Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Gjennom Looking Glass: Time-lapse mikroskopi og Longitudinal sporing av enkeltceller for å studere Anti-kreft Therapeutics

Published: May 14, 2016 doi: 10.3791/53994
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

Abstract

Responsen av enkle celler til kreftmedisiner bidrar i vesentlig grad ved bestemmelse av populasjonen respons, og derfor er en viktig medvirkende faktor i det totale resultat. Immunoblotting, flowcytometri og faste celleforsøk blir ofte brukt for å studere hvordan celler reagerer på anti-kreft medikamenter. Disse metodene er viktig, men de har flere ulemper. Variasjon i narkotika reaksjoner mellom kreft og normale celler, og mellom celler av forskjellig kreft opprinnelse, og forbigående og sjelden svar er vanskelig å forstå ved hjelp av befolkningen gjennomsnitts analyser og uten å være i stand til å direkte spore og analysere dem på langs. Mikroskopet er spesielt godt egnet til bilde levende celler. Fremskritt i teknologi gjør oss i stand til å rutinemessig bildet celler med en oppløsning som gjør det mulig ikke bare celle sporing, men også observasjon av en rekke cellulære responser. Vi beskriver en tilnærming i detalj som gjør det mulig for den kontinuerlige time-lapse avbildning av-celler i løpet av medikamentrespons for i hovedsak så lenge som ønskelig, typisk opp til 96 timer. Ved hjelp av variasjoner av tilnærming, kan cellene bli overvåket i flere uker. Med ansettelsen av genetisk kodet fluorescerende biosensorer mange prosesser, stier og svar kan følges. Vi viser eksempler som inkluderer sporing og kvantifisering av cellevekst og cellesyklusprogresjon, kromosom dynamikk, DNA-skade og celledød. Vi diskuterer også variasjoner av teknikk og sin fleksibilitet, og fremheve noen vanlige fallgruver.

Introduction

Levende-celle mikroskopi og lengde sporing av enkeltceller er ikke en ny teknikk. Fra de tidligste mikroskoper, har entusiaster og forskere observert og studert enkeltceller og organismer, deres atferd og utvikling 1-3. Et kjent eksempel fra sent David Rogers ved Vanderbilt University i 1950 viser et menneske nøytrofile i et blodutstryk jage en Staphylococcus aureus bakterie og til slutt prosessen med fagocytose 4. Denne live-cell filmen er en utmerket illustrasjon av hvordan flere prosesser kan observeres og korrelert i et enkelt eksperiment: sensing av en kjemisk gradient, mekanikk og hastigheten på cellemotilitet, figurer celle dynamikk, heft og fagocytose av et patogen.

Ankomsten av fullt automatiserte mikroskoper og svært sensitive digitale kameraer har resultert i et økende antall etterforskere bruker mikroskop for å stille grunnleggende spørsmål i cellebiologi alt from hvor cellene flytte 5,6 og dele 7,8 til organelle dynamikk og membran trafficking 9-11. Non-fluorescerende, lysfelt mikroskopi, inklusive fase-kontrast (PC), som fått Nobelprisen for Frits Zernike i 1953, og differensial interferens kontrast (DIC) gir mulighet for observasjon av celler og kjerner, men også sub-cellulære strukturer inkludert mikrotubulidynamikk bunter , kromosomer, nukleoli, organelle dynamikk, og tykke aktin fibre 12. Genetisk kodet fluorescerende proteiner og utvikling av fluorescerende fargestoffer mot organeller har dramatisk påvirket time-lapse mikros 13-15. Selv ikke fokus for denne artikkelen, bildebehandling i celleklumper og in situ (intramikroskopi) ved hjelp av konfokal og multiphoton mikros representerer en annen utvidelse av tilnærming, og det er utestående artikler som bruker og diskuterer disse tilnærmingene 16-19.

Svarene av celler til anti-cancere legemidler eller naturprodukter er fastsatt på molekylær og cellulær skala. Forstå celle responser og skjebner etter behandling innebærer ofte befolknings gjennomsnitts-analyser (f.eks., Immunoblottingforsøk, hele brønntiltak), eller faste tidspunkter med immunfluorescens deteksjon og flowcytometri, som måler enkeltceller. Heterogenitet i encellete respons på medikamenter innenfor en befolkning, spesielt i tumorer, kan forklare noen av variasjonen i respons sett på tvers av cellelinjer og svulster som er behandlet med det samme stoffet ved metning. Long-term langsgående tilnærminger for å følge en gitt enkelt celle eller en populasjon av celler som er en mindre vanlig, men meget kraftig metode som gjør det mulig for den direkte studium av molekylrespons trasé, forskjellige fenotyper (f.eks., Celledød eller celledelingen), observasjon av celle-til-celle variasjon innenfor en populasjon, og hvordan disse faktorene bidrar til befolkningen respons dynamikk 20-22. Optimistisk, å kunneå observere og kvantifisere encellete svar vil bidra til å forbedre vår forståelse av hvordan stoffene virker, hvorfor de noen ganger mislykkes, og hvordan du best kan bruke dem.

Teknikken av langsiktig time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og analyse av narkotika reaksjoner er tilgjengelig for mange etterforskere og kan være enkle, med bare overført lys til å observere fenotype svar 20,21. De viktigste komponentene i tilnærmingen inkluderer: passende forberedelse av cellene av interesse, en automatisert mikroskop med miljøkammer, et kamera integrert med en datamaskin til å erverve og lagre bilder og programvare for å gjennomgå time-lapse og måle og analysere cellene og eventuelle fluorescerende biosensorer. Vi tilbyr en detaljert protokoll med mange tips for å drive time-lapse mikroskopi av dyrkede celler så lenge som flere dager ved hjelp av lysfelt og / eller Widefield epifluorescent mikroskopi. Denne protokollen kan anvendes for en hvilken som helst cellelinje som kan dyrkes i kulturfor å studere deres svar på anti-kreft terapi. Vi gir eksempler på data innhentet og analysert ved hjelp av flere forskjellige genetisk kodet fluorescerende biosensorer og et eksempel på fasekontrastmikroskopi, kort diskutere ulike typer sonder, fordeler og ulemper ved langsiktig time-lapse og lengde sporing, hva kan være lærte for denne tilnærmingen som er vanskelig å forstå fra ikke-direkte tilnærminger, og noen varianter som vi håper vil være av interesse og verdi for uerfarne forskere som ikke har vurdert å bruke tilnærming, og til erfarne forskere.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den følgende protokollen bruker parametere som er definert ved forsøkene på figurene 4 og 6 om kjøp innstillinger og eksperimentelle betingelser. Mange av disse parametrene kan endres for å passe andre forsøk (dvs. eksponeringstider, binning, fluorescerende kanaler, osv.). Alle prosedyrer må forholde seg til institusjonelle retningslinjer og regler og være godkjent av institusjonelle biosikkerhet komiteen. Mikroskop produsentens nettsider inneholder god informasjon for live celle bildebehandling.

