeitraffermikroskopie und Longitudinal - Tracking

    Das Mikroskop ist ein ideales Instrument für Langzeitstudien von Arzneimittelreaktion, wie sie Forscher können einzelne Zellen und ihre Schicksale sowie die gesamte Bevölkerung zu verfolgen. Variability in Ansprechen auf das Medikament innerhalb einer Population von Zellen ist ein wichtiges Thema für Anti-Krebs-Therapie-Design. Längs-Tracking einzelner Zellen ermöglicht Ermittler diese Variabilität zu beobachten und zu beginnen, um die zugrunde liegenden Mechanismen und Konsequenzen zu verstehen, wie es zu der Zellpopulation betrifft. eine Vielzahl von Fluoreszenzsonden Verwendung bietet eine Vielzahl von Möglichkeiten, beide gemeinsame und seltene Reaktion Phänotypen zu beobachten und zu verstehen. Der Zeitpunkt und der Beitrag der verschiedenen Zell Schicksal der Bevölkerung Antwort, die Beziehungen zwischen spezifischen Phänotypen und Schicksal, und Unterschiede in der Reaktion zwischen den Zelllinien oder dem Zustand nach Behandlung sind Beispiele dafür, was gelernt werden kann. Viele Krebsbezogenen Prozesse untersucht werden. Einige, die nicht in diesem Artikel hervorgehoben sind Zelltod mit Apoptose, Autophagie und Nekrose Reportern 39-42, Zellinvasion 43,44 und p53 Dynamik , die das Zellschicksal Entscheidungen 27 bestimmen. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht in der Anti-Krebstherapie-Studien auf Studien beschränkt. Die gleichen Prinzipien können auch viele andere biologische Prozesse verwendet werden , einschließlich Dynamik Mitose 45 Zytoskelett 46,47 und intrazellulär zu studieren Signalisierung 48.

    Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie kann auch Lokalisation und Intensitätsdaten von Proteinen und Molekülen von Interesse bieten. Nicht nur Veränderungen in der Protein-Ebene wichtig, um Arzneimittelreaktion, aber die richtige (oder falsche) Lokalisierung von Proteinen innerhalb der Zelle ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis Antwort. Zeitraffer-Mikroskopie liefert Daten über denen Proteine ​​lokalisiert sind (z. B. Kern, Cytosol, spezifische Organellen,etc.) nach der medikamentösen Behandlung und wie die Lokalisierung und die Gesamt Ebenen im Laufe der Zeit in einer einzelnen Zelle und Populationsebene ändern.

    Herausforderungen und Einschränkungen

    Trotz der Stärken von Zeitraffer-Mikroskopie und Langzeitanalyse von Einzelzellen gibt es Einschränkungen. Die Fluoreszenz-Reporter zeichnen sich durch ihre Stabilität und Spezifität begrenzt. Wenn fluoreszierende Fusionsproteine ​​entwerfen, ist es entscheidend, eine Sonde zu wählen, die photostabil und hell ist, aber es ist auch notwendig, um die Auswirkungen der fluoreszierenden Markierung zu prüfen, um das Protein von Interesse gebunden ist in Bezug auf seine normale Funktion und die Fähigkeit, richtig lokalisieren . Diese Fragen wurden im Detail an anderer Stelle , und es gibt viele verfügbare fluoreszierende markierte Proteine ​​diskutiert , die 15,49,50 veröffentlicht wurden. Andere fluoreszierende Markierungen oder Etiketten können zu den Zellen hinzugefügt werden und darauf geachtet werden muss, um sicherzustellen, dass sie nicht toxisch sind. Unserer Erfahrung nach diese pRoben, zum Beispiel Mitochondrien-Etiketten (Membranpotential) oder zellpermeabel DNA-Farbstoffe, neigen dazu, leichter zu bleichen und wird aufgrund der Zellproliferation verdünnt-out sein.

