Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака

Published: May 14, 2016 doi: 10.3791/53994
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

Abstract

Реакция отдельных клеток к противоопухолевых препаратов в значительной степени способствует в определении отклика населения, и, следовательно, является одним из основных факторов в общий результат. Иммуноблоттинг, проточной цитометрии и неподвижные клеточные эксперименты часто используются для изучения того, как клетки реагируют на противораковые препараты. Эти методы очень важны, но они имеют ряд недостатков. Изменчивость в ответах наркотиков между раком и нормальными клетками и между клетками различного происхождения рака, и переходных и редких ответов трудно понять с помощью усреднения населения анализов и не имея возможности непосредственно отслеживать и анализировать их в продольном направлении. Микроскоп особенно хорошо подходит для получения изображений живых клеток. Достижения в области технологии позволяют нам регулярно печатали изображения клетки при разрешении, что позволяет не только отслеживать клеток, но и наблюдение различных клеточных реакций. Описывается подход к деталям, что позволяет за время непрерывной покадровой визуализацииклеток во время реакции лекарственного средства для по существу до тех пор, как хотелось бы, как правило, до 96 часов. Используя вариации подхода, клетки могут быть проверены в течение нескольких недель. С занятости генетически кодируемых флуоресцентных биосенсоры многочисленных процессов, путей и ответы могут быть соблюдены. Мы покажем примеры, которые включают отслеживание и количественного клеточного роста и прогрессии клеточного цикла, динамика хромосом, повреждения ДНК и гибель клеток. Мы также обсудим варианты техники и ее гибкости, а также выделить некоторые общие подводные камни.

Introduction

Live-клеточная микроскопия и продольное отслеживание отдельных клеток не является новой техникой. С самых ранних микроскопов, энтузиасты и ученые наблюдали и изучали отдельные клетки и организмы, их поведение и развитие 1-3. Известный пример с конца Дэвид Роджерс в Университете Вандербильта в 1950 - е годы показывает человека в нейтрофильный мазке крови чеканка бактерии золотистый стафилококк и в конечном итоге процесс фагоцитоза 4. Этот живой-элементная фильм является прекрасной иллюстрацией того, как множественные процессы можно наблюдать и коррелировать в одном эксперименте: зондирование химического градиента, механики и скорости подвижности клеток, клеток формирует динамику, адгезию и фагоцитоз патогена.

Появление полностью автоматизированных микроскопов и высокочувствительных цифровых камер привело к увеличению числа исследователей с помощью микроскопии задавать фундаментальные вопросы в клеточной биологии в диапазоне Fром , как клетки перемещаются 5,6 и 7,8 разделить на органелл динамику и мембранном 9-11. Нефлуоресцентной, светлого микроскопии, в том числе фазового контраста (ПК), которая получила Нобелевскую премию по Цернике в 1953 году, и дифференциального интерференционного контраста (DIC) позволяют для наблюдения клеток и ядер, но и субклеточных структур, в том числе микротрубочек пучков , хромосомы, ядрышки, органелл динамика, и толстые волокна актина 12. Генетически кодируемые флуоресцентные белки и развитие флуоресцентных красителей против органелл резко повлияли замедленную микроскопию 13-15. Хотя не в центре внимания данной статьи, изображения в клеточных сфероидов и на месте (прижизненной микроскопии) с использованием конфокальной и многофотонной микроскопии представляют собой еще один расширение подхода, и есть выдающиеся статьи , которые используют и обсудить эти подходы 16-19.

Реакции клеток на анти-Канкунеэр препараты или натуральные продукты определяются на молекулярном и клеточном уровне. Понимание клеточные ответы и судьбы после лечения часто включает в себя демографические анализы усреднения (например., Иммуноблоттинг, целые меры а) или фиксированные моменты времени с обнаружением иммунофлуоресцентного и проточной цитометрии, которые измеряют отдельные клетки. Неоднородность в единичных ответах клеток на лекарственные средства в популяции, в частности, в опухолях, может объяснить некоторые из изменчивости в ответ наблюдается вдоль клеточных линий и опухолей, которые лечат тем же лекарством при насыщении. Долгосрочные продольные подходы следовать заданной одной ячейки или популяции клеток является менее распространенным , но очень мощный подход , который позволяет непосредственного изучения путей молекулярного ответа, различные фенотипы (например., Гибель клеток или деление клеток), наблюдение от клетки к клетке изменчивость в популяции, и каким образом эти факторы способствуют динамики реагирования населения 20-22. Оптимистично, будучи в состояниинаблюдать и количественно одиночные клеточные ответы поможет улучшить наше понимание того, как препараты работают, почему они иногда терпят неудачу, и как наилучшим образом использовать их.

Методика долгосрочного покадровой микроскопии, продольного отслеживания и анализа ответов наркотиков доступно для многих исследователей и могут быть простыми, используя только проходящем свете для наблюдения фенотип ответы 20,21. Основные компоненты подхода включают в себя: соответствующий препарат клеток, представляющих интерес, автоматизированный микроскоп с климатической камерой, камера интегрирована с компьютером для получения и хранения изображений, а также программное обеспечение для обзора времени покадровой и измерения и анализа клеток и любые флуоресцентные биосенсоры. Мы предоставляем подробный протокол с большим количеством советов для проведения покадровой микроскопии культивируемых клеток, пока несколько дней с использованием светлого и / или Widefield эпифлуоресцентной микроскопии. Этот протокол может быть использован для любой линии клеток, которые можно выращивать в культуреизучить их ответы на анти-терапии рака. Мы приводим примеры данных, полученных и проанализированных с использованием нескольких различных генетически кодируемые флуоресцентные биосенсоры и пример фазово-контрастной микроскопии, кратко рассмотрим различные типы зондов, преимущества и недостатки долгосрочного покадровой и продольного слежения, что может быть узнал такого подхода, который трудно понять из непрямых подходов, а также некоторые варианты, которые мы надеемся, будет представлять интерес и ценность для неопытных исследователей, которые не считаются с использованием подхода, а также для опытных исследователей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Следующий протокол использует параметры , определенные в опытах на рисунках 4 и 6 относительно установок сбора и условий эксперимента. Многие из этих параметров могут быть изменены , чтобы соответствовать другие эксперименты (например, время экспозиции, биннинговые, флуоресцентные каналы и др.). Все процедуры должны придерживаться организационных принципов и правил и утверждаются комитетом по институциональной биобезопасности. Микроскоп производитель веб-сайты содержат отличную информацию для получения изображений живых клеток.

