Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

पर हौसले अलग मानव विलस Cytotrophoblasts siRNA अभिकर्मक और EMSA विश्लेषण

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/53995
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

Summary

इस प्रोटोकॉल कुशलतापूर्वक हौसले से पृथक मानव विलस cytotrophoblasts में siRNA परासंक्रमित microporation का उपयोग और इन कोशिकाओं में डीएनए प्रोटीन परिसरों की पहचान करने के लिए एक विधि का वर्णन है। ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं पश्चिमी धब्बा द्वारा नजर रखी जा सकती है और EMSA 4 दिन की संस्कृति समय के दौरान विश्लेषण करती है।

Protocol

UQAM आचार समिति इन प्रोटोकॉल है, जो सेंट ल्यूक केंद्र Hospitalier Universitaire डे मॉन्ट्रियल के अस्पताल (मॉन्ट्रियल, कनाडा) की आचार समिति के दिशा-निर्देशों के अनुसार कर रहे मंजूरी दी है। प्रतिभागियों को एक सूचित सहमति पत्र पर हस्ताक्षर किए।

1. मध्यम तैयार करना और प्राथमिक विलस Cytotrophoblasts का अलगाव

  1. Dulbecco संशोधित ईगल 25 मिमी HEPES, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ मध्यम (DMEM) सप्लीमेंट द्वारा मानव प्राथमिक विलस cytotrophoblasts के लिए संस्कृति के माध्यम से तैयार करें। एक में बाँझ 0.22 माइक्रोन फिल्टर और दुकान के माध्यम से तैयार मध्यम फ़िल्टर -20 सी 50 मिलीलीटर की aliquots में फ्रीजर °।
  2. मानक प्रोटोकॉल 3 निम्न ताजा गर्भनालों से प्राथमिक विलस cytotrophoblasts अलग।
    1. सरौता का उपयोग करना, धीरे यह scratching बंद से ऊतक से भ्रूण झिल्ली को दूर करते हुए सावधान किया जा रहा विलस ऊतक निकालने के लिए नहीं। काटोके बारे में 3 एक्स 3 सेमी छुरी और कैंची का उपयोग करने का क्यूब्स में अपरा विल्ली शेष। अच्छी तरह से 0.9% सोडियम क्लोराइड युक्त मातृ रक्त दूर करने के लिए पानी से धो लें।
      1. सरौता के साथ प्रत्येक घन होल्डिंग, ध्यान से शेष वाहिकाओं और रेशेदार ऊतक का उपयोग कैंची से विलस ऊतक को हटा दें।
      2. विलस ऊतक के 15 से 30 मिलीग्राम के लिए, हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) युक्त trypsin में चार बार डाइजेस्ट (से 9.6 x 10 5 1.8 x 10 6 यू, अंतिम एकाग्रता 1.2 मिलीग्राम / एमएल) और deoxyribonuclease मैं (DNase मैं) ( अंतिम एकाग्रता 200 माइक्रोग्राम / निरंतर झटकों के साथ एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एमएल)।
        नोट: पहली पाचन के लिए 150 मिलीलीटर की कुल मात्रा का प्रयोग करें, दूसरी पाचन के लिए 100 मिलीलीटर और शेष दो digestions के लिए 75 मिलीलीटर।
    2. ब्रेक के बिना 15 मिनट के लिए 1250 XG पर छितरी हुई कोशिकाओं और सेंट्रीफ्यूज युक्त सतह पर तैरनेवाला लीजिए। prewarmed DMEM युक्त के 1 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निकालें1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन।
    3. 70% polyvinylpyrrolidone लेपित सिलिका ढाल (ढाल तैयार करने के लिए 1 टेबल देखें) और ब्रेक के बिना 507 XG पर 23 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज - एक असंतत 5% की चोटी पर छितरी हुई कोशिकाओं की परत। आकांक्षा से 1.033 करने के लिए 1.017 के बीच घनत्व परत को हटाने और एक नया विंदुक के साथ ढाल में 40% और 50% के बीच परतों इकट्ठा। जिसमें 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन prewarmed DMEM के 10 मिलीलीटर के साथ बड़े पैमाने पर कोशिकाओं को धो लें।
      नोट: एकत्र अंश 1.048 और 1.062, जो trophoblasts बंदरगाहों के बीच घनत्व से मेल खाती है।
    4. एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना। संक्षेप में, कोशिकाओं मिश्रण और एक नया microcentrifuge ट्यूब में 10 μl जोड़ें। trypan नीले रंग के 10 μl जोड़ें और धीरे फिर मिश्रण। सेल निलंबन ड्रा और hemocytometer कक्षों भरें। 10X उद्देश्य के तहत कोशिकाओं की गणना।
    5. जगह 1 एक्स 10 6 और 4.5 x 10 वर्गों 1.3 और 2 में उपयोग के लिए अलग ट्यूबों में 6 कोशिकाओं, संबंधितLy। अन्य प्रयोगों के लिए 4 दिन का अधिकतम 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 x 10 6 कोशिकाओं / पूरक DMEM मध्यम और संस्कृति में अच्छी तरह के घनत्व पर शेष कोशिकाओं को बीज और 5% सीओ 2।
  3. पृथक प्राथमिक विलस cytotrophoblasts की पवित्रता का मूल्यांकन
    1. स्पिन 1 एक्स 10 में 300 x जी microcentrifuge ट्यूब में हौसले से पृथक cytotrophoblasts के 6। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और prewarmed फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 300 XG पर और आकांक्षा से पीबीएस हटाने अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
    2. कोशिकाओं को ठंड मेथनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें और 20 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 5 मिनट के लिए 300 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और आकांक्षा से मेथनॉल हटा दें।
      सावधानी: जबकि मेथनॉल से निपटने के कनस्तर मुखौटा, सुरक्षा चश्मे और रबर के दस्ताने का प्रयोग करें।
    3. 300 XG पर कोशिकाओं, सेंट्रीफ्यूज rehydrate और आकांक्षा से पीबीएस दूर करने के लिए कमरे के तापमान पर पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    4. FBS (1:50 [V / V] कमजोर पड़ने) और एक एफसीआर युक्त पीबीएस में कोशिकाओं को सेतेकमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए अभिकर्मक (1:10) अवरुद्ध अविशिष्ट बाध्यकारी समाप्त करने के लिए।
    5. 5 मिनट के लिए 300 XG पर कमरे के तापमान पीबीएस के 500 μl, सेंट्रीफ्यूज कोशिकाओं के साथ दो बार धोएं और आकांक्षा से पीबीएस को हटा दें। 100 μl कमरे के तापमान पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend।
    6. एक माउस मोनोक्लोनल fluorescein आइसोथियोसाइनेट (FITC) के साथ कोशिकाओं को सेते संयुग्मित विरोधी मानव cytokeratin-7 एंटीबॉडी क्लोन LP5K (1: 200) या एक नियंत्रण निर्धारण मिलान गैर विशिष्ट में कमरे के तापमान पर पीबीएस में एंटीबॉडी 45 मिनट के लिए 0.2% BSA युक्त अंधकार। पीबीएस में कोशिकाओं को धो लें।
    7. से फ्लो 3 से कोशिकाओं का विश्लेषण। सेल की तैयारी है, जो आगे के प्रयोगों के लिए प्रवाह cytometry द्वारा 96% सी.के.-7 पॉजिटिव कोशिकाओं की एक न्यूनतम प्रदर्शित प्रयोग करें।