    Darüber hinaus gibt es viele technische Herausforderungen mit wächst und Zellen an einem Mikroskop beobachtet wird. Instabilitäten in Bezug auf Temperatur, Feuchtigkeit, Atmosphäre und Licht haben große Auswirkungen auf die Zellen, was zu einem Verlust von Daten oder sogar des gesamten Experiments. Stabilitätsprobleme in Bezug auf Bildaufnahme kann in Filme 1 und 2 zu sehen ist. Dieser Effekt kann durch die Verwendung von Paraffinfilm minimiert werden (siehe 4.2). Es gibt auch Bildstabilisierung Algorithmen für die Post-Erfassungsverarbeitung, zum Beispiel mit ImageJ (NIH). Ein Aspekt der langfristigen Zeitraum, der oft übersehen wird, ist die Datenverwaltung und Dateigröße. Selbst wenn die Binning ein einzelner Zeitraffer Experiment oft über 30 Gigabyte. Hohe Kapazität, hohe Geschwindigkeit und zuverlässige Datenspeicherung und -übertragung sind starkly gefördert. In Abhängigkeit von dem fluoreszierenden Biosensor (en) abgebildet wird, ist es oft nicht notwendig, vollständige Auflösung Bilder zu erfassen, beispielsweise nukleare oder zytoplasmatischen Sensoren. Wir empfehlen, wenn möglich, Maßnahmen zu ergreifen, Datei zu halten kleinen Größen, in einfacher resultierende mit Daten zu arbeiten, weniger anspruchsvolle Computerbedarf und verbesserte Arbeitsabläufe.

    Phototoxizität ist ein wichtiges Anliegen, wenn langfristige Zeitraffer-Mikroskopie durchgeführt wird. Licht mit hoher Intensität und Langzeitbelichtungen können gegen Ausbleichung von Fluoreszenzsonden, Zellstress und Zelltod führen. Diese Effekte können große Auswirkungen haben auf die Daten und falsche Darstellung des Experiments führen. Kamera-Binning und Verstärkung kann verwendet werden Belichtungszeiten zu reduzieren. Neutraldichtefilter in den Lichtweg verringern die Intensität des Lichts auf die Probe. Die Wellenlängen des Lichts zu Bildes verwendet werden auch die Zellen beeinflussen. Kürzere Wellenlängen (UV, in der Nähe von UV) sind schädlich für die Zellen und bei schnelleren Raten in Photobleaching führen alslängeren Wellenlängen (z. B. rot, bis rot). Wahl des Ziels kann auch Auswirkungen auf Bedingungen Bildgebung. Höhere numerische Apertur (NA) Linsen höher aufgelöste Bilder erzeugen, aber höhere Vergrößerung ermöglicht weniger Licht von der in höheren Belichtungszeiten oder intensiveres Licht resultierende Probe übertragen werden. Ein Ziel sollte mit einem geeigneten NA und Vergrößerung ausgewählt werden, die das Objekt von Interesse ohne Überabtasten lösen wird. In vielen Fällen ist die höchste Ziel möglicherweise nicht die beste Wahl. Mit Atomsonden (4, 5), ein geringer Vergrößerung am Objektiv ermöglicht die einen größeren Bereich nicht erfasst werden, effektiv Probengröße zu erhöhen, ohne die Auflösung des gewünschten Objekts zu beeinträchtigen. Langzeitzeitraffer in drei Dimensionen sollten vorsichtig durch integrierte Lichtbestrahlung durchgeführt werden. Verwendung einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop, empfindliche Kamera (z. B. EM-CCD), Kameraverstärkung und eine schnelle Piezomotor für z-Serie ist suggested Lichtexposition zu verringern. Schnelle z-Serie Akquisition ist auch wichtig, Bewegungsartefakte aufgrund Zelle Bewegung und Dynamik zu minimieren, die während des Erfassungszeitraums auftreten. Empirische Analyse von unbehandelten Zellen viele verschiedene Einstellungen können bei der Bestimmung der Auswirkungen von Fluoreszenzlicht an einem bestimmten Zelllinie oder Reporter nützlich sein. Darüber hinaus sollte eine unbehandelte Kontrolle in jedem Experiment eingeschlossen werden, um die zytotoxischen Wirkungen der Versuchseinstellungen zu bestimmen.

