Abstract
De respons van de individuele cellen op anti-kankergeneesmiddelen belangrijke stap in het bepalen van de populatie respons, en daarom is een belangrijke factor in het algemene resultaat. Immunoblotting, stroomcytometrie en vaste celexperimenten worden vaak gebruikt om te bestuderen hoe cellen reageren op anti-kanker drugs. Deze werkwijzen zijn belangrijk, maar ze hebben een aantal tekortkomingen. Variabiliteit in drug reacties tussen kanker en normale cellen, en tussen cellen van verschillende oorsprong van kanker, en van voorbijgaande aard en zeldzame reacties zijn moeilijk te begrijpen met behulp van de bevolking gemiddelde assays en zonder de mogelijkheid om rechtstreeks te volgen en in lengterichting te analyseren. De microscoop is bijzonder goed geschikt voor het levende cellen. De vooruitgang in de technologie stelt ons in staat om routinematig afbeelding cellen op een resolutie die niet alleen cell tracking, maar ook de waarneming van een verscheidenheid van cellulaire reacties mogelijk maakt. We beschrijven een aanpak in detail die het mogelijk maakt voor de continue time-lapse beeldvorming vancellen tijdens de respons op geneesmiddelen voor wezen zo lang als gewenst, gewoonlijk tot 96 uur. Varianten van de benadering kunnen cellen worden gecontroleerd weken. Met de inzet van genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren talrijke processen, paden en reacties kunnen worden gevolgd. We tonen voorbeelden die volgen en kwantificeren van celgroei en voortgang van de celcyclus, chromosoom dynamiek, DNA schade en celdood omvatten. We bespreken ook variaties van de techniek en de flexibiliteit, en markeer een aantal gemeenschappelijke valkuilen.
Introduction
Levende cellen microscopie en longitudinale volgen van enkele cellen is geen nieuwe techniek. Van de vroegste microscopen, liefhebbers en wetenschappers hebben waargenomen en studeerde enkele cellen en organismen, hun gedrag en de ontwikkeling van 1-3. Een beroemd voorbeeld van de late David Rogers aan de Vanderbilt University in de jaren 1950 toont een menselijke neutrofielen in een bloed uitstrijkje achter een Staphylococcus aureus bacterie en uiteindelijk het proces van fagocytose 4. Deze levende cellen film is een uitstekend voorbeeld van hoe meerdere processen kunnen worden waargenomen en gecorreleerd in een enkel experiment: detectie van een chemische gradiënt, mechanica en snelheid van celmotiliteit, cel vormen dynamiek, hechting en fagocytose van een pathogeen.
De komst van volledig geautomatiseerde microscopen en zeer gevoelige digitale camera's heeft geleid tot een toename van het aantal onderzoekers met behulp van microscopie op fundamentele vragen in de celbiologie, variërend f vragenrom hoe cellen verplaatsen 5,6 en verdeel 7,8 tot dynamiek en membraantransport 9-11 organel. Niet-fluorescerende, helderveld microscopie, met inbegrip van fase-contrast (PC), die de Nobelprijs voor Frits Zernike in 1953 oogstte, en differentieel interferentie contrast (DIC) zorgen voor de waarneming van cellen en kernen, maar ook sub-cellulaire structuren waaronder microtubule bundels , chromosomen, nucleoli, organel dynamiek, en dikke actine vezels 12. Genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten en de ontwikkeling van fluorescerende kleurstoffen tegen organellen dramatisch beïnvloed time-lapse microscopie 13-15. Hoewel niet de focus van dit artikel, beeldvorming in cel sferoïden en in situ (intravitale microscopie) met behulp van confocale microscopie en multi vormen een andere uitbreiding van de aanpak, en er zijn uitstekende artikelen die te gebruiken en te bespreken deze benaderingen 16-19.
De reacties van cellen op anti-Cancer drugs of natuurlijke producten worden bepaald op de moleculaire en cellulaire schaal. Inzicht in cel reacties en lot na behandeling gaat vaak gepaard met de bevolking gemiddeld assays (bijv., Immunoblotting, geheel goed maatregelen), of vaste tijdstippen met immunofluorescentie detectie en flowcytometrie, die enkele cellen te meten. Heterogeniteit in één cel reacties op geneesmiddelen binnen een populatie, in het bijzonder bij tumoren, kan een deel van de variabiliteit verklaren respons gezien in cellijnen en tumoren die worden behandeld met hetzelfde geneesmiddel bij verzadiging. Langdurige longitudinale benaderingen van een bepaalde cel of een populatie van cellen te volgen is een minder voorkomende maar zeer krachtige benadering die het mogelijk maakt de directe studie van moleculaire respons pathways, verschillende fenotypen (bv., Celdood of celdeling), waarneming van cel-tot-cel variabiliteit binnen een populatie, en hoe deze factoren bijdragen aan populatie respons dynamiek 20-22. Optimistisch, in staatom te observeren en te kwantificeren eencellige antwoorden zullen helpen bij het verbeteren ons begrip van hoe geneesmiddelen werken, waarom ze soms niet, en hoe optimaal gebruik te maken hen.
De techniek van lange-termijn time-lapse microscopie longitudinale volgen en analyseren geneesmiddel reacties beschikbaar voor vele onderzoekers en kan eenvoudig zijn met alleen uitgezonden licht fenotype reacties 20,21 observeren. De belangrijkste onderdelen van de aanpak zijn: geschikte voorbehandeling van de cellen van belang, een geautomatiseerde microscoop met omgevingskamer, een camera geïntegreerd met een computer te verwerven en opslaan van de beelden, en software om de time-lapse beoordelen meten en analyseren van de cellen en tl biosensoren. Wij bieden een gedetailleerd protocol met veel tips voor het uitvoeren van time-lapse microscopie van gekweekte cellen voor zo lang als enkele dagen met behulp van helderveld en / of groothoek epifluorescerende microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt voor elke cellijn kan worden gekweekt in kweekhun reacties op anti-kankertherapieën bestuderen. Wij bieden voorbeelden van data verkregen en geanalyseerd met behulp van meerdere verschillende genetisch gecodeerd fluorescerende biosensoren en een voorbeeld van fase-contrast microscopie, kort ingaan op de verschillende soorten probes, de voor- en nadelen van de lange-termijn time-lapse en longitudinale tracking, wat kan worden geleerd van deze aanpak is dat moeilijk te begrijpen van niet-directe aanpak, en een aantal variaties die we hopen van belang en waarde voor onervaren onderzoekers die niet hebben overwogen met behulp van de aanpak zal zijn, en ervaren onderzoekers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het volgende protocol gebruikt parameters bepaald door de experimenten in Figuren 4 en 6 betreffende verwerving instellingen en de testomstandigheden. Veel van deze parameters kunnen worden aangepast voor andere experimenten passen (bijv belichtingstijden, binning, fluorescerende kanalen, enz.). Alle procedures moeten voldoen aan institutionele richtlijnen en regelgeving en door de institutionele bioveiligheid commissie worden goedgekeurd. Microscope fabrikant websites bevatten uitstekende informatie voor live-cell imaging.