1. mikroskoper og bildebehandling

  1. Opptre live celle bildebehandling på et bredt utvalg av inverterte mikroskoper. De vanligste mikroskoper er Widefield epifluorescence og spinning-disc konfokal. Her bruker en automatisert og motorisert vidfelt epifluorescence mikroskop med 200 watt metallhalogen lyskilde.
  2. Få tak i en scene-top eller mikroskop miljøkammeret. Her bruker en scene-top miljøkammeret.
  3. Bruk kommersiell programvare for å operere mikroskoper med verktøy for å utføre time-lapse mikroskopi.
  4. Bruk kommersielt tilgjengelig programvare eller ImageJ for bildeanalyse. Mange andre analyseverktøy er kommersielt tilgjengelige, og det er skreddersydde programmer hvorav mange har blitt publisert 8,18.

2. Visualisering Cellular Prosesser og Fenotypiske Responses

  1. Visual celler med lysfelt mikroskopi. Differential interferens kontrast og fasekontrast alene kan være veldig lærerikt å studere reaksjoner på anti-kreft narkotika reaksjoner. Disse prosessene kan omfatte mitose, cellemotilitet og apoptose.
  2. Visualiser cellestrukturer, organeller og prosesser med fluorescerende biosensorer. Fluorescerende prober er informative i å spore spesifikke subcellulære prosesser. Disse kan omfatte mikrotubulidynamikk, mitokondrie og endoplasmatiske retikulum dynamikk, akkumulering av proteiner og lokalisering, ogMolekylsignalering (f.eks., fosforylering, kalsium).

3. Utarbeidelse av prøver

  1. Dyrke celler i cellekultur sertifiserte retter i en standard, fuktig cellekulturinkubator (for eksempel 37 ° C, 5% CO2, 80% relativ fuktighet).
    1. Grow HT1080 celler i MEM med EBSS. Supplere media med 10% volum / volum FBS, 1% v / v Pen / Strep, 1% v / v natrium-pyruvat, 1% v / v ikke-essensielle aminosyrer.
  2. To dager før bildebehandling, plate 50000 HT1080 FUCCI celler i 3 brønner på en 12-brønn # 1,5 glassbunn rett i en sertifisert sterile laminær flow hette. Juster antall celler belagt for å oppnå ~ 60% konfluens for starten av forsøket. Avhengig av cellelinjen og arten av eksperimentet celletettheten kan være mindre.
    Merk: Celletettheten kan ha stor innflytelse på veksten av cellelinjen og på forsøksresultatene. Telle celler for å minimere eksperiment-til-eksperiment variability på grunn av tetthet.
    1. Avhengig av miljøkammeret og de nødvendige betingelsene for forsøket, plate celler i enkelt vel retter (typisk 35- eller 60 mm), 4 brønn 35 mm-retter, 6-, 12- eller 24-brønners cellekulturplater, eller dekkglass i forskjellige formater. Bruk glassbunn plater med # 1.5 glass som de fleste objektiv er optimalisert for denne tykkelsen på glass, og bildebehandling gjennom cellekultur plast er svært dårlig.
      Merk: Noen cellelinjer ikke vokse og overleve på glass. I disse tilfeller kan glasset belegges for å forbedre celle tilslutning (f.eks., Poly-lysin eller kollagen). Noen selskaper produserer optiske cellekultur plast, må det bestemmes empirisk om dette er et levedyktig alternativ.

4. Miljø Chamber Set-up

  1. Før eventuell eksperimentering, set-up miljøkammeret, slik at den opererer på ~ 80% fuktighet, og slik at temperaturen i prøveposisjon er 37 o C. Mest dyrkede celler vokse i 5% CO2 / balanse luft atmosfære på grunn av natrium-bikarbonat-buffer i mediet. Avhengig av oppsettet, enten sette miljø kontrolleren til 5% CO 2, og det vil blande 100% CO 2 med luft, eller bruke ferdigblandet, sertifisert 5% CO 2 / balanse luft gass. Følg produsentens anvisninger for gassflytrater.
    Merk: Noen cellelinjer som vokser i CO 2-uavhengig medium i hvilket tilfelle de kan opprettholdes uten CO2. Spesielt designet bildebehandling media er også tilgjengelig som begrenser tillegg av autofluorescent forbindelser. Veksten i teser medier for den ønskede celletype må bestemmes empirisk på forhånd.
  2. Før bildebehandling, sikrer vannbeholderen er fylt (etter produsentens anvisninger) med sterilt destillert vann. Slå på miljøkammeret til ønsket temperatur og plassere den i mikroskopet scenen innfelt. For å lagre gass, ikke starte flyten på dette punktet.
    Merk: Hvis det er noen ledig plass mellom scene-top kammer og scene innfelt og / eller noen spenning på tilkoblingsledningene til kammeret det kan innføre bevegelsesartefakter i forsøket.
    1. Legg biter av parafin film over kanten av scenen innfelt åpningen før innføring av kammeret i det å par kammeret til scenen, og sørg for at ingen tilkoblinger trekker på kammeret.
  3. Tillat kammeret til likevekt til 37 o C. Opprettholde en stabil temperatur for å hindre temperatursvingninger under bildebehandling som kan påvirke cellefysiologi og introdusere drift. Nå temperaturstabilisering krever vanligvis 30 min til 1 time, avhengig av miljøet.
    1. Sett inn en "dummy" tallerken med vann i brønnene inn i kammeret mens oppvarming. Et tenkelig tallerken fylt med vann etterligner prøven, bidrar til å sikre at kammeret er tilstrekkelig varme og stabilisert. Fylling av kammeret med forvarmet sterilt vannreduserer den tid som kreves for å stabilisere temperaturen og reduserer temperaturfallet ved tilsetning av den eksperimentelle prøven.