2. मानव प्राथमिक विलस Cytotrophoblasts की siRNA अभिकर्मक

  1. मानव प्राथमिक विलस एक microporation डिवाइस का उपयोग cytotrophoblasts के अभिकर्मक
    1. युक्त 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयारmicroporated कोशिकाओं के ऊष्मायन के लिए पूरक DMEM मध्यम 2 मिलीलीटर।
    2. प्राथमिक cytotrophoblasts (धारा 1.2 देखें) के अलगाव के बाद, निलंबन में कोशिकाओं के एक विभाज्य ले और एक hemocytometer का उपयोग सेल नंबर का निर्धारण।
    3. 1.5 x 10 6 कोशिकाओं को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा एक microcentrifuge ट्यूब और गोली कोशिकाओं पर स्थानांतरण। 1 मिलीलीटर Dulbecco के पीबीएस (DPBS) (2 मिलीग्राम +, सीए 2 + मुक्त) के साथ कोशिकाओं को धो लें और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं।
    4. तैरनेवाला निकालें और मेजबान बफर के 100 μl में धीरे कोशिकाओं resuspend।
      नोट: कमरे के तापमान पर अब की तुलना में 15-30 मिनट के लिए सेल निलंबन रखने से बचें, सेल व्यवहार्यता और अभिकर्मक क्षमता को अधिकतम करने के लिए।
    5. Syncytin -2 siRNA (या नियंत्रण-तले siRNA) के 300 एनजी 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब को जोड़ने और एक 100 μl अभिकर्मक पिपेट का उपयोग सेल siRNA मिश्रण aspirate। डालेंस्टेशन में पिपेट (सामग्री की सूची देखें) और 30 मिसे के एक 1,300 वी भी नाड़ी के लिए कोशिकाओं का विषय है।
    6. इसके तत्काल बाद 6 अच्छी तरह प्लेटें (कदम 2.1.1 में तैयार) 37 डिग्री सेल्सियस पूर्व गर्म पूरक मध्यम कोशिका क्षति से बचने के लिए युक्त कोशिकाओं हस्तांतरण।
    7. दोहराएँ 2.1.5 और 2.1.6 शेष नमूनों के लिए कदम।
    8. धीरे 30 सेकंड के लिए थाली रॉक कोशिकाओं का भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए। 24 से 48 घंटे के लिए एक humidified सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं। ताज़ा करे संस्कृति के माध्यम अभिकर्मक के बाद 24 घंटे।
    9. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन (चरणों 6 करने के लिए 3 देखें)।
  2. मानव प्राथमिक cytotrophoblasts में siRNA के lipofection
    1. विलस cytotrophoblasts के अलगाव के बाद, संस्कृति के माध्यम से 2 मिलीलीटर में 6 अच्छी तरह प्लेटों में अच्छी तरह से प्रति 1.5 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं बीज के लिए और 18 घंटे के लिए सेते हैं।
    2. Syncytin-2-विशिष्ट siRNA के 300 एनजी पतला (या नियंत्रण-तलेsiRNA) और antibiotic- और सीरम मुक्त माध्यम के 10 μl की कुल मात्रा में अलग 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक के 5 μl। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    3. पतला अभिकर्मकों मिक्स और अभिकर्मक जटिल प्रपत्र कमरे के तापमान पर एक अतिरिक्त 20 मिनट के लिए सेते हैं। 100 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए मिश्रण करने के लिए antibiotic- और सीरम मुक्त माध्यम के 90 μl जोड़ें।
    4. 6 अच्छी तरह प्लेटें (कदम 2.2.1) से संस्कृति के माध्यम से निकालें। ताजा माध्यम के 2 मिलीलीटर और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 100 μl अभिकर्मक मिश्रण जोड़ें। 24 से 48 घंटे के लिए सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं। ताज़ा करे संस्कृति के माध्यम अभिकर्मक के बाद 24 घंटे।
    5. पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा अभिकर्मक दक्षता का मूल्यांकन (चरणों 6 करने के लिए 3 देखें)।

3. पूरे सेल संस्कृति से lysates की तैयारी

  1. मीडिया निकालें और पूर्व गर्म DPBS का उपयोग कर (कदम 2.1.8 और 2.2.4) से अच्छी तरह कुल्ला प्रत्येक (2 मिलीग्राम +, सीए 2 नि: शुल्क)। DPBS Aspirate और 0.25% / trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) के 500 μl जोड़ें। सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 मिनट के लिए सेते हैं। सीरम युक्त विकास मीडिया के 500 μl जोड़कर trypsin उपचार बंद करो।
    नोट: कुप्पी / पकवान के प्रकार के अनुसार उपयोग उचित मीडिया मात्रा: 10 7 कोशिकाओं / 100 मिमी पकवान / 150 सेमी 2 कुप्पी प्रति 1 मिलीलीटर; 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / 60 मिमी पकवान प्रति 0.5 मिलीग्राम / 75 सेमी 2 कुप्पी।
  2. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। कोशिकाओं DPBS के साथ (2 मिलीग्राम +, सीए 2 + मुक्त) और गोली कोशिकाओं centrifugation द्वारा 300 XG पर कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए धो लें।
  3. ध्यान से गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें। बर्फ पर ट्यूब रखें। 50-200 μl ठंडा रेडियो-Immunoprecipitation परख (RIPA) बफर (बफर रचना के लिए 2 टेबल देखें) हौसले से जोड़ने युक्त गोली Resuspendएड प्रोटीज और एक 1x अंतिम एकाग्रता में फॉस्फेट अवरोधकों। संक्षेप में, ट्यूब भंवर और 30 मिनट के लिए बर्फ पर छोड़ दें।
  4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 16,000 XG पर स्पिन। ध्यान से बर्फ पर ट्यूब जगह है। एक विंदुक का प्रयोग, बर्फ पर रखा एक ताजा पूर्व ठंडा microcentrifuge ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला। गोली त्यागें।

संवर्धित कोशिकाओं से परमाणु अर्क के 4. तैयारी

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से (कदम 1.2.5) के लिए, पूर्व गर्म DPBS (2 मिलीग्राम +, सीए 2 नि: शुल्क) के 1 मिलीलीटर के साथ दो बार सुसंस्कृत cytotrophoblasts धो लें। महाप्राण DPBS और 0.25% / trypsin EDTA के 500 μl जोड़ें। सीओ 2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-3 मिनट के लिए सेते हैं और सीरम युक्त विकास मीडिया के 500 μl जोड़कर trypsin उपचार बंद करो।
  2. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण, कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं। Centrifugation द्वारा DPBS (2 मिलीग्राम +, सीए 2 + मुक्त) और गोली कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं को धो लेंकमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए 300 XG पर। ध्यान से गोली बाधा पहुँचा के बिना सब तैरनेवाला निकालें और बर्फ पर ट्यूब जगह है।
  3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार परमाणु प्रोटीन निकालें। प्रोटीन मात्रा का ठहराव परख (ब्रैडफोर्ड या bicinchoninic एसिड परख (बीसीए)) का उपयोग कर प्रत्येक नमूने की प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण।

5. नमूना तैयार करना और वैद्युतकणसंचलन

  1. एक प्रोटीन मात्रा का ठहराव परख का उपयोग कर प्रत्येक सेल निकालने के लिए प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण (उदाहरण के लिए, ब्रैडफोर्ड 8 या बीसीए 9)।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार (एंटीबॉडी में कमी और विकृतीकरण की स्थिति में इस्तेमाल किया जा सकता है), कुल प्रोटीन की 20-30 ग्राम के लिए 2x Laemmli नमूना बफर (तालिका 2) के एक बराबर मात्रा में जोड़ें।
  3. 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें सेल lysates। अशेष 50-100 lysate दोहराया / फ्रीज पिघलना चक्र से बचने और भविष्य में उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर शेष ट्यूबों को स्टोर करने के μl। नमूने गर्म कर रहे हैं, वहीं चल बफर (तालिका 2) 1x के 1 एल तैयार करते हैं।
  4. कुछ सेकंड के लिए 16,000 XG पर नमूने स्पिन और बर्फ पर उन्हें जगह है।
  5. एक 12% एसडीएस पृष्ठ जेल (जेल रचना के लिए 2 टेबल देखें) के प्रत्येक कुएं में प्रोटीन के बराबर राशि लोड, एक आणविक वजन मार्कर के साथ। 100 वी पर 2 घंटा के लिए 1 के लिए जेल चला

6. झिल्ली को जेल से प्रोटीन स्थानांतरण

  1. 1 मिनट के लिए सक्रिय करें मेथनॉल के साथ polyvinylidene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली और 1x स्थानांतरण बफर / 10% मेथनॉल समाधान के साथ कुल्ला। निर्माता के निर्देशों के अनुसार, प्रोटीन आकार पर निर्भर करता है 1 घंटा 30 मिनट के लिए स्थानांतरण।
    नोट: स्थानांतरण क्षमता अवरुद्ध कदम से पहले रक्तवर्ण रंग लाल धुंधला का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है।

7. एंटीबॉडी धुंधला

  1. कमरे के तापमान पर 1 घंटे या रात भर के 4 डिग्री सेल्सियस पर 5% अवरुद्ध समाधान प्रयोग करने के लिए झिल्ली ब्लॉक।
  2. 6 या विरोधी glyceraldehyde-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज (GAPDH; 0.4 माइक्रोग्राम / एमएल, 1: 500) के साथ 5% अवरुद्ध समाधान में रात भर में: विरोधी Syncytin -2 एंटीबॉडी (5000 1 से 4 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ झिल्ली सेते 4 डिग्री सेल्सियस (विरोधी Syncytin -2) या कमरे के तापमान पर 45 मिनट के लिए। Tris बफर खारा बीच में झिल्ली तीन बार धोएं (TBST; बफर रचना के लिए 2 टेबल देखें) 5 मिनट के लिए।
  3. उचित हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) के साथ झिल्ली सेते संयुग्मित विरोधी खरगोश या विरोधी माउस एंटीबॉडी (1: 10,000) में 5% 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर TBST में बफर अवरुद्ध। झिल्ली TBST में तीन बार 5 मिनट के लिए और फिर धो टीबीएस में कुल्ला। chemiluminescence आधारित सोख्ता सब्सट्रेट का उपयोग संकेतों का पता लगाने।

8. एकल असहाय oligonucleotide के radiolabeling

  1. phosphorylation प्रतिक्रिया
    1. एक microcentrifuge ट्यूब में, 1x टी -4 polynucleotide काइनेज बफर के साथ-साथ एक आगे oligonucleotide के 50 एनजी जोड़ने के लिए, 1 यूटी -4 polynucleotide काइनेज और 20 μCi (γ- 32 पी) एटीपी और nuclease मुक्त पानी के साथ 20 μl करने के लिए प्रतिक्रिया मात्रा को बनाते हैं।
    2. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 0.5 एम EDTA के 5 μl जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो। nuclease मुक्त पानी के साथ 50 μl करने के लिए खंड अप करें।
  2. ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स से अनिगमित न्यूक्लियोटाइड का हटाया
    1. जी -25 स्तंभ ते बफर (तालिका 2) निर्माता के निर्देशों का पालन के साथ equilibrated तैयार करें। एक ताजा DNase मुक्त 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में स्तंभ रखें।
    2. धीरे-धीरे खत्म हो राल जांच (कदम 8.1.2 से) के 50 μl जोड़ने के लिए, राल बिस्तर परेशान नहीं सावधान किया जा रहा है। 350 XG पर 2 मिनट के लिए स्पिन 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में शुद्ध नमूना एकत्र करने के लिए। 350 XG पर 2 मिनट के लिए nuclease मुक्त पानी और स्पिन के 36 μl के साथ जी -25 स्तंभ धो लें microcentrifuge ट्यूब में इसे इकट्ठा करने के लिए।
  3. पूरक किनारा राजभाषा के साथ संकरणigonucleotide
    1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब radiolabeled जांच (86 μl) स्थानांतरण और रिवर्स oligonucleotide के 200 एनजी और annealing बफर के 1x (तालिका 2) जोड़ें। गर्मी 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए और ठंडा करने के लिए कमरे के तापमान पर रात भर छोड़ दें।
    2. लेबल हटाया गया के 50 एनजी आगे जोड़कर गैर रेडियोधर्मी डबल असहाय oligonucleotides को तैयार है और एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स और annealing बफर के 1x रिवर्स। nuclease मुक्त पानी के साथ 100 μl करने के लिए खंड अप करें। गर्मी और कदम 8.3.1 में वर्णित के रूप में कमरे के तापमान पर रखने के लिए।

9. EMSA के लिए एक गैर denaturing polyacrylamide जेल की तैयारी

  1. एक 1.5 मिमी अंतरिक्ष कंघी (जेल रचना के लिए 2 टेबल देखें) के साथ एक 4% देशी जेल (10 x 12 सेमी) तैयार करें। आसुत जल का उपयोग कर सभी गिलास प्लेट साफ करें।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि प्लेटों ईओण डिटर्जेंट से पूरी तरह मुक्त, एसडीएस की तरह हो।
  2. इसके तत्काल बाद पीप्लेटों के बीच में हमारे एक्रिलामाइड समाधान polymerization आगे बढ़ने के लिए (लगभग 30 मिनट) की अनुमति है।
  3. वैद्युतकणसंचलन तंत्र को इकट्ठा करने और 0.5x TBE साथ टैंक को भरने। नमूना लोड करने से पहले 150 वी पर 1 घंटे के लिए 30 मिनट के लिए जेल प्री-चलाते हैं।

10 डीएनए बाध्यकारी प्रतिक्रिया

  1. एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में, 1x जेल शिफ्ट बाध्यकारी बफर (तालिका 2) में परमाणु निकालने (4.3 चरण) के 10 माइक्रोग्राम प्रति जोड़ सकते हैं और nuclease मुक्त पानी के साथ 10 μl के लिए अंतिम मात्रा को बनाते हैं। एक नियंत्रण के रूप में, कोई परमाणु निकालने के साथ एक ट्यूब तैयार करते हैं। प्रतियोगिता प्रतिक्रिया के लिए, ठंड गैर विशिष्ट या विशिष्ट डबल असहाय oligonucleotide (कदम 8.3.2) के 1 μl जोड़ें।
  2. प्रत्येक प्रतिक्रिया के लिए कदम 8.3.1 से रेडियोधर्मी जांच की 1 μl जोड़ें। 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्रतिक्रिया सेते हैं। प्रतिक्रिया प्रति 10x जेल लोड हो रहा बफर के 1 μl जोड़ें और धारा 9 में तैयार जेल पर प्रत्येक नमूना लोड।
  3. 15 पर 2 घंटा के लिए 1 1/2 के लिए जेल चला0 वी माइग्रेशन के बाद, एक भास्वर स्क्रीन के नीचे एक जोखिम कैसेट में जेल और गिलास एक प्लास्टिक की चादर और स्थिति में लपेट। 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कैसेट छोड़ दें।
  4. जोखिम कैसेट से स्क्रीन निकालें और स्कैनिंग के लिए भास्वर इमेजिंग डिवाइस में सम्मिलित करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

अवधि गर्भधारण से ताजा गर्भनालों मानव प्राथमिक विलस cytotrophoblasts को अलग-थलग करने के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग में प्रस्तुत प्रयोगों के सेट संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया। उनके अलगाव के बाद, हम पहले cytokeratin-7 मार्कर (चित्रा 1) के उपयोग के माध्यम cytotrophoblasts की पवित्रता का विश्लेषण किया। सेल की तैयारी इस प्रकार एक मोनोक्लोनल विरोधी cytokeratin-7 एंटीबॉडी का उपयोग दाग रहे थे। चित्रा 1 प्रतिनिधित्व प्राथमिक विलस cytotrophoblasts की शुद्धि के बाद एक ठेठ प्रयोग, cytometry मानक प्रवाह से विश्लेषण का परिणाम है। घनत्व ढाल कदम के बाद,> 97% कोशिकाओं (इस मामले में, 99%) सकारात्मक मानक प्रयोगों में cytokeratin-7 के लिए दाग रहे हैं, जिससे इस प्रकार की कोशिका की शुद्धि में क्षमता का एक बहुत ही उच्च स्तर का प्रदर्शन है।

उनके अलगाव के बाद, मानव प्राथमिक cytotrophoblasts सीधे टीआरए के लिए इस्तेमाल किया जा सकताnsfection। दो अलग प्रोटोकॉल का मूल्यांकन किया गया है, यानी, microporation और लिपिड आधारित अभिकर्मक। दोनों प्रोटोकॉल एक तले siRNA (नकारात्मक नियंत्रण) की तुलना में siRNA Syncytin -2 mRNA के लिए विशिष्ट साथ परीक्षण किया गया है। अभिकर्मक दक्षता अगले पश्चिमी धब्बा विश्लेषण द्वारा मूल्यांकन किया गया था। परिणामों की पुष्टि की है कि Syncytin -2 अभिव्यक्ति काफी microporation पर कोशिकापोषकप्रसू व्युत्पन्न अर्क में खामोश था (चित्रा 2)। दूसरी ओर, कोई महत्वपूर्ण मुंह बंद जब siRNAs लिपिड आधारित अभिकर्मक अभिकर्मक द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट थे उल्लेख किया गया था।

हम यह भी हौसले से पृथक cytotrophoblasts पर EMSA प्रयोग किए। एक radiolabeled जांच है कि एक Syncytin -2 प्रमोटर क्षेत्र से उत्पन्न संश्लेषित किया गया था। संश्लेषित जांच (करार दिया गुम्मट, 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') पहले CREB से संबंधित प्रतिलेखन 7 कारकों बाध्य करने के लिए दिखाया गया है। परमाणु extr की उपस्थिति में 24 और 48 घंटा सुसंस्कृत विलस cytotrophoblasts से कार्य करता है, Syncytin-2-प्रमोटर व्युत्पन्न जांच दो डीएनए प्रोटीन परिसरों की उपस्थिति देखी गई। 100x ठंड गुम्मट oligonucleotide के अलावा, जटिल के गठन के लिए प्रतिस्पर्धा है, जबकि एक ठंड असंबंधित oligonucleotide के अतिरिक्त (माउस तंत्रिका शिखा बढ़ाने 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') के साथ कोई समान प्रतियोगिता मनाया गया, दोनों संकेतों की विशिष्टता (इस बात की पुष्टि चित्रा 3)।

आकृति 1
विलस cytotrophoblasts के चित्र 1 से फ्लो के माध्यम से प्राथमिक विलस cytotrophoblasts की पवित्रता का मूल्यांकन। हौसले से पृथक की तैयारी पहले permeabilized और फिर cytokeratin-7 (काला लाइन) के लिए निर्धारण नियंत्रण एंटीबॉडी (लाल रेखा) या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विशिष्ट साथ लेबल रहे थे। कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया। लेस / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. लिपिड आधारित अभिकर्मक और microporation के बीच siRNA अभिकर्मक क्षमता की तुलना। हौसले से पृथक विलस cytotrophoblasts बनाम एक तले नियंत्रण लिपिड आधारित अभिकर्मक या microporation का उपयोग कर siRNA Syncytin-2-विशिष्ट siRNA के 300 एनजी के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे। (ए) पश्चिमी धब्बा विश्लेषण विरोधी Syncytin -2 और विरोधी GAPDH एंटीबॉडी का उपयोग प्रत्येक अभिकर्मक हालत से सेलुलर अर्क पर प्रदर्शन किया गया। (बी) के पश्चिमी धब्बा विश्लेषण से Syncytin -2 प्रोटीन का स्तर (त्रुटि सलाखों के रूप में परिभाषित कर रहे हैं एसडी *** पी <0.001) इसी GAPDH संकेतों के साथ सामान्य बनाने के बाद बैंड तीव्रता के मामले में मात्रा निर्धारित किया गया।5 / 53995fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. डीएनए प्रोटीन परिसरों EMSA विश्लेषण द्वारा की पहचान की। प्राथमिक विलस 24 या 48 घंटे के लिए सुसंस्कृत cytotrophoblasts से परमाणु अर्क एक गुम्मट जांच के साथ या बिना विशिष्ट या अविशिष्ट से अधिक (100x) Syncytin-2 के एक प्रमोटर क्षेत्र के लिए इसी के साथ incubated रहे थे ठंड ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स। डीएनए प्रोटीन परिसरों एक देशी जेल पर पलायन पर अलग हो गए थे। विशिष्ट संकेत और नि: शुल्क जांच जेल के दाईं ओर संकेत कर रहे हैं। गुम्मट जांच परमाणु निकालने के अभाव में incubated भी एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था। सीटी NE = कोशिकापोषकप्रसू परमाणु अर्क। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Percoll फाइनल के% Percoll (90%) (एमएल) की मात्रा HBSS की मात्रा (एमएल)
70 2.33 0.67
65 2.17 0.83
60 2.00 1.00
55 1.83 1.17
50 1.67 1.33
45 1.50 1.50
40 1.33 1.67
35 1.17 1.83
30 1.00 2.00
25 0.83 2.17
20 0.67 2.33
15 0.50 2.50
10 0.33 2.67
5 0.17 2.83

तालिका 1. 5% -70% polyvinylpyrrolidone लेपित सिलिका ढाल सेटिंग।

बफर रचना टिप्पणियाँ / विवरण
पीबीएस 1x 0.9 मिमी 2 CaCl, 2.7 मिमी KCl, 1.5 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 0.5 मिमी 2 MgCl, 136.9 मिमी NaCl और 0.8 मिमी ना 2 4 HPO
RIPA बफर 150 मिमी NaCl, 1.0% एनपी 40 या 0.1% ट्राइटन X-100, 0.5% सोडियम deoxycholate, 0.1% एसडीएस (सोडियम सल्फेट dodecyl), 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 8.0
Laemmli नमूना बफर 4% एसडीएस, 10% 2-mercaptoethanoएल, 20% ग्लिसरॉल, 0.004% bromophenol नीले, 0.125 एम Tris एचसीएल, पीएच 6.8
10x चल बफर 25 मिमी Tris आधार, 190 मिमी ग्लाइसिन, 0.1% एसडीएस
10x स्थानांतरण बफर 25 मिमी Tris आधार, 192 मिमी ग्लाइसिन
TBST 1x बफर 10 मिमी Tris एचसीएल, 15 मिमी NaCl, 0.05% के बीच 20 7 पीएच पर अच्छी तरह मिक्स और फिल्टर। फिल्टर करने में विफलता की झिल्ली "खोलना" करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं।
बफर अवरुद्ध 5% दूध या बीएसए (गोजातीय सीरम albumin) 1x बफर TBST को जोड़ा गया
ते बफर 10 मिमी Tris एचसीएल (8.0 पीएच), 1 मिमी EDTA
एनीलिंग बफर 1 एम NaCl, 50 मिमी Tris एचसीएल पीएच 7.5, 100 मिमी 2 MgCl 0,2 मिमी EDTA, 1 मिमी डीटीटी
5x जेल शिफ्ट बंधन बफर 20% glyceroएल, 5 मिमी 2 MgCl, 2.5 मिमी EDTA, 2.5 मिमी डीटीटी, 250 मिमी NaCl, 50 मिमी Tris एचसीएल (पीएच 7.5) और 0.25 मिलीग्राम / एमएल पाली (di-डीसी)।
बफर लोड हो रहा है 250 मिमी Tris एचसीएल (7.5 पीएच), 0.2% bromophenol नीले और 40% ग्लिसरॉल
TBE 5x Tris आधार की 54 ग्राम और 1 एल विआयनीकृत पानी में बोरिक एसिड का 27.5 जी, जो 20 मिलीलीटर 0.5 एम EDTA भी शामिल है, पीएच 8 भंग
4% देशी जेल TBE 5x बफर 6.0 मिलीलीटर
29: 1 एक्रिलामाइड / bisacrylamide (30% w / v) 10 मिलीलीटर
40% एक्रिलामाइड (डब्ल्यू / वी) 0.75 मिलीलीटर
100% ग्लिसरॉल 1.5 मिलीलीटर
आसुत जल 41.5 मिलीलीटर
अमोनियम persulfate 25% 250 मिलीलीटर
TEMED 75 मिलीलीटर
4% Stacराजा जेल (6 मिलीग्राम) एसडीएस पृष्ठ के लिए DDH 2 हे 4.1 मिलीलीटर
30% एक्रिलामाइड 1.0 मिलीलीटर
1.0 एम Tris 0.75 मिलीलीटर
10% एसडीएस 60 μl
10% ए पी एस 60 μl
TEMED 6 μl
12% एसडीएस पृष्ठ के लिए अलग जेल (10 मिलीलीटर) DDH 2 हे 3.3 मिलीलीटर
30% एक्रिलामाइड 4.0 मिलीलीटर
1.5 एम Tris 2.5 मिलीलीटर
10% एसडीएस 100 μl
10% ए पी एस 100μl
TEMED 4 μl

तालिका 2 बफ़र्स की संरचना है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

मानव अपरा समारोह और विकास पर अध्ययन बहुत विभिन्न अपरा सेल आबादी के अलगाव के अनुकूलन के उद्देश्य से प्रोटोकॉल द्वारा सुधार किया गया है। सबसे अच्छा अध्ययन अपरा सेल की आबादी का एक विलस cytotrophoblasts, अध्ययन है जो की बहुत कुशल और विश्वसनीय अलगाव की अनुमति देने के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल से लाभ हुआ है बनी हुई है। यह आगे इस तरह के अभिकर्मक और प्रमोटर अध्ययन के रूप में प्रयोगों के एक नंबर की अनुमति दी है। एक पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 3 का उपयोग करना, प्राथमिक विलस cytotrophoblasts का शुद्ध आबादी प्राप्त किया जा सकता है। सी.के.-7 एक मध्यवर्ती रेशा प्रोटीन है, जो cytotrophoblasts में व्यक्त किया जाता है। इस प्रोटीन के खिलाफ मोनोक्लोनल एंटीबॉडी नाल 10 से उनके अलगाव के बाद इस trophoblast आबादी की शुद्धता निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। तैयारी शुद्ध हो सकता है जब कोशिकाओं के 96% सी.के.-7 के लिए सकारात्मक रहे हैं परिभाषित कर रहे हैं। कोशिकाओं बाद अभिकर्मक के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है। अभिकर्मक प्रोटोकॉललिपिड आधारित दृष्टिकोण को शामिल मोटे तौर पर प्राथमिक कोशिकाओं 11,12 में न्यूक्लिक एसिड हस्तांतरण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, कुछ कोशिकाओं में लिपिड तैयार करने की विषाक्तता एक नुकसान हो जाता। Microporation एक electroporation जगह है, जो कम से कम गर्मी, धातु आयन विघटन, पीएच भिन्नता और ऑक्साइड गठन उत्पन्न करता है के रूप में एक विंदुक टिप का उपयोग कर एक electroporation तकनीक है; जो की सभी कोशिकाओं के लिए हानिकारक हो सकता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत आंकड़ों के आधार पर आंका microporation रूप से पश्चिमी धब्बा विश्लेषण करती है, लिपिड आधारित अभिकर्मक प्रोटोकॉल से siRNA वितरण के लिए एक अधिक कुशल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। एक EMSA दृष्टिकोण, एक जांच Syncytin -2 प्रमोटर कि अपनी गतिविधि 7 के लिए महत्वपूर्ण कारकों में बाँध के लिए परीक्षण किया गया था जाना जाता है के एक चयनित क्षेत्र के खिलाफ बनाया का उपयोग करना। जांच से अलग-थलग cytotrophoblasts से परमाणु निकालने के साथ incubated था। के रूप में चित्रा 3 में प्रस्तुत किया, विशिष्ट संकेत प्राप्त किया गया।

अलग प्रोटोकॉल के साथ साथ ज वर्णितहाल के वर्षों में अनुकूलित किया गया AVE। हालांकि, वे सभी उच्च गुणवत्ता कोशिकापोषकप्रसू की तैयारी है, जो महत्वपूर्ण कदम की एक निश्चित संख्या पर निर्भर करते हैं पर भरोसा करते हैं। और सबसे पहले, जन्म के बाद, गर्भनालों एक बफर समाधान में रखा जाना चाहिए और कोशिकाओं घंटे अधिक से अधिक 5 समाधान में डूब जाने के बाद उनके पास से अलग किया जाना चाहिए। Trypsin और DNase उपचार बहुत महत्व का भी कर रहे हैं और ध्यान से कोशिकापोषकप्रसू तैयारी की गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए किया जाना चाहिए। नाल विल्ली और समय उनके अलगाव के लिए जरूरत की कमी के व्यापक स्क्रबिंग दोनों अतिरिक्त सुधार, जो दृढ़ता से सेल नंबर अलगाव की दक्षता उन्नयन कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल की उपज आगे घनत्व ढाल कदम है, जो बारीकी से निगरानी की जानी चाहिए दौरान इष्टतम centrifugation पर निर्भर करता है। ठीक से नलियों को संतुलित करने में विफलता भी ढाल के विरूपण को बढ़ावा मिलेगा और गंभीर रूप से सेल नंबर कम।

अभिकर्मक प्रोटोकॉल का वर्णनडी के साथ साथ कई वर्षों के लिए परीक्षण किया गया है। हालांकि microporation के लिए आवश्यक शर्तों आम तौर पर सीधा कर रहे हैं, विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं के लिए अभिकर्मक के अनुकूलन फिर भी आवश्यक हैं। यह भी ट्रांसफ़ेक्ट न्यूक्लिक एसिड (siRNA या प्लास्मिड डीएनए) की राशि के अनुकूलन शामिल है। इस प्रकार, के लिए प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित है, विभिन्न siRNAs सांद्रता का अनुकूलन एक कुशलता के दमन siRNA की पहचान करने की सिफारिश की है। microporation और कोशिकाओं की पूरी निलंबन से पहले सेल गोली के लिए एक उपयुक्त निलंबन मात्रा के अलावा अतिरिक्त कारक है, जो अभिकर्मक क्षमता को प्रभावित कर रहे हैं।

EMSA प्रयोगों भी अनुकूलन आवश्यक हो गया है। नाल दाताओं और अलग कोशिकापोषकप्रसू अलगाव क्षमता और शुद्धता के साथ जुड़े विविधता को देखते हुए, EMSA प्रयोगों परिणामों की पुष्टि करने के लिए 5 गुना तक दोहराया जाना चाहिए। इसके अलावा, उच्च सेल नंबर होने के पर्याप्त prote सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैपरमाणु निकालने की तैयारी और प्रोटीन / डीएनए परिसरों के बाद पता लगाने में स्तरों में। इसके अलावा, अत्यधिक रेडियोधर्मी oligonucleotide जांच के लिए तैयार रहना चाहिए, और हाल ही में खरीदी रेडियोधर्मी एटीपी से नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए।

सीमाओं की एक श्रृंखला प्रस्तुत प्रोटोकॉल में रेखांकित किया जाना चाहिए। यह पहली बार जोर दिया जा करने के लिए प्रवाह cytometry कि विश्लेषण सेल की तैयारी में syncytiotrophoblast टुकड़े के संभावित उपस्थिति का आकलन नहीं कर सकते हैं की जरूरत है। अन्य प्रोटोकॉल जैसे प्रवाह cytometry या एंटीबॉडी बाध्य चुंबकीय मोती 13,14 के उपयोग का उपयोग कर छँटाई के रूप में, इस मुद्दे को हल करने के लिए प्रस्तावित किया गया है। हालांकि यह है कि इन टुकड़ों को सामान्य रूप से सेल संस्कृति कुओं का पालन नहीं करते हैं और अक्सर कदम सेल धोने के बाद हटा रहे हैं उल्लेख किया जाना चाहिए। प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए एक और सीमा यह है कि प्राथमिक विलस cytotrophoblasts सेल संस्कृति में एक बहुत ही सीमित अस्तित्व समय है। इसलिए, भले ही चयनित विधि के स्थिर, गांव के अभिकर्मकlous cytotrophoblasts अप्राप्य रहेगा। EMSA का विश्लेषण करती है, इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में, यह भी कुछ सीमाएं हैं। हालांकि संकेतों की विशिष्टता आसानी से अतिरिक्त लेबल हटाया गया ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स के साथ प्रतियोगिता प्रयोगों द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, बाध्य कारकों केवल supershifted संकेतों में जिसके परिणामस्वरूप विशिष्ट प्रतिलेखन कारक के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग पहचाना जा सकता है। EMSA प्रयोगों इसके अलावा सीमित रूप में यह विट्रो डीएनए, प्रोटीन बातचीत में अध्ययन रहते हैं। विवो प्रोटोकॉल में ऐसी चिप परख के रूप में अधिक प्रतिनिधि सेटिंग्स, के साथ प्रयोग, और अधिक हाल ही में आगे EMSA परिणाम पुष्टि करने के लिए आवश्यक हैं।

प्रोटोकॉल कोशिकापोषकप्रसू अलगाव और अभिकर्मक के लिए यहाँ बताया अध्ययनों में जो क्षणिक मुंह बंद करने या विशिष्ट जीन की overexpression समारोह, प्रसार या एक विशिष्ट trophoblast सेल प्रकार के भेदभाव में उनकी भूमिका को समझने की जरूरत है के लिए महत्वपूर्ण आवेदन किया है। इसके अलावा, पर अभिकर्मक, टीव्यक्त प्रोटीन की agged संस्करणों intracellular ट्रैकिंग के लिए उपयुक्त हो सकता है और इस तरह के confocal माइक्रोस्कोपी के रूप में मानक तकनीक, द्वारा विश्लेषण करती है और प्रवाह cytometry होगा। EMSA प्रोटोकॉल प्रमोटर विनियमन और फंसा प्रतिलेखन कारक से संबंधित जटिल विवरण का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण शोधकर्ताओं ने गर्भनाल की कमी और विलस cytotrophoblasts में व्यक्त जीनों की बदल विनियमन से संबंधित कुछ बीमारियों के विकास में शामिल कारकों की पहचान करने की अनुमति देगा।

अंत में, मानव प्राथमिक cytotrophoblasts गर्भनालों से आसानी से अलग हो सकता है और इस तरह के siRNA अभिकर्मक और EMSA के रूप में मानक प्रोटोकॉल, के लिए उत्तरदायी हैं कर सकते हैं। हालांकि इस तरह के lipofection 15 और nucleofection 16 के रूप में अलग अलग अभिकर्मक प्रक्रियाओं, उपलब्ध हैं, microporation पृथक विलस cytotrophoblasts की siRNA अभिकर्मक के लिए एक बहुत ही कारगर तरीका लगता है, सीमित सेल डी के साथ एक दृष्टिकोण की पेशकशएथलीट और अपेक्षाकृत कम लागत। विलस cytotrophoblasts के संदर्भ में, इस दृष्टिकोण अलग जीन का मुंह बंद करने और विभिन्न कार्यों या सेल प्रकार की विशेषताओं में अपने निहितार्थ के आकलन की अनुमति चाहिए। इसके अलावा, अभिव्यक्ति वैक्टर के अभिकर्मक भी इस प्रोटोकॉल का उपयोग संभव है और siRNA आधारित दृष्टिकोण के पूरक डेटा निकलेगा। EMSA करने के लिए सम्मान के साथ, इस तकनीक प्रोटीन डीएनए परिसरों का मूल्यांकन जब ऐसी DNase मैं footprinting, मेथिलिकरण हस्तक्षेप परख, क्रोमेटिन immunoprecipitation और क्रोमेटिन रचना विश्लेषण के रूप में वैकल्पिक तरीकों, की तुलना में अधिक तेजी से और सरल तरीका प्रदान करता है। इसलिए, इस तकनीक को मूल्यवान मानक प्रमोटर में विश्लेषण करती है या किसी अन्य बढ़ाने / शमन युक्त डीएनए क्षेत्रों के परीक्षण बनी हुई है। विलस cytotrophoblasts के लिए अपने विश्वसनीय उपयोग की हमारे प्रदर्शन महत्वपूर्ण है क्योंकि यह जीन का विनियमन, कार्यात्मक स्तर पर संभावित प्रभाव के बारे में जानकारी के साथ कहते है। बावजूद उनकीसंस्कृति में सीमित समय, प्राथमिक विलस cytotrophoblasts मानक के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं और अधिक हाल ही में के रूप में अच्छी तरह से जानकारीपूर्ण तरीकों के लिए अनुकूल होना चाहिए।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

इस काम कनाडा के राष्ट्रीय विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (NSERC) (# 298527) (बी बी) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया। सीटी एक संस्थागत किराया छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया। ए वी एक NSERC ग्राहम बेल पीएच.डी. द्वारा समर्थित किया गया छात्रवृत्ति। बी बी मानव Retrovirology में कनाडा अनुसंधान चेयर (टीयर 2) का आयोजन किया। पाठ में संशोधन में मदद के लिए बीट्रिक्स Beisner करने के लिए धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HBSS without  Ca2+, Mg2+  Sigma #H2387
HBSS (10x) Sigma #14060-057
DMEM High Glucose without Hepes Gibco #12100-061
Hepes (1 M) Gibco #15630-080
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) Gibco #15640-055
Amphotericin B  Sigma #A2411
CaCl2 Sigma #C4901
MgSO4.7H2O  Sigma #M
Fetal bovine serum Gibco #16170-078 
Percoll  Sigma #P-1644 For density gradient
Syncytin-2 siRNA Ambion Life technologies #AM16708
Scrambled siRNA Qiagen # SI03650318
DNase I Sigma-Aldrich #D5025
Trypsine, type I  Sigma #T8003
DharmaFECT Lipotransfection  reagents  GEhealthcare # T-2001-01
Trypsin/EDTA Life technologies #25300-062
Protease Inhibitor Cocktail Roche Diagnostic #11873580001
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Scientific #23225
BSA Sigma #A7906
TWEEN 20 Sigma #P9416 
Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody  Cell Signaling #7074
BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) Roche Diagnostic #11500708001
DPBS  Life technologies #14287-080
T4 Polynucleotide Kinase NEB #M0201S
ATP, [γ-32P] Perkin Elmer #BLU002A100UC
Acrylmide Sigma  #A9099
TEMED Life technologies #17919
Ammonium Persulfate Sigma  #A3678
Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated Millipore CBL194F Dilution 1:200
FcR blocking reagent  Miltenyi Biotec 130- 059-901 Dilution 1:10
Flow Cytometer BD Acuri system Becton Dickinson
Microporator MP-100 apparatus  Digital Bio
Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) Life technologies MPK10096
PVDF membrane  Millipore IPVH00010  Activate with methanol
Anti-human GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology sc-137179 1:500
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody Cell Signalling #7074 1:10,000
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody Cell Signalling #7076  1:10,000
NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Thermo Scientific #78833
G-25 column  GE Healthcare #27-5325-01
Chemiluminsescence and fluorescence imaging device Montréal Biotech Fusion FX5
4% native gel Home made
PBS Home made 1x
Personal Molecular Imager (PMI) System BioRad

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
  3. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  4. Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
  5. Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
  6. Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
  7. Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  9. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  10. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
  11. Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
  12. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
  13. Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
  14. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  15. Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
  16. Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).

Tags

आनुवंशिकी अंक 115 आण्विक जीवविज्ञान अंक मानव विलस cytotrophoblasts Syncytin -2 siRNA Microporation लिपिड आधारित अभिकर्मक electrophoretic गतिशीलता शिफ्ट परख
पर हौसले अलग मानव विलस Cytotrophoblasts siRNA अभिकर्मक और EMSA विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lokossou, A. G., Toufaily, C.,… More

Lokossou, A. G., Toufaily, C., Vargas, A., Barbeau, B. siRNA Transfection and EMSA Analyses on Freshly Isolated Human Villous Cytotrophoblasts. J. Vis. Exp. (115), e53995, doi:10.3791/53995 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter