Summary
يصف هذا البروتوكول وسيلة لtransfecting بكفاءة سيرنا في أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان المعزولة حديثا باستخدام microporation وتحديد المجمعات الحمض النووي والبروتينات في هذه الخلايا. يمكن رصد الخلايا Transfected لطخة الغربية وEMSA يحلل خلال الوقت ثقافة لمدة 4 أيام.
Protocol
وافقت لجنة الاخلاق UQAM هذه البروتوكولات، التي هي وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات من سانت لوك مستشفى مركز HOSPITALIER الجامعي مونتريال (مونتريال، كندا). وقع المشاركون على استمارة الموافقة المسبقة.
1. إعداد المتوسطة وعزل زغبي أرومة غاذية خلوية الابتدائية
- إعداد مستنبت لأرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان الأساسية من خلال استكمال Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) مع 25 ملي HEPES، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. تصفية المتوسطة استعداد من خلال معقم مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية في aliquots من 50 مل.
- عزل أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية من مشيمة جديدة بعد البروتوكولات القياسية 3.
- باستخدام كماشة، وإزالة غشاء الجنين من الأنسجة عن طريق خدش عليه بلطف، مع الحرص على عدم إزالة الأنسجة زغبي. اقطع التبقى الزغابات المشيمية في مكعبات من حوالي 3 × 3 سم باستخدام مشرط ومقص. يغسل جيدا بالماء تحتوي على 0.9٪ كلوريد الصوديوم لإزالة دم الأم.
- عقد كل مكعب مع كماشة، وإزالة بعناية الأنسجة زغبي من السفن المتبقية ومقص النسيج باستخدام الليفية.
- لمدة 15 إلى 30 ملغ من الأنسجة زغبي، يهضم أربع مرات في محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) التي تحتوي على التربسين (من 9.6 × 10 5-1،8 × 10 6 U، التركيز النهائي 1.2 ملغ / مل)، وديوكسي ريبونيوكلياز الأول (الدناز I) ( التركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع الهز المستمر.
ملاحظة: استخدم 150 مل الحجم الكلي لهضم الأول، و 100 مل لهضم الثاني و 75 مل لمدة المتبقية الهضم.
- جمع طاف تحتوي على خلايا متفرقة وأجهزة الطرد المركزي في 1250 x ج لمدة 15 دقيقة دون فرامل. إزالة طاف والخلايا resuspend في 1 مل من prewarmed DMEM تحتوي على1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
- طبقة الخلايا المتفرقة على رأس متقطع 5٪ - 70٪ التدرج المغلفة بوفيدون السيليكا (انظر الجدول رقم 1 لإعداد التدرج) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 23 دقيقة في 507 x ج من دون فرامل. إزالة طبقة كثافة بين 1،017-1،033 بواسطة الطموح وجمع طبقات تتراوح بين 40٪ و 50٪ في الانحدار مع ماصة جديدة. غسل الخلايا على نطاق واسع مع 10 مل من DMEM prewarmed تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
ملاحظة: الأجزاء المتجمعة يتوافق مع الكثافة بين 1.048 و 1.062، التي تؤوي أرومة مغذية. - عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. لفترة وجيزة، ومزيج الخلايا وإضافة 10 ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge جديد. إضافة 10 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان وتخلط بلطف مرة أخرى. وضع تعليق خلية وملء غرف عدادة الكريات. عد الخلايا تحت الهدف 10X.
- ضع 1 × 10 6 و 4.5 × 10 6 الخلايا في أنابيب منفصلة للاستخدام في أقسام 1.3 و 2، خاص بهلاي. البذور الخلايا المتبقية في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 6 خلايا / جيد في استكمال DMEM المتوسطة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة أقصاها 4 أيام لتجارب أخرى.
- باستخدام كماشة، وإزالة غشاء الجنين من الأنسجة عن طريق خدش عليه بلطف، مع الحرص على عدم إزالة الأنسجة زغبي. اقطع التبقى الزغابات المشيمية في مكعبات من حوالي 3 × 3 سم باستخدام مشرط ومقص. يغسل جيدا بالماء تحتوي على 0.9٪ كلوريد الصوديوم لإزالة دم الأم.
- تقييم نقاء أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية معزولة
- تدور 1 × 10 6 من أرومة غاذية خلوية المعزولة حديثا في أنابيب microcentrifuge في 300 × ز. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من prewarmed الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). خلايا الطرد المركزي في 300 x ج وإزالة PBS بواسطة الطموح.
- إضافة 1 مل من الميثانول الباردة إلى الخلايا واحتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة الميثانول بواسطة الطموح.
