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Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l'étude Therapeutics Anti-cancer

Published: May 14, 2016 doi: 10.3791/53994
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

Abstract

La réponse des cellules individuelles aux médicaments anti-cancer contribue de manière significative dans la détermination de la réponse de la population, et est donc un facteur important dans le résultat global. Immunoblotting, la cytométrie en flux et les expériences cellulaires fixes sont souvent utilisés pour étudier comment les cellules répondent aux médicaments anti-cancéreux. Ces méthodes sont importants, mais ils ont plusieurs lacunes. Variabilité dans les réponses de la drogue entre le cancer et les cellules normales, et entre les cellules d'origine du cancer différents, transitoires et réponses rares sont difficiles à comprendre en utilisant des tests population de moyenne et sans être en mesure de suivre et de les analyser longitudinalement directement. Le microscope est particulièrement bien adapté à des cellules vivantes d'image. Les progrès réalisés dans la technologie permettent de routinière les cellules d'image à une résolution qui permet non seulement le suivi des cellules, mais également l'observation d'une variété de réponses cellulaires. Nous décrivons une approche en détail qui permet l'imagerie en continu time-lapse deles cellules au cours de la réponse à un médicament pour l'essentiel aussi longtemps que souhaité, typiquement jusqu'à 96 h. Utilisation de variations de l'approche, les cellules peuvent être surveillés pendant des semaines. Avec l'emploi des codés génétiquement biocapteurs fluorescents de nombreux processus, les voies et les réponses peuvent être suivies. Nous montrons que des exemples comprennent le suivi et la quantification de la croissance cellulaire et la progression du cycle cellulaire, la dynamique des chromosomes, des lésions de l'ADN et la mort cellulaire. Nous discutons également des variations de la technique et de sa flexibilité, et mettre en évidence certains pièges courants.

Introduction

La microscopie des cellules vivantes et le suivi longitudinal des cellules individuelles ne sont pas une nouvelle technique. Dès les premiers microscopes, les amateurs et les scientifiques ont observé et étudié des cellules individuelles et les organismes, leurs comportements, et le développement 1-3. Un exemple célèbre de la fin David Rogers à l' Université Vanderbilt dans les années 1950 montre un neutrophile humaine dans un frottis sanguin chassant une bactérie Staphylococcus aureus et éventuellement le processus de phagocytose 4. Ce film live-cellule est une excellente illustration de la façon dont les processus multiples peuvent être observés et corrélées en une seule expérience: détection d'un gradient chimique, mécanique et de la vitesse de la motilité cellulaire, cellule façonne la dynamique, l'adhérence et la phagocytose d'un agent pathogène.

L'avènement des microscopes entièrement automatisés et des caméras numériques très sensibles a donné lieu à un nombre croissant de chercheurs en utilisant la microscopie à poser des questions fondamentales en biologie cellulaire allant from comment les cellules se déplacent 5,6 et 7,8 à diviser organite dynamique et le trafic membranaire 9-11. Non-fluorescent, la microscopie en fond clair, y compris à contraste de phase (PC), qui a recueilli le prix Nobel de Frits Zernike en 1953, et le contraste d'interférence différentiel (DIC) permettre l'observation des cellules et des noyaux, mais aussi des structures sous-cellulaires, y compris les faisceaux de microtubules , les chromosomes, les nucléoles, la dynamique des organites et des fibres d'actine épaisses 12. Génétiquement codés protéines fluorescentes et le développement des colorants fluorescents contre organites ont considérablement influencé time-lapse microscopie 13-15. Bien que pas l'objet de cet article, l' imagerie en sphéroïdes cellulaires et in situ (microscopie intravitale) en utilisant la microscopie confocale et multiphotonique représentent une autre expansion de l'approche, et il y a des articles en suspens qui utilisent et traitent de ces approches 16-19.

Les réponses des cellules à l'anti-cancmédicaments er ou de produits naturels sont déterminés à l'échelle moléculaire et cellulaire. Comprendre le traitement des réponses cellulaires et sorts suivants implique souvent la population (par exemple , des analyses moyennes., Immunoblot, des mesures entières de puits), ou points de temps fixes avec détection par immunofluorescence et la cytométrie de flux, qui mesurent des cellules individuelles. Hétérogénéité dans les réponses des cellules individuelles à des médicaments au sein d'une population, en particulier dans les tumeurs, peut expliquer en partie la variabilité de la réponse observée dans les lignées cellulaires et les tumeurs qui sont traités avec le même médicament à saturation. À long terme des approches longitudinales de suivre une seule cellule donnée ou une population de cellules est une approche moins commune , mais très puissant qui permet l'étude directe des voies de réponse moléculaire, différents phénotypes (par exemple., La mort cellulaire ou la division cellulaire), l' observation de la variabilité de cellule à cellule dans une population, et comment ces facteurs contribuent à la dynamique de la réponse de la population 20-22. Optimiste, pouvoird'observer et de quantifier les réponses des cellules individuelles contribuera à améliorer notre compréhension de la façon dont les médicaments fonctionnent, pourquoi ils ne parviennent pas toujours, et comment les utiliser au mieux.

La technique de la microscopie à long terme time-lapse, suivi longitudinal, et l' analyse des réponses des médicaments est disponible pour de nombreux chercheurs et peut être simple, en utilisant la lumière uniquement transmis à observer le phénotype des réponses 20,21. Les principales composantes de l'approche comprennent: la préparation appropriée des cellules d'intérêt, un microscope automatisé avec la chambre de l'environnement, un appareil photo intégré à un ordinateur pour acquérir et stocker les images, et le logiciel pour examiner le time-lapse et de mesurer et d'analyser les cellules et tous les biocapteurs fluorescents. Nous fournissons un protocole détaillé avec de nombreux conseils pour la conduite Vidéomicroscopie des cellules cultivées aussi longtemps que plusieurs jours en utilisant clair et / ou microscopie épifluorescence widefield. Ce protocole peut être utilisé pour toute lignée cellulaire qui peut être cultivée dans une culturepour étudier les réponses aux traitements anti-cancéreux. Nous fournissons des exemples de données acquises et analysées en utilisant plusieurs différents biocapteurs fluorescents génétiquement codés et un exemple de la microscopie à contraste de phase, discuter brièvement les différents types de sondes, les avantages et les inconvénients à long terme time-lapse et le suivi longitudinal, ce qui peut être appris pour cette approche qui est difficile à comprendre des approches non-directes, et quelques variations que nous espérons être d'intérêt et de la valeur pour les chercheurs inexpérimentés qui ne l'ont pas envisagé d'utiliser l'approche et à des chercheurs expérimentés.

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Protocol

Le protocole suivant utilise des paramètres définis par les expériences sur les figures 4 et 6 en ce qui concerne les paramètres d'acquisition et les conditions expérimentales. Bon nombre de ces paramètres peuvent être modifiés pour adapter d' autres expériences (c. -à- temps d'exposition, binning, canaux fluorescents, etc.). Toutes les procédures doivent respecter les directives et les règlements institutionnels et être approuvé par le comité de biosécurité institutionnelle. sites fabricant de Microscope contiennent d'excellentes informations pour l'imagerie des cellules vivantes.

1. Microscopes et logiciel d'imagerie

  1. Effectuer l'imagerie cellulaire en direct sur une grande variété de microscopes inversés. Les microscopes les plus courants sont Widefield épifluorescence et filature disque confocale. Ici, utiliser un microscope automatisé et motorisé Widefield épifluorescence avec une source de lumière aux halogénures métalliques de 200 watts.
  2. Obtenir un stade supérieur ou microscope chambre environnementale. Ici, utiliser une étape-tchambre environnementale op.
  3. Utilisez un logiciel commercial pour faire fonctionner des microscopes avec des utilitaires pour exécuter la microscopie time-lapse.
  4. Utilisez un logiciel disponible dans le commerce ou ImageJ pour l'analyse d'image. Beaucoup d' autres outils d'analyse sont disponibles dans le commerce, et il existe des programmes sur mesure dont beaucoup ont été publiées 8,18.

2. Visualisation des processus cellulaires et réponses phénotypiques

  1. Visualisez les cellules par microscopie en fond clair. Contraste d'interférence différentiel et contraste de phase seul peut être très instructif d'étudier les réponses aux réponses aux médicaments anti-cancer. Ces procédés peuvent comprendre la mitose, la motilité cellulaire et l'apoptose.
  2. Visualiser les structures cellulaires, les organelles et les procédés de biocapteurs fluorescents. Les sondes fluorescentes sont informatives dans le suivi des processus subcellulaires spécifiques. Ceux-ci peuvent inclure la dynamique des microtubules, des mitochondries et la dynamique du réticulum endoplasmique, l'accumulation de protéines et la localisation, etsignalisation moléculaire (par exemple., la phosphorylation, le calcium).

3. Préparation des échantillons

  1. Cultiver des cellules en culture cellulaire plats certifiés par une norme, un incubateur de culture cellulaire humidifiée (par exemple 37 ° C, 5% de CO2, 80% d' humidité relative).
    1. Cultiver les cellules HT1080 dans du MEM avec EBSS. Compléter le support avec 10% v / v de FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / pyruvate de sodium v ​​et 1% v / v d'acides aminés non essentiels.
  2. Deux jours avant l'imagerie, les cellules plaque 50.000 HT1080 Fucci dans 3 puits d'un # 1.5 verre plat en bas de 12 puits dans une hotte laminaire d'écoulement stérile certifié. Ajuster le nombre de cellules ensemencées pour atteindre ~ 60% de confluence pour le début de l'expérience. En fonction de la lignée cellulaire et de la nature de l'expérience, la densité cellulaire peut être inférieure.
    Remarque: La densité cellulaire peut avoir une influence profonde sur la croissance de la lignée cellulaire et les résultats expérimentaux. Compter les cellules afin de minimiser l'expérience à l'expérience variability en raison de la densité.
    1. Selon la chambre de l'environnement et les conditions nécessaires à l'expérience, les cellules de la plaque dans des boîtes à puits unique (typiquement 35- ou 60-mm), 4 bien des plats de 35 mm, 6, 12 ou 24 plaques de culture cellulaire, ou Coverslip diapositives dans divers formats. Utiliser des plaques de verre à fond avec # 1.5 verre comme la plupart des lentilles de l'objectif sont optimisés pour cette épaisseur de verre, et de l'imagerie par culture cellulaire en plastique est très pauvre.
      Remarque: Certaines lignées de cellules ne se développent pas et survivent sur le verre. Dans ces cas, le verre peut être revêtue afin d'améliorer l' adhérence des cellules (par ex., La poly-lysine ou de collagène). Certaines entreprises fabriquent optique culture cellulaire en plastique, il doit être déterminé de manière empirique si cela est une option viable.

4. Chambre de l'environnement Set-up

  1. Avant toute expérimentation, mise en place de la chambre de l' environnement afin qu'il fonctionne à ~ 80% d' humidité et ainsi de la température à la position de l' échantillon est de 37 o C. La plupart des cellules en culture croissent dans 5% de CO 2 / équilibre atmosphère d'air due à un tampon de bicarbonate de sodium dans le milieu. En fonction de la mise en place, soit définir le contrôleur de l' environnement à 5% de CO 2 et il se mélange à 100% de CO 2 avec de l' air, ou pré-mélangé, certifié gaz de l' air 5% de CO 2 / de l' équilibre. Suivez les instructions du fabricant pour des débits de gaz.
    Remarque: Certaines lignées cellulaires se développent dans CO 2 moyen -indépendante auquel cas ils peuvent être maintenus sans CO 2. Spécialement conçu support de formation d'image est également disponible, qui limite l'addition de composés autofluorescentes. La croissance des thèses médiums pour le type cellulaire souhaité doit être déterminée empiriquement au préalable.
  2. Avant imagerie, d'assurer le réservoir d'eau est rempli (en suivant les instructions du fabricant) avec de l'eau distillée stérile. Allumez la chambre de l'environnement à la température désirée et le placer dans l'encart de platine du microscope. Pour économiser de l'essence, ne commencez pas le débit à ce point.
    Remarque: S'il y a un espace libre entre la chambre stade supérieur et encart de scène et / ou de toute tension sur la connexion des cordons à la chambre, il peut introduire des artefacts de mouvement dans l'expérience.
    1. Lay morceaux de pellicule de paraffine sur les bords de l'insert d'ouverture de scène avant d'insérer la chambre en elle pour coupler la chambre à l'étage, et assurez-vous qu'aucune connexion tirent sur la chambre.
  3. Laisser la chambre à équilibrer à 37 o C. Maintenir une température stable pour éviter les fluctuations de température lors de l'imagerie qui peut affecter la physiologie cellulaire et d'introduire la dérive. Atteindre l'équilibre de température nécessite généralement 30 min à 1 h, en fonction de l'environnement.
    1. Insérez un plat «factice» avec de l'eau dans les puits dans la chambre tout en chauffant. Un plat d'imagerie rempli d'eau imite l'échantillon, qui aidera à assurer la chambre est suffisamment réchauffé et stabilisé. Remplir la chambre avec de l'eau stérile préchaufféeréduit le temps nécessaire à la stabilisation de la température et réduit au minimum la diminution de la température lors de l'addition de l'échantillon expérimental.

5. Microscope Set-up

  1. Allumez le microscope, ordinateur associé, et tous les périphériques nécessaires.
    1. En fonction de la source de lumière, attendez pour l' allumer jusqu'à ce que nécessaire (par ex., LED).
  2. Avec la tourelle objectif dans une position basse, sélectionnez l'objectif 20X 0,7 NA à utiliser.
  3. Placer l'échantillon sur l'objectif - ce sera plus facile de trouver les cellules lorsque l'échantillon est dans la chambre.
  4. Définir les paramètres d'imagerie à ce moment si elles sont connues des expériences précédentes.

6. Le transport des cellules à Microscope et dans la chambre

  1. Transport des cellules à imager de l'incubateur à la chambre de l'environnement. Assurez -vous que cela soit fait rapidement pour limiter les effets d'une relativement faible CO 2
  2. Placez les cellules dans un récipient en polystyrène étanche ou un sac isolé pour éviter les grands changements environnementaux.
  • Insérez le plat d'imagerie de l'échantillon dans la chambre en suivant les instructions du fabricant.
  • Après que les cellules ont été fixés à l'intérieur de la chambre de l'environnement, sceller la chambre pour maintenir un environnement stable et tournez immédiatement à la source (s) de gaz atmosphérique.
    1. Comme certaines chambres environnementales n'utilisent pas un virage serré, couvercle étanche, pour retarder l'évaporation, la couche stérile, l'huile minérale certifiée embryon au-dessus du milieu de croissance. Enveloppez film de paraffine perméant gaz autour du périmètre bords du plat de l'échantillon en faisant attention à ne pas obstruer la zone d'imagerie en verre. , les méthodes d'humidification secondaires localisées peuvent être employées. Condensation sur le couvercle de la boîte d'échantillon peut diminuer performance de la microscopie en fond clair.
  • Afin de minimiser les effets de la dérive thermique tôt au cours de l'expérience, attendez 30 minutes avant de commencer le time-lapse. Le temps nécessaire varie en fonction de la taille du plat d'imagerie et d'autres facteurs. Déterminer de façon empirique.

    • 7. Configuration de l'imagerie

    1. Sélectionnez les conditions d'imagerie qui représenteront le mieux les données. Prendre des précautions pour éviter la phototoxicité en limitant les temps d'exposition, en utilisant la lumière d'intensité plus faible et la sélection des sondes qui sont excités par des longueurs d'onde de la lumière.
    2. Définir x, y et z plane et la longueur d'onde souhaitée (s) pour chaque position à imager. La résolution temporelle est limitée par le nombre de positions et de longueurs d'onde. Pour long terme time-lapse de la plupart des processus cellulaires, acquérir une image toutes les 10 - 20 min; de plus haute résolution temporelle (intervalles courts, par exemple., 1 min) fournit plus de points de données et le suivi des cellules donc plus robuste, mais entraîne également plus intégréeexposition à la lumière et de plus grands ensembles de données.
      1. Comme HT1080 FUCCI ont des protéines dynamiques fluorescentes vert et rouge (voir résultats représentatifs), utiliser les durées d'exposition suivantes: FITC / GFP - 50 msec, Texas Red / TRITC - 40 msec, fond clair - 20 msec. Utilisez un bac 2 x 2.
    3. Activer le logiciel autofocalisation contrôlé en utilisant les paramètres par défaut dans les paramètres avancés. Définir une plage de mise au point automatique de 10 pm avec la taille de l'étape recommandée. Assurez-vous de le faire avant de commencer le time-lapse. Autofocus avec des images en fond clair et jamais avec fluorescence pour réduire la phototoxicité et photoblanchiment.
      1. Utilisez un logiciel contrôlé des systèmes de mise au point automatique sur un microscope avec une platine motorisée, et se concentrer directement sur l'échantillon. Cependant, ils ne peuvent limiter la vitesse d'acquisition de l'expérience. Hardware contrôlé systèmes de focalisation en continu fonctionnent bien pour la microscopie time-lapse et d'améliorer la vitesse, permettant plusieurs positions à imager ou un taux d'acquisition plus élevé. Cependant, ilscompter sur la détection de l'interface air-verre et peut perdre le focus de l'échantillon avec des variations dans l'épaisseur du verre à travers le puits.
    4. Remplacer la moitié du milieu par un milieu contenant la concentration de médicament désiré qui a été chauffé à 37 ° C le remplacement des médias partiel contribue à réduire la dérive thermique. Les conditions de cette expérience sont des véhicules (DMSO), 1 uM selinexor et 10 uM PD0332991.
      Remarque: Cette étape peut également être effectuée après le démarrage de l'acquisition par une pause et de redémarrer l'expérience. Cela permet un suivi longitudinal des réponses pré- et post-médicament de cellules individuelles. Si la stabilité ou le métabolisme drogue est une préoccupation, une pause et le remplacement des médias peut être fait avec la même méthode. Pour tester la dégradation du médicament ou du métabolisme, des médias à partir de cellules traitées peuvent également être placés sur des cellules naïves pour tester l'action des médicaments.
    5. Démarrez le time-lapse.
    6. Comme le time-lapse fonctionne, vérifiez que les champs imagées restent au point et l'chamber maintient une humidité de 37 o C.
      1. Réglez la mise au besoin en arrêtant l'acquisition au cours de l'intervalle de temps entre les points de temps.
    7. Si nécessaire, ajouter de l'eau à la chambre lors des expériences plus longues. Éviter de refroidir la chambre en ajoutant de l' eau distillée stérile préchauffée à 37 ° C.

    8. Mettre fin à la Time-lapse

    1. Lorsque l'expérience a exécuté jusqu'à la fin, arrêtez l'acquisition si elle n'a pas été définie pour arrêter automatiquement.
    2. Assurez-vous que le time-lapse a été enregistré correctement sur le disque dur, bien que la plupart des logiciels enregistrent automatiquement lors de l'acquisition si pas fini correctement les données peuvent être perdues.
    3. Retirer la chambre du microscope et de disposer des cellules dans les déchets biologiques en suivant les procédures de biosécurité institutionnelle approuvés.

    9. Suivi longitudinal et analyse des données Time-lapse

    1. Choisissez la méthode d'analyse qui estappropriés pour les processus biologiques d'intérêt. De nombreux plugins pour ImageJ, les programmes utilisant MatLab, et les plates-formes personnalisées ont été produits pour des applications spécifiques. La méthodologie suivante concerne le suivi des noyaux et l' analyse des sondes fluorescentes nucléaires , comme montré sur les figures 4 et 5.
    2. Ouvrez les piles d'images .tif pour les canaux utilisés dans ImageJ. Sinon, les fichiers natifs ouverts à partir du programme d'acquisition directement dans ImageJ en utilisant le plugin Bioformats.
    3. Dessinez une région d'intérêt (ROI) dans le noyau d'une cellule en utilisant l'image de fond clair ou le canal d'étiquette nucléaire (le cas échéant) et l'ajouter au gestionnaire de ROI. Remarque: Si les cellules imagées ont une étiquette nucléaire (par exemple, histone H2B-EGFP.), Puis le suivi automatique des cellules peut être utilisé pour créer des régions d'intérêt (ROI) représentant des noyaux individuels à travers le temps.
    4. Passer au prochain point de temps et de positionner le retour sur investissement dans le même nucleus. Ajouter le retour sur investissement pour le gestionnaire de ROI.
    5. Continuer de suivre et de faire ROIs pour la cellule individuelle jusqu'à ce qu'il y est un événement cellulaire (mitose, apoptose, etc.) Ou la cellule ne peut plus être suivi (ie., Se déplace hors du cadre ou l'expérience se termine).
    6. Lorsque ROIs ont été établies pour les cellules à travers le temps, ils sont sur le terrain, les superposer sur les canaux fluorescents d'intérêt. Mesurer l'intensité moyenne de la fluorescence dans chaque canal pour chaque point temporel. Enregistrer la liste de retour sur investissement pour une utilisation ultérieure.
      1. Diverses mesures peuvent être effectuées à l'intérieur de la ROI pour des applications dans différentes expériences. Cliquez sur Analyse → Set mesures ... pour faire apparaître un menu pour choisir la méthode d' analyse (par exemple., L' intensité dans le retour sur investissement, d'intensité intégrée, etc signifie.).
    7. Notez le destin des cellules pour les cellules individuelles (par exemple., L' apoptose, la division, la survie) , tandis que le suivi. Ceci permet la création de courbes de survie et furtheanalyse de la population de r.
    8. Avec l'intensité moyenne pour les deux canaux, créer un nuage de points pour afficher la dynamique du cycle cellulaire en réponse à la thérapeutique (figure 5B, C).
      Note: Les parcelles peuvent être créées pour des cellules individuelles dans le temps ou en moyenne sur une population de cellules chenillés. l'imagerie quantitative peut être critique pour l'établissement des réponses complexes et des relations de cellule en réponse à la thérapeutique du cancer. Vidéomicroscopie à long terme, le suivi longitudinal et l' analyse des données est un processus en plusieurs étapes, avec de nombreuses options pour le type d'outils de microscopie et d' analyse, et suit le schéma général présenté à la figure 1.

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    Representative Results

    À long terme de la microscopie time-lapse et le suivi longitudinal directe permet l'étude de nombreux effets anti-cancer pendant la réponse aux médicaments. Après les grandes lignes de la figure 1, plusieurs exemples de cellules sont présentés exprimant reporters fluorescents validés traités avec des médicaments anti-cancéreux, suivis et analysés en utilisant des approches différentes.

    Phase microscopie à contraste seul est très instructif et des rapports sur interphase contre la mitose, la durée de la mitose et de l' arrestation, la division cellulaire anormale, et la mort cellulaire 21,23,24 robuste. Les médicaments qui ciblent la division cellulaire, les médicaments anti-mitotiques souvent appelées, continuent d'être développés. Figure 2 et Films 1 et 2 montrent des exemples d'une paire de lignes appariées mammaires cancéreuses dérivées cellules MCF7 qui ne diffèrent que par leur statut de p53, traitées avec 500 nM d'un type de médicament anti-cancéreux qui cibleet inhibe la protéine moteur mitotique, kinésine-5 (KSP1, KIF11, Eg5), ce qui entraîne la mitose 20 prolongée. Les cellules MCF7 de type sauvage (figure 2A) sont un modèle pour étudier p53-dépendante arrêt du cycle cellulaire 25-27. Les cellules de type sauvage entrent en mitose, restent pendant plusieurs heures, éventuellement laisser et largement arrêter à l' induction de p53 25. Quand p53 est éliminé par knock - down stable p53 (p53 MCF7 sh), au lieu d'arrêter après qu'ils aient quitté la mitose, les cellules passent par des cycles répétés (figure 2B). Les cellules ont été suivies manuellement et l'indice mitotique et le pourcentage de cellules qui entrent dans une deuxième mitose ont été évaluées (figure 2C, D). Nous observons que la cellule p53 sh suivi divise quand il entre dans un second tour de la mitose plutôt que d'arrêter et de quitter la mitose sans division. Bien que non représentée ici la durée des événements mitotiques, temps entre mitoses successives, pour cent des divisions cellulaires, et les événements de la mort cellulaire associés peut aussi être sévidées 20,21.

    Les taxanes, par exemple le paclitaxel et le docétaxel, sont la chimiothérapie courante pour de nombreux cancers, y compris ceux qui sont difficiles à traiter comme ceux du sein du pancréas et avancé. Paclitaxel se lie à la plus-fin dynamique des microtubules et les stabilise, ce qui empêche leur fonction normale. Paclitaxel a noté des effets dose-dépendants, et même à de faibles concentrations peut perturber la normale progression mitotique et la ségrégation des chromosomes 16. La ségrégation fidèle des chromosomes est essentielle à la prolifération cellulaire normale et quand anormale peut entraîner une aneuploïdie qui peut déclencher un arrêt du cycle cellulaire, mais aussi agir en tant que moteur de la progression du cancer. Figure 3 et Movie 3 montrent des cellules HeLa cervical cancer dérivé exprimant de manière stable la chromatine marqueur histone-2b fusionné à mCherry et la bêta-tubuline fusionné à la EGFP (non représenté) dans un milieu de croissance normal traité avec 1 nM de paclitaxel. Dans cepar exemple, l'entrée et la progression à travers la mitose peut être suivie. Le moment de la mitose semble normal dans cette cellule, mais l'alignement et la ségrégation des chromosomes ne sont pas, ce qui entraîne des renflements nucléaires et micronoyaux qui sont des structures indiquant une mauvaise ségrégation des chromosomes. Micronoyaux sont sujettes à des dommages et chromothripsis l' ADN, qui est la fragmentation à grande échelle des chromosomes ou chromatine - cela a des implications importantes dans l' évolution de la tumeur 28,29. Bien que non représentée ici, l'origine de micronoyaux par rapport à d'autres structures mitose et le sort de ces cellules peuvent être directement suivis à l'aide à long terme time-lapse. En outre, un marqueur chromatine exprimé par un endommagement de l'ADN rapporteur pourrait être utilisé pour établir la relation entre la ségrégation des chromosomes, la formation de micronoyaux et de lésions de l'ADN.

    reporters fluorescents permettent des processus cellulaires énumérables à être suivis et nouveaux journalistes sont continuellement développés. example, le cycle cellulaire est constitué de phases qui sont d' un intérêt particulier dans le développement de thérapies anticancéreuses ciblées. Figure 4 et Movie 4 montre une lignée cellulaire de fibrosarcome dérivé (HT1080) que de manière stable co-exprime deux journalistes appelés, les indicateurs du cycle cellulaire ubiquitine fluorescent (FUCCI) 30. Dans le système ici, une partie du polypeptide CDT1 est fusionnée à mKO2 (monomère Kusabira orange, 2) et augmente en G1 en phase et se dégrade au début de la phase S, et une partie de Geminin est fusionnée à mAG (monomère vert Azami) et augmente à la mi-phase S et est dégradée lors de l'anaphase. Cette cellule se trouve dans un milieu de croissance normal et progresse à travers le cycle cellulaire dans les 15 heures. La figure 5A, B et film 5 présentent les mêmes cellules dans du milieu normal traitées avec 10 uM PD0332991, un inhibiteur de CDK4 / 6. Les cellules progressent dans G2 phase et se divisent normalement, et fortement arrêter dans le G1-phase ultérieure, ce qui indique le potentiel d'effetive effets cytostatiques dans les tumeurs en croissance. Figure 5C, D et Movie 6 présentent les mêmes cellules dans un milieu normale traitée avec une petite molécule appelée selinexor (KPT-330), un puissant inhibiteur de la protéine d'exportation nucléaire, exportin-1 (XPO1, alias CRM1 ). Ces composés sont appelés inhibiteurs sélectifs de l' exportation nucléaire (SINE) et leurs effets anti-cancer sont actuellement sous enquête 31,32. Les résultats du traitement dans SINE phénotypes du cycle cellulaire solides et la mort cellulaire 33,34. Cet exemple montre une cellule qui progresse à travers G1 en phase avec une cinétique normale (environ 6 h), mais des expériences de retard dans la progression de la phase S, comme indiqué par la période à la fois le signal rouge et vert (environ 3 heures dans le contrôle, mais 10 dans SINE traité ). Cette cellule meurt à la fin de S- ou G2-phase après 21 h 30 min; un cycle cellulaire normal est d'environ 15 heures. Les effets de selinexor sont à l'étude pour le sang différent et tumeurs solides 35.

    Figure cellules HT1080 6 et Movie 7 montrent qui expriment de manière stable un ADN double brin dommages reporter, mCherry-BP1-2 36 dans la croissance normale milieu traité avec 10 uM d'étoposide (VP-16), un poison topo-isomérase II. Ce journaliste est composé d'une partie de l'ADN double brin protéine du site de rupture, 53BP1 qui est fusionnée à mCherry. Le noyau de cette cellule a été suivi using le plugin analyser des particules dans ImageJ et le signal mCherry-BP1-2 intégré a été mesurée dans chaque trame après seuillage sur les valeurs qui ont éliminé la sonde nucléaire soluble. dommages à l'ADN est minime pour les 10 premières heures, puis augmente régulièrement. Les inhibiteurs de la topoisomérase II sont connus pour affecter particulièrement S et G2 phase, lorsque l'enzyme est la plus active 37,38. Les cinétiques observées dans cet exemple pourrait indiquer le cycle cellulaire dommages associés; combinant mCherry-BP1-2 avec des journalistes Fucci pourrait démontrer le calendrier des dommages qui peuvent ensuite être liée à la cellule sort.

    Figure 1
    Figure 1. Présentation de l' utilisation à long terme Microscopie Time-lapse et le suivi longitudinal pour étudier Anti-cancer Réponse de la drogue. Les cellules dans des plats d'imagerie cellules vivantes appropriées étiquetés comme désiré sont imagées, des cellules ou des régions d'intérêt sont suivis, et les données sont analysé. De nombreuses méthodes existent pour suivre et quantifier les cellules, certains sont indiqués ici. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 2
    Figure 2. contraste de phase Time-lapse Microscopie Affiche p53-dépendance après Anti-mitotique traitement de la toxicomanie. De type sauvage (A) et p53-knockdown (B) cellules MCF7 ont été traitées avec 500 nM Kinesin-5 inhibiteur et imagées toutes les 10 min pour 96 h en utilisant la microscopie à contraste de phase avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. Les cellules individuelles ont été suivies manuellement pour cent et la mitose et si la cellule progresse à une autre au cours de la mitose nouveau time-lapse ont été notés. Les flèches indiquent la cellule qui est suivi. La cellule sh p53 (B) se divise en entrant dans une seconde mitose. (C) Les deux lignées cellulaires show arrestation mitotique prolongée comme indiqué par la mitose pour cent de crête élevée (premier bleu et flèches rouges). (C, D) Près de 90% des cellules sans p53 (sh p53, n = 87) montrent une progression continue (flèches rouges) , comparativement à 20% de type sauvage (n = 130). Les barres d'erreur indiquent l'écart type. Bar = 20 um. Films 1 et 2. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3. La chromatine Marker Histone 2b révèle Preuve de Chromosome Ségrégation Anomalies après Low-dose Paclitaxel traitement. Paclitaxel est un médicament microtubules ciblé qui en résulte, les défauts complexes de concentration-dépendante de la croissance et la division cellulaire. L'organisation de la chromatine informe sur les différents états de cellules, y compris le stadede la mitose et de la mort cellulaire. les cellules HeLa exprimant de façon stable à la fois H2b-mCherry et β-tubuline-EGFP ont été traités avec 1 nM de paclitaxel. Cette cellule se trouve initialement dans l'interphase, progresse à travers les étapes de la mitose et de fractures. Bien que le temps de la mitose semble normal, il existe des preuves d'attachement et de ségrégation des chromosomes erreurs qui sont résolus (flèches). Le sort de ces cellules peut être déterminée directement par le suivi longitudinal. Contraste de phase (non représenté) et des images fluorescentes ont été acquises à 1 image par 10 min avec un objectif 20X Ph2 0,70 NA. Bar = 10 pm. Film 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4. Marqueurs de cycle cellulaire fluorescentes permettent un suivi direct de la progression du cycle cellulaire.(A) Un champ de cellules HT1080 de fibrosarcome vivant exprimant le système FUCCI imagé par contraste de phase et fluorescence. (B, C) ​​La cellule mitotique dans la zone en pointillés dans le panneau A est suivi. progresser normalement à travers le cycle cellulaire en environ 15 heures. Après la mitose, les cellules sont brièvement dim, puis deviennent rouges à mesure qu'ils progressent dans et à travers G1-phase. Lorsque les cellules entrent en phase S, la sonde rouge CDT1 est dégradée et les verts sonde Geminin augmente. La brève période d'environ 3 heures où les deux sondes sont présents, indique au début de la phase S. Comme les cellules progressent à travers S- et G2 phase et dans la prochaine mitose qu'ils restent verts. La sonde verte est dégradée sur anaphase de la division cellulaire. Contraste de phase et des images fluorescentes ont été acquises à 1 image par 10 min avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. Bar = 10 pm. Film 4. S'il vous plaît cliquez ici pour view une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5. Cycle cellulaire des effets spécifiques et associés la mort cellulaire. La même lignée cellulaire comme dans la figure 4 , mais traités avec deux molécules différentes qui représentent des cibles différentes anti-cancer. Les temps après traitement sont indiqués. (A, B) après traitement d'une cellule / G2 en phase S tardive avec 10 uM PD0332991 CDK4 / 6 inhibiteur, il cellule progresse normalement à la mitose (M) et divise. Une cellule fille est suivie par la mesure des intensités fluorescentes rouges et vertes dans la région d'intérêt dans le noyau. La cellule reste arrêté en G1-phase pour environ 40 heures. (C, D) après traitement d'une cellule de fin de la phase G2 à 1 uM selinexor, il cellule progresse normalement à la mitose (M) et divise. Une cellule fille est suivie et il entre dans G1 phase, progresse à traversun S-phase précoce prolongée (le signal rouge et vert), transition vers le seul vert et meurt après 21 h 30 min. Les données indiquent la progression de la phase S est affectée par le traitement selinexor. Contraste de phase et des images fluorescentes ont été acquises à 1 image par 10 min avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. Bar = 10 um. Films 5 et 6. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 6
    Figure 6. Dynamique ADN de dommages après traitement de la toxicomanie. Beaucoup de thérapies anti-cancer entraînent des lésions de l' ADN qui peuvent profondément influer sur la réponse cellulaire et la réussite du traitement. des cellules HT1080 exprimant de manière stable à la fois le double brin marqueur d'altération de l'ADN-mCherry BP1-2 et H2b-EGFP (non représenté) ont été traitées avec 10 uM de l'étoposide topoisomérase II et l'ADN de la drogue dAmage a été suivi. (A) Le nombre et l' intensité de l'augmentation des foyers après l' étoposide. Il y a d'abord un retard, ce qui indique des effets possibles du cycle cellulaire compatible avec le mécanisme connu de l'étoposide. En 22 h 50 min cette cellule a accumulé des niveaux élevés de dommages. Bien que non représentée ici, le sort de cette cellule peut être déterminée par le suivi direct. (B) Un retour sur investissement correspondant au noyau obtenu par le signal H2b-EGFP a été suivie à l' aide de suivi des particules dans ImageJ et le signal BP1-2 mCherry intégré a été quantifiée et tracée au fil du temps. Le retard du signal jusqu'à environ 10 h est noté, suivie d'une augmentation persistante. images fluorescentes ont été acquises à 1 image par 10 min avec un objectif 40X PH2 0,75 NA. Bar = 10 pm. Film 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


    Film 1. contraste de phase Time-lapse Microscopie des cellules de type sauvage MCF7 après. Cellules de type sauvage MCF7 traitement anti-mitotique médicaments ont été traités avec 500 nM Kinesin-5 inhibiteur et imagé toutes les 10 minutes pendant 96 heures en utilisant la microscopie à contraste de phase avec un 20X PH2 0,70 lentille NA. Prolongée arrêt mitotique et la sortie de la mitose peuvent être observées, comme décrit dans la figure 2. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    Moive 2
    Film 2. contraste de phase Time-lapse Microscopie de p53-knockdown MCF7 cellules après traitement des cellules anti-mitotique médicaments. MCF7 exprimant de manière stable un petit ARN en épingle à cheveux ciblant p53 pour la dégradation ont été traités avec 500 nM Kinesin-5 inhibiteur et imager toutes les 10 minutes pendant 96 heures en utilisant la microscopie à contraste de phase avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. Prolongée arrêt mitotique et plusieurs tours de la mitose peuvent être observées, comme décrit dans la figure 2. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    Moive 3
    Film 3. Fluorescent Time-lapse Microscopie de cellules HeLa après à faible dose des cellules Paclitaxel traitement. HeLa exprimant de façon stable H2B-mCherry et β-tubuline-EGFP ont été traités avec 1 nM de paclitaxel. Attachement Chromosome et les questions de ségrégation peuvent être observées, comme décrit dans la figure 3. Les images ont été acquises toutes les 10 minutes avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Moive 4
    Film 4. Marqueurs de cycle cellulaire fluorescentes permettent un suivi direct de la progression du cycle cellulaire. Cellules HT1080 exprimant le système FUCCI ont été suivis longitudinalement pendant la microscopie time-lapse. La cellule va dim après la sortie de la mitose, puis devient rouge lorsque la cellule progresse dans G1-phase. Comme la cellule entre dans la phase S, il devient jaune comme le vert sonde Geminin augmente et la sonde rouge CDT1 est dégradée. La cellule reste verte à mesure qu'elle progresse à travers S- et G2-phase. dégrade Le vert comme les cellules entre dans anaphase. Quantification de cette cellule est représentée sur la figure 4. Les images ont été acquises toutes les 10 minutes avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. S'il vous plaît , cliquez ici pour télécharger ce fichier.

    Moive 5 "src =" / files / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    5. Film HT1080 cellule exprimant des marqueurs fluorescents du cycle cellulaire après traitement avec un inhibiteur en phase G1. Cellules HT1080 exprimant le système FUCCI ont été traitées avec 10 uM PD0332991, un inhibiteur de CDK4 / 6. La cellule chenillé progresse normalement à la mitose et la divise. Une fille est suivie, et reste rouge dans G1 pendant toute la durée du film. Quantification est représenté sur la figure 5. Les images ont été acquises toutes les 10 minutes avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. S'il vous plaît , cliquez ici pour télécharger ce fichier.

    Moive 6
    Film 6. HT1080 cellule exprimant fluorescentes marqueurs du cycle cellulaire après traitement avec le Exportin-1 Inhibitor, Selinexor. Cellules HT1080 exprimant le système FUCCI étaient régaled avec 1 uM selinexor. Cette cellule fin G2 phase a été suivie par mitose. Une cellule fille progresse ensuite dans la phase G1 (rouge) et entre dans la phase S (jaune). La cellule progresse lentement à travers S phases jusqu'à ce qu'elle entre-S fin / G2 phase et meurt après 21 h 30 min de traitement. Quantification est représenté sur la figure 5. Les images ont été acquises toutes les 10 minutes avec un objectif 20X PH2 0,70 NA. S'il vous plaît , cliquez ici pour télécharger ce fichier.

    Moive 7
    Film 7. ADN Dommages Dynamics après traitement avec un topoisomérase II des cellules HT1080 Inhibitor. Exprimant de manière stable le double brin dommages de l' ADN marqueur mCherry-BP1-2 et H2B-EGFP ont été traitées avec 10 uM étoposide, un inhibiteur de la topoisomérase II. Le mCherry-BP1-2 est affiché dans le film. Comme le traitement continueras, le signal des augmentations mCherry-BP1-2, indiquant une augmentation des dommages d'ADN double brin. Quantification est représenté sur la figure 6. Les images ont été acquises toutes les 10 minutes avec un objectif 40X PH2 0,75 NA. S'il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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    Discussion

    Avantages de Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal

    Le microscope est un instrument idéal pour des études longitudinales de la réponse aux médicaments car il permet aux enquêteurs de suivre les cellules individuelles et leurs destins ainsi que l'ensemble de la population. Variabilité dans la réponse aux médicaments au sein d'une population de cellules est un enjeu majeur pour la conception thérapeutique anti-cancer. Le suivi longitudinal des cellules individuelles permet aux enquêteurs d'observer cette variabilité et commencent à comprendre les mécanismes sous-jacents et les conséquences en ce qui concerne la population de cellules. Utilisant une variété de sondes fluorescentes offre une multitude de façons d'observer et de comprendre les deux phénotypes de réponse communes et rares. Le moment et la contribution des différents destins cellulaires à la réponse de la population, les relations entre les phénotypes et sorts spécifiques, et les différences de réponse entre des lignées cellulaires ou l'état lors du traitement sont des exemples de ce qui peut être appris. De nombreux procédés associés au cancer peuvent être étudiés. Certains qui ne sont pas mis en évidence dans cet article incluent la mort cellulaire à l' apoptose, l' autophagie, et les journalistes de nécrose 39-42, l' invasion des cellules 43,44, et la dynamique de p53 qui déterminent les décisions du destin cellulaire 27. En outre, cette approche ne se limite pas à des études dans la lutte contre le cancer thérapeutiques études. Les mêmes principes peuvent être utilisés pour étudier de nombreux autres processus biologiques , y compris la mitose 45 la dynamique du cytosquelette 46,47 et intracellulaire de signalisation 48.

    Time-lapse microscopie fluorescente peut aussi fournir des données de localisation et de l'intensité de protéines et de molécules d'intérêt. Non seulement les changements dans le niveau important de la réponse au médicament protéique, mais la localisation proprement dite (ou inadéquate) des protéines dans la cellule est essentielle pour comprendre la réponse. Vidéomicroscopie fournit des données sur l' endroit où les protéines sont localisées (par exemple., Le noyau, le cytosol, organites spécifiques,etc.) après traitement de la toxicomanie et de la façon dont la localisation et les niveaux totaux changent au fil du temps à un niveau cellulaire et seule population.

    Défis et limites

    Malgré les points forts de la microscopie time-lapse et analyse longitudinale des cellules individuelles, il y a des limites. rapporteurs de fluorescence sont limitées par leur stabilité et leur spécificité. Lors de la conception des protéines de fusion fluorescentes, il est essentiel de choisir une sonde qui est photo-stable et clair, mais il est également nécessaire d'examiner les effets de l'étiquette fluorescente étant attachée à la protéine d'intérêt en ce qui concerne sa fonction normale et la capacité de localiser correctement . Ces questions ont été examinées en détail ailleurs et il y a beaucoup de protéines marquées fluorescentes disponibles qui ont été publiées 15,49,50. D'autres étiquettes ou marqueurs fluorescents peuvent être ajoutés aux cellules, et les soins doivent être prises pour veiller à ce qu'ils ne sont pas toxiques. Dans notre expérience, ces pvêtements, par exemple des marqueurs mitochondriaux (potentiel de membrane cellulaire) ou perméable à des colorants d'ADN, ont tendance à blanchir plus facilement et sera diluée, en raison de la prolifération cellulaire.

    En outre, il existe de nombreux défis techniques avec la croissance et l'observation des cellules au microscope. Instabilité en ce qui concerne la température, l'humidité, l'atmosphère et la lumière aura des effets importants sur les cellules, ce qui entraîne une perte de données ou même toute l'expérience. Problèmes de stabilité concernant la capture d' image peut être vu dans les films 1 et 2. Cet effet peut être minimisée par l'utilisation de film de paraffine (voir 4.2). Il y a aussi des algorithmes de stabilisation d'image disponibles pour le traitement post-acquisition, par exemple en utilisant ImageJ (NIH). Un aspect de long terme time-lapse qui est souvent négligé est la gestion des données et la taille de fichier. Même lorsque binning les données, une expérience unique time-lapse est souvent supérieure à 30 gigaoctets. Haute capacité, à haute vitesse, le stockage de données fiables et de transfert sont fortsly encouragée. En fonction du biocapteur fluorescent (s) étant imagé, il est souvent nécessaire d'acquérir des images pleine résolution, par exemple des capteurs nucléaires ou cytoplasmiques. Nous vous recommandons, si possible, de prendre des mesures pour maintenir la taille des fichiers, ce qui facilite l'utilisation des données, besoins informatiques moins exigeants, et l'amélioration des flux de travail.

    Phototoxicité est une préoccupation majeure lors de l'exécution à long Vidéomicroscopie terme. la lumière d'intensité élevée et de longues expositions peuvent conduire à photoblanchiment de sondes fluorescentes, le stress cellulaire et la mort cellulaire. Ces effets peuvent avoir des effets importants sur les données et conduire à de fausses déclarations de l'expérience. binning et le gain caméra peuvent être utilisés pour réduire les temps d'exposition. Les filtres de densité neutre dans le trajet de la lumière à réduire l'intensité de la lumière sur l'échantillon. Les longueurs d'onde de la lumière utilisée à l'image seront également affecter les cellules. longueurs d'onde plus courtes (UV, près UV) sont plus dommageables pour les cellules et entraînent photo-blanchiment à des taux plus rapides quedes longueurs d' onde (par exemple., rouge, rouge lointain). Choix de l'objectif peut également affecter l'imagerie conditions. La hausse des lentilles ouverture numérique (NA) va produire des images haute résolution, mais plus fort grossissement permet moins de lumière à transmettre de l'échantillon qui entraînera une hausse des temps d'exposition ou de la lumière plus intense. Un objectif doit être choisi avec un NA et grossissement approprié qui permettra de résoudre votre objet d'intérêt sans suréchantillonnage. Dans de nombreux cas, l'objectif le plus élevé ne peut pas être le choix le plus approprié. Avec des sondes nucléaires (figures 4, 5), un objectif à faible grossissement permet un plus grand champ d'être capturé, augmentant efficacement la taille de l' échantillon, sans compromettre la résolution de l'objet désiré. À long terme time-lapse en trois dimensions doit être réalisée avec précaution en raison de l'exposition lumineuse intégrée. Au moyen d' un disque tournant confocal, une caméra sensible (par ex., EM-CCD), le gain de la caméra, et un moteur piézo - électrique rapide pour la série Z est suggested pour réduire l'exposition de la lumière. acquisition z série rapide est également important de minimiser les artefacts dus au mouvement et à la dynamique des cellules de mouvement qui se produisent au cours de la période d'acquisition. L'analyse empirique des cellules non traitées à l'aide de nombreux paramètres différents peuvent être utiles pour déterminer les effets de la lumière fluorescente sur une lignée cellulaire donnée ou reporter. En outre, un témoin non traité doit être inclus dans chaque expérience pour déterminer les effets cytotoxiques des paramètres expérimentaux.

    Les variations de la Technique

    À long terme time-lapse est robuste et très flexible. En utilisant des techniques de co-culture, les différentes lignées cellulaires ou les mêmes lignées cellulaires exprimant différents rapporteurs peuvent être utilisés. Un exemple remarquable de ce que l'imagerie des cellules phagocytaires avec des cellules cibles qui meurent en réponse à un médicament anti-cancer. Un autre exemple pourrait être d'étudier l'impact de répondre cellules sur les cellules naïves de la drogue voisine. Couplé avec photo-activateable, photo-convertible, et les protéines fluorescentes photo-commutables, et des protéines modifiées qui peuvent être activés par la lumière pour déclencher des effets spécifiques (par exemple., KillerRed), il y a beaucoup de possibilités. Des approches plus complexes peuvent être utilisés qui emploient divers types spécialisés de la microscopie telles que la redistribution fluorescente après photoblanchiment, Förster transfert d'énergie par résonance (FRET), et super résolution (par exemple., La microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM), structure microscopique d'éclairage (SIM), ou une déplétion émission stimulée (STED)), et bien d'autres, et il y a des avantages et des limites de chaque approche.

    À long terme (par exemple., Semaines, mois) réponses et la récupération des cellules après élimination du médicament est essentielle à la compréhension anti-cancer action du médicament. plats à fond de verre GRILLE sont un outil précieux pour surveiller des cellules ou des régions spécifiques au sein d'une population / région à plusieurs reprises. Par exemple, avec un plat grillagée, le dr initialréponse ug peut être imagée en utilisant un time-lapse, le médicament peut être retiré, et les domaines spécifiques de la grille peut être imagée dans le temps ou soumis à supplémentaire time-lapse au moment voulu. Le fond de verre sur la vaisselle peut être enlevée soit par découpe avec un outil de traçage ou en utilisant un réactif du commerce, et les cellules sur le verre peut être colorée pour d'autres marqueurs d'intérêt pour l'activité associée exemple sénescence β-galactosidase, et par rapport à le time-lapse de comprendre l'histoire de la façon dont les cellules ont atteint cet état. Si la population de cellules est suffisamment grand, il peut également être soumis à un immunotransfert ou cytométrie de flux.

    échantillons épais ont toujours été difficiles à l'image, par exemple sphéroïdes dans divers matériaux de gel et de matrices. Les approches plus récentes , y compris confocal fluorescent ou multi-microscopie biphotonique 16,18,19,51 peut être utilisé pour étendre l'approche à une dans la compréhension in situ de la façon dont les cellules répondent à la thérapeutique anti-cancer. leétudes soi et un nombre croissant de scientifiques utilisant time-lapse pour étudier la réponse aux médicaments anti-cancer 24,52-54 démontrent clairement que nous nous dirigeons vers le développement d' une compréhension de la pharmacodynamique de cellules uniques qui aideront à améliorer notre capacité à utiliser des médicaments anti-cancer et peut-être plus efficacement prédire la réponse aux médicaments anti-cancéreux.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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    Médecine numéro 111 microscopie à fluorescence imagerie des cellules vivantes time-lapse la biologie du cancer la biologie cellulaire
    Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopie et le suivi longitudinal des cellules individuelles pour l'étude Therapeutics Anti-cancer
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    Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

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