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Medicine

鏡の国のアリス:単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します

Published: May 14, 2016 doi: 10.3791/53994

Abstract

抗癌剤への単一細胞の応答は、集団の応答を決定する際に有意に寄与し、したがって、全体的な結果の主要な要因です。イムノブロッティングは、フローサイトメトリーおよび固定細胞実験は、多くの場合、細胞が抗がん剤への対応方法を研究するために使用されています。これらのメソッドは重要ですが、彼らはいくつかの欠点を持っています。癌細胞と正常細胞の間で、異なるがん由来の細胞、および過渡希応答の間の薬物応答における変動性は、集団平均化アッセイを使用して直接追跡し、長手方向にそれらを分析することができることなく理解することは困難です。顕微鏡は、画像の生細胞に特に適しています。技術の進歩だけでなく、細胞の追跡だけでなく、様々な細胞応答の観察を可能解像度で日常画像セルに私たちを有効にします。私たちは、の連続タイムラプスイメージングを可能にする詳細なアプローチについて説明します基本的に限り、一般的に96時間まで、所望のようにのための薬剤応答中に細胞。アプローチのバリエーションを使用して、細胞が週間モニターすることができます。遺伝的にコード化された蛍光バイオセンサーの採用により多数のプロセス、経路および応答が続くことができます。我々は、追跡し、細胞増殖および細胞周期進行、染色体ダイナミクス、DNA損傷の定量化、および細胞死を含む例を示します。我々はまた、技術とその柔軟性のバリエーションを議論し、いくつかの一般的な落とし穴を強調表示します。

Introduction

単一細胞の生細胞の顕微鏡縦追跡は新しい技術ではありません。最古の顕微鏡から、愛好家や科学者は、単一の細胞および生物、彼らの行動、および開発1-3を観察し、研究しています。 1950年代のバンダービルト大学の後期のデビッド・ロジャースからの有名な例は、 黄色ブドウ球菌の菌と食作用4の最終的過程を追いかけて血液塗抹標本中のヒト好中球を示しています。化学勾配の検知、力学および細胞運動性、細胞の形状のダイナミクス、接着、および病原体の食作用の速度:この生細胞ムービーは、単一の実験で観察され、相関させることができるか、複数のプロセスの優れた説明図です。

完全に自動化された顕微鏡や高感度デジタルカメラの出現がfの範囲の細胞生物学の基本的な質問をするために顕微鏡を用いて研究者数の増加をもたらしました細胞は5,6を移動し、ダイナミクスや膜輸送9-11をオルガネラする7,8分割の仕方ROM。 1953年にフリッツ・ゼルニケのためのノーベル賞を獲得し、位相コントラスト(PC)を含む非蛍光、明視野顕微鏡、、、および微分干渉コントラスト(DIC)は、微小管の束を含む細胞および核だけでなく、サブ細胞構造の観察を可能に、染色体、核小体、細胞小器官ダイナミクス、太いアクチン繊維12。遺伝的にコードされる蛍光タンパク質や細胞小器官に対する蛍光色素の開発が飛躍的にタイムラプス顕微鏡13-15に影響与えています。この記事の焦点ではないが、共焦点および多光子顕微鏡を用いて細胞スフェロイドにおけるその場 (生体顕微鏡) 撮像がアプローチの別の拡大を表しており、使用してこれらのアプローチを16-19を議論する優れた記事があります。

抗CANCに対する細胞の応答えー薬または天然物は、分子や細胞スケールで決定されます。治療後の細胞応答と運命を理解することは、多くの場合、免疫蛍光検出に人口平均化アッセイ( 例えば 、免疫ブロット法、全ウェル対策)、または固定の時点を含み、単一の細胞を測定する、フローサイトメトリー。集団内の薬物への単一細胞応答の不均一性は、腫瘍において特に飽和で同じ薬物で処置された細胞株および腫瘍全体で見られる応答の変動のいくつかを説明することができます。指定された単一の細胞または細胞の集団を追跡する縦のアプローチ長期的には、分子応答経路の直接的な研究を可能にするあまり一般的ではないが、非常に強力なアプローチである、の異なる表現型( 例えば 、細胞死や細胞分裂)、観察細胞と細胞の集団内で変動し、どのようにこれらの要因は、人口の応答ダイナミクス20-22に貢献しています。楽観的、できること単一細胞の反応を観察し、定量化するためには、薬物は、彼らが時々失敗する理由、仕事、そしてどのように最高のそれらを使用する方法の我々の理解を向上させるのに役立ちます。

長期的タイムラプス顕微鏡、縦追跡、および薬物応答の解析の手法は、多くの研究者に利用可能であると表現型の応答20,21を観察する透過光のみを使用して、シンプルにすることができます。アプローチの主なコンポーネントは以下のとおりです。目的の細胞の適切な準備、環境室と自動顕微鏡、画像を取得し、保存するためのコンピュータと一体化したカメラ、および時間経過と対策を検討し、細胞を分析するためのソフトウェアを任意の蛍光バイオセンサー。私たちは、明視野および/または広視野落射蛍光顕微鏡を使用している限り、数日間培養した細胞のタイムラプス顕微鏡検査を行うための多くのヒントを詳細なプロトコルを提供します。このプロトコールは、培養で増殖させることができる任意の細胞株のために使用することができます抗癌治療への応答を研究します。我々は、取得したデータの例を提供し、複数の異なる遺伝的にコードされた蛍光バイオセンサーおよび位相差顕微鏡の例を用いて分析し、簡単に何をすることができ、プローブの異なる種類の、長期の時間経過、縦トラッキングの長所と短所を議論します非直接アプローチ、そして我々はアプローチを使用して考えていない経験の浅い研究者、および経験豊富な研究者に興味や価値があることを願っていますいくつかのバリエーションから理解することは困難である。このアプローチを学びました。