تحذير: استخدام قناع اسطوانة، نظارات السلامة والقفازات المطاطية أثناء التعامل مع الميثانول. - إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لترطيب الخلايا، الطرد المركزي في 300 x ج وإزالة PBS بواسطة الطموح.
- احتضان الخلايا في برنامج تلفزيوني تحتوي على FBS (01:50 [ت / ت] تمييع) وFCRحجب كاشف (01:10) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لقضاء ملزم انوعي.
- يغسل مرتين مع 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني، وخلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة PBS بواسطة الطموح. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخلايا مع ثيوسيانات الماوس وحيدة النسيلة فلوريسئين (FITC) -conjugated مكافحة البشرية LP5K cytokeratin-7 الأجسام المضادة استنساخ (1: 200) أو isotype السيطرة المطابقة الأجسام المضادة غير محددة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ BSA لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني.
- تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي 3. استخدام الاستعدادات الخلية، والتي تبرهن على الحد الأدنى من 96٪ خلايا إيجابية CK-7 التدفق الخلوي لمزيد من التجارب.
2. سيرنا ترنسفكأيشن الابتدائية زغبي أرومة غاذية خلوية الإنسان
- ترنسفكأيشن من أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان الأساسية باستخدام جهاز microporation
- إعداد 6 لوحات جيدة تحتوي على2 مل من المتوسط DMEM تستكمل لاحتضان خلايا microporated.
- بعد عزل أرومة غاذية خلوية الأولية (انظر القسم 1.2)، واتخاذ قسامة من الخلايا في تعليق وتحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
- نقل 1.5 × 10 6 خلايا لأنبوب microcentrifuge وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع 1 مل Dulbecco لبرنامج تلفزيوني (DPBS) (المغنيسيوم 2+، كا 2+ خالية) وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة طاف و resuspend الخلايا برفق في 100 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق.
ملاحظة: تجنب الاحتفاظ تعليق خلية لمدة أطول من 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبقاء الخلية والكفاءة ترنسفكأيشن لتعظيم. - إضافة 300 نانوغرام من Syncytin-2 سيرنا (أو مشوشة تحكم سيرنا) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، ونضح الخليط خلايا سيرنا باستخدام 100 ميكرولتر ترنسفكأيشن ماصة. إدراجماصة في محطة (انظر قائمة من المواد) وإخضاع الخلايا إلى نبض واحد من 30 ميللي ثانية 1300 V.
- على الفور نقل الخلايا إلى 6 لوحات جيدا (المعد في الخطوة 2.1.1) التي تحتوي على درجة حرارة ما قبل 37 ° C المتوسطة تستكمل لتجنب تلف الخلايا.
- كرر الخطوات من 2.1.5 و 2.1.6 لعينات المتبقية.
- صخرة بلطف لوحة لمدة 30 ثانية لضمان التوزيع العادل للخلايا. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في ترطيب CO 2 حاضنة لل24-48 ساعة. تحديث مستنبت 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
- تقييم كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق تحليل لطخة غربية (انظر الخطوات 3-6).
- Lipofection من سيرنا في أرومة غاذية خلوية الإنسان الأساسية
- بعد عزل أرومة غاذية خلوية زغبي، البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 6 خلايا لكل بئر في 6 لوحات جيدة في 2 مل من مستنبت واحتضان لمدة 18 ساعة.
- تمييع 300 نانوغرام من Syncytin-2-محددة سيرنا (أو سارعت ضبطسيرنا) و 5 ميكرولتر من الدهون على أساس ترنسفكأيشن الكاشف في منفصلة 1.5 مل الأنابيب في حجم ما مجموعه 10 ميكرولتر من المتوسطة antibiotic- وخالية من المصل. احتضان لمدة 5 دقائق.
- مزيج من الكواشف المخفف واحتضان لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن. إضافة 90 ميكرولتر من المتوسطة antibiotic- وخالية من المصل إلى المزيج إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
- إزالة مستنبت من 6 لوحات جيدا (الخطوة 2.2.1). إضافة 2 مل من المتوسط الطازجة ومزيج ترنسفكأيشن 100 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 ل24 إلى 48 ساعة. تحديث مستنبت 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
- تقييم كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق تحليل لطخة غربية (انظر الخطوات 3-6).
3. إعداد لست] من ثقافة كله خلية
- إزالة وسائل الإعلام وشطف كل بئر (من خطوات 2.1.8 و 2.2.4) باستخدام DPBS استعد مسبقا (المغنيسيوم 2+، كا 2+ مجانا). نضح DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل / (EDTA). احتضان لمدة 1-3 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2. إيقاف العلاج التربسين وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من مصل يحتوي على وسائط النمو.