    Variationen der Technik

    Langzeitzeitraffer ist robust und sehr flexibel. Mit Co-Kultur-Techniken, verschiedene Zelllinien oder die gleichen verschiedenen Reportern exprimierenden Zelllinien verwendet werden. Ein herausragendes Beispiel ist Abbilden phagozytischen Zellen mit Zielzellen, die in Reaktion auf ein Antikrebsmittel sterben. Ein weiteres Beispiel könnte sein, die Auswirkungen von reagierenden Zellen zu studieren, auf medikamentös vorbehandelten Zellen benachbart sind. Gekoppelt mit Foto-activateable, Foto-Cabrio, und photoschaltbare fluoreszierende Proteine ​​und erzeugte Proteine ​​, die durch Licht aktiviert werden können , spezifische Effekte auslösen (z. B. KillerRed), gibt es viele Möglichkeiten. Mehr können komplexe Ansätze verwendet werden , die (FRET) nach Photobleaching, Transfer Energie Förster - Resonanz verschiedene spezialisierte Arten von Mikroskopie wie fluoreszierende Umverteilung beschäftigen und Superauflösung (z. B. stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM), strukturelle Beleuchtung Mikroskopie (SIM), oder stimulierte Emission Depletion (STED)), und viele andere, und es gibt Vorteile und Grenzen der einzelnen Ansätze.

    Langzeitanwendung (zB., Wochen, Monate) Antworten und die Gewinnung von Zellen nach der Arzneimittelentfernung ist von zentraler Bedeutung für das Verständnis Anti-Krebs - Wirkung von Medikamenten. Gridded Glasbodenschalen sind ein wertvolles Werkzeug, um bestimmte Zellen oder Regionen wiederholt innerhalb einer Population / Gebiet zu überwachen. Zum Beispiel mit einem gerasterten Gericht, die anfängliche drug Reaktion kann unter Verwendung eines Zeitraffer abzubildenden kann das Arzneimittel entfernt werden und spezifische Bereiche in dem Netz über die Zeit oder unterworfen zusätzliche Zeitraffer zum gewünschten Zeitpunkt abgebildet werden. Der Glasboden auf dem Geschirr kann entweder durch Schneiden mit einem Schreiber Werkzeug entfernt werden oder mit Hilfe eines kommerziellen Reagens und die Zellen auf dem Glas können für andere Marker von Interesse gefärbt werden, zum Beispiel Seneszenz assoziierten β-galactocidase Aktivität, und im Vergleich zu die Zeitraffer die Geschichte, wie Zellen erreicht diesen Zustand zu verstehen. Wenn die Zellpopulation groß genug ist, es auch Immunoblotting unterzogen werden kann oder Durchflusszytometrie.

    Dicke Proben sind traditionell schwer zu Bild, zum Beispiel Sphäroiden in verschiedenen Gel-Materialien und Matrizen. Neuere Ansätze fluoreszierendes konfokalen oder Mehrphotonenmikroskopie 16,18,19,51 darunter verwendet werden können , die Annäherung an ein in situ Verständnis davon , wie Zellen auf Anti-Krebs - Therapeutika reagieren zu verlängern. Dasse Studien und eine wachsende Zahl von Wissenschaftlern Zeitraffer unter Verwendung von Anti-Krebs - Medikament Antwort zu studieren 24,52-54 deutlich zeigen , dass wir in Richtung bewegen , ein Verständnis der einzelnen Zelle Pharmakodynamik zu entwickeln , die unsere Fähigkeit , Anti-Krebs - Medikamente zu verwenden , verbessern helfen effektiver und vielleicht vorhersagen Ansprechen auf das Medikament Anti-Krebs.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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    Medizin Heft 111 Fluoreszenzmikroskopie Live-Cell-Imaging Zeitraffer Krebsbiologie Zellbiologie
    Durch den Spiegel: Zeitraffer-Mikroskopie und Longitudinal-Tracking von Einzelzellen Anti-Krebs-Therapeutika zu studieren
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    Burke, R. T., Orth, J. D. Through… More

    Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

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