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Protocol

以下のプロトコルは、取得の設定や実験条件について、 4、 6の実験によって定義されたパラメータを使用しています。これらのパラメータの多くは、他の実験に適合するように修正することができる( すなわち、露光時間、ビニング、蛍光チャネルなど )。すべての手順は、制度ガイドラインと規則を遵守しなければならないと制度バイオセーフティ委員会によって承認されます。顕微鏡メーカーのウェブサイトでは、ライブセルイメージングのための優れた情報が含まれています。

1.顕微鏡およびイメージングソフトウェア

  1. 倒立顕微鏡の多種多様でライブセルイメージングを実行します。最も一般的な顕微鏡は、落射蛍光とスピニングディスク共焦点を広視野ています。ここでは、200ワットのメタルハライド光源を用いて自動化された電動式広視野落射蛍光顕微鏡を使用しています。
  2. ステージ上部または顕微鏡環境室を入手します。ここで、ステージトンを使用オペアンプ環境室。
  3. タイムラプス顕微鏡を実行するためのユーティリティで顕微鏡を操作する商用ソフトウェアを使用してください。
  4. 画像解析用の市販のソフトウェアまたはImageJのを使用してください。他の多くの分析ツールが市販されており、8,18を公開されているの多くのカスタムメイドのプログラムがあります。

2.細胞プロセスおよび表現型応答の可視化

  1. 明視野顕微鏡で細胞を可視化します。微分干渉コントラスト単独位相コントラストは、抗癌薬の応答に対する応答を研究するために非常に有益であることができます。これらのプロセスは、有糸分裂、細胞運動性およびアポトーシスを含むことができます。
  2. 蛍光バイオセンサーを用いて細胞構造、細胞小器官およびプロセスを視覚化します。蛍光プローブは、特定の細胞内のプロセスを追跡するのに有益です。これらは、微小管ダイナミクス、ミトコンドリアと小胞体のダイナミクス、タンパク質の蓄積および局在化を含むことができ、分子シグナル( 例えば 、リン酸化、カルシウム)。

試料の調製

  1. 標準の加湿細胞培養インキュベーター( 例えば、37 O C、5%CO 2、相対湿度80%)で細胞培養認定皿で細胞を増殖させます。
    1. EBSSとMEMでHT1080細胞を成長させます。 10%v / vのFBS、1%v / vのペニシリン/ストレプトマイシン、1%(v / v)のピルビン酸ナトリウム、1%v / vの非必須アミノ酸を含む培地を補います。
  2. イメージングの2日前に、認定された無菌層流フード内で12ウェル#1.5ガラスボトムディッシュの3ウェルにプレート50,000 HT1080 FUCCI細胞。実験の開始のための〜60%のコンフルエンスを達成するために播種した細胞の数を調整します。実験の細胞株および性質に応じて、セル密度が小さくてもよいです。
    注:細胞密度は、細胞株の成長を、実験結果に大きな影響を有していてもよいです。実験間variabilitを最小限にするために、細胞を数えます密度に起因するyの。
    1. 環境室や実験に必要な条件、単一ウェル皿中のプレート細胞(典型的には、35-または60ミリメートル)、4も35-mmディッシュ、6、12または24ウェル細胞培養プレート、またはに応じて、様々なフォーマットでカバースリップスライド。細胞培養プラスチックを通して#1.5ほとんどの対物レンズは、ガラスのこの厚さのために最適化されているように、ガラス、およびイメージングのガラス底プレートを使用して、非常に悪いです。
      注:一部の細胞株が成長し、ガラス上に生存しません。これらの場合において、ガラスは、細胞接着( 例えば 、ポリリジンまたはコラーゲン)を高めるためにコーティングすることができます。一部の企業は、光細胞培養プラスチックを製造し、これは実行可能なオプションである場合、それは経験的に決定されなければなりません。

4.環境チャンバーセットアップ

  1. 前のいずれかの実験に、セットアップ環境室を37°Cのそれは80%の湿度〜で動作し、そのように試料位置での温度となるように。ほとんどの培養細胞は、培地中の重炭酸ナトリウム緩衝液を5%CO 2 /バランス空気雰囲気中で成長します。セットアップに応じて、いずれかの5%CO 2の環境制御装置を設定し、それが空気で100%のCO 2を混合 、または5%CO 2 /バランスエアガス認定、プレミックスを使用します。ガス流速については、製造元の指示に従ってください。
    注:一部の細胞系は、それらがCO 2なしで維持することができ、その場合にCO 2非依存性培地中で増殖します。具体的に設計された画像形成媒体は、自家蛍光化合物の添加を制限することも可能です。所望の細胞型のための論文媒体の成長は事前に実験的に決定されなければなりません。
  2. 撮影の前に、水溜りを滅菌蒸留水で(製造者の指示に従って)満たされていることを確認します。所望の温度設定に環境室をオンにして、顕微鏡ステージの挿入図に配置します。ガスを保存するには、この時点でフローを開始しないでください。
    注意:ステージトップチャンバーとステージインセットおよび/またはそれが実験に運動アーチファクトを導入することができるチャンバへの接続コード上の任意のテンションとの間の空きスペースがある場合。
    1. ステージに結合するように、その中にチャンバを、チャンバを挿入する前段階のはめ込み開口部の縁の上にパラフィンフィルムの断片を置き、そして何の接続は、チャンバを引いていないことを確認してください。
  3. チャンバーは37℃。に平衡することを許可します細胞生理学に影響を与えるとドリフトを導入することができる撮像中の温度変動を防止するための安定した温度を維持します。温度平衡に到達すると、通常の環境に応じて、1時間に30分を必要とします。
    1. 温めながらチャンバー内に井戸内の水と「ダミー」の料理を挿入します。室を確保する手助け水模倣でサンプルを充填したイメージング皿は、十分に温め、安定化されます。予め温めた滅菌水でチャンバーを充填温度安定化に必要な時間を短縮し、実験試料の添加時に温度低下を最小限に抑えます。