ملاحظة: استخدام حجم وسائل الإعلام المناسبة وفقا لنوع من قارورة / طبق: 1 مل لكل 10 7 خلية / 100 طبق ملم / 150 سم 2 قارورة. 0.5 مل لكل 5 × 10 6 خلايا / 60 طبق مم / 75 سم 2 قارورة. - نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع DPBS (المغنيسيوم 2+، كا 2+ خالية) وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه. وضع أنبوب على الجليد. Resuspend وبيليه في 50-200 راديو مناعي الفحص (المعهد الملكي) العازلة الجليد الباردة ميكرولتر (انظر الجدول رقم 2 لتكوين عازلة) التي تحتوي على إضافة حديثاإد البروتيني ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز بتركيز نهائي 1X. لفترة وجيزة، دوامة أنبوب وترك على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- تدور في 16000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. وضع بعناية أنبوب على الجليد. باستخدام ماصة، طاف لنقل أنبوب microcentrifuge جديدة قبل تبريده أبقى على الجليد. تجاهل بيليه.
4. إعداد مقتطفات النووية من الخلايا المستزرعة
- لكل (الخطوة 1.2.5) جيدا، وغسل أرومة غاذية خلوية مثقف مرتين مع 1 مل من قبل تحسنت DPBS (المغنيسيوم 2+، كا 2+ مجانا). نضح DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين / EDTA. احتضان لمدة 1-3 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 ووقف العلاج التربسين وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من مصل يحتوي على وسائط النمو.
- نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع DPBS (المغنيسيوم 2+، كا 2+ خالية) وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزيفي 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية كل طاف دون الإخلال بيليه ووضع أنبوب على الجليد.
- استخراج البروتين النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد تركيز البروتين من كل عينة باستخدام فحص البروتين الكمي (برادفورد أو حمض bicinchoninic فحص (BCA)).
5. تحضير العينة والكهربائي
- تحديد تركيز البروتين لكل استخراج الخلايا باستخدام فحص البروتين الكمي (على سبيل المثال، برادفورد 8 أو BCA 9).
- وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (إذا كان يمكن استخدام الأجسام المضادة في ظروف انخفاض وتمسخ)، إضافة حجم مساو من 2X Laemmli عينة العازلة (الجدول 2) إلى 20-30 ميكروغرام من البروتين الكلي.
- لست] خلية يغلي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قسامة 50-100 ميكرولتر من المحللة لتجنب تكرار تجميد دورات / الذوبان وتخزين أنابيب المتبقية في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. في حين أن العينات يتم تسخين، وإعداد 1 لتر من 1X العازلة على التوالي (الجدول 2).
- تدور العينات في 16000 x ج لمدة بضع ثوان، ووضعها على الجليد.
- تحميل كمية متساوية من البروتين في كل بئر من 12٪ هلام SDS-PAGE (انظر الجدول رقم 2 لتكوين هلام)، جنبا إلى جنب مع الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل هلام ل1-2 ساعة على 100 V.
6. نقل البروتين من جل إلى غشاء
- تفعيل فلوريد البولي (PVDF) الغشاء مع الميثانول لمدة 1 دقيقة ويشطف نقل 1X حل العازلة / 10٪ الميثانول. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، ونقل لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة اعتمادا على حجم البروتين.
ملاحظة: كفاءة نقل يمكن تقييم باستخدام الشقائقية الأحمر تلطيخ قبل خطوة الحجب.
7. تلوين الأجسام المضادة
- منع الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية باستخدام 5٪ عرقلة الحل.
- احتضان الغشاء مع المضادة Syncytin-2-الأجسام المضادة (4 ميكروغرام / مل، 1: 5000) 6 أو مع مكافحة غليسيرألدهيد-3-فوسفات نازعة (GAPDH؛ 0.4 ميكروغرام / مل، 1: 500) في 5٪ عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 ° C (مكافحة Syncytin-2) أو لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل الغشاء ثلاث مرات في مخزنة المالحة تريس توين (TBST، انظر الجدول 2 لتكوين العازلة) لمدة 5 دقائق.
- احتضان الغشاء مع المناسبة البيروكسيديز الفجل (HRP) -conjugated المضادة للأرنب أو الأجسام المضادة لمكافحة فأر (1: 10000) في 5٪ عازلة تمنع في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة 5 دقائق ثم يشطف في TBS. كشف الإشارات باستخدام الركيزة النشاف القائم على التوهج.
8. Radiolabeling من واحدة الذين تقطعت بهم السبل قليل النوكليوتيد
- رد فعل الفسفرة
- في أنبوب microcentrifuge، إضافة 50 نانوغرام من النوكليوتيد إلى الأمام جنبا إلى جنب مع 1X T4 عازلة عديد النوكليوتيد كيناز، 1 UT4 كيناز عديد النوكليوتيد و 20 μCi (γ- 32 P) ATP وتشكل حجم رد الفعل إلى 20 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه.