1. Микроскопия и визуализации программного обеспечения

  1. Выполнение изображений живых клеток на самых разнообразных инвертированных микроскопов. Наиболее распространенными микроскопов Widefield эпифлуоресцентной и прядильно-диск конфокальной. При этом использовать автоматизированный и моторизованных Widefield эпифлуоресцентной микроскоп с 200 Вт источник света металлогалогенные лампы.
  2. Получите сценический верхом или микроскоп климатическую камеру. Здесь используется этап-тор климатическую камеру.
  3. Использование коммерческого программного обеспечения для работы с микроскопами утилит для выполнения покадровой микроскопии.
  4. Используйте коммерчески доступное программное обеспечение или ImageJ для анализа изображений. Многие другие инструменты анализа коммерчески доступны, и есть заказные программы , многие из которых были опубликованы 8,18.

2. Визуальное клеточные процессы и фенотипических ответов

  1. Визуализируйте клетки с светлопольному микроскопии. одна Дифференциальный интерференционный контраст и фазовый контраст может быть очень информативным для изучения ответов на ответы на противораковый препарат. Эти процессы могут включать в себя митоза, подвижность клеток и апоптоз.
  2. Визуализируйте клеточные структуры, органеллы и процессы с люминесцентными биосенсоров. Флуоресцентные зонды являются информативными для отслеживания конкретных субклеточных процессов. Они могут включать в себя динамику микротрубочек, митохондриальной и эндоплазматический ретикулум, динамика накопления белков и локализации, а такжемолекулярной сигнализации (например., фосфорилирование, кальций).

3. Приготовление образцов

  1. Рост клеток в культуре клеток сертифицированных блюд в качестве стандарта, увлажненный клеточной культуры инкубатор (например, 37 ° С, 5% СО 2, 80% относительной влажности воздуха).
    1. Grow HT1080 клеток в МОС с EBSS. Дополнение носитель с 10% об / об FBS, 1% об / об пен / стреп, 1% об / об пирувата натрия и 1% об / об несущественных аминокислот.
  2. За два дня до визуализации, пластины 50000 HT1080 Fucci клеток в 3 лунки 12-луночного # 1.5 со стеклянным дном блюдо в заверенной стерильного капотом ламинарного потока. Отрегулировать количество посеянных клеток для достижения ~ 60% сплошности для начала эксперимента. В зависимости от линии и характера эксперимента плотность клеток клеток может быть меньше.
    Примечание: Плотность клеток может иметь большое влияние на рост клеточной линии и на экспериментальных результатов. Граф клеток, чтобы свести к минимуму эксперимент к эксперименту variabilitу из-за плотности.
    1. В зависимости от окружающей среды камеры и необходимых условий для эксперимента, клетки пластины в отдельных блюд также (как правило, 35- или 60-мм), 4 также 35-мм блюда, 6-, 12- или 24-луночный культуральный пластин, или покровное слайды в различных форматах. Используйте стеклянные пластины с дном # 1.5 из стекла, поскольку большинство линз объектива оптимизированы для этой толщины стекла, и обработки изображений с помощью клеточной культуры пластика очень плохое.
      Примечание: Некоторые клеточные линии, не растут и выживают на стекле. В этих случаях, стекло может быть нанесено покрытие , с тем , чтобы улучшить сцепление клеток (например., Поли-лизин или коллаген). Некоторые фирмы выпускают оптический пластик клеточной культуры, то она должна быть определена опытным путем, если это является жизнеспособным вариантом.

4. Экологическая палата Set-вверх

  1. Перед любым экспериментам, экологическую камеру, устроена таким образом , что он работает на ~ 80% влажности и поэтому температура в месте расположения образца составляет 37 ° С, Наиболее культивируемые клетки растут в 5% воздуха атмосферы СО 2 / баланса вследствие буфера бикарбоната натрия в среде. В зависимости от настройки, либо установить экологический контроллер на 5% CO 2 , и она будет смешивать 100% CO 2 с воздухом, или использовать предварительно смешивают, сертифицированное 5% CO 2 / баланс воздуха газа. Следуйте инструкциям изготовителя газового потока ставок.
    Примечание: Некоторые клеточные линии растут в CO 2 -независимый среды и в этом случае они могут поддерживаться без СО 2. Специально разработанные средства массовой визуализации также доступна, что ограничивает добавление autofluorescent соединений. Рост в тезисах средах для желаемого типа клеток должны быть определены эмпирически заранее.
  2. До начала обработки изображений, убедитесь, резервуар для воды заполнен (следуя инструкциям изготовителя) стерильной дистиллированной водой. Включите климатическую камеру до желаемой установки температуры и поместите его в столик микроскопа врезке. Для экономии газа, не начинайте поток в этой точке,
    Примечание: Если есть свободное пространство между сценой-камерой и верхней ступени врезке и / или какого-либо напряжения на соединительных кабелей к камере может ввести артефакты движения в эксперименте.
    1. Положите кусочки парафиновой пленки по краям сцены вставки отверстия перед установкой камеры в нее, чтобы пара в камеру на сцену, и убедитесь, что соединение не тянет на камеру.
  3. Дайте камере для уравновешивания до 37 о С. Поддержание стабильной температуры для предотвращения колебаний температуры во время формирования изображения, которые могут повлиять на физиологии клетки и ввести дрейф. Достижение уравновешивания температуры обычно требуется от 30 минут до 1 часа, в зависимости от окружающей среды.
    1. Вставьте фиктивного блюдо с водой в лунки в камеру при нагревании. Изображений блюдо наполнен водой имитирует образец, помогая обеспечить камеру достаточно утеплены и стабилизировалась. Заполнение камеры с подогретым стерильной водойсокращает время, необходимое для стабилизации температуры и сводит к минимуму снижение температуры при добавлении исследуемого образца.

5. Микроскоп Настройка

  1. Включите микроскоп, соединенный с компьютером, а также любые необходимые периферийные устройства.
    1. В зависимости от источника света, ждать , чтобы включить его до тех пор , пока это необходимо (например., LED).
  2. С объективной башни в нижнем положении, выберите цель 20X 0.7 NA, который будет использоваться.
  3. Поместите образец над целью - это сделает его легче найти клетки, когда образец находится в камере.
  4. Определить параметры изображения в это время, если они известны из предыдущих экспериментов.

6. Транспортировка клеток к микроскопу и в палате

  1. Транспорта клетки должны быть отображены из инкубатора в климатическую камеру. Убедитесь в том, что это будет сделано быстро , чтобы ограничить влияние сравнительно низким содержанием СО 2
  2. Поместите клетки в герметичном контейнере из пенополистирола или изолированный мешок, чтобы избежать больших изменений в окружающей среде.
  • Вставьте образец изображения блюдо в камеру следующие инструкции производителя.
  • После того как клетки были обеспечены в климатическую камеру, уплотнения камеры, чтобы поддерживать стабильную окружающую среду и сразу же включите источник (и) атмосферного газа.
    1. Поскольку некоторые климатические камеры не используют плотно запечатанную крышку, чтобы замедлить испарение, слой стерильного, эмбрион сертифицированное минеральное масло в верхней части ростовой среды. Оберните газ-проникающего парафиновой пленки вокруг периметра края тарелки образца соблюдая осторожность, чтобы не перекрывать зону стекла изображения. могут быть использованы локализованы, вторичные методы увлажнения. Конденсат на крышке образца блюдо может уменьшить perforMance из светлопольному микроскопии.
  • Для того, чтобы свести к минимуму влияние температурного дрейфа в начале в ходе эксперимента, подождите 30 минут до начала времени покадровой. Необходимое время варьируется в зависимости от размера изображения посуды и других факторов. Определить опытным путем.

    • 7. Настройка визуализации

    1. Выберите условия формирования изображения, которые наилучшим образом представляют данные. Примите меры предосторожности, чтобы избежать фототоксичности путем ограничения времени экспозиции, используя более низкую интенсивность света и выбор зондов, которые возбуждаются более длинных длин волн света.
    2. Определим х, у и г-плоскости и требуемую длину волны (ы) для каждой позиции должны быть отображены. Разрешение по времени ограничено числом позиций и длин волн. Для долгосрочного покадровой большинства клеточных процессов, приобретают одно изображение каждые 10 - 20 мин; более высоким временным разрешением (короткие интервалы, например., 1 мин) обеспечивает больше точек данных и , следовательно , более надежное отслеживание клеток, но и приводит к более интегрированнойвоздействие света и большие наборы данных.
      1. Как HT1080 Fucci имеют динамические зеленый и красный флуоресцентные белки (см Представитель Результаты), используйте следующие времена экспозиции: FITC / GFP - 50 мс, Texas Red / TRITC - 40 мс, Светлое - 20 мс. Используйте 2 х 2 бункера.
    3. Включение программного обеспечения контролируемого автофокусировку с использованием параметров по умолчанию в расширенных настройках. Определить диапазон автоматической фокусировки 10 мкм с рекомендуемым размером шага. Не забудьте сделать это перед началом временной промежуток. Автофокус с Светлое изображениями и никогда с флуоресценции для уменьшения фототоксичности и фотообесцвечивания.
      1. С помощью программного обеспечения под контролем системы автофокусировку на любой микроскоп с моторизованным этапе, так и непосредственно сосредоточиться на образце. Тем не менее, они могут ограничить скорость сбора данных эксперимента. Аппаратные средства контролируются непрерывные фокусирующие системы работают хорошо для покадровой микроскопии и повышения скорости, что позволяет более позиций, которые будут отображены или более высокий уровень приобретения. Тем не менее, ониполагаться на обнаружение границы раздела воздух-стекла и может потерять фокус образца с изменением толщины стекла по всей скважине.
    4. Заменить половину средств массовой информации со средами , содержащими требуемую концентрацию лекарственного средства , которая была подогревают до 37 о С. Частичная замена средств массовой информации помогает уменьшить тепловой дрейф. Условия в этом эксперименте транспортный аппарат (DMSO), 1 мкМ selinexor и 10 мкМ PD0332991.
      Примечание: Этот шаг также может быть сделано после запуска приобретения путем приостановки и возобновления эксперимента. Это позволяет для продольного отслеживания реакций до и после наркотиков одиночных клеток. Если стабильность лекарственного средства или метаболизм является проблемой, делая паузу и замена СМИ можно сделать с помощью того же метода. Для тестирования деградации лекарственного средства или обмена веществ, средств массовой информации из обработанных клеток также могут быть размещены на наивных клеток, чтобы испытать действие препарата.
    5. Начало времени покадровой.
    6. Как проходит заданный промежуток времени, убедитесь, что изображаемого поля остаются в фокусе и Chambeг поддерживает влажную 37 о С.
      1. Отрегулируйте фокусировку по мере необходимости приостановки приобретения в течение промежутка времени между моментами времени.
    7. При необходимости добавить воду в камеру во время длительных экспериментов. Избегайте охлаждения камеры путем добавления предварительно подогретый, стерильной дистиллированной воды при температуре 37 о С.

    8. Завершение ЗАМЕДЛЕННАЯ

    1. Когда эксперимент продолжается до завершения, остановить приобретение, если он не был установлен автоматически остановится.
    2. Убедитесь, что заданный промежуток времени был сохранен должным образом на жесткий диск, хотя большинство пакетов программного обеспечения автоматического сохранения во время приобретения, если не закончена должным образом данные могут быть потеряны.
    3. Снимите камеру с микроскопом и распоряжаться клетки в биологически опасные отходы следующим утвержденными процедурами институционального обеспечения биобезопасности.