5.顕微鏡セットアップ

  1. 顕微鏡、関連するコンピュータ、および任意の必要な周辺機器の電源を入れます。
    1. 光源に応じて、必要になるまでこれをオンにするのを待つ( 例えば 、LED)。
  2. 低い位置にある対物レンズタレットを使用すると、使用する20X 0.7 NAの対物レンズを選択します。
  3. 目的以上のサンプルを置きます - これは、試料がチャンバー内にあるときに、それが簡単に細胞を見つけることになります。
  4. 彼らは以前の実験から知られている場合は、この時点で撮像パラメータを定義します。

6.顕微鏡にし、チャンバー内に細胞を輸送

  1. 環境室にインキュベーターから撮像される細胞をトランスポートします。これは比較的低いCO 2の効果を制限するために迅速に行われていることを確認してください
  2. 大きな環境変化を避けるために密封された発泡スチロールの容器または絶縁された袋に細胞を置きます。
  • 製造元の指示に従ってチャンバー内に試料イメージング皿を挿入します。
  • 細胞は、環境チャンバ内に固定された後、安定した環境を維持し、すぐに雰囲気ガスの供給源(複数可)をオンにするために、チャンバをシール。
    1. いくつかの環境室はタイトな、密封された蓋を利用しないように、成長培地の上に蒸着、無菌層、胚認定鉱物油を遅延させます。ガラス撮像領域を妨げないように注意しながら試料皿の周囲のエッジの周りにガス透過性パラフィンフィルムを包みます。ローカライズされた、二次加湿方法を採用することができます。試料皿の蓋に結露がperforを減少させることができます明視野顕微鏡のマンス。
  • 初期の実験中の熱ドリフトの影響を最小限にするために、時間経過を開始する前に30分待ちます。所要時間は、イメージング皿のサイズやその他の要因によって異なります。経験的に決定します。
  • 7.イメージングを設定します

    1. 最良のデータを表現する撮影条件を選択します。 、露光時間を制限する低い強度の光を使って光の長い波長によって励起されたプローブを選択することにより、光毒性を避けるための予防措置を講じてください。
    2. X、Y、および画像化される各位置に対するz平面と所望の波長(複数可)を定義します。時間分解能は、位置と波長の数によって制限されます。ほとんどの細胞プロセスの長期タイムラプスについては、すべての10 1つの画像を取得 - 20分。より高い時間分解能(短い間隔、 例えば 、1分)、より多くのデータポイントを提供し、したがって、より強固な細胞追跡だけでなく、複数の集積をもたらします露光、大きなデータセット。
      1. - 50ミリ秒、テキサスレッド/ TRITC - 40ミリ秒、明視野 - 20ミリ秒FITC / GFP:HT1080 FUCCIが動的緑色と赤色蛍光タンパク質を持っているように(代表的な結果を参照)、以下の露光時間を使用します。 2×2のビンを使用してください。
    3. 高度な設定の下で、デフォルトパラメータを使用して、ソフトウェア制御のオートフォーカスを有効にします。推奨ステップサイズで10μmのオートフォーカス範囲を定義します。タイムラプスを開始する前にこれを実行してください。光毒性および光退色を低減するために、蛍光と明視野画像と決してとオートフォーカス。
      1. 電動ステージで任意の顕微鏡上でソフトウェア制御オートフォーカスシステムを使用し、直接サンプルに焦点を当てます。しかし、それらは、実験の取得速度を制限することができます。ハードウェア制御の連続フォーカシングシステムは、タイムラプス顕微鏡検査のためにうまく機能し、それ以上の位置に結像するか、買収の高いレートを可能にする、速度を向上させます。しかしながら、それら空気 - ガラス界面の検出に依存しているとよく全体のガラスの厚さの変化にサンプルのフォーカスを失う可能性があります。
    4. メディアは37℃。に温めてきた所望の薬物濃度を含有する培地の半分を交換してください部分的なメディアの交換は、熱ドリフトを低減することができます。この実験における条件は、車両(DMSO)、1μMのselinexorと10μMのPD0332991です。
      注:このステップは、実験を一時停止し、再起動することにより、買収を開始した後もを行うことができます。これは、単一の細胞の前および後の薬物応答の長手追跡を可能にします。薬物安定性や代謝が懸念される場合は、一時停止と交換するメディアが同じ方法で行うことができます。薬剤分解または代謝を試験するために、処理された細胞からの培地はまた、薬物の作用を試験するためにナイーブな細胞上に配置することができます。
    5. タイムラプスを開始します。
    6. タイムラプスを実行すると、撮像されたフィールドがフォーカスとchambeに残っていることを確認してくださいrは湿度の高い37℃。を維持します
      1. 時点間の時間のギャップの間に取得を一時停止することにより、必要に応じてフォーカスを調整します。
    7. 必要に応じて、より長い実験中にチャンバに水を追加します。 37 O℃で予熱した、滅菌蒸留水を添加することにより、チャンバを冷却する避けます

    8.タイムラプスエンディング

    1. 実験が完了するまで実行したとき、それが自動的に停止するように設定されていない場合、取得を停止します。
    2. 正常に完了していないデータが失われる可能性があれば、ほとんどのソフトウェアパッケージを自動的に取得中に保存しているが、時間経過は、ハードドライブに正しく保存されていることを確認してください。
    3. 顕微鏡からチャンバーを外し、承認機関バイオ安全手順に従ってバイオハザード廃棄物への細胞の処分。

    9.縦の追跡と分析時系列データの

    1. ある分析のための方法論を選択します。関心の生物学的プロセスのための適切な。 ImageJの、MATLABを使用したプログラム、およびカスタム・プラットフォームのための多くのプラグインは、特定の用途のために製造されています。 4、 5に示されているように、以下の方法論は、核と核の蛍光プローブの分析の追跡をカバーしています。
    2. ImageJの中で利用されるチャネルのための.tif画像スタックを開きます。また、Bioformatsプラグインを使用して、ImageJの中で直接取得プログラムからネイティブファイルを開きます。
    3. (使用する場合)明視野画像または核ラベルチャネルを使用して、1つの細胞の核内に関心領域(ROI)を描き、ROIマネージャーに追加します。注:画像化された細胞は核ラベルを持っている場合( 例えば 、ヒストンH2B-EGFP。)、その後自動細胞追跡は時間を通じて興味(ROIを)個々の核を表すの領域を作成するために利用することができます。
    4. 次の時点に進み、同じnucleu内のROIを配置秒。 ROIマネージャーにROIを追加します。
    5. 追跡し、細胞事象(有糸分裂、アポトーシス、 など 。)又は細胞がもはや追跡することはできませんがあるまで、個々の細胞のためのROIを作り続ける( すなわち 、フレームの外に移動するか、実験は終了)。
    6. ROIは、彼らがフィールドにいる時間を介して細胞のために確立されている場合には、関心の蛍光チャネルにそれらを重ね合わせます。すべての時点について、各チャネルにおける蛍光の平均強度を測定します。後で使用するためにROIのリストを保存します。
      1. 種々の測定は、異なる実験における用途のためのROI内で行うことができます。分析→設定の測定をクリックして...分析方法を選択するメニューを表示する( 例えば 、ROI内の平均強度、積分強度、 。)。
    7. 追跡しながら、個々の細胞( 例えば 、アポトーシス、分裂、生存)のための細胞の運命に注意してください。これは、生存曲線とfurtheを作成できますrの人口分析。
    8. 両方のチャネルの平均強度で、治療( 図5B、C)に応答して細胞周期動態を表示する散布図を作成します。
      注:プロットは、経時的に個々のセルのために作成または追跡細胞集団にわたって平均化することができます。定量的イメージングは​​、癌治療に応答して、複雑な応答と細胞の関係を確立するために重要になる場合があります。長期タイムラプス顕微鏡、縦追跡およびデータ分析は、顕微鏡および分析ツールのタイプのための多くのオプションで、多段階のプロセスであり、 図1に提供される一般的な概要を次の。

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    Representative Results

    長期タイムラプス顕微鏡と直接縦トラッキングは、薬物応答の間に多くの抗がん効果の研究を可能にします。 図1の概要に続いて、細胞の複数の例は、抗がん剤で処理し追跡し、異なるアプローチを用いて分析することを検証した蛍光レポーターを発現して示されています。

    単独の位相差顕微鏡は、非常に有益であるとロバスト有糸分裂、有糸分裂期間および停止、異常な細胞分裂、および細胞死21,23,24対間期に報告します。細胞分裂を標的とする薬剤、多くの場合、抗有糸分裂薬と呼ばれる、開発され続けている。彼らのp53の状態が異なるだけでマッチした乳癌由来MCF7細胞株のペアの2 作品1及び図2の例を 、500で処理されましたその標的抗がん剤の種類のnMのそして長引く有糸分裂20で得られた有糸分裂モータータンパク質、キネシン-5(KSP1、KIF11、Eg5の)を阻害します。野生型MCF7細胞( 図2A)p53依存性細胞周期停止25-27を研究するためパラダイムです。野生型細胞は、有糸分裂に入る数時間のまま、最終的に離れて、主にp53の25の誘導と逮捕します。 p53のは、安定したp53ノックダウン(MCF7 shのp53を)によって除去されると、代わりに彼らは有糸分裂を離れた後に逮捕の、細胞は、繰り返しサイクル( 図2B)を通過します。細胞を手動で追跡し、分裂指数と第二有糸分裂に入る細胞の割合が( 図2C、D)スコア化しました。私たちは、それはむしろ逮捕し、分裂することなく、有糸分裂を残すよりも、有糸分裂の第二ラウンドに入ると追跡のsh p53の細胞が分割することを確認します。ここで、有糸分裂事象の持続時間を示していないが、連続的な有糸分裂、細胞分裂の割合、および関連する細胞死のイベント間の時間ものとすることができます20,21の芯抜き。

    タキサンは、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルのために、膵臓癌および進行乳癌のような治療が困難であるものを含む多くの癌のための一般的な化学療法です。パクリタキセルは、微小管の動的なプラス端に結合し、その正常な機能を防止し、それらを安定化させます。パクリタキセルは、用量依存的な効果を指摘しており、低濃度でも、通常の有糸分裂の進行および染色体分離16を乱すことができます。染色体の忠実な分離は、正常な細胞増殖および時異常な細胞周期の停止を誘発するだけでなく、癌の進行のドライバーとして作用することが異数性をもたらすことができるのが不可欠である。安定クロマチンを発現する3 ムービー3を示し、子宮頸部癌由来のHeLa細胞を mCherryをに融合されたマーカーのヒストン2Bおよびβ-チューブリンは、1 nMのパクリタキセルで処理した通常の増殖培地中で(図示せず)EGFPに融合しました。この中の例は、有糸分裂を通じてへの進入および進行を追跡することができます。有糸分裂のタイミングは、このセルに正常に見える、しかし、染色体の整列および分離が悪い染色体の分離を示す構造であり、核バルジと小核の結果、ではありません。小核、染色体、またはクロマチンの大規模な断片である、DNA損傷およびクロモスリプシスする傾向がある-これは、腫瘍の進展28,29において重要な意味を持ちます。一方で、ここでは他の有糸分裂の構造との関係で小核の起源を示し、これらの細胞の運命は、直接長期タイムラプスを使用して追跡することができません。 DNA損傷レポーターは、染色体分離、小核及びDNA損傷の間の関係を確立するために使用することができるとともに、さらに、クロマチンマーカーを発現しました。

    蛍光レポーターを追跡すると、新しい記者が継続的に開発されている列挙細胞プロセスを可能にします。元のための十分な、細胞周期は、標的抗癌治療薬の開発に特に関心があるのフェーズで構成されています。 図4を ムービー4は安定して2レポーターを同時発現し、蛍光ユビキチン細胞周期の指標と呼ばれる線維肉腫由来細胞株(HT1080)を示しています(FUCCI)30。ここでのシステムでは、CDT1ポリペプチドの部分は、mKO2(モノマーKusabiraオレンジ2)に融合され、G1期の増加および早期S期で分解し、Gemininの部分は、MAG(単量体アザミグリーン)に融合されていますそして、半ばS相の増加とは、分裂後期の際に分解されます。この細胞は、通常の増殖培地中で、15時間で細胞周期を介して進行する。 図5A、Bおよびムービー5は 、10μMPD0332991、のCdk4 / 6阻害剤で処理された通常の培地中で同じ細胞を示します。細胞はG2期を経て進行すると正常に分割し、強力な効果の可能性を示す、後続のG1期で逮捕します成長する腫瘍での細胞増殖抑制効果をアイブ。 図5Cは、D ムービー6は、エクスポーチ-1(XPO1を、別名CRM1を、小分子と呼ばれるselinexor(KPT-330)、核外輸送タンパク質阻害剤強力で処理された通常の培地中で同じ細胞を示します)。これらの化合物は、核輸出(SINE)の選択的阻害剤と呼ばれ、それらの抗癌効果を調査31,32中です。強力な細胞周期表現型と細胞死33,34におけるSINE処理結果。この例では、通常の速度(約6時間)でG1期を通じて進行するセルを示しているが、処理されたSINEの両方の赤と緑の信号(約3コントロールの時間が、10と期間によって示されるように、S期の進行​​の遅延を経験します)。このセルは、21時間30分後遅れてS-またはG2期に死にます。正常な細胞周期は、約15時間です。 selinexorの効果は、異なる血液および固形腫瘍35のために研究されています。

    36を表現する6 ムービー7ショーHT1080細胞を培地は、10μMのエトポシド(VP-16)、トポイソメラーゼII毒で処理しました。このレポーターは、mCherryをに融合されるDNA二本鎖切断部位のタンパク質、53BP1の部分から構成されています。この細胞の核は、USIを追跡しましたImageJの中の粒子の分析プラグインと統合されたmCherryを-BP1-2信号をngのは、可溶性核プローブを排除した値を閾値処理した後、各フレームで測定しました。 DNA損傷は、最初の10時間の最小であり、その後、着実に増加します。トポイソメラーゼII阻害剤は、酵素が37,38最もアクティブである場合に特に、S-及びG2期に影響を与えることが知られています。この例で観察された速度は、細胞周期関連損傷している可能性があります。 FUCCI記者とmCherryを-BP1-2を組み合わせることにより、その後、細胞の運命にリンクさせることができるダメージのタイミングを実証することができます。