1. microscopen en Imaging Software
- Live cell imaging op een breed scala van omgekeerde microscopen. De meest voorkomende microscopen zijn groothoek epifluorescentie en spinning-disk confocale. Hier, maken gebruik van een geautomatiseerde en gemotoriseerd groothoek epifluorescentiemicroscoop met 200 watt HQI lichtbron.
- Zorg voor een stage-top of microscoop klimaatkamer. Hier, gebruik dan een stage-top klimaatkamer.
- Gebruik commerciële software aan microscopen werken met hulpprogramma's om time-lapse microscopie te voeren.
- Gebruik in de handel verkrijgbare software of ImageJ voor beeldanalyse. Veel andere analyse-instrumenten zijn in de handel verkrijgbaar, en er zijn op maat gemaakte programma's waarvan vele zijn gepubliceerd 8,18.
2. Het visualiseren van cellulaire processen en fenotypische Responses
- Visualiseer cellen met helderveld microscopie. Differentiële interferentie contrast en fasecontrast alleen kan zeer informatief tussen reacties op antikankergeneesmiddel responsen bestuderen. Deze werkwijzen kunnen omvatten mitose, celmotiliteit en apoptose.
- Visualiseren celstructuren, organellen en processen fluorescerende biosensoren. Fluorescerende probes zijn informatief bij het opsporen van specifieke subcellulaire processen. Deze kunnen onder meer dynamiek van microtubuli, mitochondriale en endoplasmatisch reticulum dynamiek, eiwit accumulatie en lokalisatie, enmoleculaire signalering (bijv., fosforylatie, calcium).
3. Voorbereiding van monsters
- Groeien cellen in celkweek gecertificeerd gerechten in een standaard celkweek bevochtigde incubator (bijvoorbeeld 37 ° C, 5% CO2, 80% relatieve vochtigheid).
- Groeien HT1080 cellen in MEM met EBSS. Aanvullen van het medium met 10% v / v FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v natriumpyruvaat en 1% v / v niet-essentiële aminozuren.
- Twee dagen voor imaging, plaat 50.000 HT1080 Fucci cellen in 3 putjes van een 12-well # 1.5 glazen bodem schaal in een gecertificeerde steriele laminaire stroming kap. Pas het aantal cellen uitgeplaat bereiken ~ 60% confluentie voor de start van het experiment. Afhankelijk van de cellijn en de aard van het experiment celdichtheid kan minder zijn.
Opmerking: Celdichtheid kunnen grote invloed hebben op de groei van de cellijn en de experimentele resultaten. Tellen cellen te minimaliseren experiment-to-experiment variability als gevolg van de dichtheid.- Afhankelijk van de klimaatkamer en de noodzakelijke voorwaarden voor het experiment, plaat cellen in enkele putjes (typisch 35- of 60-mm), 4 en 35-mm gerechten, 6-, 12- of 24-well celkweek platen, of dekglaasje dia's in verschillende formaten. Gebruik glazen bodem platen met # 1,5 glas als de meeste objectieven zijn geoptimaliseerd voor deze dikte van het glas, en de beeldvorming door celcultuur plastic is zeer slecht.
Opmerking: Sommige cellijnen niet groeien en te overleven op glas. In deze gevallen kan het glas worden bekleed om celhechting te verbeteren (bijv., Poly-lysine of collageen). Sommige bedrijven produceren optische celkweek kunststof bestaat, moet empirisch worden bepaald of dit een haalbare optie.
- Afhankelijk van de klimaatkamer en de noodzakelijke voorwaarden voor het experiment, plaat cellen in enkele putjes (typisch 35- of 60-mm), 4 en 35-mm gerechten, 6-, 12- of 24-well celkweek platen, of dekglaasje dia's in verschillende formaten. Gebruik glazen bodem platen met # 1,5 glas als de meeste objectieven zijn geoptimaliseerd voor deze dikte van het glas, en de beeldvorming door celcultuur plastic is zeer slecht.
4. Milieu Chamber Set-up
- Vóór iedere proefneming, opzet de klimaatkamer zodat het werkt op ~ 80% luchtvochtigheid en zo de temperatuur van het monster positie 37 o C. Meest gekweekte cellen groeien in 5% CO2 / luchtbalans sfeer door natriumbicarbonaat buffer in het medium. Afhankelijk van de set-up, ofwel zet de milieu-controller tot 5% CO 2 en het zal mixen 100% CO 2 met lucht, of gebruik maken van pre-mixed, gecertificeerde 5% CO 2 / balans lucht gas. Volg de aanwijzingen van de fabrikant voor de gasstroom-tarieven.
Opmerking: Sommige cellijnen groeien in CO 2-onafhankelijke medium in welk geval zij zonder CO 2 kan worden gehandhaafd. Speciaal beeldmedia is ook dat de toevoeging van autofluorescente verbindingen beperkt. De groei in scripties mediums voor het gewenste type cel moet empirisch vooraf worden bepaald. - Voorafgaand aan de beeldvorming, zorgen voor het waterreservoir gevuld is (na aanwijzingen van de fabrikant) met steriel gedestilleerd water. Schakel de klimaatkamer op de gewenste temperatuur en legt deze in de microscooptafel inzet. Om gas op te slaan, hoeft de stroom op dit moment niet starten.
Opmerking: Als er een vrije ruimte tussen het podium-top kamer en het podium inzet en / of enige spanning op aansluitsnoeren naar de kamer kan bewegingsartefacten te introduceren in het experiment.- Leg stukjes van paraffine film over de randen van het podium inzet opening voorafgaand aan het plaatsen van de kamer erin het koppelen van de kamer naar het podium, en zorg ervoor dat geen verbindingen te trekken op de kamer.
- Laat de kamer in evenwicht tot 37 o C. Zorg voor een stabiele temperatuur aan temperatuurschommelingen te voorkomen dat tijdens de beeldvorming welke cel fysiologie van invloed kan zijn en de invoering van drift. Temperatuurevenwicht bereiken vereist gewoonlijk 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de omgeving.
- Plaats een 'dummy' schotel met water in de putten in de kamer tijdens het opwarmen. Een imaging schotel gevuld met water bootst de steekproef, te helpen zorgen voor de kamer is voldoende opgewarmd en gestabiliseerd. Het vullen van de kamer met voorverwarmde steriel watervermindert de tijd die nodig temperatuurstabilisatie en minimaliseert de temperatuurdaling na toevoeging van het experimentele monster.
5. Microscoop Set-up
- Schakel de microscoop, bijbehorende computer en alle benodigde randapparatuur.
- Afhankelijk van de lichtbron, wacht aan te zetten totdat het nodig is (bijv., LED).
- Met het doel torentje in een lage positie, selecteer de 20X 0,7 NA doel worden gebruikt.
- Plaats het monster op het streven - dit maakt het makkelijker om de cellen te vinden wanneer het monster in de kamer.
- imaging parameters op dit moment als deze bekend uit eerdere experimenten.
6. Het transport van cellen op een microscoop en in de Kamer
- Vervoer de cellen af te beelden uit de incubator naar de klimaatkamer. Zorg ervoor dat deze snel wordt gedaan om de effecten van een relatief lage CO 2 beperken
- Plaats de cellen in een afgesloten container Styrofoam of geïsoleerde zak om grote veranderingen in het milieu te voorkomen.
- Aangezien sommige klimaatkamers geen strakke, gesloten deksel gebruiken, verdamping, laag steriele embryo gecertificeerde minerale olie vertragen bovenop het groeimedium. Wikkel gas-permeant paraffine film rond de omtrek-randen van de schaal voor monsters zorg dat u de glazen imaging gebied niet te hinderen. Gelokaliseerde bevochtiging secundaire werkwijzen kunnen worden toegepast. Condensatie op het deksel van de schaal voor monsters kan verminderen uitvoeMance van helderveld microscopie.
7. Instellen van de Imaging
- Selecteer imaging voorwaarden die het beste de gegevens zal vertegenwoordigen. Neem voorzorgsmaatregelen om fototoxiciteit te voorkomen door het beperken van de blootstelling keer, met behulp van een lagere intensiteit van het licht en het selecteren van probes die zijn enthousiast over langere golflengten van het licht.
- Definieer x, y en z-vlak en de gewenste golflengte (n) voor elke positie af te beelden. De tijdsresolutie wordt beperkt door het aantal posities en golflengten. Voor de lange termijn time-lapse van de meeste cellulaire processen, het verwerven van een afbeelding om de 10 - 20 min; hogere tijdsresolutie (met korte tussenpozen, bijv., 1 min) zorgt voor meer datapunten en daardoor robuuster cell tracking, maar ook resulteert in een meer geïntegreerdeblootstelling aan licht en grotere datasets.
- Zoals HT1080 Fucci hebben dynamisch groen en rood fluorescerende eiwitten (zie Representatieve resultaten), gebruikt u de volgende belichtingstijden: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, Helderveld - 20 msec. Gebruik een 2 x 2 bin.
- Enable software gecontroleerde autofocus met behulp van de standaard parameters onder geavanceerde instellingen. Definieer een autofocus bereik van 10 urn met de aanbevolen stapgrootte. Zorg ervoor dat u dit te doen voordat het starten van de time-lapse. Autofocus met helderveld beelden en nooit met fluorescentie tot fototoxiciteit en fotobleken te verminderen.
- Gebruik software gecontroleerde autofocus systemen op een microscoop met een gemotoriseerde podium, en direct gericht op het monster. Ze kunnen echter de meetsnelheid van het experiment beperken. Hardware gecontroleerde continue focus systemen werken goed voor time-lapse microscopie en het verbeteren van de snelheid, waardoor meer posities af te beelden of een hoger percentage van de overname. Echter, zijvertrouwen op detectie van lucht-glasgrensvlak en kunnen focus van het monster verliezen met variaties in glasdikte in de put.
- Vervang de helft van de media met media die de gewenste geneesmiddelconcentratie die is verwarmd tot 37 oC Gedeeltelijke vervanging media helpt om thermische drift te verminderen. De omstandigheden in dit experiment zijn Vehicle (DMSO), 1 uM selinexor en 10 uM PD0332991.
Opmerking: Deze stap kan ook na het starten van de overname door onderbreken en opnieuw starten van de proef. Dit maakt lengterichting volgen van pre- en post-drug reacties van enkele cellen. Als geneesmiddel stabiliteit of metabolisme is een zorg, pauzeren en vervangen van de media kan met dezelfde methode. Om te testen voor drug afbraak of metabolisme, media van behandelde cellen kunnen zich ook bevindt op naïeve cellen geplaatst om drug actie te testen. - Start de time-lapse.
- Als de time-lapse loopt, ervoor te zorgen dat de afgebeelde velden in focus en de chambe blijvenr handhaaft een vochtige 37 o C.
- Pas de scherpstelling zo nodig door het pauzeren van de overname gedurende de tijd tussen tijdstippen.
- Indien nodig, voeg water toe tot de kamer tijdens langere experimenten. Vermijd het koelen van de kamer door het toevoegen van voorverwarmde, steriel gedestilleerd water bij 37 o C.
8. Het beëindigen van de Time-lapse
- Wanneer het experiment is uitgevoerd voltooid, stoppen de overname als deze niet is ingesteld op automatisch stoppen.
- Zorg ervoor dat de time-lapse de juiste manier is opgeslagen op de harde schijf, hoewel de meeste software pakketten automatisch op te slaan tijdens de overname zo niet klaar met de juiste gegevens verloren kunnen gaan.
- Verwijder de kamer van de microscoop en gooi de cellen in biologisch gevaarlijk afval volgende goedgekeurde institutionele bioveiligheid procedures.
9. Longitudinal Tracking en analyse van Time-lapse gegevens
- Kies de methodologie voor de analyse die iseigenen voor de biologische processen van belang. Veel plugins voor ImageJ, programma's met behulp van Matlab, en aangepaste platforms zijn geproduceerd voor specifieke toepassingen. De volgende methode omvat het volgen van kernen en analyse van nucleaire fluorescente probes zoals aangetoond in figuren 4 en 5.
- Open de .tif beeld stacks voor de gebruikte kanalen in ImageJ. Als alternatief geopend oorspronkelijke bestanden uit de overname programma rechtstreeks in ImageJ met de Bioformats plugin.
- Teken een regio van belang (ROI) binnen de kern van een cel met behulp van beeld helderveld of de nucleaire label kanaal (indien gebruikt) en voeg deze toe aan de ROI manager. Opmerking: Als de afgebeelde cellen een nucleaire label (bijvoorbeeld histon H2B-EGFP.), Vervolgens automatisch cell tracking worden toegepast om gebieden van belang (ROI) die individuele kernen maken door de tijd.
- Ga door naar de volgende keer punt en de positie van de ROI binnen dezelfde nucleus. Voeg de ROI van de ROI manager.
- Deze volgen en te ROI voor de individuele cel totdat een cellulaire gebeurtenis (mitose, apoptose, enz.) Of de cel kan niet meer worden gevolgd (bijv., Beweegt van frame of het experiment is beëindigd).
- Wanneer ROI vastgesteld voor cellen door de tijd dat ze in het veld, op elkaar leggen op de fluorescerende kanalen van belang. Meet de gemiddelde intensiteit van de fluorescentie in elk kanaal voor elk tijdstip. Sla de ROI lijst voor later gebruik.
- Verschillende metingen kunnen worden gedaan binnen de ROI voor toepassingen in verschillende experimenten. Klik Analyse → Set Metingen ... om een menu te brengen tot de analytische methode te kiezen (bijv., Gemiddelde intensiteit binnen de ROI, geïntegreerde intensiteit, enz.).
- Opmerking cel lot voor individuele cellen (bijv., Apoptose, afdeling, overleving), terwijl het bijhouden van. Dit maakt het mogelijk voor de oprichting van de overleving bochten en further populatie-analyse.
- Met de gemiddelde intensiteit voor beide kanalen, maakt u een scatterplot te celcyclus dynamiek weer te geven in reactie op Therapeutics (Figuur 5B, C).
Noot: Plots kan worden gemaakt voor individuele cellen in de tijd gemiddeld over een of populatie van cellen gevolgd. Kwantitatieve beeldvorming kan kritisch voor het vaststellen van complexe reacties en cel verhoudingen als reactie op kanker therapeutische middelen. Langdurig time-lapse microscopie longitudinale tracking en hierbij zijn een meerstaps proces met vele mogelijkheden voor het type microscopie en analyse, en volgt de hoofdlijnen gegeven in Figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lange-termijn time-lapse microscopie en directe longitudinale tracking kan voor de studie van veel anti-kanker effecten tijdens drug reactie. Volgens de algemene schets in figuur 1, worden meerdere voorbeelden van cellen weergegeven expressie gevalideerd fluorescente reporters die behandeld met anti-kankergeneesmiddelen, gevolgd en geanalyseerd met behulp van verschillende methoden.
Fasecontrastmicroscopie alleen is zeer informatief en robuust rapporteert over interfase versus mitose, mitotische duur en de arrestatie, abnormale celdeling en celdood 21,23,24. Geneesmiddelen die celdeling gericht, vaak aangeduid antimitotische geneesmiddelen, verder worden ontwikkeld. Figuur 2 en films 1 en 2 tonen voorbeelden van een paar bij elkaar passende borstkanker afgeleide MCF7 cellijnen die alleen verschillen in hun p53 status behandeld met 500 nM van een type geneesmiddel tegen kanker dat targetsen remt de mitotische motor proteïne, kinesine-5 (KSP1, Kif11, Eg5), wat resulteert in langdurige mitose 20. Wildtype MCF7-cellen (Figuur 2A) zijn een paradigma p53-afhankelijke celcyclus 25-27 bestuderen. Wild-type cellen in te voeren mitose, blijven voor enkele uren, uiteindelijk verlaten en grotendeels arresteren met inductie van p53 25. Wanneer p53 wordt verwijderd met stabiele p53 knockdown (MCF7 p53 sh), in plaats van arrestatie na mitose verlaten de cellen gaan door herhaalde cycli (Figuur 2B). Cellen werden handmatig gevolgd en de mitotische index en het percentage van cellen die een tweede mitose binnengaan werden beoordeeld (Figuur 2C, D). Wij merken op dat de sh p53 cel gevolgd verdeelt wanneer het een tweede ronde van de mitose in plaats van de arrestatie en het verlaten van mitose zonder verdeling binnenkomt. Hoewel niet hier de duur van mitotische gebeurtenissen getoond, kan de tijd tussen opeenvolgende mitosen, procent van celdelingen en bijbehorende celdood gebeurtenissen ook s zijnklokhuis 20,21.
Taxanen, zoals paclitaxel en docetaxel, komen vaak chemotherapie voor vele kankers, waaronder die welke moeilijk te behandelen als alvleesklier en gevorderde borstkanker zijn. Paclitaxel bindt aan de dynamische plus-uiteinde van microtubules stabiliseert en hen verhinderen hun normale functie. Paclitaxel heeft kennis genomen van de dosis-afhankelijke effecten, en zelfs bij lage concentraties kan de normale progressie van de mitose en chromosoom segregatie 16 verstoren. Trouwe scheiding van chromosomen is essentieel voor een normale cel proliferatie en als abnormaal kan resulteren in aneuploïdie dat de celcyclus kunnen leiden, maar ook fungeren als aanjager van de progressie van kanker. Figuur 3 en Movie 3 tonen cervix-carcinoom afgeleide HeLa-cellen die stabiel de uiting van de chromatine marker histon-2b gefuseerd aan mCherry en bèta-tubuline gefuseerd met EGFP (niet getoond) in normale groeimedium behandeld met 1 nM paclitaxel. In dezeBijvoorbeeld, de toegang tot en de progressie door middel van mitose gevolgd kan worden. De timing van de mitose lijkt normaal in deze cel echter chromosoom afstemming en segregatie is niet, wat resulteert in de nucleaire uitstulpingen en micronuclei die structuren aangeeft slechte chromosoom segregatie. Micronuclei zijn gevoelig voor DNA schade en chromothripsis, dat de grootschalige fragmentatie van de chromosomen of chromatine - Dit heeft belangrijke gevolgen voor tumor evolutie 28,29. Hoewel hier niet getoond, kan de oorsprong van micronuclei met betrekking tot andere mitotische structuren en het lot van deze cellen direct worden gevolgd met behulp van de lange termijn time-lapse. Verder is een chromatine marker expressie met een DNA-schade reporter kan worden gebruikt om de relatie tussen chromosoomsegregatie, micronuclei en DNA schade vast te stellen.
TL-verslaggevers zorgen voor opsombaar celprocessen te worden gevolgd en de nieuwe verslaggevers worden voortdurend ontwikkeld. voor exruim, de celcyclus omvat fasen die van bijzonder belang van gerichte anti-kanker therapeutica. Figuur 4 en Film 4 toont een fibrosarcoom afgeleide cellijn (HT1080) die stabiel co-expressie brengt twee reporters genoemd, fluorescent ubiquitine celcyclus indicatoren (Fucci) 30. In het systeem hier wordt een deel van de CDT1 polypeptide gefuseerd aan mKO2 (monomeer Kusabira orange 2) en verhogingen in G1-fase en wordt afgebroken in de vroege S-fase en een gedeelte van geminin gefuseerd MAG (monomeer Azami groen) en verhoogt midden-S-fase en wordt afgebroken bij anafase. Deze cel is bij normale groeimedium en doorloopt de celcyclus van 15 uur. Figuur 5A, B en Film 5 tonen dezelfde cellen in normaal medium behandeld met 10 uM PD0332991 een Cdk4 / 6 inhibitor. De cellen vooruitgang door G2-fase en normaal te verdelen, en sterk te arresteren in de daaropvolgende G1-fase, met vermelding van de mogelijkheden voor effective cytostatische effecten in groeiende tumoren. 5C, D en film 6 tonen dezelfde cellen in normaal medium behandeld met een klein molecuul genaamd selinexor (KPT-330), een krachtige remmer nucleair export eiwit export van-1 (XPO1, aka CRM1 ). Deze verbindingen worden aangeduid als selectieve remmers van nucleaire export (SINE) en hun anti-kanker effecten zijn onderzocht 31,32. SINE behandeling leidt tot een sterke celcyclus fenotypes en celdood 33,34. Dit voorbeeld toont een cel die door de G1-fase normale kinetiek (ongeveer 6 uur) verloopt, maar ervaart late S-fase-progressie zoals aangegeven door de periode met zowel rode als groene signaal (ongeveer 3 uur onder controle, maar 10 in SINE behandeld ). Deze cel sterft in de late S- of G2-fase na 21 uur en 30 min; een normale celcyclus ongeveer 15 uur. De effecten van selinexor worden bestudeerd voor verschillende bloed en solide tumoren 35.
Figuur 6 en 7 tonen Movie HT1080 cellen die stabiel een dubbelstrengs DNA-schade verslaggever, mCherry-BP1-2 36 te drukken in de normale groei medium behandeld met 10 uM etoposide (VP-16), een topoisomerase II toxine. Deze reporter bestaat uit een gedeelte van het DNA dubbelstrengs breuken ter eiwit 53BP1 dat is gefuseerd aan mCherry. De kern van deze cel werd gevolgd using de Analyseer Deeltjes plugin in ImageJ en de geïntegreerde mCherry-BP1-2 signaal werd gemeten in elk frame na drempelvorming uit waarden die oplosbaar zijn nucleaire sonde geëlimineerd. DNA schade minimaal voor de eerste 10 uur en vervolgens geleidelijk toeneemt. Topoisomerase II-remmers is bekend dat bijzonder beïnvloeden S- en G2-fase, wanneer het enzym het meest actief is 37,38. De kinetiek waargenomen in dit voorbeeld zou celcyclus geassocieerde schade aan machines; combineren mCherry-BP1-2 met Fucci verslaggevers kon de timing van de schade die vervolgens kan worden gekoppeld aan het lot cel te demonstreren.
Figuur 1. Overzicht van het gebruik op lange termijn time-lapse microscopie en Longitudinal Tracking naar Anti-kanker Drug Response studie. Cellen in de juiste live cell imaging gerechten zoals gewenst bestempeld worden afgebeeld, cellen of regio's van belang worden bijgehouden, en de gegevens geanalyseerd. Veel methoden bestaan op te sporen en te kwantificeren cellen, sommige zijn hier aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Fase-contrast Time-lapse microscopie toont p53-afhankelijkheid na anti-mitotische Drug Treatment. Wildtype (A) en p53-knockdown (B) MCF7-cellen werden behandeld met 500 nM kinesine-5 inhibitor en afgebeeld elke 10 min gedurende 96 hr met behulp van fase-contrast microscopie met een 20X PH2 0,70 NA lens. Individuele cellen werden handmatig gevolgd en het percentage mitose en als de cel zich ontwikkelt tot een mitose weer tijdens de time-lapse werden gescoord. Pijlen geven cel die wordt bijgehouden. De sh p53 cel (B) verdeelt bij het betreden van een tweede mitose. (C) Beide cellijnen show langdurige mitose zoals blijkt uit de hoge piek percentage mitose (eerste blauwe en rode pijlen). (C, D) bijna 90% van de cellen zonder p53 (p53 sh, n = 87) laat een verdere progressie (rode pijlen) in vergelijking met 20% van wildtype (n = 130). Error bars geven de standaarddeviatie. Bar = 20 urn. Movies 1 en 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. De chromatine Marker histon 2b voren komen die chromosoomsegregatie afwijkingen na lage dosis paclitaxel behandeling. Paclitaxel is een microtubulus gericht geneesmiddel die resulteert in complexe, concentratie-afhankelijke defecten in celgroei en deling. De organisatie van het chromatine informeert over andere cel staten, met inbegrip van het podiumvan mitose en celdood. HeLa-cellen die stabiel zowel H2b-mCherry en β-tubuline-EGFP tot expressie werden behandeld met 1 nM paclitaxel. Deze cel is in eerste instantie in de interfase, vordert door de stadia van de mitose en verdeelt. Terwijl de tijd in mitose normaal lijkt, zijn er aanwijzingen van chromosoom gehechtheid en segregatie fouten die zijn opgelost (pijlen). Het lot van deze cellen kunnen direct lengterichting volgen vastgesteld. Fasecontrast (niet getoond) en fluorescentiebeelden werden bij 1 beeld per 10 minuten met een 20X F2 0,70 NA lens verkregen. Bar = 10 micrometer. Movie 3. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Fluorescent celcyclus Markers Zorg voor Direct Monitoring van de voortgang van de celcyclus.(A) Een gebied van levende fibrosarcoom HT1080 cellen die de Fucci systeem afgebeeld door fase contrast en fluorescentie. (B, C) De mitotische cellen in de gestippelde rechthoek in panel A wordt gevolgd. Normaal voortgang door de celcyclus van ongeveer 15 uur. Na mitose, cellen zijn kort zwak, en dan worden rood als ze vooruitgang in en door G1-fase. Wanneer de cellen in te voeren S-fase, de rode CDT1 sonde is afgebroken en de groene geminin probe toeneemt. De korte ongeveer 3 uur periode wanneer beide probes aanwezig zijn, geeft vroege S-fase. Als cellen verder komt in S- en G2-fase en in de volgende mitose blijven ze groen. De groene probe wordt afgebroken bij anafase van celdeling. Fase-contrast en fluorescerende beelden werden op 1 beeld per 10 minuten met een 20X PH2 0,70 NA lens verworven. Bar = 10 pm. Movie 4. Klik hier om view een grotere versie van deze figuur.
Figuur 5. celcyclus specifieke effecten en geassocieerde celdood. Hetzelfde cellijn als in figuur 4, maar behandeld met twee verschillende moleculen die verschillende anti-kanker targets te vertegenwoordigen. Tijdstippen na de behandeling zijn aangegeven. (A, B) na behandeling van een late S / G2-fase cellen met 10 uM PD0332991 Cdk4 / 6 inhibitor het cel ontwikkelt gewoonlijk mitose (M) en verdeelt. Een dochtercel wordt gevolgd door het meten van rode en groene fluorescentie intensiteiten in het gebied van belang in de kern. De cel blijft gearresteerd in G1-fase gedurende ongeveer 40 uur. (C, D) Na behandeling van een late fase G2-cellen met 1 uM selinexor het cel ontwikkelt gewoonlijk mitose (M) en verdeelt. Eén dochter cel wordt gevolgd en het binnenkomt G1-fase doorloopteen langdurige vroege S-fase (rood en groen signaal), overgangen uitsluitend groene en sterft na 21 uur en 30 min. De gegevens suggereren S-fase voortgang wordt beïnvloed door selinexor behandeling. Fase-contrast en fluorescerende beelden werden op 1 beeld per 10 minuten met een 20X PH2 0,70 NA lens verworven. Bar = 10 urn. Movies 5 en 6. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. DNA Schade Dynamics na Drug Treatment. Veel anti-kanker therapieën leiden tot DNA-schade die diep van invloed kan zijn cel respons en de behandeling succes. HT1080-cellen stabiel tot expressie zowel dubbelstrengs DNA schade merker mCherry-BP1-2 en H2b-EGFP (niet weergegeven) werden behandeld met 10 uM van de topoisomerase II en DNA drug etoposide dAmage werd bijgehouden. (A) Het aantal en de intensiteit van de brandpunten stijging na etoposide. Er is in eerste instantie een achterstand, met vermelding van mogelijke celcyclus effecten in overeenstemming met de bekende mechanisme van etoposide. Door 22 uur 50 min deze cel heeft opgelopen hoge niveaus van schade. Hoewel hier niet getoond, kan het lot van de cel bepaald door directe tracking. (B) Een ROI overeenkomt met de kern verkregen door H2b-EGFP signaal werd bijgehouden met particle volgen in ImageJ en de geïntegreerde BP1-2 mCherry signaal werd gekwantificeerd en uitgezet in de tijd. De vertraging in het signaal tot ongeveer 10 uur wordt opgemerkt, gevolgd door een aanhoudende toename. Fluorescent beelden werden op 1 beeld per 10 minuten met een 40X PH2 0,75 NA lens verworven. Bar = 10 pm. Movie 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Film 1. Fase-contrast Time-lapse microscopie van de Wildtype MCF7-cellen na anti-mitotische Drug Treatment. Wildtype MCF7-cellen werden behandeld met 500 nM kinesine-5 inhibitor en afgebeeld elke 10 min gedurende 96 uur middels fase-contrast microscopie met een 20X PH2 0,70 NA lens. Langdurige mitotische arrestatie en het verlaten van mitose kan worden waargenomen, zoals beschreven in figuur 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Movie 2. Fase-contrast Time-lapse microscopie van de p53-knockdown MCF7 cellen na Anti-mitotische Drug Treatment. MCF7-cellen stabiel tot expressie een kleine haarspeld RNA targeting p53 voor degradatie werden behandeld met 500 nM Kinesin-5-remmer en afgebeeld elke 10 min gedurende 96 uur middels fase-contrast microscopie met een 20X PH2 0,70 NA lens. Langdurige mitotische arrestatie en meerdere rondes van celdeling kan worden waargenomen, zoals beschreven in figuur 2. Klik hier om dit bestand te downloaden.
3. Fluorescerende film Time-lapse microscopie van de HeLa cellen na lage dosis paclitaxel behandeling. HeLa-cellen stabiel tot expressie H2B-mCherry en β-tubuline-EGFP werden behandeld met 1 nM paclitaxel. Chromosoom gehechtheid en segregatie problemen kunnen worden waargenomen, zoals beschreven in figuur 3. Beelden werden elke 10 minuten met een 20X PH2 0,70 NA lens verworven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Movie 4. Fluorescent celcyclus Markers Zorg voor Direct Monitoring van de voortgang van de celcyclus. HT1080 cellen die de Fucci systeem werden longitudinaal gevolgd tijdens de time-lapse microscopie. De cel gaat dim na het verlaten van mitose, en dan wordt rood als de cel vordert in G1-fase. Als de cel binnenkomt S-fase wordt geel als groene geminin probe toeneemt en de rode CDT1 probe afgebroken. De cel blijft groen als het vordert in S- en G2-fase. De groene degradeert als de cellen binnenkomt anafase. Kwantificering van deze cel is weergegeven in figuur 4. Beelden werden elke 10 min met een 20X PH2 0,70 NA lens verworven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Moive 5 "src =" / files / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
Movie 5. HT1080 cel die Fluorescent celcyclus Markers na behandeling met een G1-fase Inhibitor. HT1080 cellen die de Fucci systeem werden behandeld met 10 uM PD0332991, een Cdk4 / 6-remmer. De bijgehouden cel vordert normaal mitose en verdeelt. Een dochter is gevolgd, en blijft rood G1 voor de duur van de film. Kwantificering is weergegeven in figuur 5. Beelden werden elke 10 min verworven met een 20X PH2 0,70 NA lens. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Movie 6. HT1080 cel die Fluorescent celcyclus Markers na behandeling met de export van-1 Inhibitor, Selinexor. HT1080 cellen die de Fucci systeem waren traktatieed met 1 uM selinexor. Dit laat G2-fase cel werd gevolgd door middel van mitose. Een dochtercel vervolgt dan met G1-fase (rood) en gaat S-fase (geel). De cel vordert langzaam door S-fasen totdat het in de late-S / G2-fase en sterft na 21 uur en 30 min van de behandeling. Kwantificering is weergegeven in figuur 5. Beelden werden elke 10 min verworven met een 20X PH2 0,70 NA lens. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Movie 7. DNA Damage Dynamics na behandeling met een topoisomerase II-remmer. HT1080 cellen die stabiel de uiting van de dubbelstrengs DNA-schade marker mCherry-BP1-2 en H2B-EGFP werden behandeld met 10 uM etoposide, een topoisomerase II-remmer. De mCherry-BP1-2 wordt weergegeven in de film. Als behandeling voort te zettens, het signaal van mCherry-BP1-2 toeneemt, wat aangeeft verhoogde dubbelstrengs DNA-schade. Kwantificering is weergegeven in figuur 6. Beelden werden elke 10 min verworven met een 40X PH2 0,75 NA lens. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Voordelen van de Time-lapse Microscopie en Longitudinal Tracking
De microscoop is een ideaal instrument voor longitudinale studies van geneesmiddelrespons omdat hiermee onderzoekers individuele cellen en hun lot en de gehele populatie te volgen. Variabiliteit in drug antwoord binnen een populatie van cellen is een groot probleem voor anti-kanker therapeutische design. Longitudinaal volgen van enkele cellen kunnen onderzoekers deze variabiliteit observeren en beginnen de onderliggende mechanismen en gevolgen begrijpt als het gaat om de celpopulatie. Met behulp van een verscheidenheid van fluorescerende probes biedt een veelvoud aan mogelijkheden om te observeren en te begrijpen zowel de gemeenschappelijke en zeldzame reactie fenotypes. De timing en de bijdrage van andere cel lot om de respons bevolking, relaties tussen specifieke fenotypes en lot, en verschillen in respons tussen cellijnen of de toestand na behandeling zijn voorbeelden van wat kan worden geleerd. Vele kankergerelateerde processen kunnen worden bestudeerd. Sommigen die niet zijn gemarkeerd in dit artikel onder meer celdood met apoptose, autofagie en necrose verslaggevers 39-42, cel invasie 43,44, en p53 dynamiek die cel beslissingen over het lot 27 te bepalen. Bovendien is deze benadering niet beperkt tot studies van anti-kanker therapeutica studies. Dezelfde principes kunnen worden gebruikt om vele andere biologische processen waaronder mitose 45 cytoskelet dynamiek 46,47 en intracellulaire signalering 48 bestuderen.
Time-lapse fluorescentie microscopie kunnen ook zorgen voor lokalisatie en de intensiteit gegevens van eiwitten en moleculen van belang. Niet alleen zijn de veranderingen in eiwitten niveau belangrijk om drugs respons, maar de juiste (of onjuiste) lokalisatie van eiwitten in de cel is van cruciaal belang voor het begrip reactie. Time-lapse microscopie levert gegevens over waar eiwitten worden gelokaliseerd (bijv., Kern, cytosol, specifieke organellen,enz.) na de behandeling met geneesmiddelen en hoe de lokalisatie en de totale niveaus veranderen in de tijd op een enkele cel en populatieniveau.
Uitdagingen en beperkingen
Ondanks de sterke punten van time-lapse microscopie en longitudinale analyse van enkele cellen, zijn er beperkingen. Fluorescentie reporters zijn beperkt door hun stabiliteit en specificiteit. Bij het ontwerpen van fluorescerende fusie-eiwitten, is het essentieel om een probe die foto-stabiele en heldere kiezen, maar het is ook noodzakelijk om de effecten van de fluorescente tag achten voor de normale functie en vermogen om goed te lokaliseren is bevestigd aan het eiwit van interesse . Deze kwesties zijn in detail besproken elders en er zijn vele beschikbare fluorescente gelabeld eiwitten die zijn gepubliceerd 15,49,50. Andere fluorescente labels of labels kunnen worden toegevoegd aan de cellen, en er moet op worden gelet dat ze niet toxisch zijn. In onze ervaring, deze probes, bijvoorbeeld mitochondriale labels (membraan potentiële) of de cel doorlaatbaar DNA kleurstoffen, de neiging om gemakkelijker te bleken en zal verdund-out als gevolg van celproliferatie.
Daarnaast zijn er veel technische uitdagingen groeien en observeren cellen op een microscoop. Instabiliteit met betrekking tot de temperatuur, luchtvochtigheid, sfeer, en het licht zal grote gevolgen hebben voor de cellen, met als gevolg verlies van gegevens of zelfs het gehele experiment. Stabiliteitsproblemen betrekking beeldopname te zien in films 1 en 2. Dit effect kan worden geminimaliseerd door het gebruik van paraffine film (zie 4.2). Er zijn ook beeldstabilisatie algoritmen beschikbaar voor post-acquisitie processing, bijvoorbeeld met behulp van ImageJ (NIH). Een aspect van de lange-termijn time-lapse die vaak over het hoofd gezien is data management en de bestandsgrootte. Zelfs wanneer binning de gegevens, een time-lapse experiment is vaak meer dan 30 gigabytes. Hoge capaciteit, high-speed, betrouwbare data-opslag en overdracht zijn sterkly aangemoedigd. Afhankelijk van de fluorescerende biosensor (s) af te beelden, is het vaak niet nodig om beelden met hoge resolutie, zoals nucleaire en cytoplasmatische sensoren verwerven. Wij raden waar mogelijk maatregelen te nemen om het bestand klein te houden, wat resulteert in makkelijker om te werken met data, minder veeleisende computerbehoeften, en verbeterde workflow te nemen.
Fototoxiciteit is een grote zorg bij het uitvoeren van lange termijn time-lapse microscopie. Hoge intensiteit licht en lange blootstelling kan leiden tot fotobleken van de fluorescerende probes, mobiele stress en celdood. Deze effecten kunnen een groot effect op de gegevens en tot verdraaiing van het experiment. Camera binning en versterking kan worden gebruikt om de blootstelling te verkorten. Neutrale dichtheid filters in het lichtpad vermindering van de intensiteit van het licht op het monster. De golflengten van licht gebruikt om het beeld zal ook van invloed op de cellen. Kortere golflengten (UV, in de buurt van UV) zijn meer schade aan cellen en resulteren in foto-bleken bij sneller tarieven danlangere golflengten (bijv. rood, ver rood). Keuze van de doelstelling kan ook invloed hebben op de beeldvorming van omstandigheden. Hogere numerieke opening (NA) lenzen zal produceren hogere resolutie afbeeldingen, maar sterkere vergroting laat minder licht uit het monster resulteert in een hogere blootstelling keer of meer intens licht te verzenden. Een objectieve moeten worden geselecteerd met een geschikte NA en vergroting dat uw object van belang zal oplossen zonder oversampling. In veel gevallen kan de hoogste doel niet de meest geschikte zijn. Nucleaire probes (figuren 4, 5), een lage objectiefvergroting zorgt voor een groter gebied worden vastgelegd, effectief verhogen steekproefomvang, zonder dat de resolutie van het gewenste object. Lange-termijn time-lapse in drie dimensies moet met voorzichtigheid worden uitgevoerd door geïntegreerde blootstelling aan licht. Met behulp van een draaiende schijf confocale microscoop, gevoelige camera (bijv., EM-CCD), camera gain, en een snelle piëzo motor voor z-series is suggested om blootstelling aan licht te verminderen. Fast z-series overname is ook belangrijk om bewegingsartefacten te wijten aan cel beweging en dynamiek die zich voordoen in de periode acquisitie te minimaliseren. Empirische analyse van onbehandelde cellen met behulp van vele verschillende instellingen kunnen nuttig zijn bij het bepalen van de effecten van de tl-licht op een bepaalde cellijn of journalist zijn. Bovendien moet een onbehandelde controle bij elk experiment opgenomen voor de cytotoxische effecten van de experimentele instellingen bepalen.
Variaties van de techniek
Lange-termijn time-lapse is robuust en zeer flexibel. Middels co-kweektechnieken, verschillende cellijnen of dezelfde cellijnen die verschillende reporters kan worden gebruikt. Een uitstekend voorbeeld hiervan is het afbeelden van fagocytische cellen met doelcellen die sterven in reactie op een geneesmiddel tegen kanker. Een ander voorbeeld zou kunnen zijn om de gevolgen van de reagerende cellen op aangrenzende drug naïeve cellen te bestuderen. In combinatie met foto-activateable, foto-converteerbare en foto-schakelbare fluorescente eiwitten en gemodificeerde eiwitten die kunnen worden geactiveerd door licht van specifieke effecten veroorzaken (bv., KillerRed), zijn er vele mogelijkheden. Complexere benaderingen kunnen worden gebruikt die verschillende gespecialiseerde vormen van microscopie, zoals TL herverdeling na fotobleken, Förster resonance energy transfer (FRET), en super resolutie (bijv., Stochastische optische reconstructie microscopie (STORM), structurele verlichting microscopie (SIM) in dienst hebben, of gestimuleerde emissie uitputting (STED)), en vele anderen en er voordelen en beperkingen van elke benadering.
Lange termijn (bijv., Weken, maanden) reacties en het herstel van de cellen na verwijdering geneesmiddel centraal begrip geneesmiddel tegen kanker werking. Gerasterde glazen bodem gerechten zijn een waardevol instrument om specifieke cellen of regio's binnen een populatie / gebied herhaaldelijk te controleren. Bijvoorbeeld, met een gerasterde schotel, de aanvankelijke Dr.ug respons kunnen worden afgebeeld met behulp van een time-lapse, het geneesmiddel kan worden verwijderd, en specifieke gebieden in het raster kan worden afgebeeld na verloop van tijd of onderworpen aan extra time-lapse op het gewenste tijdstip. De glazen bodem op de vaat kan worden verwijderd door ofwel snijden met een schrijver gereedschap of met een commercieel reagens, en de cellen op het glas kan worden gekleurd voor andere markers van belang, bijvoorbeeld senescence geassocieerde β-galactocidase activiteit en vergeleken met de time-lapse om de geschiedenis van hoe cellen bereikte deze toestand te begrijpen. Als de celpopulatie groot genoeg kan worden onderworpen aan immunoblotting of flowcytometrie.
Dikke monsters zijn traditioneel moeilijk geweest om de afbeelding, bijvoorbeeld sferoïden in diverse gel materialen en matrices. Nieuwere nadert waaronder fluorescerende confocale of multifotonmicroscopie microscopie 16,18,19,51 kan worden gebruikt om de benadering uit te breiden tot een in situ begrip van hoe cellen reageren op anti-kanker therapeutica. Dese studies en een groeiend aantal van wetenschappers met behulp van time-lapse om anti-kanker medicijn reactie 24,52-54 tonen duidelijk aan dat we zijn op weg naar het ontwikkelen van een goed begrip van enkele cel farmacodynamische eigenschappen die u zullen helpen bij het verbeteren van ons vermogen om anti-kanker drugs te gebruiken te bestuderen antikankergeneesmiddel respons effectiever en misschien voorspellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| Etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| Selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| Cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35 mm Dish, 20 mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35 mm Dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| Multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
References
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
- Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
- The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
- van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
- Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
- Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
- Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
- Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
- Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
- Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
- Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
- Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
- Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
- Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
- Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
- Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
- Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
- Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
- Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
- Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
- Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
- Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
- Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
- Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
- Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
- Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
- Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
- Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
- Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
- Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
- Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
- D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
- Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
- Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
- N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
- Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
- Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
- Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
- Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
- Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
- Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
- Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
- Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
- Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
- Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
- Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
- Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).