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقف رد فعل عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA. تشكل وحدة التخزين إلى 50 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه.
- إزالة النيوكليوتيدات الفردية من أليغنوكليوتيد]
- إعداد العمود G-25 معايرتها مع العازلة TE (الجدول 2) بعد تعليمات الشركة الصانعة. وضع عمود في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge خالية الدناز جديدة.
- ببطء إضافة 50 ميكرولتر من التحقيق (من الخطوة 8.1.2) على الراتنج، والحرص على عدم تعكير صفو السرير الراتنج. تدور لمدة 2 دقيقة في 350 x ج لجمع عينة النقاء في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. غسل العمود G-25 مع 36 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه وتدور لمدة 2 دقيقة في 350 x ج لأنه جمع في أنبوب microcentrifuge.
- التهجين مع رأ حبلا التكميليةigonucleotide
- نقل التحقيق رديولبلد (86 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإضافة 200 نانوغرام من قليل النوكليوتيد العكسي و1X العازلة الصلب (الجدول 2). الحرارة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية، وتترك ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة لتبريد.
- إعداد أليغنوكليوتيد المزدوج تقطعت بهم السبل غير المشعة عن طريق إضافة 50 نانوغرام من ليس لها علامة إلى الأمام وعكس أليغنوكليوتيد و1X العازلة الصلب في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تشكل وحدة التخزين إلى 100 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. الحرارة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة كما هو موضح في الخطوة 8.3.1.
9. إعداد عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد جل لEMSA
- إعداد 4٪ هلام الأصلي (10 × 12 سم) مع 1.5 ملم الفضاء مشط (انظر الجدول رقم 2 لتكوين هلام). تنظيف جميع لوحات الزجاج باستخدام الماء المقطر.
ملاحظة: من المهم للغاية أن لوحات تكون خالية تماما من المنظفات الأيونية، مثل SDS. - على الفور صلدينا الحل الأكريلاميد في بين لوحات والسماح البلمرة للمضي قدما (حوالي 30 دقيقة).
- تجميع الأجهزة الكهربائي وملء خزان مع TBE 0.5X. قبل تشغيل هلام لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على 150 V قبل تحميل عينة.
10. الحمض النووي ملزم رد الفعل
- في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة 10 ميكروغرام من استخراج النووي (الخطوة 4.3) في 1X جل ملزم التحول عازلة (الجدول 2) ويشكلون الحجم النهائي إلى 10 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. كعنصر تحكم، وإعداد أنبوب مع عدم وجود مستخلص النووي. للتفاعل المنافسة، إضافة 1 ميكرولتر من النوكليوتيد البارد غير محددة أو معينة المزدوج تقطعت بهم السبل (الخطوة 8.3.2).
- إضافة 1 ميكرولتر من التحقيق المشع من الخطوة 8.3.1 لكل رد فعل. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة 1 ميكرولتر من العازلة تحميل 10X جل في رد الفعل وتحميل كل عينة على هلام أعدت في الباب 9.
- تشغيل هلام ل1 1/2 إلى 2 ساعة على 150 خامسا بعد الهجرة، والتفاف جل والزجاج في غلاف بلاستيكي وموقف في الكاسيت التعرض أدناه شاشة الفوسفور. ترك كاسيت عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- إزالة الشاشة من الكاسيت التعرض وضعه في الجهاز الفوسفور التصوير للمسح الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
استخدمت مشيمة جديدة من حالات الحمل المدى لعزل أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان الأساسية لإجراء مجموعة من التجارب المقدمة في قسم البروتوكول. بعد عزلتهم، علينا أولا بتحليل نقاء أرومة غاذية خلوية من خلال استخدام علامة cytokeratin-7 (الشكل 1). وهكذا ملطخة الاستعدادات خلية باستخدام وحيدة النسيلة المضادة للcytokeratin-7 الأجسام المضادة الشكل 1 يمثل نتائج تجربة نموذجية التالية تنقية أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية وتحليلها بواسطة التدفق القياسي الخلوي. بعد الخطوة التدرج الكثافة،> 97٪ خلايا (في هذه الحالة، 99٪) هي ملطخة بشكل إيجابي لcytokeratin-7 في التجارب القياسية، مما يدل على درجة عالية جدا من الكفاءة في تنقية هذا نوع من الخلايا.
بعد عزلتهم، أرومة غاذية خلوية الأولية الإنسان يمكن أن تستخدم مباشرة لهيئة تنظيم الاتصالاتnsfection. تم تقييم اثنين من بروتوكولات مختلفة، أي microporation وترنسفكأيشن الدهون على أساس. تم اختبار كل من البروتوكولات مع سيرنا محددة لSyncytin-2 مرنا ومقارنته مع سيرنا سارعت (المراقبة السلبية). تم تقييم كفاءة ترنسفكأيشن المقبل عن طريق تحليل لطخة غربية. وأكدت النتائج أن Syncytin-2 التعبير وإسكات بشكل كبير في مقتطفات المستمدة من الأرومة الغاذية الخلوية على microporation (الشكل 2). من ناحية أخرى، لوحظ عدم إسكات كبير عندما و transfected الرناوات siRNAs من قبل كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس.
نحن أيضا إجراء تجارب EMSA على أرومة غاذية خلوية المعزولة حديثا. تم توليفها والتحقيق رديولبلد التي نشأت من منطقة المروج Syncytin-2. التحقيق توليفها (وهو ما يسمى WT، 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') وقد تبين سابقا لربط 7 عوامل النسخ المتعلقة CREB. في ظل وجود EXTR النووي أعمال من 24 و 48 ساعة أرومة غاذية خلوية زغبي مثقف، وأظهر التحقيق المستمدة Syncytin-2-المروج وجود اثنين من المجمعات الحمض النووي والبروتينات. إضافة 100X البارد النوكليوتيد WT تنافست لتشكيل المجمع، في حين أن هناك منافسة مماثلة مع فائض قليل النوكليوتيد لا علاقة لها البارد (الماوس العصبية كريست محسن 2، 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') وقد لوحظ، مما يؤكد خصوصية كل الإشارات ( الشكل 3).
الشكل 1. تقييم نقاء أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية من خلال التدفق الخلوي. معزولة طازجة الاستعدادات من أرومة غاذية خلوية زغبي تم permeabilized أولا ثم وصفت مع الأجسام المضادة isotype السيطرة (خط أحمر) أو الأجسام المضادة وحيدة النسيلة محددة لcytokeratin-7 (خط أسود). وقد تم تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. ليه / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مقارنة بين الكفاءة ترنسفكأيشن سيرنا بين ترنسفكأيشن الدهون على أساس وmicroporation. و transfected أرومة غاذية خلوية زغبي معزولة طازجة مع 300 نانوغرام من Syncytin-2-محددة سيرنا مقابل لسيرنا السيطرة سارعت باستخدام كاشف الدهون على أساس أو microporation. تم تنفيذ (A) التحليلات الغربية وصمة عار على مقتطفات الخلوية من كل حالة ترنسفكأيشن باستخدام أضداد GAPDH مكافحة Syncytin-2 و. (ب) مستويات Syncytin-2 البروتين من التحليلات الغربية وصمة عار وكميا من حيث كثافة الموجات التالية التطبيع مع المقابلة إشارات GAPDH (يتم تحديد أشرطة الخطأ كما SD ***، ف <0.001). 5 / 53995fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
وحضنت الشكل 3. المجمعات الحمض النووي والبروتينات التي تم تحديدها من خلال تحليل EMSA. مقتطفات النووية من أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية مثقف لمدة 24 أو 48 ساعة مع لجنة التحقيق WT المقابلة لمنطقة المروج من Syncytin-2 مع أو بدون زيادة (100X) من محددة أو انوعي [أليغنوكليوتيد الباردة. تم فصل المجمعات الحمض النووي والبروتينات على الهجرة على هلام الأصلي. يشار إلى إشارات محددة وتحقيقات حرة على الجانب الأيمن من هلام. وقد استخدم WT التحقيق المحتضنة في غياب استخراج النووي أيضا كوسيلة لمراقبة سلبية. CT NE = مقتطفات النووية الأرومة الغاذية الخلوية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| ٪ من نهائي Percoll | حجم Percoll (90٪) (مل) | حجم HBSS (مل) |
| 70 | 2.33 | 0.67 |
| 65 | 2.17 | 0.83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1.17 |
| 50 | 1.67 | 1.33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1.33 | 1.67 |
| 35 | 1.17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0.83 | 2.17 |
| 20 | 0.67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| 10 | 0.33 | 2.67 |
| 5 | 0.17 | 2.83 |
الجدول 1. 5٪ -70٪ وضع المغلفة بوفيدون السيليكا التدرج.
| عازلة | تركيب | تعليقات / الوصف |
| برنامج تلفزيوني 1X | 0.9 ملي CaCl 2، 2.7 ملي بوكل، 1.5 ملي KH 2 PO 4، 0.5 ملي MgCl 2، 136.9 ملي كلوريد الصوديوم و 0.8 ملي نا 2 هبو 4 | |
| المعهد الملكي العازلة | 150 مم كلوريد الصوديوم، 1.0٪ NP-40 أو 0.1٪ تريتون X-100، و 0.5٪ deoxycholate الصوديوم، 0.1٪ SDS (الصوديوم دوديسيل كبريتات)، 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 8.0 درجة الحموضة | |
| العازلة عينة Laemmli | 4٪ SDS، 10٪ 2-mercaptoethanoلتر، و 20٪ الجلسرين، 0.004٪ برموفينول الأزرق، 0.125 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8 | |
| 10X عازلة تشغيل | 25 ملي تريس قاعدة، 190 ملي الجلايسين، 0.1٪ SDS | |
| عازلة نقل 10X | 25 ملي تريس قاعدة، 192 ملي جليكاين | |
| عازلة TBST 1X | 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، 15 مم كلوريد الصوديوم، 0.05٪ توين 20 في درجة الحموضة 7 | تخلط جيدا وتصفيتها. يمكن عدم تصفية يؤدي إلى "اكتشاف" من الغشاء. |
| عازلة تمنع | وأضاف الحليب 5٪ أو BSA (ألبومين المصل البقري) إلى TBST العازلة 1X | |
| TE العازلة | 10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0)، 1 ملم EDTA | |
| عازلة الصلب | 1 M كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.5 درجة الحموضة، و 100 ملي MgCl 2، 0،2 ملي EDTA، 1 ملم DTT | |
| 5X جل التحول الاحتياطي ملزم | 20٪ glyceroلتر، 5 ملي MgCl 2، 2.5 ملي EDTA، 2.5 ملي DTT، 250 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة) و 0.25 ملغ / مل بولي (DI-تيار مستمر). | |
| العازلة تحميل | 250 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك (7.5 درجة الحموضة)، 0.2٪ برموفينول الأزرق و 40٪ الجلسرين | |
| TBE 5X | حل 54 غرام من قاعدة تريس و 27.5 غرام من حمض البوريك في 1 لتر ماء منزوع الأيونات، التي تضم 20 مل 0.5 M EDTA، ودرجة الحموضة 8 | |
| 4٪ هلام الأصلي | عازلة TBE 5X | 6.0 مل |
| 29: 1 مادة الأكريلاميد / bisacrylamide (30٪ ث / ت) | 10 مل | |
| 40٪ الأكريلاميد (ث / ت) | 0.75 مل | |
| 100٪ الجلسرين | 1.5 مل | |
| الماء المقطر | 41.5 مل | |
| الأمونيوم بيرسلفات 25٪ | 250 مل | |
| TEMED | 75 مل | |
| 4٪ STACالملك جل (6 مل) لSDS-PAGE | ده 2 O | 4.1 مل |
| 30٪ الأكريلاميد | 1.0 مل | |
| 1.0 M تريس | 0.75 مل | |
| 10٪ SDS | 60 ميكرولتر | |
| 10٪ APS | 60 ميكرولتر | |
| TEMED | 6 ميكرولتر | |
| 12٪ فصل جل (10 مل) لSDS-PAGE | ده 2 O | 3.3 مل |
| 30٪ الأكريلاميد | 4.0 مل | |
| 1.5 M تريس | 2.5 مل | |
| 10٪ SDS | 100 ميكرولتر | |
| 10٪ APS | 100ميكرولتر | |
| TEMED | 4 ميكرولتر |
الجدول 2. تكوين مخازن.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قد تحسنت الدراسات على وظيفة المشيمة الإنسان والتنمية إلى حد كبير من قبل بروتوكولات تهدف إلى تحسين عزل مختلف السكان الخلية المشيمة. واحدة من أفضل السكان الخلية المشيمة المدروس يبقى أرومة غاذية خلوية زغبي، ودراسة التي استفادت كثيرا من البروتوكولات الأمثل السماح عزلة فعالة وموثوق بها. وقد سمح ذلك أيضا على عدد من التجارب، مثل دراسات ترنسفكأيشن والمروج. باستخدام بروتوكول الموصوفة سابقا 3، مجموعات نقية من أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية يمكن الحصول عليها. CK-7 هو بروتين خيوط وسيطة، وهو ما يعبر عنه في أرومة غاذية خلوية. وتستخدم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد هذا البروتين لتحديد نقاء هذه الفئة من السكان الأرومة الغاذية بعد عزلتهم من المشيمة 10. وتعرف الاستعدادات لتكون نقية عند 96٪ من الخلايا هي إيجابية للCK-7. ويمكن بعد ذلك الخلايا يمكن استخدامها مباشرة لترنسفكأيشن. البروتوكولات ترنسفكأيشنتنطوي على نهج القائم على الدهون وتستخدم على نطاق واسع لنقل الأحماض النووية في خلايا أولية 11،12. ومع ذلك، سمية صياغة المادة الدهنية في بعض الخلايا تصبح غير مؤات. Microporation هو عبارة عن تقنية Electroporation للباستخدام طرف ماصة كفضاء Electroporation لل، الذي يولد حرارة الحد الأدنى، وانحلال أيونات المعادن، والتباين ودرجة الحموضة وتشكيل أكسيد. والتي يمكن أن تكون ضارة للخلايا. واستنادا إلى البيانات المقدمة هنا، يمثل microporation نهجا أكثر كفاءة لتسليم سيرنا من بروتوكول ترنسفكأيشن الدهون على أساس، والحكم عليها من خلال تحليل لطخة غربية. باستخدام نهج EMSA، تحقيقا مصممة ضد المنطقة المحددة من المروج Syncytin-2 ما هو معروف لربط العوامل الهامة لنشاطها 7 تم اختباره. وقد حضنت التحقيق مع استخراج النووي من أرومة غاذية خلوية معزولة. كما هو مبين في الشكل (3)، وقد تم الحصول على إشارات محددة.
بروتوكولات مختلفة وصفت هنا حافي تم تحسين في السنوات الأخيرة. ومع ذلك، فإنها كلها تعتمد على الاستعدادات الأرومة الغاذية الخلوية عالية الجودة، والتي تعتمد على عدد معين من الخطوات الحاسمة. أولا وقبل كل شيء، وبعد الولادة، تحتاج مشيمة إلى أن يوضع في محلول منظم، ويجب أن تكون معزولة خلايا لهم من بعد ما لا يزيد عن 5 ساعات يجري مغمورة في المحلول. العلاج التربسين والدناز هي أيضا ذات أهمية كبيرة وينبغي الاضطلاع بها بعناية لتحقيق أقصى قدر من الجودة من إعداد الأرومة الغاذية الخلوية. تنقية واسعة من الزغابات المشيمة والحد من الوقت اللازم لعزلتهم على حد سواء تحسينات إضافية، والتي يمكن ترقية بقوة كفاءة عدد زنزانة انفرادية. العائد من هذا البروتوكول يعتمد كذلك على الطرد المركزي الأمثل خلال الخطوة التدرج الكثافة، التي ينبغي مراقبتها عن كثب. إن الفشل في تحقيق التوازن بشكل صحيح الأنابيب يؤدي أيضا إلى تشويه التدرج ويقلل بشدة أعداد الخلايا.
وصف بروتوكول ترنسفكأيشند هنا تم اختبارها لأكثر من عدة سنوات. وعلى الرغم من الظروف اللازمة لmicroporation هي واضحة عموما، وعلى الرغم من ذلك يتطلب تعظيم الاستفادة من ترنسفكأيشن لمختلف الخلايا الأولية. هذا ينطوي أيضا على تعظيم الاستفادة من كمية حمض النووي transfected (سيرنا أو DNA البلازميد). وهكذا، على وصف بروتوكول هنا، فمن المستحسن الاستفادة المثلى من تركيزات مختلفة الرناوات siRNAs لتحديد هوية سيرنا قمع بكفاءة. إضافة وحدة تخزين تعليق المناسب لبيليه الخلية قبل microporation والوقف الكامل للخلايا هي العوامل الإضافية التي تؤثر على كفاءة ترنسفكأيشن.
وقد استدعى التجارب EMSA أيضا الأمثل. ونظرا لعدم تجانس المرتبطة مع الجهات المانحة المشيمة ومتفاوتة الكفاءة العزلة الأرومة الغاذية الخلوية ودرجات نقاء، تحتاج التجارب EMSA أن يتكرر ما يصل الى 5 مرات لتأكيد النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، وجود أعداد الخلايا نولي أهمية كبيرة لضمان المتواجد كافيةفي المستويات في استخراج الاستعدادات النووية وكشف لاحق من المجمعات بروتين / الحمض النووي. وعلاوة على ذلك، ينبغي إعداد تحقيقات قليل النوكليوتيد عالية الإشعاع، ويجب أن يكون مستعدا طازجة من ATP المشعة التي تم شراؤها مؤخرا.
يجب أن يكون مفهوما سلسلة من القيود في بروتوكول المعروضة. أنه يحتاج أولا إلى التشديد على أن التدفق الخلوي التحليلات لا يمكن تقييم احتمال وجود شظايا الأرومة الغاذية المخلوية في الاستعدادات الخلية. وقد اقترحت بروتوكولات أخرى لحل هذه المسألة، مثل الفرز باستخدام التدفق الخلوي أو استخدام حبات مغناطيسية محددة الأجسام المضادة 13،14. وتجدر الإشارة على الرغم من أن هذه الشظايا لا تلتزم عادة إلى الآبار زراعة الخلايا وغالبا ما يتم إزالتها بعد خطوة الغسيل الخلية. الحد أخرى إلى بروتوكول المعروضة هو أن أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية وقتا بقاء محدود جدا في زراعة الخلايا. وبالتالي، بغض النظر عن الوسيلة المختارة، ترنسفكأيشن مستقرة من VILستبقى أرومة غاذية خلوية ويس بعيد المنال. EMSA التحليلات، كما هو موضح في هذا البروتوكول، وأيضا بعض القيود. وعلى الرغم من خصوصية إشارات يمكن بسهولة أن تقدره التجارب المنافسة مع أليغنوكليوتيد غير المسماة الزائدة، ويمكن تحديد العوامل ملزمة فقط باستخدام أجسام مضادة ضد عوامل النسخ المحددة مما أدى إلى إشارات supershifted. تجارب EMSA علاوة على ذلك لا تزال محدودة كما يدرس في تفاعلات الحمض النووي والبروتينات في المختبر. هناك حاجة لتجارب مع مزيد من الإعدادات التمثيلية، مثل فحص رقاقة، وأكثر حداثة في بروتوكولات الجسم الحي لزيادة تأكيد نتيجة EMSA.
بروتوكولات الموصوفة هنا لعزل الأرومة الغاذية الخلوية وترنسفكأيشن لها تطبيقات هامة للدراسات التي تحتاج إلى إسكات عابرة أو overexpression من الجينات المحددة لاستيعاب دورها في وظيفة، والانتشار أو تمايز نوع من الخلايا الأرومة الغاذية محددة. وبالإضافة إلى ذلك، على ترنسفكأيشن، رسوف الإصدارات agged من البروتينات وأعرب تكون مناسبة لتتبع الخلايا ويحلل من خلال تقنيات القياسية، مثل الفحص المجهري متحد البؤر والتدفق الخلوي. بروتوكول EMSA يمكن استخدامها لدراسة التفاصيل المعقدة المتعلقة تنظيم المروج وعوامل النسخ المتورطين. وعلاوة على ذلك، فإن هذا المنهج التجريبي تسمح للباحثين لتحديد العوامل التي تدخل في تطوير بعض الأمراض الناجمة عن نقص المشيمة وتنظيم محورة من الجينات التي أعرب عنها في أرومة غاذية خلوية زغبي.
في الختام، يمكن أرومة غاذية خلوية الأولية الإنسان أن يكون معزولا بسهولة من مشيمة وقابلة للبروتوكولات القياسية، مثل سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA. وعلى الرغم من الإجراءات ترنسفكأيشن مختلفة، مثل lipofection 15 و 16 nucleofection المتاحة، microporation يبدو وسيلة فعالة جدا لسيرنا ترنسفكأيشن من أرومة غاذية خلوية زغبي عزلة، وتقدم نهجا مع محدودية خلية ديATH وبتكلفة منخفضة نسبيا. في سياق أرومة غاذية خلوية زغبي، أن هذا النهج يسمح إسكات الجينات المختلفة، وتقييم تأثيراتها في مختلف وظائف أو خصائص نوع من الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، ترنسفكأيشن ناقلات التعبير هو أيضا من الممكن استخدام هذا البروتوكول وسوف تسفر عن بيانات مكملة للنهج القائم على سيرنا. وفيما يتعلق EMSA، وتقدم هذه التقنية طريقة أسرع وأبسط لتقييم المجمعات البروتين DNA بالمقارنة مع النهج البديلة، مثل الدناز أنا البصمة، مثيلة تدخل الفحص، مناعي لونين والكروماتين يحلل التشكل. وبالتالي، لا تزال هذه التقنية قيمة في المروج القياسية يحلل أو اختبار أي محسن المناطق الحمض النووي أخرى / التي تحتوي على القامع. لدينا دليل على استخدام موثوق بها لأرومة غاذية خلوية زغبي مهمة، كما أنه يضيف معلومات عن تنظيم الجينات، مع الآثار المحتملة على المستوى الوظيفي. وعلى الرغم منضيق الوقت في الثقافة، أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية هي مناسبة للدراسات القياسية وينبغي أن تكون قابلة للتكيف مع أكثر حداثة وكذلك أساليب بالمعلومات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من خلال منحة من العلوم والبحوث الهندسية المجلس الوطني لكندا (NSERC) (# 298527) (BB). وأيد CT من قبل منحة دراسية FARE المؤسسية. وأيد AV التي كتبها على درجة الدكتوراه NSERC غراهام بيل منحة دراسية. عقدت BB كرسي أبحاث كندا في Retrovirology الإنسان (المستوى 2). بفضل بياتريكس Beisner للمساعدة في إعادة النظر في النص.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