    9. Продольный Отслеживание и анализ Интерв данных

    1. Выберите методологию для анализа, которыйсоответствующие для биологических процессов, представляющих интерес. Многие плагины для ImageJ, программ с использованием MatLab и пользовательские платформы были произведены для конкретных применений. Следующая методика охватывает отслеживание ядер и анализа флуоресцентных зондов ядерных , как показано на фигурах 4 и 5.
    2. Откройте .tif стеки изображения для используемых каналов в ImageJ. В качестве альтернативы, собственные открытые файлы из программы приобретения непосредственно в ImageJ с помощью плагина Bioformats.
    3. Нарисуйте область интереса (ROI) в ядре одной клетки, используя изображение или светлое канал ядерной метки (если используется) и добавить его к менеджеру ROI. Примечание: Если изображаемой клетки имеют ядерную метку (например, гистон Н2В-EGFP.), А затем автоматическое отслеживание клеток может быть использовано для создания областей интереса (трансформирования) , представляющие отдельные ядра с течением времени.
    4. Перейдем к следующему моменту времени и положение ROI в пределах того же nucleus. Добавьте ROI менеджеру ROI.
    5. Продолжать отслеживать и сделать трансформирования для отдельной клетки до тех пор , пока не будет клеточное событие (митоз, апоптоз и др.) Или клетка не может быть больше не отслеживаются (то есть., Перемещается из кадра или завершении эксперимента).
    6. Когда трансформирования созданы для клеток в течение времени они находятся в области, совместимся их на люминесцентные каналы, представляющие интерес. Измерьте среднюю интенсивность флуоресценции в каждом канале для каждой временной точки. Сохранение списка ROI для последующего использования.
      1. Различные измерения могут быть сделаны в пределах ROI для применения в различных экспериментах. Нажмите Анализ → Set Измерения ... чтобы вызвать меню , чтобы выбрать аналитический метод (например., Средняя интенсивность в пределах ROI, интегральной интенсивности и др.).
    7. Примечание судьбы клеток для отдельных клеток (например., Апоптоз, деление, выживание) в то время как отслеживание. Это позволяет для создания кривых выживаемости и furtheАнализ г населения.
    8. При средней интенсивности для обоих каналов, создать график рассеяния для отображения динамики клеточного цикла в ответ на терапевтических средств (Фиг.5В, С).
      Примечание: Графики могут быть созданы для отдельных клеток с течением времени или усредненное по популяции отслеживаемых клеток. Количественная визуализация может иметь решающее значение для установления сложных ответов и отношения клеток в ответ на терапии рака. Долгосрочный покадровой микроскопии, продольное отслеживание и анализ данных представляет собой многоступенчатый процесс, с большим количеством опций для типа микроскопии и анализа инструментов, и следует в общих чертах представленную на рисунке 1.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Долгосрочный покадровой микроскопии и прямой продольной слежения позволяет для изучения многих эффектов противораковых во время реакции препарата. После общих чертах на рисунке 1, множественные примеры клеток , экспрессирующих показаны валидацию флуоресцентные репортерам , что лечение с противораковыми препаратами, отслеживаемых, и анализировали с использованием различных подходов.

    Одна фаза контрастной микроскопии является очень информативным и робастно отчеты о интерфазных по сравнению с митоза, продолжительность митотического и арест, нарушение клеточного деления и гибели клеток 21,23,24. Лекарственные средства , которые нацелены на деление клеток, которые часто называют антимитотические наркотики, продолжают развиваться. Рисунок 2 и Фильмы 1 и 2 показаны примеры пары соответственных рака полученных линий MCF7 клеток молочной железы , которые отличаются только в их статусе p53, обрабатывают 500 нмоль типа лекарства против рака, что целии ингибирует митотическую белок двигателя, Kinesin-5 (KSP1, Kif11, EG5), что приводит к затяжным митоза 20. Дикие MCF7 клетки типа (рис 2A) являются парадигмой для изучения р53-зависимого клеточного цикла 25-27. Клетки дикого типа вступают в митоз, остаются в течение нескольких часов, в конце концов , уйти и в значительной степени задерживать с индукцией р53 25. Когда р53 удаляется стабильной р53 нокдауна (MCF7 ш) p53, вместо того , чтобы арестовать после того, как они покидают митоза, клетки проходят через повторяющиеся циклы (рис 2В). Клетки отслеживаются вручную и митотический индекс и процент клеток , которые поступают во вторую митоза были забиты (рис 2С, D). Заметим, что р53 клетка ш отслеживаются делит, когда он входит во второй раунд митоза, а не арестовывать и оставив митоза без разделения. Хотя здесь не показана продолжительность митоза событий, время между последовательными митозов, процентов клеточных делений, и связанных с ними событий гибели клеток также может быть sПорошковая 20,21.

    Таксаны, например, паклитаксел и доцетаксел, являются общими для химиотерапии многих видов рака, в том числе те, которые трудно поддаются лечению, как поджелудочной железы и передовых груди. Паклитаксел связывается с динамическим плюс-концу микротрубочек и стабилизирует их, предотвращая их нормальную функцию. Паклитаксел отметил дозозависимое эффекты, и даже при низких концентрациях может возмутить нормальной прогрессии митоза и сегрегации хромосом 16. Верная сегрегация хромосом имеет важное значение для нормальной пролиферации клеток и при возникновении нештатных может привести к анеуплоидии , что может вызвать остановку клеточного цикла, но и выступать в качестве движущей силы прогрессии рака. Рисунок 3 и Movie 3 показывают , рак шейки матки клеток , полученных из HeLa , стабильно экспрессирующие хроматина маркер гистона-2b, слитый с mCherry и бета-тубулина, слитый с EGFP (не показан) в нормальной ростовой среде обрабатывали 1 нМ паклитаксела. В этомНапример, вступление в прогрессии и через митоз можно следовать. Время митоза кажется нормальным в этой клетке, однако выравнивание хромосом и их сегрегации нет, в результате чего ядерных выпуклостей и микроядер, которые являются структуры, указывающие на плохое сегрегации хромосом. Микроядра склонны к повреждению ДНК и хромотрипсис, который является крупномасштабной фрагментации хромосом или хроматина - это имеет важное значение в эволюции опухоли 28,29. Хотя здесь не показано, происхождение микроядер с относительно других митотических структур и судьба этих клеток может быть непосредственно отслеживается с помощью долгосрочного времени покадровой. Кроме того, хроматина маркер выражено повреждение ДНК, репортер может быть использован для установления взаимосвязи между сегрегации хромосом, микроядер и повреждения ДНК.

    Флуоресцентные репортеры позволяют ПЕРЕЧИСЛИМЫЕ клеточные процессы, которые необходимо отслеживать и новые журналисты постоянно совершенствуются. Для эксдостаточно, клеточный цикл состоит из этапов, которые представляют особый интерес в развитии целевых противораковые терапии. Рисунок 4 и Movie 4 показывает Фибросаркома происхождения клеточной линии (HT1080) , которые стабильно совместно выражает два репортера называют, флуоресцентные убиквитин показатели клеточного цикла (Fucci) 30. В системе здесь, часть полипептида Cdt1 слит с mKO2 (мономерный Kusabira оранжевого 2) и увеличивается в G1-фазе и разлагается в начале S-фазы, а часть geminin слит с Mag (мономерный Азами зеленый) и увеличивается в середине S-фазе и разлагается при анафазе. Эта клетка находится в нормальной среде для роста и прогрессирует через клеточный цикл в 15 ч. На фиг.5А, В и кино 5 показывают те же самые клетки в нормальной среде , обрабатывали 10 мкМ PD0332991, ингибитор Cdk4 / 6. Клетки прогрессировать через G2-фазы и разделить нормально, и сильно арестовывать в последующем G1-фазе, что указывает на потенциал для эффектаив цитостатические эффекты в растущих опухолей. Рисунок 5C, D и Movie 6 показывают одни и те же клетки в нормальной среде , обработанной малой молекулы под названием selinexor (КПТ-330), является мощным ингибитором экспорта белков ядерной, экспортином-1 (XPO1, также известный как Crm1 ). Эти соединения называются селективные ингибиторы ядерного экспорта (синусоидальный) и их противораковые эффекты в настоящее время находятся под следствием 31,32. SINE обработка приводит к сильным фенотипов клеточного цикла и гибели клеток 33,34. В этом примере показана ячейка, которая проходит через G1-фазы с нормальной кинетикой (примерно 6 ч), но испытывает задержку в прогрессии S-фазы, как показано на период с красного и зеленого сигнала (примерно 3 ч в контроле, а в 10 в SINE обработанной ). Эта клетка умирает в конце S- или G2-фазы после 21 ч 30 мин; нормальный клеточный цикл составляет приблизительно 15 ч. Эффекты selinexor изучаются для различных крови и солидных опухолей 35.

    Рисунок HT1080 клетки 6 и 7 Movie показывают , что стабильно экспрессируют двухцепочечной ДНК повреждение репортер, mCherry-BP1-2 36 в нормальном росте среда обрабатывали 10 мкМ этопозид (VP-16), топоизомеразы II яд. Этот репортер состоит из части ДНК двухцепочечной белка сайт перерыв, 53BP1, который слит с mCherry. Ядро этой клетки отслеживалась USIнг плагин Анализировать частиц в ImageJ и интегрированный сигнал mCherry-BP1-2 измеряли в каждом кадре после пороговой из значения, исключенные растворимый ядерный зонд. Повреждение ДНК минимальна в течение первых 10 ч, а затем неуклонно возрастает. Ингибиторы топоизомеразы II , как известно, в частности , влияют на S- и G2-фазы, когда фермент наиболее активен 37,38. Кинетика наблюдаемые в данном примере может указывать на клеточный цикл, связанный повреждение; сочетая mCherry-BP1-2 с журналистами Fucci могли продемонстрировать сроки повреждения, которые затем могут быть связаны с клеточной судьбы.

    Рисунок 1
    Рисунок 1. Обзор использования долгосрочных временных замедленную микроскопию и Продольная Tracking для изучения противораковым ответ наркотиков. Клетки в соответствующих блюдах живых клеток , меченных по желанию изображаются, клетки или области интереса отслеживается, и данные проанализирован, Существует много методов для отслеживания и количественной оценки клеток, некоторые из них указаны здесь. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    фигура 2
    Рисунок 2. фазового контраста Покадровый Микроскопия показывает p53 зависимость после анти-митотического наркотиками лечения. Дикого типа (А) и p53-нокдаун (В) MCF7 клетки обрабатывали 500 нМ ингибитора Kinesin-5 и изображаемого через каждые 10 мин в течение 96 ч с использованием фазово-контрастной микроскопии с 20X PH2 0,70 линзы НС. Отдельные клетки отслеживались вручную, а процент митоз и если клетка переходит к другому митоз снова во время покадровой были забиты. Стрелки указывают на ячейку, которая отслеживается. Ячейка ш р53 (В) делит при входе второго митоза. (C) Обе клеточные линии шоW длительное задержание митотический как обозначено высокой пиковой процент митозов (первый синие и красные стрелки). (C, D) Около 90% клеток без р53 (ш р53, п = 87) показывают , продолжал прогрессия (красные стрелки) по сравнению с 20% от дикого типа (п = 130). Столбики ошибок указывают стандартное отклонение. Бар = 20 мкм. Фильмы 1 и 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 3
    Рисунок 3. хроматина Маркер гистонов 2b обнаружены свидетельства расхождении хромосом Аномалии после низких доз паклитаксела Лечение. Паклитаксел представляет собой микротрубочки целевой препарат , который приводит к сложным, концентрационных зависящих от дефектов клеточного роста и деления. Организация хроматина информирует о различных состояниях клеток, в том числе на стадиимитоза и гибели клеток. HeLa клетки, стабильно экспрессирующие как H2B-mCherry и бета-тубулина-EGFP обрабатывали 1 нМ паклитаксела. Эта ячейка изначально в интерфазе, прогрессирует через стадии митоза и водоразделов. В то время как время, в течение митоза кажется нормальным, есть свидетельства прикрепления хромосом и их сегрегации ошибок, которые разрешены (стрелки). Судьба этих клеток может быть определена непосредственно продольным трекинга. Фазового контраста (не показан) и флуоресцентные изображения были получены на 1 кадр в 10 мин с 20X Ph2 0,70 линзы НС. Bar = 10 мкм. Фильм 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    Рисунок 4. флуоресцентных маркеров клеточного цикла Разрешить для прямого контроля клеточного цикла прогрессии.(А) Поле HT1080 клеток фибросаркомы живых, выражающих систему Fucci изображенную с помощью фазового контраста и флуоресценции. (B, C) ​​Митотический ячейка в пунктирным прямоугольником в панели А следует. Как правило, по мере прохождения клеточного цикла приблизительно 15 часов. После митоза, клетки кратко тусклым, а затем становятся красными, как они прогрессируют в и через G1-фазы. Когда клетки вступают в S-фазу, красный Cdt1 зонд деградирует и зеленый увеличивается geminin зонд. Краткое приблизительно 3 ч период, когда оба зонда присутствуют, указывает на ранней S-фазе. Поскольку клетки прогрессировать через S- и G2-фазы и в следующем митоза они остаются зелеными. Зеленый зонд разлагается при анафазе клеточного деления. Фазового контраста и флуоресцентные изображения были получены на 1 кадр в 10 мин с 20X PH2 0,70 линзы НС. Bar = 10 мкм. Фильм 4. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIРЭБ большую версию этой фигуры.

    Рисунок 5
    Рисунок 5. клеточного цикла Конкретные эффекты и связанное с ними гибель клеток. Та же клеточная линия , как показано на рисунке 4 , но обрабатывают двумя различными молекулами , которые представляют собой разные цели противораковые. Времена после лечения указаны. (A, B) После лечения позднего / G2-фазе клеточного S с 10 мкМ PD0332991 ингибитора Cdk4 / 6, то клетка развивается нормально митоза (М) и водоразделов. Одна из дочерних клеток отслеживается путем измерения красного и зеленого интенсивности флуоресцентных в интересующей нас области в ядре. Ячейка остается арестован в G1-фазе в течение приблизительно 40 часов. (С, D) После лечения поздней G2-фазы клеточного с 1 мкМ selinexor, это клетка прогрессирует обычно в митоз (М) и разделит. Одна из дочерних клеток отслеживается и он входит в G1-фазу, проходит череззатяжного рано S-фазы (красный и зеленый сигнал), переходит исключительно зеленый и умирает после 21 ч 30 мин. Данные свидетельствуют о том прогрессии S-фазы зависит от selinexor лечения. Фазового контраста и флуоресцентные изображения были получены на 1 кадр в 10 мин с 20X PH2 0,70 линзы НС. Бар = 10 мкм. Фильмы 5 и 6. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 6
    Рисунок 6. Динамика повреждения ДНК после лечения наркозависимости. Многие методы лечения противоопухолевыми привести к повреждению ДНК , которые могут повлиять на глубоко клеточный ответ и успех лечения. НТ1080 клетки, стабильно экспрессирующие как двухцепочечную повреждение ДНК-маркер mCherry-BP1-2 и H2b-EGFP (не показан), обрабатывали 10 мкМ этопозид лекарственного топоизомеразы II и ДНК-DAmage отслеживалась. (A) Число и интенсивность очагов увеличения после этопозид. Существует изначально отставание, что указывает на возможное влияние клеточного цикла в соответствии с известным механизмом этопозид. К 22 ч 50 мин эта ячейка накопил высокие уровни повреждений. В то время как здесь не показано, судьба этой клетки может быть определена путем прямого слежения. (B) ROI , соответствующий ядру , полученного посредством сигнала H2b-EGFP отслеживалась с помощью отслеживания частиц в ImageJ и интегрированный сигнал BP1-2 mCherry количественно и наносили на график в течение долгого времени. Отставание в сигнале, до примерно 10 ч, отмечается, затем стойкое повышение. Флуоресцентные изображения были получены на 1 кадр в 10 мин с 40X PH2 0.75 линзы НС. Bar = 10 мкм. Фильм 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.


    Фильм 1. фазового контраста Покадровый Микроскопия дикого типа MCF7 клеток после лечения. Клеток дикого типа MCF7 анти-митотический наркотиков обрабатывали 500 нМ ингибитора Kinesin-5 и отображены через каждые 10 мин в течение 96 ч с использованием фазово-контрастной микроскопии с 20Х PH2 0,70 NA объектива. Продолжительное митоза и выход из митоза можно наблюдать, как описано на рисунке 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

    Moive 2
    Фильм 2. фазового контраста Покадровый Микроскопия р53-нокдаун MCF7 клеток после клеток Лечение анти-митотический наркотиками. MCF7 , стабильно экспрессирующих небольшую шпильку РНК ориентации р53 деградации обрабатывали 500 нМ ингибитора Kinesin-5 и изображается каждые 10 мин в течение 96 ч с использованием фазово-контрастной микроскопии с 20X PH2 0,70 линзы НС. Продолжительное митоза и несколько раундов митоза можно наблюдать, как описано на рисунке 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

    Moive 3
    Фильм 3. Люминесцентные Покадровый Микроскопия клеток HeLa после того, как с низкой дозой паклитаксела Лечение. HeLa клеток , стабильно экспрессирующих H2B-mCherry и бета-тубулина-EGFP обрабатывали 1 нМ паклитаксела. Хромосома вложения и проблемы сегрегации можно наблюдать, как описано на рисунке 3. Изображения были получены через каждые 10 мин с 20X PH2 0,70 линзы NA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

    ove_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Moive 4
    Фильм 4. флуоресцентных маркеров клеточного цикла Разрешить для прямого контроля клеточного цикла Progression. НТ1080 клетки , экспрессирующие системы Fucci были продольно отслеживаться во время покадровой микроскопии. Ячейка становится тусклым после выхода из митоза, а затем становится красным, как клетка проходит через G1-фазы. По мере того как клетка вступает S-фазу, он становится желтым, как зеленый увеличивается geminin зонд и красный Cdt1 зонд деградирует. Клетка остается зеленым, как он прогрессирует через S- и G2-фазы. Зеленый деградирует, так как клетки входит анафазу. Количественное этой ячейки показан на рисунке 4. Изображения были получены через каждые 10 мин с 20X PH2 0,70 линзы NA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

    Moive 5 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    Фильм 5. HT1080 клеток , экспрессирующих флуоресцентные маркеры для клеточного цикла после обработки с G1-фазы Ингибитор. НТ1080 клетки , экспрессирующие системы Fucci обрабатывали 10 мкМ PD0332991, ингибитор Cdk4 / 6. Отслеживаемая клеток прогрессирует нормально митоза и водоразделов. Одна дочь отслеживается, и остается красным в G1 для продолжительности фильма. Количественное показана на рисунке 5. Изображения были получены через каждые 10 мин с 20X PH2 0,70 линзы NA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

    Moive 6
    Фильм 6. HT1080 клетки , экспрессирующие флуоресцентных маркеров клеточного цикла после обработки Exportin-1 ингибатора, Selinexor. HT1080 клеток , экспрессирующих систему Fucci были лечитьред с 1 мкМ selinexor. Это в конце G2-фазе клеточного отслеживалась путем митоза. Затем дочерняя клетка проходит через G1-фазы (красный) и входит в S-фазу (желтый). Клетка медленно прогрессирует через S-фазы, пока она не войдет в конце-S / G2-фазы и умирает после 21 ч 30 мин обработки. Количественное показана на рисунке 5. Изображения были получены через каждые 10 мин с 20X PH2 0,70 линзы NA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

    Moive 7
    Фильм 7. ДНК Динамика повреждения после обработки с помощью НТ1080 клетки топоизомеразы II. Ингибитор стабильно экспрессирующих двухцепочечной повреждения ДНК маркер mCherry-BP1-2 и H2B-EGFP обрабатывали 10 мкМ этопозид, ингибитор топоизомеразы II. MCherry-BP1-2 отображается в фильме. В качестве лечения продолжаютs, сигнал mCherry-BP1-2 возрастает, что указывает на увеличение двухцепочечной повреждение ДНК. Количественное показан на рисунке 6. Изображения были получены через каждые 10 мин с 40X PH2 0.75 линзы NA. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы загрузить этот файл.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Преимущества Интерв микроскопией и Продольный слежения

    Микроскоп является идеальным инструментом для продольных исследований реакции лекарственного средства, поскольку это позволяет исследователям отслеживать отдельные клетки и их судьбы, а также все население. Изменчивость в ответ лекарства в популяции клеток является серьезной проблемой для противоракового терапевтического дизайна. Продольная отслеживание отдельных клеток позволяет исследователям наблюдать эту изменчивость и начинают понимать основные механизмы и последствия, как она относится к клеточной популяции. Используя различные флуоресцентных зондов обеспечивает множество способов наблюдать и понимать как общие, так и редкие фенотипы реагирования. Сроки и вклад различных судеб клеток в ответ населения, отношения между конкретными фенотипами и предназначений, а также различия в ответ клеточных линий или состояния после лечения являются примерами того, что можно научиться, могут быть изучены многие процессы, связанных с раком. Некоторые , которые не выделяются в этой статье , включают гибель клеток с апоптоза, аутофагии и некроза репортеров 39-42, инвазию клеток 43,44 и динамику р53 , которые определяют судьбы клеток решения 27. Кроме того, этот подход не ограничивается исследований, в противораковых терапевтических исследований. Те же самые принципы могут быть использованы для изучения многих других биологических процессов , включая митоз 45 динамики цитоскелета 46,47 и внутриклеточной сигнализации 48.

    Покадровый флуоресцентной микроскопии может также обеспечить локализацию и интенсивность данных белков и молекул, представляющих интерес. Мало того, что изменения в уровне белка, важного для ответа наркотиков, но правильное (или неправильное) локализация белков внутри клетки имеет решающее значение для понимания ответа. Покадровый микроскопия позволяет получать данные о том, где белки локализованы (например., Ядро, цитозоль, специфические органеллы,и др.) после того, как медикаментозное лечение и как локализация и общие уровни изменяются с течением времени в одной клетки и популяционном уровне.

    Проблемы и ограничения

    Несмотря на сильные покадровой микроскопии и продольного анализа отдельных клеток, существуют ограничения. Флуоресцентные репортеры ограничены их стабильности и специфичности. При проектировании флуоресцентных слитых белков, важно, чтобы выбрать зонд, который фотографического стабильным и светлый, но также необходимо учитывать эффекты флуоресцентной метки привязываясь к интересующему белку относительно его нормальной функции и способности правильно локализовать , Эти вопросы обсуждались подробно в другом месте , и есть много доступных флуоресцентных меченных белков , которые были опубликованы 15,49,50. Другие флуоресцентные метки или метки могут быть добавлены к клеткам, и необходимо соблюдать осторожность, чтобы гарантировать, что они не являются токсичными. По нашему опыту, эти рробы, например митохондриальных этикеток (мембранный потенциал) или клеточных проницаемой красителей ДНК, как правило, отбеливают проще и будет разбавлен-из-за пролиферации клеток.

    Кроме того, существует много технических проблем, с увеличивающейся и наблюдения клеток на микроскопе. Нестабильность в отношении температуры, влажности, атмосферы и света будет иметь большое влияние на клетки, что приводит к потере данных или даже всего эксперимента. Проблемы стабильности в отношении захвата изображения можно увидеть в кино 1 и 2. Этот эффект можно свести к минимуму за счет использования парафиновой пленки (см 4.2). Существуют также алгоритмы стабилизации изображения, доступные для обработки после приобретения, например, с использованием ImageJ (NIH). Аспект долгосрочного покадровой, что часто забывают, является управление данными и размер файла. Даже когда биннинг данные, один эксперимент в заданный промежуток времени часто превышает 30 гигабайт. Высокая производительность, высокая скорость, надежность хранения данных и передачи сильныLY рекомендуется. В зависимости от флуоресцентного биосенсора (ов) изображаемого, часто нет необходимости приобретать разрешение изображений, например ядерной или цитоплазматической датчиков. Мы рекомендуем, когда это возможно, принять меры, чтобы сохранить файл малые размеры, в результате чего проще работать с данными, менее требовательных вычислительных и улучшение работы потока.

    Фототоксичности является серьезной проблемой при выполнении долгосрочного покадровой микроскопии. Высокая интенсивность света и длительная экспозиция может привести к фотообесцвечивания флуоресцентных зондов, клеточного стресса и гибели клеток. Эти эффекты могут иметь большое влияние на данные и привести к искажению эксперимента. бининг камеры и усиление могут быть использованы для уменьшения времени экспозиции. фильтры нейтральной плотности в световом пути уменьшить интенсивность света на образце. Длина волны света, используемого для изображения также влияет на клетки. Более короткие длины волн (УФ, ближнем УФ) являются более разрушительными для клеток и привести к фото-отбелки на более быстрыми темпами, чемболее длинные волны (например., красный, далеко красный). Выбор цели может также повлиять на условия формирования изображения. Более высокие числовая апертура (NA) линзы будут получать изображения с более высоким разрешением, но более высокое увеличение позволяет меньше света, который передается от образца, что приводит к более высоким временем экспозиции или более интенсивный свет. Цель должна быть выбрана с помощью соответствующего НС и увеличения, который разрешит ваш объект интереса без передискретизации. Во многих случаях самая высокая цель не может быть наиболее подходящим выбором. С помощью ядерных зондов (рис 4, 5), цель малом увеличении позволяет большее поле для захвата, эффективно увеличивая размер выборки, без ущерба для разрешения нужного объекта. Долгосрочный заданный промежуток времени в трех измерениях следует проводить осторожно из-за комплексного воздействия света. Используя вращающийся диск конфокальной микроскопии, чувствительность камеры (например., EM-CCD), усиление камеры и быстрый пьезоэлектрический двигатель для серии Z является suggested для уменьшения воздействия света. Быстрое получение Z-серии также имеет важное значение для минимизации артефактов движения из-за движения и динамики клеток, которые происходят в период приобретения. Эмпирический анализ необработанных клеток с использованием различных параметров может быть полезным при определении влияния флуоресцентного света на любой данной линии или репортера клеток. Кроме того, необработанный контроль должен быть включен в каждый эксперимент, чтобы определить, цитотоксическое действие экспериментальных установок.

    Вариации техники

    Долгосрочный заданный промежуток времени является надежным и очень гибким. Использование совместного культивирования методы, различные клеточные линии или те же клеточные линии, экспрессирующие различные репортерам могут быть использованы. Один выдающийся пример этого визуализации фагоцитоза клеток с клетками-мишенями, которые умирают в ответ на лекарства против рака. Другим примером может служить для изучения влияния реагирования клеток на соседние клетки наивные наркотиков. В сочетании с фото-ACTIVAteable, фото-кабриолет, а также фото-переключаемые флуоресцентные белки и сконструированные белки , которые могут быть активированы с помощью света , чтобы вызвать определенные эффекты (например., KillerRed), есть много возможностей. Более сложные подходы могут быть использованы , которые используют различные специализированные типы микроскопии , такие как флуоресцентный перераспределения после фотообесцвечивания Форстер резонансного переноса энергии (FRET) и сверхвысокого разрешения (например., Стохастический оптическая реконструкция микроскопии (STORM), структурного освещения микроскопии (SIM), или стимулироваться истощение выбросов (STED)), и многие другие, и есть преимущества и недостатки каждого подхода.

    Долгосрочный (например., Недели, месяцы) ответы и восстановление клеток после удаления лекарственного средства является центральным для понимания действия лекарства против рака. Рифленые со стеклянным дном блюда являются ценным инструментом для мониторинга конкретных клеток или регионов в пределах популяции / региона неоднократно. Например, с насечкой блюдо, первоначальный докторответ UG могут быть отображены с помощью покадровой, препарат может быть удалена, а конкретные области, в сетке могут быть отображены с течением времени или подвергнуты дополнительному покадровой в нужное время. Со стеклянным дном на посуде могут быть удалены либо резки с помощью инструмента надреза, или с использованием коммерческого реагента, а клетки на стекле могут быть окрашены для других маркеров, представляющих интерес, например, увядания связанного β-galactocidase активностью, и по сравнению с время покадровой понять историю того, как клетки достигают этого состояния. Если популяция клеток достаточно велика, она может быть также подвергнут иммуноблоттинга или проточной цитометрии.

    Толстые образцы традиционно трудно изображения, например сфероидов в различных гелевых материалов и матриц. Новые подходы , включая флуоресцентный конфокальной или многофотонной микроскопии 16,18,19,51 может быть использован для расширения подхода к месте понимания того , как клетки реагируют на противораковые терапии в.исследования как таковые и все большее число ученых от времени с помощью покадровой для изучения противораковый ответ снадобья 24,52-54 ясно демонстрируют , что мы движемся в направлении развития понимания отдельных фармакодинамики клеток , который поможет улучшить нашу способность использовать препараты против рака более эффективно и, возможно предсказать противораковый ответ наркотиков.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
    2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
    3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
    4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
    5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
    6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
    7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
    8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
    9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
    10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
    11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
    12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
    13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
    14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
    15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
    16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
    17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
    18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
    19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
    20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
    21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
    22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
    23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
    24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
    25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
    26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
    27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
    28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
    29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
    30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
    32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
    33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
    34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
    35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
    36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
    37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
    38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
    39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
    40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
    41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
    42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
    43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
    44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
    45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
    46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
    47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
    48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
    49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
    50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
    51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
    52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
    53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
    54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

    Tags

    Медицина выпуск 111 люминесцентной микроскопии визуализации живых клеток замедленной биологии рака клеточная биология
    Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Burke, R. T., Orth, J. D. Through… More

    Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter