Summary
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het efficiënt siRNA transfectie van vers geïsoleerde menselijke villous cytotrofoblasten behulp microporatie en het identificeren van DNA-eiwitcomplexen in deze cellen. Getransfecteerde cellen kunnen worden gecontroleerd door Western blot en EMSA analyses gedurende de 4 dagen cultuurtijd.
Protocol
De UQAM ethische commissie heeft deze protocollen, die in overeenstemming zijn met de richtlijnen van de ethische commissie van St-Luc ziekenhuis van het Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Canada) goedgekeurd. De deelnemers tekenden een informed consent formulier.
1. Medium Voorbereiding en isolatie van Primary Villous cytotrofoblasten
- Bereid kweekmedium voor humane primaire villous cytotrofoblasten aanvulling Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 25 mM HEPES, 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine. Filter de voorbereide medium door steriel 0,22 pm filter en op te slaan in een -20 ° C vriezer in porties van 50 ml.
- Isoleer primaire villous cytotrofoblasten van verse placenta volgende standaard protocollen 3.
- Met behulp van een tang, verwijder de vliezen uit het weefsel door voorzichtig te krabben het uit, terwijl ze voorzichtig villous weefsel niet te verwijderen. Snij deresterende placenta villi in blokjes van ongeveer 3 x 3 cm met behulp scalpel en schaar. Grondig wassen met water dat 0,9% NaCl maternale bloed te verwijderen.
- Het houden van elke kubus met een tang voorzichtig de villous weefsel te verwijderen van de resterende schepen en vezelig weefsel met een schaar.
- 15 tot 30 mg villus weefsel verteren viermaal Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) met trypsine (van 9,6 x 10 5-1,8 x 10 6 U; eindconcentratie 1,2 mg / ml) en deoxyribonuclease I (DNase I) ( eindconcentratie 200 gg / ml) gedurende 30 min bij 37 ° C in een waterbad onder voortdurend schudden.
Opmerking: gebruik 150 ml totaal volume van de eerste digestie, 100 ml voor de tweede digestie en 75 ml voor de twee overige digesties.
- Verzamel de bovenstaande vloeistof die gedispergeerde cellen en centrifugeer bij 1250 xg gedurende 15 min zonder remmen. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 ml voorverwarmde DMEM bevattende1% penicilline / streptomycine.
- Laag het gedispergeerde cellen op een discontinue 5% - 70% polyvinylpyrrolidon-gecoate silica gradiënt (zie Tabel 1 voor de bereiding gradiënt) en centrifugeer gedurende 23 minuten bij 507 xg zonder rem. Verwijder de dichtheid laag tussen 1,017-1,033 door afzuigen en laat de lagen tussen 40% en 50% in het verloop met een nieuwe pipet. Was de cellen uitvoerig met 10 ml voorverwarmde DMEM bevattende 1% penicilline / streptomycine.
Opmerking: De verzamelde fractie stemt overeen met dichtheden tussen 1,048 en 1,062, wat trophoblasts herbergt. - Tel de cellen met een hemocytometer. In het kort cellen meng en voeg 10 ul in een nieuwe microcentrifugebuis. Voeg 10 ul van trypan blauw en voorzichtig weer mengen. Het opstellen van de celsuspensie en vul de hemocytometer kamers. Tel de cellen onder 10X objectief.
- Plaats 1 x 10 6 en 4,5 x 10 6 cellen in afzonderlijke buizen voor gebruik in secties 1.3 en 2, respectievelijkly. Zaad de overige cellen in een dichtheid van 1,5 x 10 6 cellen / well in DMEM aangevuld medium en kweek bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende maximaal 4 dagen voor de andere experimenten.
- Met behulp van een tang, verwijder de vliezen uit het weefsel door voorzichtig te krabben het uit, terwijl ze voorzichtig villous weefsel niet te verwijderen. Snij deresterende placenta villi in blokjes van ongeveer 3 x 3 cm met behulp scalpel en schaar. Grondig wassen met water dat 0,9% NaCl maternale bloed te verwijderen.
- Evaluatie van de zuiverheid van geïsoleerde primaire villous cytotrofoblasten
- Spin 1 x 10 6 van de vers geïsoleerde cytotrofoblasten in microcentrifugebuizen bij 300 x g. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml voorverwarmd fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer cellen op 300 xg en verwijder PBS door aspiratie.
- Voeg 1 ml koude methanol om cellen en incuberen bij -20 ° C gedurende 20 min. Centrifugeer cellen op 300 xg gedurende 5 minuten en verwijder methanol door aspiratie.
Let op: Gebruik bus masker, veiligheidsbril en rubberen handschoenen tijdens het hanteren methanol. - Voeg 1 ml PBS bij kamertemperatuur cellen gecentrifugeerd hydrateren bij 300 xg en verwijder PBS door afzuigen.
- Incubeer cellen in PBS bevattende FBS (01:50 [v / v] verdunning) en een FcRblokkeringsreagens (01:10) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur om niet-specifieke binding te elimineren.
- Was tweemaal met 500 pl PBS kamertemperatuur Centrifugeer cellen bij 300 g gedurende 5 minuten en verwijder PBS door afzuigen. Resuspendeer cellen in 100 ul PBS kamertemperatuur.
- Incubeer cellen met een muis monoklonaal fluoresceïne isothiocyanaat (FITC) geconjugeerd anti-humaan cytokeratine 7-antilichaam kloon LP5K (1: 200) of een controle isotype-gematched non-specifiek antilichaam in PBS met 0,2% BSA gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Was de cellen in PBS.
- Analyseer de cellen door flowcytometrie 3. Gebruik celpreparaten die ten minste 96% CK-7-positieve cellen vertonen door flowcytometrie voor verdere experimenten.
2. siRNA Transfectie van humane primaire Villous cytotrofoblasten
- Transfectie van primaire menselijke villi cytotrofoblasten met een microporatie-inrichting
- Bereid 6-well platen met2 ml DMEM aangevuld medium voor incubatie van microporated cellen.
- Na isolatie van de primaire cytotrofoblasten (zie paragraaf 1.2), neemt een monster van cellen in suspensie en het bepalen van het aantal cellen met behulp van een hemocytometer.
- Transfer 1,5 x 10 6 cellen om een microcentrifugebuis en pellet cellen door centrifugeren bij 300 g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met 1 ml Dulbecco's PBS (DPBS) (Mg2 +, Ca2 + -vrij) en pellet van de cellen door centrifugatie bij 300 xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 100 pl resuspensiebuffer.
Opmerking: vermijden om celsuspensie langer dan 15-30 min bij kamertemperatuur levensvatbaarheid van de cellen en transfectie-efficiëntie te maximaliseren. - Voeg 300 ng Syncytin-2 siRNA (of control scrambled siRNA) aan de 1,5 ml microcentrifugebuis en zuig de cel-siRNA mengsel met behulp van een pipet 100 ul transfectie. invoegende pipet in het station (zie lijst van materialen) en de onderwerpen van de cellen aan een 1300 V enkele puls van 30 ms.
- Onmiddellijk over de cellen 6-well platen (bereid in stap 2.1.1) die 37 ° C voorverwarmd medium aangevuld tot celbeschadiging voorkomen.
- Herhaal stap 2.1.5 en 2.1.6 voor de overige monsters.
- Schud de plaat gedurende 30 seconden om een gelijkmatige verdeling van de cellen te waarborgen. Incubeer de plaat bij 37 ° C in een bevochtigde CO2 incubator gedurende 24 tot 48 uur. Vernieuwen kweekmedium 24 uur na transfectie.
- Evalueer transfectie-efficiëntie door Western blot-analyse (zie stappen 3-6).
- Lipofectie van siRNA in de menselijke primaire cytotrofoblasten
- Na isolatie van de villi cytotrofoblasten, zaad de cellen bij een dichtheid van 1,5 x 10 6 cellen per putje in 6-wells platen in 2 ml kweekmedium en incubeer 18 uur.
- Verdun 300 ng Syncytin-2-specifieke siRNA (of control-scrambledsiRNA) en 5 gl van lipide-gebaseerde transfectie reagens in afzonderlijke 1,5 ml buizen in een totaal volume van 10 pl en antibiotica-serumvrij medium. Incubeer gedurende 5 min.
- Meng de verdunde reagentia en incubeer gedurende nog 20 minuten bij kamertemperatuur om de transfectie te vormen. Voeg 90 ul van antibiotica-en serumvrij medium aan het mengsel tot een eindvolume van 100 pl.
- Verwijder kweekmedium uit de 6-well platen (stap 2.2.1). Voeg 2 ml vers medium en 100 pi transfectiemengsel aan elk putje. Incubeer de cellen bij 37 ° C in een CO2 incubator gedurende 24 tot 48 uur. Vernieuwen kweekmedium 24 uur na transfectie.
- Evalueer transfectie-efficiëntie door Western blot-analyse (zie stappen 3-6).
3. Voorbereiding van lysaten van Whole Cell Culture
- Verwijder de media en spoel elk putje (van stap 2.1.8 en 2.2.4) met behulp van voorverwarmde DPBS (Mg 2+, Ca 2+ gratis). Zuig het DPBS en voeg 500 ul van 0,25% trypsine / ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA). Incubeer gedurende 1-3 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator. Stop trypsine behandeling door toevoeging van 500 pl serum bevattende groeimedia.
Opmerking: Gebruik de juiste media volume afhankelijk van de aard van de kolf / gerecht: 1 ml per 10 7 cellen / 100 mm schaal / 150 cm2 fles; 0,5 ml per 5 x 10 6 cellen / 60 mm schaal / 75 cm 2 kolf. - Overdracht cellen om een 1,5 ml microcentrifugebuis, pellet cellen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met DPBS (Mg2 +, Ca2 + -vrij) en pellet cellen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig bovenstaande vloeistof zonder de pellet te verstoren. Plaats de buis op ijs. Resuspendeer de pellet in 50-200 ul ijskoude Radio-immunoprecipitatie assay (RIPA) buffer (zie tabel 2 voor buffer compositie) met daarin vers toe te voegened protease en fosfatase remmers bij een 1x uiteindelijke concentratie. In het kort vortex de kolf en laat op ijs gedurende 30 min.
- Spin bij 16.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Plaats de buis voorzichtig op ijs. Met behulp van een pipet het supernatant naar een nieuwe pre-gekoelde microcentrifugebuis op ijs bewaard. Gooi de pellet.
4. Voorbereiding van de Nuclear Uittreksels uit gekweekte cellen
- Voor elk putje (stap 1.2.5), was gekweekt cytotrofoblasten tweemaal met 1 ml voorverwarmde DPBS (Mg2 +, Ca2 + vrij). Aspireren DPBS en voeg 500 ul van 0,25% trypsine / EDTA. Incubeer gedurende 1-3 minuten bij 37 ° C in een CO2 incubator en stop trypsine behandeld door toevoeging van 500 pl serum bevattende groeimedia.
- Overdracht cellen om een 1,5 ml microcentrifugebuis, pellet cellen door centrifugeren bij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen met DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -vrij) en pellet cellen door centrifugerenbij 300 xg gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder voorzichtig alle bovenstaande vloeistof zonder verstoring van de pellet en plaats de buis op ijs.
- Extract nucleair eiwit volgens de instructies van de fabrikant. Bepaal eiwitconcentratie van elk monster met behulp van eiwit kwantificatie assay (Bradford assay of bicinchoninezuur (BCA)).
5. Monstervoorbereiding en elektroforese
- Bepaal de eiwitconcentratie voor elk celextract met een kwantificering eiwit assay (bijvoorbeeld 8 Bradford of BCA 9).
- Volgens de instructies van de fabrikant (indien antilichamen kunnen worden gebruikt bij reductie en denaturatie omstandigheden), voeg een gelijk volume van 2x Laemmli monsterbuffer (tabel 2) 20-30 ug totaal eiwit.
- Kook cellysaten bij 100 ° C gedurende 5 minuten. Aliquot 50-100 pl lysaat aan herhaalde vries / ontdooi cycli te voorkomen en uit de resterende buizen bij -20 ° C voor toekomstig gebruik. Terwijl de monsters verwarmen, bereiden 1 liter 1 x loopbuffer (tabel 2).
- Spin de monsters bij 16.000 xg gedurende enkele seconden en plaats ze op ijs.
- Laad gelijke hoeveelheid eiwit in elke well van een 12% SDS-PAGE-gel (zie Tabel 2 voor gelsamenstelling), samen met een molecuulgewicht merker. Voer de elektroforese gedurende 1-2 uur bij 100 V.
6. overbrengen van het eiwit uit de gel naar het membraan
- Activeren polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met methanol gedurende 1 min en spoel met 1x overdracht buffer / 10% methanoloplossing. Volgens de instructies van de fabrikant, transfer voor 30 minuten tot 1 uur, afhankelijk van de eiwitgrootte.
Opmerking: Transfer efficiëntie kan worden beoordeeld met behulp van Ponceau rode vlekken voordat de blokkerende stap.
7. antilichaamkleuring
- Blokkeer het membraan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C met 5% blokkeeroplossing.
- Incubeer het membraan met anti-Syncytin-2 antilichamen (4 ug / ml; 1: 5000) 6 of anti-glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase (GAPDH, 0,4 gg / ml; 1: 500) in 5% blokkeeroplossing overnacht bij 4 ° C (anti-Syncytin-2) of gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur. Was het membraan drie maal in Tris-gebufferde zoutoplossing Tween (TBST zie Tabel 2 voor buffersamenstelling) gedurende 5 min.
- Incubeer het membraan met geschikte mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-konijn of anti-muis antilichaam (1: 10.000) in 5% blokkerende buffer in TBST bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Was het membraan drie keer in TBST gedurende 5 minuten en spoel in TBS. Signalen detecteren met behulp van de chemiluminescentie gebaseerde blotting substraat.
8. Radioactief merken van enkelstrengs oligonucleotide
- fosforyleringsreactie
- In een microcentrifuge buis, voeg 50 ng een voorwaartse oligonucleotide met 1x T4 polynucleotide kinase buffer, 1 UT4 polynucleotidekinase en 20 uCi (γ- 32 P) ATP en deel uitmaken van de reactie volume tot 20 pi met nuclease-vrij water.
- Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Stop de reactie door toevoeging van 5 pl 0,5 M EDTA. Maak het volume tot 50 pi met nuclease-vrij water.
- Verwijdering van niet opgenomen nucleotiden van oligonucleotiden
- Bereid een G-25 kolom geëquilibreerd met TE buffer (tabel 2) volgens de instructies van de fabrikant. Plaats de kolom in een frisse DNase-vrij 1,5 ml microcentrifugebuis.
- Voeg langzaam 50 pl probe (uit stap 8.1.2) via hars voorzichtig het harsbed niet te verstoren. Spin gedurende 2 minuten bij 350 xg om het gezuiverde monster in 1,5 ml microcentrifugebuis verzamelen. Was de kolom G-25 met 36 ul nuclease-vrij water en draaien gedurende 2 minuten bij 350 xg om het te verzamelen in de microcentrifugebuis.
- Hybridisatie met de complementaire streng oligonucleotide
- Breng de radioactief gemerkte probe (86 pi) van een 1,5 ml microcentrifugebuis en voeg 200 ng omgekeerde oligonucleotide en 1x annealen buffer (tabel 2). Verhit 5 min bij 95 ° C en laat een nacht bij kamertemperatuur koelen.
- Bereid niet-radioactieve dubbelstrengs oligonucleotiden door toevoeging van 50 ng niet-gelabelde voorwaartse en achterwaartse oligonucleotiden en 1x annealen buffer in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Maak het volume tot 100 ul met nuclease-vrij water. Warmte en laten kamertemperatuur zoals beschreven in stap 8.3.1.
9. Bereiding van een niet-denaturerende polyacrylamidegelelektroforese EMSA
- Bereid een 4% natieve gel (10 x 12 cm) met een 1,5 mm ruimte-kam (zie Tabel 2 voor gelsamenstelling). Reinig alle glazen platen met behulp van gedestilleerd water.
Let op: Het is essentieel dat de platen zijn volledig vrij van ionische detergent, zoals SDS. - onmiddellijk pons de acrylamide oplossing tussen de platen en laat polymerisatie te gaan (ongeveer 30 min).
- Monteer de elektroforese apparatuur en vul de tank met 0.5x TBE. Pre-run de gel gedurende 30 minuten tot 1 uur bij 150 V voordat monster laden.
10. DNA bindingsreactie
- In een 1,5 ml microcentrifugebuis, voeg 10 ug van nucleair extract (stap 4.3) in 1x Gel Shift Binding buffer (tabel 2) en vul het uiteindelijke volume tot 10 pi met nuclease-vrij water. Als controle werd een buis bereiden zonder nucleair extract. Voor de competitiereactie, voeg 1 pl koud aspecifieke of specifieke dubbelstrengs oligonucleotide (stap 8.3.2).
- Voeg 1 pl radioactieve probe uit stap 8.3.1 aan elke reactie. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Voeg 1 ul van 10x gel laadbuffer per reactie en laadt elk monster op de gel bereid in hoofdstuk 9.
- Voer de elektroforese gedurende 1 1/2 tot 2 uur bij 150 V. Na de migratie, wikkel de gel en het glas in een plastic wrap en positie in een blootstelling cassette onder een fosforscherm. Reactie cassette bij 4 ° C gedurende 24 uur.
- Verwijder het scherm van blootstelling cassette, plaats in de fosfor afbeeldingsinrichting gescand.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Verse placenta van zwangerschappen werden gebruikt om humane primaire villous cytotrofoblasten isoleren de reeks experimenten in de sectie Protocol voeren. Na hun scheiding, we eerst analyseerde de zuiverheid van cytotrofoblasten door het gebruik van de cytokeratine 7-marker (figuur 1). Celpreparaten werden dus gekleurd met een monoklonaal anti-cytokeratine-7 antilichaam. Figuur 1 geeft de resultaten van een typisch experiment na zuivering van primaire villous cytotrofoblasten door standaard doorstroomcytometrie geanalyseerd. Na de dichtheidsgradiënt stap worden> 97% cellen (in dit geval 99%) positief gekleurd voor cytokeratine-7 in standaardexperimenten, waardoor een zeer hoog rendement bij de zuivering van dit celtype demonstreren.
Na hun scheiding, kan de menselijke primaire cytotrofoblasten direct worden gebruikt voor de transfection. Twee verschillende protocollen werden geëvalueerd, dat wil zeggen, microporatie en lipide-gebaseerde transfectie. Beide protocollen werden getest met siRNA specifiek voor Syncytin-2 mRNA en vergeleken met een gecodeerde siRNA (negatieve controle). Transfectie-efficiëntie werd vervolgens geëvalueerd door Western blotanalyse. Resultaten bevestigden dat Syncytin-2-expressie aanzienlijk werd muisstil in-cytotrofoblast afgeleide extracten op microporatie (figuur 2). Anderzijds werd geen significante silencing opgemerkt bij siRNA's werden getransfecteerd door het op lipide gebaseerde transfectiereagens.
Wij hebben ook EMSA experimenten op vers geïsoleerde cytotrofoblasten. Radioactief gemerkte probe die afkomstig is van een Syncytin 2-promotorgebied werd gesynthetiseerd. De gesynthetiseerde probe (genaamd WT, 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') werd aangetoond aan-gerelateerde transcriptiefactor CREB 7 factoren binden. In aanwezigheid van nucleaire extr acts uit 24 en 48 uur gekweekt villous cytotrofoblasten de Syncytin-2-promotor-afgeleide probe toonde de aanwezigheid van twee DNA-eiwitcomplexen. Toevoeging van 100x koude WT oligonucleotide streden om de vorming van het complex, terwijl geen soortgelijke concurrentie met overmaat koude verbonden oligonucleotide (muis neurale Enhancer 2, 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') werd waargenomen, hetgeen de specificiteit van beide signalen ( figuur 3).