5. Mikroskop Oppsett

  1. Slå på mikroskopet, assosiert datamaskin, og eventuelle nødvendige eksterne enheter.
    1. Avhengig av lyskilden, vente med å slå den på inntil nødvendig (f.eks., LED).
  2. Med sikte turret i en lav posisjon, velger 20X 0,7 NA målet som skal brukes.
  3. Plasser prøven over målet - dette vil gjøre det lettere å finne cellene når prøven er i kammeret.
  4. Definer bildeparametere på dette tidspunktet hvis de er kjent fra tidligere eksperimenter.

6. Transport Celler til mikroskop og inn i kammeret

  1. Transportere cellene som skal avbildes fra inkubatoren til miljøkammeret. Sørg for at dette gjøres raskt for å begrense virkningene av en forholdsvis lav CO 2
  2. Plassere cellene i en forseglet Styrofoam beholder eller pose isolert for å unngå store endringer i miljøet.
  • Sett prøven bilde rett inn i kammeret etter produsentens anvisninger.
  • Etter at cellene er festet inne i miljøkammeret, forsegle kammeret for å opprettholde et stabilt miljø og umiddelbart slår på kilden (e) for atmosfærisk gass.
    1. Som noen miljøkamrene ikke benytter et tett, forseglet lokk, for å forsinke fordampning, lag sterilt, embryo-sertifisert mineralolje på toppen av vekstmediet. Pakk gass-permeant parafin film rundt omkretsen kantene på prøven fatet være forsiktig med å hindre glass bildeområdet. Lokaliserte, sekundære fuktemetoder kan anvendes. Kondens på lokket av prøven fatet kan redusere utføMance av lysfelt mikroskopi.
  • For å minimalisere virkningene av termisk drift tidlig i løpet av forsøket, vent i 30 minutter før start av time-lapse. Den nødvendige tid varierer basert på bildebehandling tallerken størrelse og andre faktorer. Bestem empirisk.

    • 7. Sette opp Imaging

    1. Velg bildeforhold som best representerer dataene. Ta forholdsregler for å unngå fototoksisitet ved å begrense eksponeringstider, ved hjelp av lavere intensitet lys og velge sonder som er opphisset av lengre bølgelengder av lys.
    2. Definere x, y og z-planet og ønsket bølgelengde (r) for hver posisjon som skal avbildes. Tidsoppløsningen er begrenset av antallet av posisjoner og bølgelengder. For langsiktig time-lapse av de fleste cellulære prosesser, erverve ett bilde hvert 10 - 20 min; høyere tidsoppløsning (korte intervaller, f.eks., 1 min) gir flere datapunkter og dermed mer robust celle sporing, men også resulterer i mer integrertlyseksponering og større datasett.
      1. Som HT1080 FUCCI ha dynamiske grønn og rød fluorescerende proteiner (se Representant Resultater), kan du bruke følgende eksponeringstider: FITC / GFP - 50 ms, Texas Rød / TRITC - 40 ms, Lysfelt - 20 ms. Bruk en 2 x 2 bin.
    3. Aktiver programvarestyrt autofokus med standardparameterne i henhold til avanserte innstillinger. Definer en autofokus orden 10 mikrometer med den anbefalte trinnstørrelse. Sørg for å gjøre dette før du starter time-lapse. Autofokus med lysfelt bilder og aldri med fluorescens for å redusere fototoksisitet og fotobleking.
      1. Bruk programvarestyrte autofokussystemer på alle mikroskop med en motorisert stadium, og direkte fokus på prøven. De kan imidlertid begrense kjøpet hastigheten av forsøket. Maskinvare kontrollert kontinuerlig fokus systemer fungerer godt for time-lapse mikroskopi og bedre hastighet, noe som åpner for flere stillinger for å bli fotografert eller en høyere rate av oppkjøpet. Men destole på deteksjon av luftglassgrensesnitt og kan miste fokus av prøven med variasjoner i glasstykkelse på tvers av brønnen.
    4. Erstatte halvparten av mediet med mediet inneholdende det ønskede medikamentkonsentrasjonen som er blitt oppvarmet til 37 o C. Delvis media erstatning bidrar til å redusere termisk drift. Forholdene i dette forsøket er Vehicle (DMSO), 1fiM selinexor og 10 mikrometer PD0332991.
      Merk: Dette trinnet kan også gjøres etter start oppkjøpet ved å pause og starte eksperimentet. Dette gjør det mulig for langsgående sporing av før og etter narkotika reaksjoner fra enkeltceller. Hvis stoffet stabilitet eller metabolisme er en bekymring, pause og erstatte media kan gjøres med samme metode. For å teste for narkotika nedbrytning eller metabolisme, kan media fra behandlede celler også bli lagt vekt på naive celler for å teste narkotika handling.
    5. Start time-lapse.
    6. Som time-lapse går, sikre at fotografert feltene forbli i fokus og chamber opprettholder et fuktig 37 o C.
      1. Juster fokus etter behov ved å stanse oppkjøpet i løpet av tiden gapet mellom tidspunkter.
    7. Om nødvendig, tilsett vann til kammeret under lengre eksperimenter. Unngå avkjøling av kammeret ved tilsetning av forvarmet, sterilt, destillert vann ved 37 o C

    8. Avslutte Time-lapse

    1. Når eksperimentet har gått til ferdigstillelse, stoppe oppkjøpet hvis det ikke ble satt til å stoppe automatisk.
    2. Pass på at time-lapse er lagret skikkelig på harddisken, selv om de fleste programvarepakker automatisk lagrer under oppkjøpet hvis ikke ferdig riktig data kan gå tapt.
    3. Fjern kammeret fra mikroskopet og kast av cellene i biologisk avfall følgende godkjente institusjonelle biosikkerhet prosedyrer.