    図1
    抗がん薬物反応を研究するために長期タイムラプス顕微鏡と縦の追跡を使用した場合の図1.概要。希望としてラベル付けされ、適切なライブセルイメージングディッシュ中の細胞は、細胞または関心領域が追跡され、画像化され、データがあります分析。多くの方法がいくつかは、ここで示され、細胞を追跡し、定量化するために存在する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図2
    図2.位相コントラストタイムラプス顕微鏡は、抗有糸分裂薬物治療後のp53依存性を示す。野生型(A)とp53ノックダウン(B)MCF7細胞を、500 nMのキネシン-5阻害剤で処理し、96のために10分毎に画像化しました20X PH2 0.70 NAレンズを位相差顕微鏡を使用して時間。個々の細胞は、手動で追跡およびパーセントの有糸分裂および細胞は、時間経過中に再び別の有糸分裂へと進行する場合に点数化したされました。矢印は、追跡されているセルを示しています。 SHのp53の細胞(B)は、第二の有糸分裂に入る分割します。 (C)両方の細胞株がSHO高いピーク%の有糸分裂(最初に青と赤の矢印)で示されているようワット長時間の有糸分裂停止。 20野生型の%(N = 130)と比較して(C、D)のp53ない細胞の約90%(shのp53を、N = 87)を示し続け進行(赤矢印)。エラーバーは標準偏差を示します。バー=20μmである。 作品1及び2。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図3
    図3.クロマチンマーカーヒストン2bは、低用量のパクリタキセル治療後に染色体偏析異常の証拠を明らかに。パクリタキセルは、細胞の成長と分裂で複雑 ​​な、濃度依存性の欠陥が生じる微小管標的薬です。クロマチンの組織は段階を含む、種々の細胞状態に知らせます有糸分裂および細胞死。安定H2bを-mCherryを、βチューブリン-EGFPの両方を発現するHeLa細胞を1 nMのパクリタキセルで処理しました。この細胞は、間期に最初は有糸分裂と分裂の段階を経て進行します。有糸分裂中の時間が正常に見えるが、(矢印)解決される染色体アタッチメントおよび分離誤差の証拠があります。これらの細胞の運命は、長手方向のトラッキングによって直接決定することができます。位相コントラスト(図示せず)と蛍光画像を20X Ph2が0.70 NAレンズを10分ごとに1フレームで取得しました。バー=10μmである。 動画3。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図4
    図4.蛍光細胞周期マーカーは、細胞周期進行のダイレクトモニタリングを許可します。(A) 位相コントラストおよび蛍光により撮像されたFUCCIシステムを表現するライブHT1080線維肉腫細胞のフィールド。 (B、C)パネルAの破線のボックス内の有糸分裂細胞が続いています。通常は約15時間で細胞周期を進行。有糸分裂後、細胞を簡単に暗いであり、彼らはにし、G1期を経て進行するにつれて赤になります。細胞がS期に入ると、赤いCDT1プローブが劣化し、緑Gemininのプローブが増加しています。両方のプローブが存在する短い約3時間の期間、初期のS期を示しています。細胞は、S-及びG2期を通過し、次の有糸分裂に進行するように、彼らはグリーンに点灯したままです。緑色プローブは、細胞分裂の後期時に分解されます。位相コントラストおよび蛍光画像は20X PH2 0.70 NAレンズと10分ごとに1フレームで取得しました。バー=10μmである。 動画4。 viにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版をEW。

    図5
    図5.細胞周期特異的効果と関連する細胞死。 図4と同じ細胞株が、異なる抗癌標的を表す2つの異なる分子で処理しました。治療後の時間が示されています。 (A、B)は、10μMPD0332991のCdk4 / 6阻害剤と後期S / G2期の細胞の処理の後、細胞は、有糸分裂(M)と除算に通常進みます。一つの娘細胞は、核内の関心領域に赤色および緑色蛍光強度を測定することによって追跡されます。細胞は約40時間、G1期で逮捕されたままです。 (C、D)は、1μMのselinexorと後期G2期の細胞の処理後、細胞は、有糸分裂(M)と除算に通常進みます。一つの娘細胞を追跡し、それは、G1期に入るを通じて進行されます長引く初期のS相(赤と緑の信号)、単に緑に移行し、21時間30分後に死にます。データは、S期の進行​​をselinexor処理によって影響を受ける示唆する。位相コントラストおよび蛍光画像は20X PH2 0.70 NAレンズと10分ごとに1フレームで取得しました。バー=10μmである。 作品5及び6。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

    図6
    薬物治療。多くの抗癌治療後の図6のDNA損傷のダイナミクスは深く細胞応答および治療 ​​の成功に影響を与えることができるDNAの損傷につながります。安定的に二本鎖DNA損傷マーカーmCherryを-BP1-2とH2bを-EGFP(図示せず)の両方を発現するHT1080細胞をトポイソメラーゼII薬物エトポシド及びDNA Dの10μMで処理しました。amageを追跡しました。 (A)エトポシド後の病巣の増加数と強度。ラグは、エトポシドの既知のメカニズムと一致可能な細胞周期効果を示す、最初に存在します。 22時間50分では、この細胞は、損傷を高レベルで蓄積してきました。ここに示されていないが、この細胞の運命を直接追跡することによって決定することができます。 (B)H2bを-EGFP信号を経て得られた核に対応するROIは、ImageJの中の粒子の追跡を使用して追跡したと一体化BP1-2 mCherryを信号を定量化し、時間との関係をプロットしました。約10時間までの信号の遅れは​​、持続的な増加が続き、注目されます。蛍光画像は40X PH2 0.75 NAレンズと10分ごとに1フレームで取得しました。バー=10μmである。 動画7。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。


    映画野生型MCF7細胞の1位相コントラストタイムラプス顕微鏡抗有糸分裂薬物治療後。野生型MCF7細胞は500nMのキネシン-5阻害剤で処理し、20X PH2との位相差顕微鏡を用いて96時間、10分毎に画像化しました0.70 NAレンズ。 図2で説明したように、有糸分裂から長時間の有糸分裂停止および出口は、観察することができます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

    Moive 2
    映画の抗有糸分裂薬物治療後のp53ノックダウンMCF7細胞の2位相コントラストタイムラプス顕微鏡。安定的分解のためのp53を標的とする低分子ヘアピンRNAを発現するMCF7細胞を、500 nMのキネシン-5阻害剤で処理し、 20X PH2 0.70 NAレンズを位相差顕微鏡を用いて96時間10分ごとに画像化しました。 図2で説明したように長時間の有糸分裂停止および有糸分裂の複数のラウンドは、観察することができます。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

    Moive 3
    ムービー低用量のパクリタキセル治療後のHeLa細胞の3蛍光タイムラプス顕微鏡。安定H2B-mCherryを、βチューブリン-EGFPを発現するHeLa細胞を、1 nMのパクリタキセルで処理しました。 図3で説明したように染色体アタッチメントおよび分離の問題は、観察することができる。画像は20X PH2 0.70 NAレンズを10分毎に取得した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

    ove_content「FO:キープtogether.withinページ= "1"> Moive 4
    映画4.蛍光細胞周期マーカーは、細胞周期進行のダイレクトモニタリングを許可。FUCCIシステムを発現しているHT1080細胞は、縦方向にタイムラプス顕微鏡検査の際に追跡しました。細胞は、有糸分裂を終了した後に暗く移行し、その後、細胞はG1期を通じて進行するにつれて赤くなります。細胞がS期に入ると緑Gemininのプローブ増加と赤CDT1プローブが分解されると、それは黄色になります。それはS-及びG2期を経て進行として、細胞が緑色のまま。細胞が分裂後期に入ると緑が低下します。この細胞の定量化は、図4に示されている。画像は20X PH2 0.70 NAレンズを10分毎に取得した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

    Moive 5 "SRC =" /ファイル/ ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    G1期阻害剤を用いた治療後の蛍光細胞周期マーカーを発現映画5 HT1080細胞。FUCCIシステムを発現しているHT1080細胞を、10μMPD0332991、のCdk4 / 6阻害剤で処理しました。追跡された細胞は、有糸分裂と分裂に正常に進行します。一つの娘は追跡され、映画の期間G1に赤のまま。定量化は、図5に示されいる。画像は20X PH2 0.70 NAレンズを10分毎に取得した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

    Moive 6
    エクス-1阻害剤、Selinexor。FUCCIシステムを発現しているHT1080細胞を用いた治療後に蛍光細胞周期マーカーを発現映画6. HT1080細胞は御馳走でした1μMのselinexorとエド。この後期G2期の細胞は、有糸分裂を介して追跡しました。娘細胞は、その後、G1期(赤)を経て進行し、S期(黄色)に入ります。それは後半-S / G2期に入り、治療の21時間30分後に死ぬまで、細胞は、S-段階を経てゆっくりと進行します。定量化は、図5に示されいる。画像は20X PH2 0.70 NAレンズを10分毎に取得した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

    Moive 7
    トポイソメラーゼII阻害剤での治療後のムービー7. DNA損傷ダイナミクス。安定的に二本鎖DNA損傷マーカーmCherryを-BP1-2とH2B-EGFPを発現しているHT1080細胞を、10μMのエトポシド、トポイソメラーゼII阻害剤で処理しました。 mCherryを-BP1-2は、映画の中で表示されます。治療として継続S、mCherryを-BP1-2増加の信号は、二本鎖DNAの損傷を増加示します。定量化は、図6に示されている。画像は40X PH2 0.75 NAレンズを10分毎に取得した。 このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

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    Discussion

    タイムラプス顕微鏡と縦トラッキングのメリット

    それは研究者が個々の細胞とその運命だけでなく、全人口を追跡することを可能にするよう顕微鏡は、薬剤応答の縦断的研究のための理想的な楽器です。細胞の集団内で薬物応答における変動は、抗癌治療設計のための主要な問題です。単一細胞の長手方向の追跡は、研究者がこの変動を観察し、それが細胞集団に関連した根底にあるメカニズムと影響を理解し始めることができます。蛍光プローブの様々な利用することは一般的で、まれ両方の応答の表現型を観察し、理解するための多くの方法を提供します。タイミングと異なる細胞運命の寄与人口の応答に、特定の表現型と運命の間の関係、および処理時の細胞株または状態間の応答の違いを学ぶことができるものの例です。多くの癌関連プロセスを研究することができます。この記事で強調表示されていないいくつかは、アポトーシス、オートファジーと細胞死、および壊死記者39-42、細胞浸潤43,44、および細胞運命決定27を決定たp53のダイナミクスを含みます。また、この方法は、抗癌治療研究における研究に限られるものではありません。同じ原理が48シグナリング有糸分裂45細胞骨格動態46,47および細胞内を含む他の多くの生物学的プロセスを研究するために使用することができます。

    タイムラプス蛍光顕微鏡はまた、タンパク質および目的の分子の局在と強度データを提供することができます。薬剤応答に重要なタンパク質レベルの変化であるが、細胞内のタンパク質の適切な(または不適切な)局在は、応答を理解するために重要であるだけでなく。タイムラプス顕微鏡は、(タンパク質が局在している場所にデータを提供する例えば 、核、細胞質ゾル、特定の細胞小器官、など )、薬物治療後、どのように局在化および合計レベルは、単一の細胞や個体群レベルでの時間の経過とともに変化します。

    課題と制限事項

    タイムラプス顕微鏡と単セルの縦方向の分析の長所にもかかわらず、限界があります。蛍光レポーターはそれらの安定性および特異性によって制限されています。蛍光融合タンパク質を設計する場合、光安定性と明るいプローブを選択することが重要であるが、その正常な機能と適切に局在化する能力について、目的のタンパク質に結合している蛍光タグの影響を考慮することも必要です。これらの問題は他の場所で詳細に議論されており、15,49,50が公開されている多くの利用可能な蛍光標識タンパク質があります。他の蛍光標識またはタグを細胞に添加することができ、注意は、それらが毒性でないように注意しなければなりません。私たちの経験では、これらのpローブは、例えば、ミトコンドリアラベル(膜電位)または細胞透過性DNA染料のために、簡単に漂白する傾向があり、原因で細胞増殖に希釈アウトとなります。

    また、成長し、顕微鏡で細胞を観察すると、多くの技術的な課題があります。温度、湿度、雰囲気、そして光へに関して不安定性は、データの損失、あるいは全体の実験の結果、細胞に大きな影響を持つことになります。画像キャプチャに関する安定性の問題は、 映画1及び2に見ることができる。この効果は、パラフィンフィルムの使用によって最小化することができる(4.2を参照)。 ImageJの(NIH)を使用して、例えば、取得後の処理のために利用可能な画像安定化アルゴリズムは、もあります。見落とされがち長期タイムラプスの側面は、データ管理とファイルサイズです。データをビニング場合でも、単一のタイムラプス実験は、30ギガバイトの過剰であることが多いです。大容量、高速で信頼性のデータ記憶および転送が強いですlyが奨励しました。撮像される蛍光バイオセンサ(単数または複数)に応じて、例えば、核または細胞質のセンサのフル解像度の画像を取得することがしばしば必要ではありません。可能な場合我々は、データ、あまり厳しいコンピューティング・ニーズ、および改善されたワークフローで作業しやすく、その結果、ファイルを保存するための措置をとることは、小さなサイズ、お勧めします。

    長期タイムラプス顕微鏡検査を行う際に毒性が主要な関心事です。高強度光と長時間露光は蛍光プローブ、細胞ストレスと細胞死の光退色につながることができます。これらの効果は、データに大きな影響を持っているし、実験の不実表示につながることができます。カメラのビニングゲイン、露光時間を短縮するために使用することができます。光路中のNDフィルターは、サンプル上の光の強度を低下させます。画像に使用される光の波長はまた、細胞に影響を与えます。短い波長(UV、近UV)は、細胞に対してより有害であり、より迅速な速度で光退色をもたらしますより長い波長( 例えば 、赤、遠赤色)。目的の選択は、撮影条件に影響を与えることができます。高い開口数(NA)のレンズは、より高い解像度の画像を生成するが、より高い倍率は、より少ない光が、より高い露光時間以上強い光で得られた試​​料から送信されることを可能にします。目的は、適切なNAとオーバーサンプリングすることなく、興味のあるオブジェクトを解決します倍率で選択する必要があります。多くの場合、最高の目的は、最も適切な選択ではないかもしれません。核プローブ( 図4、図5)と、低倍率の対物レンズを効果的に所望のオブジェクトの解像度を損なうことなく、サンプルサイズを大きく、捕捉されるべきより大きな視野を可能にします。 3次元での長期タイムラプスが原因で統合された露光に慎重に行われるべきです。スピニングディスク共焦点顕微鏡、感度カメラ( 例えば 、EM-CCD)、カメラのゲインを用いて、およびzシリーズの高速圧電モータsuggesteありますdは光の露出を低減することができます。高速のzシリーズの取得は、取得期間中に発生する細胞運動と力学によるモーションアーチファクトを最小限にすることも重要です。多くの異なった設定を使用して、未処理細胞の実証分析は、任意の細胞株またはレポーター上の蛍光光の影響を決定するのに役立ちます。また、未処理の対照は、実験設定の細胞毒性効果を決定するために、各実験に含まれるべきです。

    テクニックのバリエーション

    長期タイムラプスは、堅牢かつ非常に柔軟です。共培養技術を用いて、異なる細胞株または異なるレポーターを発現する同じ細胞株を使用することができます。この一顕著な例は、抗癌薬に応答して、死んでいる標的細胞と食細胞を画像化します。別の例は、薬剤ナイーブ隣接セル上の細胞応答の影響を研究することができます。フォトACTIVAと相まってteable、光転換、及び光切り替え可能蛍光タンパク質、および特異的な効果を誘発するために、光によって活性化することができる操作されたタンパク質( 例えば 、KillerRed)は、多くの可能性があります。より複雑なアプローチは、例えば、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の光退色後の蛍光再分配、及び超解像( 例えば 、確率的光学再構築顕微鏡(STORM)、構造照明顕微鏡(SIM)などの顕微鏡のさまざまな特殊なタイプを使用することに使用することができますまたは誘導放出の枯渇(STED))、および他の多くの長所と、各アプローチの限界があります。

    長期的( 例えば 、週、月)応答および薬物除去後の細胞の回復は、抗癌薬の作用を理解するための中心となります。グリッド化ガラスボトムディッシュを繰り返し、人口/エリア内の特定の細胞または領域を監視するための貴重なツールです。たとえば、グリッドの皿と、最初のDRUG応答が時間経過を使用して画像化することができ、薬物を除去することができ、グリッド内の特定の領域は、時間の経過と共に撮像さまたは所望の時間に追加の時間経過に供することができます。皿のガラス底スクライブツールまたは市販の試薬を使用して、いずれかの切断により除去することができ、例えば老化はβ-galactocidase活性に関連し、と比較するためにガラス上の細胞は、関心のある他のマーカーについて染色することができます細胞はこの状態に到達したかの歴史を理解するための時間経過。細胞集団が十分に大きい場合、それはまた、免疫ブロット法に供され、またはフローサイトメトリーができます。

    厚い試料は、伝統的に、様々なゲル材料とマトリックスの例スフェロイドのため、画像に困難でした。新しい蛍光共焦点又は多光子顕微鏡16,18,19,51を含むアプローチは、細胞が抗癌治療に応答するかをその場で理解するアプローチを拡張するために使用することができます。ザSEの研究と抗がん剤を使用する当社の能力を向上させるのに役立ちます、我々は単一細胞薬力学の理解を開発に向けて移動していることを明確に実証する抗がん剤応答24,52-54を研究するためにタイムラプスを使用して、科学者から増えていますより効果的に、おそらく抗癌薬物応答を予測します。

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

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    References

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    医学、問題111、蛍光顕微鏡、ライブセルイメージング、タイムラプス、癌生物学、細胞生物学
    鏡の国のアリス:単一細胞のタイムラプス顕微鏡と縦トラッキング抗がん治療薬を研究します
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    Burke, R. T., Orth, J. D. ThroughMore

    Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

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