Figuur 1. Evaluatie van de zuiverheid van primaire villi cytotrofoblasten met flowcytometrie. Vers geïsoleerde preparaten van villi cytotrofoblasten werden eerst gepermeabiliseerd en vervolgens gemerkt met isotype controle antilichaam (rode lijn) of monoklonaal antilichaam specifiek voor cytokeratine-7 (zwarte lijn). Cellen werden geanalyseerd met stroomcytometrie. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Vergelijking van siRNA transfectie efficiënties tussen lipide gebaseerde transfectie en microporiën. Vers geïsoleerde villous cytotrofoblasten werden getransfecteerd met 300 ng Syncytin-2-specifieke siRNA vs. gecodeerde controle siRNA met de op lipide gebaseerde reagens of microporatie. (A) Western blot analyses werden uitgevoerd op cellulaire extracten van elke transfectie staat het gebruik van anti-Syncytin-2 en anti-GAPDH antilichamen. (B) Syncytin 2-eiwitconcentraties van Western blot analyses werden gekwantificeerd in termen van bandintensiteit na normalisatie met overeenkomstige signalen GAPDH (foutbalkjes gedefinieerd als SD, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. DNA-eiwitcomplexen geïdentificeerd door EMSA analyse. Kernextracten van primaire villous cytotrofoblasten gekweekt gedurende 24 of 48 uur werden geïncubeerd met WT-probe overeenkomend met een promotergebied van Syncytin-2 met of zonder overmaat (100x) specifieke of niet-specifieke koude oligonucleotiden. DNA-eiwitcomplexen werden gescheiden op migratie op een natieve gel. Specifieke signalen en vrije probes worden op de rechterkant van de gel. WT probe geïncubeerd in afwezigheid van nucleair extract werd ook gebruikt als een negatieve controle. CT NE = cytotrofoblast nucleaire extracten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| % Van Percoll finale | Omvang van Percoll (90%) (ml) | Volume van HBSS (ml) |
| 70 | 2.33 | 0.67 |
| 65 | 2.17 | 0,83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1.17 |
| 50 | 1.67 | 1.33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1.33 | 1.67 |
| 35 | 1.17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0,83 | 2.17 |
| 20 | 0.67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| 10 | 0.33 | 2.67 |
| 5 | 0.17 | 2.83 |
Tabel 1. 5% -70% polyvinylpyrrolidon-bekleed siliciumdioxide gradiënt instelling.
| Buffer | Samenstelling | Opmerkingen / Omschrijving |
| PBS 1x | 0,9 mM CaCl2, 2,7 mM KCI, 1,5 mM KH 2PO 4, 0,5 mM MgCl2, 136,9 mM NaCl en 0,8 mM Na 2 HPO 4 | |
| RIPA Buffer | 150 mM NaCl, 1,0% NP-40 en 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholaat, 0,1% SDS (natriumdodecylsulfaat), 50 mM Tris-HCl pH 8,0 | |
| Laemmli Sample Buffer | 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% broomfenol blauw, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8 | |
| 10x loopbuffer | 25 mM Tris-base, 190 mM glycine, 0,1% SDS | |
| 10x overdracht buffer | 25 mM Tris-base, 192 mM Glycine | |
| TBST 1x buffer | 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0,05% Tween 20 bij pH 7 | Meng goed en filteren. Niet-filter kan leiden tot "spotten" van het membraan. |
| blokkeerbuffer | 5% melk of BSA (runderserumalbumine) toegevoegd aan 1x buffer TBST | |
| TE-buffer | 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA | |
| gloeien buffer | 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT | |
| 5x Gel Shift Binding Buffer | 20% glycerol, 5 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 0,25 mg / ml poly (dI-dC). | |
| laadbuffer | 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2% broomfenol blauw en 40% glycerol | |
| TBE 5x | Los op 54 g Tris Base en 27,5 g boorzuur in 1 L gedeïoniseerd water, dat 20 ml 0,5 M EDTA bevat, pH 8 | |
| 4% inheemse gel | TBE 5x buffer | 6,0 ml |
| 29: 1 acrylamide / bisacrylamide (30% w / v) | 10 ml | |
| 40% acrylamide (w / v) | 0,75 ml | |
| 100% glycerol | 1,5 ml | |
| Gedistilleerd water | 41,5 ml | |
| Ammoniumpersulfaat 25% | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stacking Gel (6 ml) voor SDS-PAGE | DDH 2 O | 4,1 ml |
| 30% Acrylamide | 1,0 ml | |
| 1,0 M Tris | 0,75 ml | |
| 10% SDS | 60 ul | |
| 10% APS | 60 ul | |
| TEMED | 6 pl | |
| 12% scheiden Gel (10 ml) voor SDS-PAGE | DDH 2 O | 3,3 ml |
| 30% Acrylamide | 4,0 ml | |
| 1,5 M Tris | 2,5 ml | |
| 10% SDS | 100 gl | |
| 10% APS | 100pl | |
| TEMED | 4 gl |
Tabel 2. Samenstelling van buffers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studies over menselijke placenta functie en ontwikkeling zijn sterk verbeterd door protocollen die gericht zijn op het optimaliseren van de isolatie van de verschillende placenta cel populaties. Een van de beste bestudeerde placenta cel populatie blijft villous cytotrofoblasten, de studie die heeft sterk geprofiteerd van geoptimaliseerde protocollen waardoor efficiënt en betrouwbaar isolement. Dit heeft verder liet een aantal experimenten, zoals transfectie en promoter studies. Door een eerder beschreven protocol 3, kunnen zuivere populaties van primaire villi cytotrofoblasten worden verkregen. CK-7 is een intermediair filament-eiwit, die wordt uitgedrukt in cytotrofoblasten. Monoklonale antilichamen tegen dit eiwit worden gebruikt om de zuiverheid van de trofoblast populatie bepalen na isolatie van de placenta 10. De voorbereidingen worden bepaald zuiver te zijn bij 96% van de cellen positief voor CK-7 zijn. De cellen kunnen vervolgens direct worden gebruikt voor transfectie. transfectieprotocollenwaarbij lipide gebaseerde benaderingen worden algemeen gebruikt om nucleïnezuren over te dragen in primaire cellen 11,12. Echter, toxiciteit van lipide formulering in sommige cellen wordt benadeeld. Microporatie is een elektroporatie technologie met behulp van een pipet tip als elektroporatie ruimte, die minimale warmte, metaalion ontbinding, pH variatie en de vorming van oxide genereert; die allemaal kunnen schadelijk zijn voor cellen. Gebaseerd op de hierin gepresenteerde gegevens, microporatie is een efficiëntere benadering voor siRNA levering dan lipide gebaseerde transfectie protocol, zoals beoordeeld door Western blot analyses. Met een EMSA benadering een probe ontworpen op een gekozen gebied van de Syncytin-2 promotor waarvan bekend is dat belangrijke factoren binden om werkzaam 7 getest. De probe werd geïncubeerd met nucleair extract van geïsoleerde cytotrofoblasten. Zoals weergegeven in figuur 3, werden specifieke signalen verkregen.
De verschillende protocollen die hierin beschreven have geoptimaliseerd afgelopen jaren. Echter, ze allemaal afhankelijk van hoge kwaliteit cytotrofoblast preparaten, die afhankelijk zijn van een aantal kritische stappen. Allereerst, na de geboorte, moet placenta in een bufferoplossing te houden en cellen worden gescheiden van hen niet meer dan 5 uur na onderdompeling in de oplossing. Trypsine en DNase behandelingen zijn ook van groot belang en moet voorzichtig worden uitgevoerd om de kwaliteit van cytotrofoblast preparaat maximaliseren. Uitgebreide schrobben van de placenta villi en vermindering van de tijd die nodig is voor hun isolement zijn beide verdere verbeteringen, die sterk van de efficiëntie van het aantal cellen isolatie kunnen upgraden. De opbrengst van dit protocol hangt verder af van optimale centrifugatie gedurende de dichtheidsgradiënt stap, die nauw moeten worden gecontroleerd. Het niet aan de buizen op de juiste evenwicht zal ook leiden tot een verstoring van het verloop en mobiele nummers ernstig te verminderen.
De transfectie-protocol te beschrijvend hierin werd getest over meerdere jaren. Hoewel de omstandigheden die nodig zijn voor microporatie algemeen eenvoudig worden optimalisatie van transfectie van de diverse primaire cellen desalniettemin noodzakelijk. Dit houdt ook het optimaliseren van de hoeveelheid getransfecteerde nucleïnezuur (siRNA of plasmide DNA). Zo kan de hier beschreven protocol, optimalisatie van verschillende siRNAs concentratie aangeraden om een efficiënt onderdrukken siRNA identificeren. Toevoeging van een geschikte suspensie volume op het celpellet voor microporatie en volledige suspensie van de cellen bijkomende omstandigheden die transfectie-efficiëntie beïnvloeden.
EMSA experimenten vereisten tevens optimalisatie. Gezien de heterogeniteit geassocieerd met placenta donoren en de variërende cytotrofoblast isolatie efficiëntie en zuiverheid moeten EMSA experimenten herhaald worden tot 5 keer om de resultaten te bevestigen. Bovendien heeft hoge celaantallen is belangrijk voldoende prote waarborgenin levels in nucleair extract preparaten en de daaropvolgende detectie van eiwit / DNA-complexen. Bovendien moet hoogradioactief oligonucleotideprobes worden voorbereid, en vers van recent aangekochte radioactieve ATP moet worden voorbereid.
Een aantal beperkingen moeten worden benadrukt in de gepresenteerde protocol. Het moet eerst worden benadrukt dat doorstroomcytometrie analyses niet de mogelijke aanwezigheid van syncytiotrofoblast fragmenten in cel preparaten kunnen beoordelen. Andere protocollen zijn voorgesteld om dit probleem op te lossen, zoals sorteren met behulp van flowcytometrie of het gebruik van antilichaam-gebonden magnetische beads 13,14. Opgemerkt wordt echter dat deze fragmenten normaal niet voldoen aan celcultuur putjes en worden vaak verwijderd na cel wasstap. Een andere beperking van de gepresenteerde protocol is dat primaire villous cytotrofoblasten een zeer beperkte overlevingsduur in celcultuur. Vandaar, ongeacht de gekozen werkwijze, stabiele transfectie van vilLous cytotrofoblasten onbereikbaar zal blijven. EMSA analyses, zoals beschreven in dit protocol, hebben ook bepaalde beperkingen. Hoewel specificiteit van de signalen gemakkelijk kunnen worden bepaald door competitie-experimenten met een overmaat ongelabelde oligonucleotiden kunnen gebonden elementen alleen worden geïdentificeerd met behulp van antilichamen tegen specifieke transcriptiefactoren waardoor supershifted signalen. EMSA experimenten bovendien beperkt blijven omdat het in vitro DNA-eiwit interacties. Experimenten met meer representatieve gevallen, zoals ChIP assay, en meer recent in vivo protocollen nodig zijn EMSA resultaten verder te bevestigen.
De hierin beschreven isolatie en cytotrofoblast transfectie protocollen belangrijke toepassingen voor studies waarin transiënte silencing of overexpressie van bepaalde genen nodig om hun rol in functie, proliferatie of differentiatie van een bepaald type trofoblast cellen begrijpen. Bovendien, na transfectie, tagged versies van tot expressie gebrachte eiwitten zijn geschikt voor intracellulaire het volgen en geanalyseerd met standaardtechnieken, zoals confocale microscopie en flowcytometrie. De EMSA-protocol kan worden gebruikt om ingewikkelde details met betrekking tot promotor regelgeving en de betrokken transcriptiefactoren te bestuderen. Bovendien zal deze experimentele benadering kunnen onderzoekers factoren betrokken bij het ontstaan van bepaalde ziekten gerelateerd aan placentation deficiëntie en de gewijzigde regulatie van genen tot expressie gebracht in villeus cytotrofoblasten identificeren.
Concluderend kunnen humane primaire cytotrofoblasten gemakkelijk geïsoleerd van placenta en vatbaar zijn voor standaardprotocollen, zoals siRNA transfectie en EMSA. Hoewel verschillende transfectie procedures, zoals lipofectie 15 en 16 nucleofection beschikbaar, microporatie lijkt een zeer efficiënte werkwijze voor siRNA transfectie van geïsoleerde villous cytotrofoblasten biedt een benadering met beperkte cel deAat en relatief lage kosten. In het kader van villous cytotrofoblasten, moet deze aanpak de silencing van verschillende genen en de beoordeling van hun betrokkenheid bij verschillende functies en kenmerken van het type cel mogelijk te maken. Daarnaast transfectie van expressievectoren is ook mogelijk met behulp van dit protocol en zal complementair gegevens opleveren om de siRNA gebaseerde aanpak. Wat EMSA, deze techniek een snellere en eenvoudigere evalueren eiwit-DNA complexen in vergelijking met alternatieve benaderingen, zoals DNase I footprinting, methylering interferentie assay chromatine immunoprecipitatie en chromatinestructuur analyses. Dus deze techniek blijft waardevol standaard promoter analyses of testen van elke andere enhancer / suppressor-bevattende DNA-gebieden. Onze demonstratie van zijn betrouwbare gebruik villous cytotrofoblasten is belangrijk, omdat het informatie geeft over de regulatie van genen, met mogelijke gevolgen op functioneel niveau. ondanks hunbeperkte tijd in cultuur, primaire villous cytotrofoblasten zijn geschikt voor standaard studies en moeten worden aangepast aan meer recente en informatief methoden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de Nationale Raad Sciences and Engineering Research van Canada (NSERC) (# 298527) (BB). CT werd ondersteund door een institutioneel FARE beurs. AV werd ondersteund door een NSERC Graham Bell Ph.D. beurs. BB hield een Canada Research Chair in Human Retrovirology (Tier 2). Met dank aan Beatrix Beisner voor hulp in de tekst te herzien.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