    9. Longitudinal Sporing og analyse av Time-lapse data

    1. Velg metode for analyse som erPasser for de biologiske prosesser av interesse. Mange plugins for ImageJ, programmer ved hjelp av Matlab, og tilpassede plattformer har blitt produsert for spesifikke applikasjoner. Den følgende metodikk omfatter sporing av kjerner og analyse av kjernefysiske fluorescerende prober som vist i figurene 4 og 5.
    2. Åpne .tif bildestakker for den benyttede kanaler i ImageJ. Alternativt åpne innfødte filer fra oppkjøpet programmet direkte i ImageJ bruke Bioformats plugin.
    3. Tegn en region av interesse (ROI) i kjernen av en celle med lysfelt bilde eller atom etiketten kanal (hvis brukt) og legge den til ROI manager. Merk: Hvis den avbildede celler har en atom etiketten (f.eks histon H2B-EGFP.), Og deretter automatisk celle sporing kan anvendes for å skape områder av interesse (ROIs) som representerer individuelle kjerner gjennom tid.
    4. Fortsett til neste gang punkt og plassere ROI innenfor samme nucleus. Legg ROI til ROI manager.
    5. Fortsette å spore og gjøre ROIs for den enkelte celle til det dannes en cellulær hendelse (mitose, apoptose, osv.), Eller cellen ikke lenger kan spores (f.eks., Flyttes ut av rammen eller eksperimentet).
    6. Når det er etablert ROIs for celler gjennom den tiden de er i feltet, innkopierer dem på fluorescerende kanaler av interesse. Måle den midlere intensitet av fluorescens i hver kanal for hvert tidspunkt. Lagre ROI liste for senere bruk.
      1. Ulike målinger kan gjøres innenfor ROI for applikasjoner i ulike eksperimenter. Klikk Analyse → Set Målinger ... for å få opp en meny for å velge analysemetode (f.eks., Mener intensitet i ROI, integrert intensitet, osv.).
    7. Merk celle skjebner for individuelle celler (f.eks., Apoptose, divisjon, overlevelse), mens sporing. Dette gir mulighet for etablering av overlevelseskurver og further populasjonsanalyse.
    8. Med gjennomsnittlig intensitet for begge kanaler, opprette et spredningsdiagram for å vise cellesyklus dynamikk som svar på therapeutics (figur 5B, C).
      Merk: Tomter kan opprettes for individuelle celler over tid, eller i gjennomsnitt over en befolkning på sporet celler. Kvantitativ bildebehandling kan være avgjørende for å etablere komplekse svar og celle relasjoner som svar på kreftbehandling. Langsiktig time-lapse mikroskopi, langsgående sporing og dataanalyse er en multi-trinns prosess, med mange muligheter for den type mikroskopi og analyseverktøy, og følger den generelle omrisset gitt i figur 1.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Langtids time-lapse mikroskopi og direkte langsgående sporing kan for studier av mange anti-kreft effekt i løpet av legemiddelrespons. Etter generell oversikt i figur 1, er flere eksempler på celler vist uttrykker validerte fluorescerende reportere som behandles med anti-kreft narkotika, spores, og analysert ved hjelp av ulike tilnærminger.

    Fasekontrastmikroskop alene er veldig lærerikt og robust rapporterer om interfase versus mitose, mitotisk varighet og arrest, unormal celledeling og celledød 21,23,24. Medikamenter som mål celledeling, ofte betegnet anti-mitotiske narkotika, fortsette å bli utviklet. Figur 2 og filmer 1 og 2 viser eksempler på en matchende par av brystkreft-avledet MCF7- cellelinjer som skiller seg bare i sin p53 status, behandlet med 500 nM av en type anti-kreft legemiddel som målog hemmer den mitotiske motor protein, kinesin-5 (KSP1, Kif11, EG5), som resulterer i forlenget mitose 20. Villtype MCF7 celler (Figur 2A) er et paradigme for å studere p53-avhengig cellesyklus arrest 25-27. Villtype celler inn mitose, forbli i flere timer, til slutt forlate og stort sett arrestere med induksjon av p53 25. Når p53 fjernes ved stabil p53 knockdown (MCF7 sh p53), i stedet for å stanse etter at de forlater mitose, cellene går gjennom gjentatte sykluser (figur 2B). Celler ble sporet manuelt og den mitotiske indeksen og prosentandelen av celler som skriver inn en andre mitose ble bedømt (figur 2C, D). Vi observerer at sh p53 cellen sporet skillelinjer når det går inn i en ny runde med mitose i stedet for å arrestere og forlate mitose uten divisjon. Selv om det ikke vises her varigheten av mitotiske hendelser, kan tiden mellom etterfølgende mitoser, prosent av celledelinger, og tilknyttet celledød hendelser også være scored 20,21.

    De taxaner, for eksempel paclitaxel og docetaxel, er vanlig kjemoterapi for mange kreftformer, inkludert de som er vanskelige å behandle som bukspyttkjertelen og avansert brystkreft. Paclitaxel binder seg til den dynamiske pluss-enden av mikrotubuli og stabiliserer dem, hindrer deres normale funksjon. Paclitaxel har merket doseavhengige effekter, og selv ved lave konsentrasjoner kan forstyrre normal mitotisk progresjon og kromosom segregering 16. Trofast segregering av kromosomene er viktig å normal celledeling og når unormal kan resultere i Aneuploidy som kan utløse cellesyklus arrest, men også fungere som en driver av kreft progresjon. Figur 3 og Movie 3 viser livmorhalskreft-avledet HeLa-celler som stabilt uttrykker kromatin men da histon-2b fusjonert til mCherry og beta-tubulin kondensert til EGFP (ikke vist) i normal vekstmedium som ble behandlet med 1 nM paclitaxel. I detteEksempelvis kan inntreden og progresjon gjennom mitose følges. Tidspunktet for mitosen synes normal i denne celle, men kromosom segregering innretting og er ikke, noe som resulterer i atom buler og mikrokjerner som er strukturer som indikerer dårlig kromosom segregering. Mikrokjerner er utsatt for DNA-skade og chromothripsis, som er den store fragmentering av kromosomer eller kromatin - Dette har viktige implikasjoner i tumorutvikling 28,29. Selv om det ikke er vist her, kan opprinnelsen til mikronuklei med relasjon til andre mitotiske strukturer og skjebnen til disse cellene være direkte spores ved hjelp av langsiktig time-lapse. Videre, uttrykt et kromatin markør med en DNA-skade reporter kunne brukes til å etablere forholdet mellom kromosom segregering, mikrokjerner og DNA-skade.

    Fluorescent journalister tillate enumerable celleprosesser for å bli sporet og nye journalister er stadig under utvikling. for exrikelig, cellesyklus består av faser som er av særlig interesse i å utvikle målrettede anti-kreftbehandling. Figur 4 og Movie 4 viser en fibrosarkom-avledet cellelinje (HT1080) som stabilt samarbeid uttrykker to journalister kalt, fluorescerende ubiquitin cellesyklus indikatorer (FUCCI) 30. I systemet her, er en del av den Cdt1 polypeptid kondensert til mKO2 (monomert Kusabira orange 2) og en økning i G1-fase og blir nedbrutt i tidlig S-fase, og en del av geminin er kondensert til MAG (monomert Azami grønn) og økninger i midten av S-fasen og er degradert på anaphase. Denne cellen er i normal vekstmedium og utvikler seg gjennom cellesyklusen i 15 timer. Figur 5A, B og film 5 viser de samme cellene i normal medium ble behandlet med 10 uM PD0332991, et Cdk4 / 6 inhibitor. Cellene går gjennom G2-fasen og dividere på vanlig måte, og sterkt arrestere i den etterfølgende G1-fasen, noe som indikerer muligheten for virkningive cytostatisk effekt i voksende svulster. figur 5C, D og Movie 6 viser de samme cellene i normal medium behandlet med et lite molekyl kalt selinexor (KPT-330), en potent hemmer atom eksport protein, exportin-en (XPO1, aka CRM1 ). Disse forbindelsene kalles selektive hemmere av kjernefysisk eksport (SINE) og deres anti-kreft effekt er under etterforskning 31,32. SINE behandling resulterer i sterke cellesyklus fenotyper og celledød 33,34. Dette eksempel viser en celle som utvikler seg gjennom G1-fase med normale kinetikk (ca. 6 timer), men opplever forsinkelser i S-faseprogresjon som indikert av perioden med både rødt og grønt signal (ca. 3 timer i kontrollen, men 10 i SINE behandlede ). Denne cellen dør i slutten av S- eller G2-fase etter 21 timer 30 min; en normal cellesyklus er omtrent 15 timer. Effektene av selinexor blir undersøkt for ulike blod og solide tumorer 35.

    Figur 6 og Movie 7 viser HT1080 celler som stabilt uttrykker en dobbel tråd DNA-skader reporter, mCherry-BP1-2 36 i normal vekst medium ble behandlet med 10 uM etoposid (VP-16), en topoisomerase II-gift. Dette reporter består av en del av DNA dobbel tråd pause stedet protein, 53BP1 som er kondensert til mCherry. Kjernen i denne cellen ble sporet using Analyser Partikler plugin i ImageJ og den integrerte mCherry-BP1-2 signal ble målt i hver ramme etter terskel ut verdier som elimineres løselig atom sonde. DNA-skade er minimal for den første 10 timer og deretter øker jevnt. Topoisomerase II-inhibitorer er kjent for å påvirke spesielt S- og G2-fasen, når enzymet er mest aktiv 37,38. Kinetikken ble observert i dette eksempel kan indikere cellesyklus tilhørende skade; kombinere mCherry-BP1-2 med FUCCI journalister kunne demonstrere tidspunktet for skaden som deretter kan knyttes til celle skjebne.

    Figur 1
    Figur 1. Oversikt over Bruke Langsiktig Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking å studere kreftlegemiddel Response. Celler i passende levende celle bildebehandling retter merket som ønskelig er avbildet, celler eller områder av interesse spores, og dataene er analysert. Mange metoder finnes for å spore og kvantifisere celler, noen er angitt her. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2. Fase-kontrast med tidsforsinkelse Mikroskopi viser p53-avhengighet etter anti-mitotisk Drug Treatment. Villtype (A) og p53-knockdown (B) MCF7-celler ble behandlet med 500 nM kinesin-5-inhibitor og avbildes hvert 10 min i 96 hr bruker fasekontrastmikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Individuelle celler ble sporet manuelt og prosent mitose og hvis cellen utvikler seg til en annen mitose igjen i løpet av time-lapse ble scoret. Piler indikerer celle som spores. Den sh p53 cellen (B) deler ved inngåelse en andre mitose. (C) begge cellelinjer show forlenget mitotisk stopp som antydet med høy topp prosent mitose (først blå og røde piler). (C, D) nær 90% av cellene uten p53 (sh p53, n = 87) viser videre progresjon (rød pil) sammenlignet med 20% av villtype (n = 130). Feilfelt angir standardavvik. Bar = 20 mikrometer. Movies 1 og 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Figur 3. Chromatin Marker Histone 2b avslører forsøk på kromosom Segregering abnormaliteter etter Low-dose Paclitaxel Treatment. Paclitaxel er en microtubule målrettet medikament som resulterer i komplekse, konsentrasjonsavhengig defekter i cellevekst og deling. Organiseringen av kromatin informerer om ulike celle stater, inkludert scenenav mitose og celledød. HeLa-celler som stabilt uttrykker både H2b-mCherry og β-tubulin-EGFP ble behandlet med 1 nM paclitaxel. Denne cellen er i utgangspunktet i inter, utvikler seg gjennom stadier av mitose og skillelinjer. Mens tiden i mitose vises normalt, det er tegn på kromosom feste og segregering feil som er løst (piler). Skjebnen til disse cellene kan bestemmes direkte av langsgående sporing. Fase-kontrast (ikke vist) og fluoriserende bildene ble kjøpt til en ramme per 10 min med en 20X Ph2 0,70 NA objektiv. Bar = 10 mikrometer. Movie 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4. Fluorescent Cell Cycle Markers Tillat for direkte overvåking av cellesyklusprogresjon.(A) Et felt av levende HT1080 fibrosarkom celler som uttrykker FUCCI system avbildes ved fase-kontrast og fluorescens. (B, C) ​​den mitotiske celle i stiplet ramme panel A følges. Normalt går gjennom cellesyklus i ca 15 timer. Etter mitose, celler er kort svak, og deretter blir rød når de går inn i og gjennom G1-fasen. Når celler inn S-fase, er den røde Cdt1 probe degradert og de grønne geminin probe øker. Den korte ca. 3 timers periode hvor begge sonder er tilstede, indikerer tidlig S-fase. Som celler fremdrift gjennom S- og G2-fasen og inn i det neste mitose de forblir grønne. Den grønne sonden er degradert ved anafase av celledeling. Fase-kontrast og fluorescerende bildene ble kjøpt til en ramme per 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Bar = 10 mikrometer. Movie 4. Klikk her for å VIew en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur den samme cellelinjen som i fig 4, men behandlet med to forskjellige molekyler som representerer ulike anti-kreft mål 5. Cell Cycle spesifikke effekter og tilhørende celledød.. Ganger etter behandling er angitt. (A, B) Etter behandling av en sen S / G2-fasen celle med 10 uM PD0332991 Cdk4 / 6 inhibitor, det celle utvikler seg normalt til mitose (M) og skiller. En datter celle spores ved å måle røde og grønne fluorescerende intensiteter i regionen av interesse i kjernen. Cellen er fortsatt arrestert i G1-fasen for ca 40 timer. (C, D) Efter behandling i en sen fase G2-celle med en uM selinexor, den celle utvikler seg normalt til mitose (M) og skiller. En datter celle spores og det går G1-fasen, utvikler seg gjennomen langvarig tidlig S-fase (rød og grønn signal), overganger til utelukkende grønt og dør etter 21 timer 30 min. Dataene tyder på S-faseprogresjon påvirkes av selinexor behandling. Fase-kontrast og fluorescerende bildene ble kjøpt til en ramme per 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Bar = 10 mikrometer. Filmer 5 og 6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6. DNA Damage Dynamics etter behandling. Mange anti-kreft terapi føre til DNA-skader som kan dypt påvirke celle respons og behandling suksess. HT1080-celler som stabilt uttrykker både den dobbeltkjedet DNA skade markør mCherry-BP1-2 og H2b-EGFP (ikke vist) som ble behandlet med 10 pM av topoisomerase II-medikament etoposid og DNA dAmage ble sporet. (A) Antallet og intensiteten av foci økning etter etoposid. Det er i utgangspunktet et lag, noe som indikerer mulige cellesyklus effekter konsistent med den kjente mekanismen av etoposid. Ved 22 timer 50 min denne celle har akkumulert høye nivåer av skader. Selv om det ikke er vist her, kan skjebnen til denne celle bestemmes ved direkte sporing. (B) En ROI svarende til kjernen oppnås gjennom H2b-EGFP-signalet ble sporet ved hjelp av partikkel-sporing i ImageJ og den integrerte BP1-2 mCherry signalet ble kvantifisert og plottet over tid. Etterslep i signalet inntil omtrent 10 timer er angitt, etterfulgt av en vedvarende økning. Fluorescent bildene ble kjøpt til en ramme per 10 min med en 40X PH2 0,75 NA objektiv. Bar = 10 mikrometer. Movie 7. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


    Movie 1. Fase-kontrast Time-lapse mikroskopi av hvete MCF7 celler etter Anti-mitotisk behandling. Hvete MCF7 celler ble behandlet med 500 nM kinesin-5 hemmer og avbildes hvert 10 min for 96 timer ved hjelp av fasekontrastmikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Langvarig mitotisk arrest og exit fra mitose kan observeres, som beskrevet i figur 2. Klikk her for å laste ned denne filen.

    moive 2
    Movie 2. Fase kontrast Time-lapse mikroskopi av p53-knockdown MCF7 celler etter Anti-mitotisk Drug Treatment. MCF7 celler som stabilt uttrykker en liten hårnål RNA rettet mot p53 for degradering ble behandlet med 500 nM kinesin-5 hemmer og avbildes hvert 10 min for 96 timer ved hjelp av fasekontrastmikroskopi med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Langvarig mitotisk arrest og flere runder med mitose kan observeres, som beskrevet i figur 2. Klikk her for å laste ned denne filen.

    moive 3
    Movie 3. Fluorescent Time-lapse mikroskopi av HeLa celler etter Low-dose Paclitaxel Treatment. HeLa-celler som stabilt uttrykker H2B-mCherry og β-tubulin-EGFP ble behandlet med 1 nM paclitaxel. Kromosom vedlegg og segregering problemer kan observeres, som beskrevet i figur 3. Bilder ble kjøpt hvert 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klikk her for å laste ned denne filen.

    ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> moive 4
    Film 4. Fluorescent Cell Cycle Markers Tillat for direkte overvåking av cellesyklusprogresjon. HT1080 celler som uttrykker FUCCI systemet ble langs sporet under time-lapse mikroskopi. Cellen går dim etter spennende mitose, og deretter blir rød som den cellen utvikler seg gjennom G1-fasen. Etter hvert som cellen går inn i S-fasen, blir den gule som den grønne geminin proben øker, og den røde Cdt1 sonden er degradert. Cellen er fortsatt grønt som det utvikler seg gjennom S- og G2-fase. Den grønne forringer når cellene kommer inn anaphase. Kvantifisering av denne cellen er vist i Figur 4. Bilder ble kjøpt hvert 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Moive 5 "src =" / files / ftp_upload / 53994 / 53994movie5.jpg "/>
    Movie 5. HT1080 Cell Uttrykke Fluorescent Cell Cycle Markers etter behandling med en G1-fase Inhibitor. HT1080 celler som uttrykker FUCCI systemet ble behandlet med 10 mm PD0332991, en ​​Cdk4 / 6-hemmer. Den spores celle utvikler seg normalt til mitose og skillelinjer. En datter er spores, og forblir rød i G1 for varigheten av filmen. Kvantifisering er vist i figur 5. Bilder ble kjøpt hvert 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klikk her for å laste ned denne filen.

    moive 6
    Movie 6. HT1080 Cell Uttrykke Fluorescent Cell Cycle Markers etter behandling med exportin-en Sperre, Selinexor. HT1080 celler som uttrykker FUCCI systemet var godbited med en mikrometer selinexor. Dette sent G2-fase celle ble sporet gjennom mitose. En datter celle utvikler seg så gjennom G1-fase (rød) og går inn i S-fase (gul). Cellen utvikler seg langsomt gjennom S-faser før den kommer inn sent-S / G2-fasen og dør etter 21 timer 30 min behandling. Kvantifisering er vist i figur 5. Bilder ble kjøpt hvert 10 min med en 20X PH2 0,70 NA objektiv. Klikk her for å laste ned denne filen.

    moive 7
    Film 7. DNA-skader Dynamics etter behandling med en topoisomerase II-hemmer. HT1080 celler som stabilt uttrykker dobbel tråd DNA-skader markør mCherry-BP1-2 og H2B-EGFP ble behandlet med 10 mm etoposid, en topoisomerase II inhibitor. Den mCherry-BP1-2 vises i filmen. Som behandlingen fortsettes, signalet mCherry-BP1-2 øker, noe som indikerer økt dobbel tråd DNA-skader. Kvantifisering er vist i figur 6. Bilder ble kjøpt hvert 10 min med en 40X PH2 0,75 NA objektiv. Klikk her for å laste ned denne filen.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Fordeler med Time-lapse mikroskopi og Longitudinal Tracking

    Mikroskopet er et ideelt instrument for longitudinelle studier av legemiddelrespons som gjør det mulig etterforskere for å spore individuelle celler og deres skjebner, samt hele befolkningen. Variasjon i narkotika svar innen en populasjon av celler er et stort problem for anti-kreft terapeutisk design. Langsgående sporing av enkeltceller gjør at etterforskerne å observere denne variasjonen og begynne å forstå de underliggende mekanismene og konsekvensene som det gjelder cellepopulasjonen. Ved hjelp av en rekke fluorescerende prober gir et mangfold av måter å observere og forstå både vanlige og sjeldne respons fenotyper. Tidspunktet for og bidrag fra ulike celle skjebner til befolkningen respons, relasjoner mellom spesifikke fenotyper og skjebner, og forskjeller i respons mellom cellelinjer eller staten ved behandling er eksempler på hva som kan læres. Mange kreftrelaterte prosesser kan studeres. Noen som ikke er uthevet i denne artikkelen omfatter celledød med apoptose, autofagi, og nekrose journalister 39-42, celle invasjon 43,44, og p53 dynamikk som bestemmer celle skjebne beslutninger 27. I tillegg er denne metoden ikke er begrenset til undersøkelser i anti-kreftbehandling studier. De samme prinsipper kan anvendes for å studere mange andre biologiske prosesser, inkludert mitose 45 cytoskjelett dynamikk 46,47 og intracellulær signaliserings 48.

    Time-lapse fluorescerende mikroskopi kan også gi lokalisering og intensitet data av proteiner og molekyler av interesse. Ikke bare er endringer i proteinnivå viktig for legemiddelrespons, men den riktige (eller feil) lokalisering av proteiner i cellene er avgjørende for forståelsen respons. Time-lapse mikroskopi gir data om hvor proteinene er lokalisert (f.eks., Kjernen, cytosol, spesifikke organeller,osv.) etter medikamentell behandling og hvordan lokalisering og total nivåer endres over tid på en enkelt celle og populasjonsnivå.

    Utfordringer og begrensninger

    Til tross for de sterke sider av time-lapse mikroskopi og langsgående analyse av enkeltceller, er det begrensninger. Fluorescens journalister er begrenset av sin stabilitet og spesifisitet. Ved utforming av fluorescerende fusjonsproteiner, er det avgjørende å velge en sonde som er foto-stabil og sterkt, men det er også nødvendig å vurdere virkningene av det fluorescerende merkelappen er festet til proteinet av interesse om sin normale funksjon og evne til å lokalisere . Disse problemene har blitt diskutert i detalj andre steder, og det er mange ledige fluorescerende tagget proteiner som er publisert 15,49,50. Andre fluorescerende etiketter eller koder kan legges til cellene, og omsorg må tas for å sikre at de er ikke giftige. I vår erfaring, disse pkapper, for eksempel mitokondrielle etiketter (membran potensielle) eller celle gjennomtrengelig DNA fargestoffer, har en tendens til å bleke lettere og vil være fortynnet ut på grunn av celledeling.

    I tillegg er det mange tekniske utfordringer med å vokse og observere cellene på et mikroskop. Ustabilitet med hensyn til temperatur, fuktighet, atmosfære, og lyset vil ha store effekter på cellene, noe som resulterer i tap av data eller til og med hele forsøket. Stabilitetsproblemer angående bildeopptak kan sees i filmer 1 og 2. Denne effekten kan reduseres gjennom bruk av parafin film (se 4.2). Det er også bildestabilisering algoritmer tilgjengelig for post-oppkjøpet behandling, for eksempel ved hjelp ImageJ (NIH). Et aspekt av langsiktig time-lapse som ofte blir oversett er data management og filstørrelse. Selv når binning dataene, er en enkelt time-lapse eksperiment ofte i overkant av 30 gigabyte. Høy kapasitet, høy hastighet, pålitelig datalagring og overføring er sterkely oppmuntret. Avhengig av det fluorescerende biosensor (e) som avbildes, er det ofte ikke nødvendig å erverve full oppløsning, for eksempel nukleær eller cytoplasmatiske sensorer. Vi anbefaler når det er mulig, å treffe tiltak for å holde filstørrelsen liten, noe som resulterer i enklere å jobbe med data, mindre krevende databehov, og forbedret arbeidsflyt.

    Fototoksisitet er et stort problem når du utfører langsiktig time-lapse mikroskopi. Høy intensitet lys og lange eksponeringer kan føre til fotobleking av fluorescerende prober, stress i cellene og celledød. Disse effektene kan ha stor innvirkning på dataene og føre til feiltolkning av forsøket. Kamera binning og gevinst kan brukes til å redusere eksponeringstider. Nøytral filtre i lysbanen redusere intensiteten av lyset på prøven. De bølgelengder av lys som brukes av bildet vil også påvirke cellene. Kortere bølgelengder (UV, nær UV) er mer skadelig for cellene og føre til foto-bleking på raskere priser ennlengre bølgelengder (f.eks., rød, langt rød). Valg av objektiv kan også påvirke bildebehandling forhold. Høyere numeriske apertur (NA) linser vil gi bilder med høyere oppløsning, men høyere forstørrelse tillater mindre lys som skal overføres fra prøven resulterer i høyere eksponeringstider eller mer intenst lys. En objektiv bør velges med en passende NA og forstørrelse som vil løse objekt av interesse uten oversampling. I mange tilfeller kan det høyeste målet ikke være det mest hensiktsmessige valg. Med nukleære sonder (figurene 4, 5), muliggjør en lav forstørrelse mål for et større felt som skal fanges, effektivt øker prøvestørrelse, uten at det går oppløsning av den ønskede gjenstand. Langsiktig time-lapse i tre dimensjoner bør utføres med forsiktighet på grunn av integrert lys. Ved hjelp av en roterende disk konfokalmikroskop, følsom kamera (f.eks., EM-CCD), kamera gevinst, og en rask piezo motor for z-serien er suggested for å redusere lyseksponering. Fast oppkjøpet z-serien er også viktig for å minimalisere bevegelsesartefakter grunn celle bevegelse og dynamikk som oppstår under oppkjøpet perioden. Empirisk analyse av ubehandlede celler ved hjelp av mange forskjellige innstillinger kan være nyttig for å bestemme virkningen av fluoriserende lys på en gitt cellelinje eller reporter. I tillegg bør en ubehandlet kontroll tas med i hvert forsøk for å bestemme de cytotoksiske virkningene av de eksperimentelle innstillinger.

    Varianter av Technique

    Langsiktig time-lapse er robust og svært fleksibel. Ved hjelp av co-dyrkningsteknikker, forskjellige cellelinjer eller de samme cellelinjer som uttrykker forskjellige reportere kan anvendes. En fremragende eksempel på dette er tenkelig fagocyttiske celler med målceller som er døende i respons til et anti-kreft legemiddel. Et annet eksempel kan være å studere virkningen av å svare celler på nabo narkotika naive celler. Sammen med foto-activateable, foto-cabriolet, og foto valgbar fluorescerende proteiner, og konstruerte proteiner som kan aktiveres av lys for å utløse spesifikke effekter (f.eks., KillerRed), er det mange muligheter. Mer komplekse tilnærminger kan brukes som benytter ulike spesialiserte typer mikroskopi som fluorescerende omfordeling etter fotobleking, Förster resonans energi overføring (FRET), og super-oppløsning (f.eks., Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), strukturelle belysning mikroskopi (SIM), eller stimulert emisjon mangel (STED)), og mange andre, og det er fordeler og begrensninger av hver fremgangsmåte.

    Langsiktig (f.eks., Uker, måneder) respons og utvinning av celler etter narkotika fjerning er viktig for å forstå anti-kreft narkotika handling. Rutenett med glassbunn retter er et verdifullt verktøy for å overvåke bestemte celler eller regioner i en befolkning / område gjentatte ganger. For eksempel, med en gitterantenne, den første drug reaksjon kan avbildes ved hjelp av en time-lapse, stoffet kan fjernes, og bestemte områder i nettet kan avbildes over tid eller utsettes for ekstra time-lapse på ønsket tidspunkt. Glasset bunn på serviset kan fjernes enten ved skjæring med et risseverktøy eller ved anvendelse av et kommersielt reagens, og cellene på glass, kan farges for andre markører i området, for eksempel senescens forbindelse β-galactocidase aktivitet, og sammenlignet time-lapse å forstå historien om hvordan celler nådd denne tilstanden. Hvis cellepopulasjonen er stor nok, kan også bli utsatt for immunblotting eller strømningscytometri.

    Tykke prøver har tradisjonelt vært vanskelig å bilde, for eksempel kuler i forskjellige gelmaterialer og matriser. Nyere tilnærminger inkludert fluorescerende konfokal eller multi-foton mikroskopi 16,18,19,51 kan brukes til å forlenge tilnærming til en in situ forståelse av hvordan celler reagerer på anti-kreft terapeutiske midler. DeSE studier og et økende antall fra forskere ved hjelp av time-lapse å studere anti-kreft narkotika respons 24,52-54 viser klart at vi beveger oss mot å utvikle en forståelse av encellete farmakodynamikk som vil bidra til å forbedre vår evne til å bruke anti-kreft narkotika mer effektivt og kanskje forutsi anti-cancer medikament respons.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Taxol (paclitaxel) Sigma T7191 microtubule stabilizing drug
    Etoposide Selleckchem S1225 topoisomerase II inhibitor
    Selinexor Karyopharm Therapeutics na XPO1/CRM1 inhibitor, gift
    Kinesin-5 inhibitor Merck Serono na gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2
    Cell growth medium HyClone (Fisher) or Mediatech many companies available
    5% CO2/balance air, certified Airgas Z03NI7222004379
    35 mm Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35-20-1.5-N many companies available
    35 mm 4-well Dish, 20 mm glass bottom Cellvis D35C4-20-1.5-N many companies available
    35 mm Dish, gridded glass bottom MatTek P35G-2-14-CGRD many companies available
    Multi-well, glass bottom Cellvis P12-1.5H-N many companies available
    Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope Olympus
    Olympus IX2-UCB controller Olympus
    PRIOR LumenPro200 Prior Scientific Lumen200PRO
    PRIOR Proscan III motorized stage Prio Scientific H117
    STEV chamber InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Environmental Controller Unit InVivo Scientific STEV.ECU.HC5 STAGE TOP
    Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller Hamamatsu C10600
    Nikon Eclipse Ti Nikon
    Nikon laser launch Nikon
    SOLA light engine lumencor
    iXon Ultra 897 EM-CCD ANDOR 
    TOKAI HIT inclubation chamber TOKAI HIT TIZSH

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
    2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
    3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
    4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
    5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
    6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
    7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
    8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
    9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
    10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
    11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
    12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
    13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
    14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
    15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
    16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
    17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
    18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
    19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
    20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
    21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
    22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
    23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
    24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
    25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
    26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
    27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
    28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
    29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
    30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
    31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
    32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
    33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
    34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391 (2015).
    35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
    36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
    37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
    38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
    39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
    40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
    41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
    42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
    43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
    44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
    45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
    46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
    47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
    48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
    49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
    50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
    51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
    52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
    53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
    54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

    Tags

    Medisin fluorescens mikroskopi live-cell imaging time-lapse kreft biologi cellebiologi
    Gjennom Looking Glass: Time-lapse mikroskopi og Longitudinal sporing av enkeltceller for å studere Anti-kreft Therapeutics
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Burke, R. T., Orth, J. D. Through… More

    Burke, R. T., Orth, J. D. Through the Looking Glass: Time-lapse Microscopy and Longitudinal Tracking of Single Cells to Study Anti-cancer Therapeutics. J. Vis. Exp. (111), e53994, doi:10.3791/53994 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter