Summary
このプロトコルは、効率的に新たに単離されたヒト絨毛細胞栄養芽層でのsiRNAのトランスフェクションマイクロポを使用して、これらの細胞におけるDNA-タンパク質複合体を同定するための方法が記載されています。トランスフェクトされた細胞は、ウェスタンブロットによりモニターすることができ、EMSAは、4日間の培養期間中に分析します。
Protocol
UQAM倫理委員会は、センターHospitalier Universitaireモントリオール（モントリオール、カナダ）のサンリュック病院の倫理委員会のガイドラインに従っているこれらのプロトコルを、承認しました。参加者は、インフォームドコンセントフォームに署名しました。
1.ミディアム調製と原発絨毛細胞栄養層の分離
- 25mMのHEPES、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補充することによって、ヒト初代絨毛細胞栄養芽層のための培地を調製します。 50ミリリットルのアリコートでCの冷凍庫-20℃で滅菌した0.22μmのフィルターとストアを介して調製した培地をフィルタリングします。
- 標準的なプロトコル3次の新鮮な胎盤からの一次絨毛細胞栄養層を分離します。
- ペンチを使用して、絨毛組織を除去しないように注意しながら、静かに掻きすることによって、組織から胎児膜を除去します。カットメスやハサミを使用して、約3×3センチの立方体の残りの胎盤絨毛。徹底的に母体の血液を除去するために0.9％NaClを含む水で洗います。
- ペンチで各キューブを持ち、慎重に残りの船やハサミを使用して線維組織からの絨毛組織を除去します。
- およびデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI）（;絨毛組織の15〜30 mgのために、（最終濃度1.2 mg / mlで9.6×10 5〜1.8×10 6 U）ハンクス平衡塩溶液（HBSS）を含むトリプシンで4回ダイジェスト連続的に振とうしながら水浴中で37℃で30分間の最終濃度は200μg/ mlで）。
注：、150ミリリットルに最初の消化のための総容量を使用し、残りの2つの消化のための第二の消化と75ミリリットルのための100ミリリットル。
- ブレーキなしで15分間、1250×gで分散した細胞と遠心分離を含む上清を収集します。上清を除去し、含む予め加温したDMEMの1ミリリットルで再懸濁細胞1％のペニシリン/ストレプトマイシン。
- ブレーキなしで507×gで23分間、70％のポリビニルピロリドン被覆シリカ勾配（勾配を調製するための表1を参照）、遠心分離-不連続5％の上に分散した細胞をレイヤ。吸引により1.033から1.017の間に密度層を取り外し、新しいピペットを用いて勾配で40％と50％の間の層を収集します。 1％ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する予め温めたDMEM 10mlで広範囲に細胞を洗浄します。
注：収集画分は、栄養膜を保有1.048と1.062の間の密度に相当します。 - 血球計数器を用いて細胞を数えます。簡単に言えば、細胞を混合し、新しいマイクロチューブに10μlを添加します。トリパンブルーの10μlを添加して、再び穏やかに混合します。細胞懸濁液を策定し、血球計数器室を埋めます。 10Xの目的で細胞をカウントします。
- それぞれ、セクション1.3および2で使用するために別々のチューブに1×10 6〜4.5×10 6個の細胞を配置LY。他の実験のため4日間の最大のためにCO 2を 37℃/ウェルで添加したDMEM培地と文化の中で1.5×10 6細胞の密度で、残りの細胞をシードし、5％。
- ペンチを使用して、絨毛組織を除去しないように注意しながら、静かに掻きすることによって、組織から胎児膜を除去します。カットメスやハサミを使用して、約3×3センチの立方体の残りの胎盤絨毛。徹底的に母体の血液を除去するために0.9％NaClを含む水で洗います。
- 孤立した一次絨毛細胞栄養芽層の純度の評価
- 300×gでマイクロ遠心チューブ内の新たに単離した細胞栄養層のスピン1×10 6。上清を捨て、予め温めたリン酸緩衝生理食塩水（PBS）の1ミリリットルを追加します。 300×gで遠心分離細胞および吸引によってPBSを削除します。
- 細胞に冷メタノールの1ミリリットルを加え、20分間-20℃でインキュベートします。 5分間、300×gで遠心分離し、細胞および吸引によりメタノールを除去。
注意：メタノールの処理中にキャニスターマスク、保護メガネ、ゴム手袋を使用してください。 - 、細胞を再水和するために、室温でPBSの1ミリリットルを追加300×gで遠心分離し、吸引によってPBSを削除します。
- FBS（1：50 [V / V]希釈）とのFcRを含むPBSで細胞をインキュベート非特異的結合を除去するために室温で45分間試薬（1:10）ブロッキング。
- 5分間、300×gで室温500μlのPBS、遠心細胞で二回洗浄し、吸引によってPBSを削除します。 100μlの室温PBSで細胞を再懸濁し。
- で室温にて45分間、0.2％BSAを含有するPBSまたは対照アイソタイプが一致した非特異的抗体：マウスモノクローナルフルオレセインイソチオシアネート（FITC）を有する細胞を、抗ヒトサイトケラチン7抗体クローンLP5K（200 1）抱合インキュベート暗い。 PBSで細胞を洗浄します。
- フローサイトメトリー3により細胞を分析します。さらなる実験のために、フローサイトメトリーによって96％CK-7陽性細胞の最小値を実証する細胞調製物を、使用します。
ヒト原発絨毛細胞栄養芽層の2 siRNAのトランスフェクション
- 微小穿孔器を用いて、ヒト一次絨毛細胞栄養層のトランスフェクション
- 含む6ウェルプレートを準備microporated細胞のインキュベーションのために添加したDMEM培地2ml。
- 一次細胞栄養芽層（1.2節を参照）の単離後、懸濁液中の細胞のアリコートを取り、血球計数器を用いて細胞数を決定します。
- 室温で5分間、300×gで遠心分離することによってマイクロチューブ、ペレット細胞に1.5×10 6個の細胞を転送します。 1ミリリットルダルベッコPBS（DPBS）マグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+ -free）で細胞を洗浄し、室温で5分間、300×gでの遠心分離によって細胞をペレット。
- 上清を除去し、再懸濁緩衝液100μlの細胞を穏やかに再懸濁します。
注：細胞生存率およびトランスフェクション効率を最大にするために、室温で15〜30分間よりも長く細胞懸濁液を維持避けます。 - 1.5ミリリットルマイクロチューブにsyncytinの-2のsiRNA（またはコントロールスクランブルsiRNA）の300 ngのを追加し、100μlのトランスフェクションピペットを用いて細胞-siRNAの混合物を吸引します。インサート駅へのピペット（材料のリストを参照）、30ミリ秒の1300 V単一パルスに細胞を供します。
- すぐに細胞の損傷を避けるために37℃で予熱した添加培地を含有する（ステップ2.1.1で調製した）を6ウェルプレートに細胞を移します。
- 繰り返して、残りのサンプルのための2.1.5と2.1.6を繰り返します。
- 静かに細胞の均一な分布を確実にするために30秒間プレートを揺らし。 24〜48時間、加湿CO 2インキュベーター中、37℃でプレートをインキュベートします。培地をトランスフェクション後24時間を更新します。
- ウェスタンブロット分析により、トランスフェクション効率を評価する（工程を3~6参照）。
- ヒト初代細胞栄養芽層でのsiRNAのリポフェクション
- 絨毛細胞栄養芽層の分離後、培地2mlに6ウェルプレートにウェル当たり1.5×10 6細胞の密度で細胞を播種し、18時間インキュベートします。
- syncytinの-2特異的siRNA（またはコントロールスクランブル300ngのを希釈siRNA）と抗生物質と無血清培地10μlの総体積で別々の1.5ミリリットルチューブ内脂質ベースのトランスフェクション試薬5μlの。 5分間インキュベートします。
- 希釈された試薬を混合し、トランスフェクション複合体を形成するために、室温でさらに20分間インキュベートします。 100μlの最終体積にミックスに抗生物質および無血清培地90μlのを追加します。
- 6ウェルプレート（ステップ2.2.1）から培地を除去します。 2新鮮な培地mlの各ウェルに100μlのトランスフェクションミックスを追加します。 24〜48時間、CO 2インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートします。培地をトランスフェクション後24時間を更新します。
- ウェスタンブロット分析により、トランスフェクション効率を評価する（工程を3~6参照）。
全細胞培養からの溶解物の調製
- メディアを取り出して、予め温めておいたDPBSを使用して（ステップ2.1.8および2.2.4から）を各ウェルを洗浄（、Mg 2+で の Ca 2+を含みません）。 DPBSを吸引し、0.25％トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）の500μlを添加します。 CO 2インキュベーター中、37℃で1~3分間インキュベートします。増殖培地を含む血清500μlのを追加することにより、トリプシン処理を停止します。
注意：使用して、適切なメディアボリュームフラスコ/皿の種類に応じて：10 7細胞/ 100ミリメートル皿/ 150cm 2のフラスコ当たり1ミリリットル。 5×10 6細胞/ 60 mmディッシュあたり0.5ミリリットル/ 75cm 2のフラスコ。 - 室温で2分間、300×gで遠心分離により細胞をペレット化を1.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞を移します。室温で2分間300×gでの遠心分離によってDPBSマグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+フリー）、ペレット細胞で細胞を洗浄。
- ペレットを乱さないように注意して上清を除去します。チューブを氷上に置きます。たての追加を含む（緩衝液の組成については表2を参照）50-200μlの氷冷ラジオ免疫沈降アッセイ（RIPA）緩衝液中にペレットを再懸濁1×最終濃度で、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を編。簡単に言えば、チューブをボルテックスし、30分間氷上で残します。
- 4℃で20分間、16,000×gでスピン。慎重にチューブを氷上に置きます。ピペットを用いて、氷上に維持し、新鮮な予備冷却マイクロ遠心チューブに上清を移します。ペレットを捨てます。
培養細胞からの核抽出物の4準備
- 各ウェル（ステップ1.2.5）の場合は、予め温めておいたDPBSマグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+を含まない）の1ミリリットルで二回培養細胞栄養を洗います。吸引しDPBS 0.25％トリプシン/ EDTAの500μlのを追加します。 CO 2インキュベーター中、37℃で1-3分間インキュベートし、血清を含有する増殖培地を500μlを添加することにより、トリプシン処理を停止します。
- 室温で2分間、300×gで遠心分離により細胞をペレット化を1.5 mlのマイクロ遠心チューブに細胞を移します。遠心分離によってDPBSマグネシウム（Mg 2+、 の Ca 2+フリー）、ペレット細胞と細胞を洗浄室温で2分間、300×gで。慎重にペレットを中断することなく、すべての上清を除去し、チューブを氷上に置きます。
- 製造元の指示に従って核タンパク質を抽出します。タンパク質定量アッセイ（ブラッドフォードまたはビシンコニン酸アッセイ（BCA））を用いて、各サンプルのタンパク質濃度を決定します。
5.サンプル調製と電気泳動
- タンパク質定量アッセイ使用して、各細胞抽出物のためのタンパク質濃度を決定（例えば、ブラッドフォード8またはBCA 9）。
- （抗体を還元および変性条件下で使用することができる場合）、製造業者の説明書に従って、全タンパク質の20〜30μgのに2倍のLaemmliサンプル緩衝液（ 表2）の等量を加えます。
- 5分間、100℃で細胞溶解物を沸騰。繰り返し凍結/融解サイクルを回避し、将来の使用のために-20℃で、残りの管を格納するための溶解物のアリコートを50〜100μlの。 試料を加熱している間に、バッファ（ 表2）を実行して1倍の1 Lを用意。
- 数秒間16,000×gでサンプルをスピンし、氷の上に置きます。
- 分子量マーカーと一緒に、12％SDS-PAGEゲル（ゲル状組成物については表2を参照）の各ウェルに等量のタンパク質をロードします。 100 Vで1〜2時間、ゲルを実行します。
6.ゲルから膜へのタンパク質の転送
- ポリフッ化ビニリデン（PVDF）1分間のメタノールを有する膜を活性化し、1×転写緩衝液/ 10％メタノール溶液ですすいでください。製造業者の指示に従って、タンパク質の大きさに応じて1時間に30分間移します。
注：転写効率がブロッキング工程の前にポンソーレッド染色を用いて評価することができます。
7.抗体染色
- 室温で1時間または4℃で一晩5％のブロッキング溶液を使用するための膜をブロックします。
- 6または抗グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH; 0.4 / mlの、1：500）で5％のブロッキング溶液中で一晩;抗syncytinの-2抗体（5,000 1を4μg/ ml）で膜をインキュベート4°C（抗syncytinの-2）または室温で45分間。トリス緩衝食塩水Tween中で膜を3回洗浄（TBST;緩衝液の組成は表2を参照） を 5分間。
- 適切な西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）で膜をインキュベート共役抗ウサギまたは抗マウス抗体（1：10,000）5％1時間室温でTBSTでブロッキング緩衝液です。 5分間、膜をTBSTで3回洗浄した後、TBSですすいでください。化学発光ベースブロッティング基板を用いて信号を検出します。
一本鎖オリゴヌクレオチドの8放射性標識
- リン酸化反応
- マイクロチューブでは、1×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液と一緒に1 Uの前方オリゴヌクレオチド50ngのを追加します。T4ポリヌクレオチドキナーゼおよび20μCiの（γ-32 P）ATPおよびヌクレアーゼフリー水で20μlのに反応容量を構成しています。
- 37℃で30分間インキュベートします。 0.5 M EDTAの5μLを加えて反応を停止します。ヌクレアーゼフリー水で50μlにボリュームを構成します。
- オリゴヌクレオチドから取り込まれていないヌクレオチドの除去
- 製造者の指示に従って、TE緩衝液（ 表2）で平衡化したG-25カラムを準備します。新鮮なDNアーゼフリー1.5ミリリットルのマイクロチューブ内の列を配置します。
- ゆっくりと樹脂床を乱さないように注意しながら、樹脂上で（ステップ8.1.2から）プローブの50μlを添加します。 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ中の精製サンプルを収集するために、350×gで2分間スピン。ヌクレアーゼフリー水36μlのG-25カラムを洗浄し、マイクロチューブにそれを収集するために、350×gで2分間スピン。
- 相補鎖オールとのハイブリダイゼーションigonucleotide
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに放射性標識したプローブ（86μl）を転送し、アニーリング緩衝液（ 表2）の逆オリゴヌクレオチドおよび1倍の200 ngのを追加します。熱95℃で5分とは、冷却のために、室温で一晩おきます。
- 前方の未標識の50 ngのを追加することにより、非放射性の二本鎖オリゴヌクレオチドを調製し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブにオリゴヌクレオチドおよびアニーリング緩衝液の1倍を逆転。ヌクレアーゼフリー水で100μlにボリュームを構成します。熱とステップ8.3.1で説明したように、室温で保管してください。
EMSAのための非変性ポリアクリルアミドゲルの9準備
- 1.5ミリメートルのスペースコーム（ゲル組成物については表2を参照）で4％ネイティブゲル（10×12センチ）を準備します。蒸留水を使用して、すべてのガラスプレートを清掃してください。
注：プレートは、SDSのように、イオン性界面活性剤を全く含まないことが重要です。 - 直後のpプレート間における当社のアクリルアミド溶液は、重合が（約30分）を進行させます。
- 電気泳動装置を組み立て、0.5×TBEでタンクを埋めます。サンプルローディング前に150 Vで1時間に30分間ゲルを事前に実行します。
10. DNA結合反応
- 1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブでは、1×ゲルシフト結合緩衝液（ 表2）核抽出物（ステップ4.3）の10μgのを追加し、ヌクレアーゼフリー水で10μLへの最終的なボリュームを構成します。対照として、無核抽出物でチューブを準備します。競合反応のために、冷たい非特異的または特異的な二本鎖オリゴヌクレオチド（ステップ8.3.2）の1μlを添加します。
- ステップ8.3.1から各反応物に放射性プローブの1μLを加えます。 20分間室温で反応をインキュベートします。反応あたり10倍ゲルローディング緩衝液1μLを加え、セクション9で調製したゲル上の各サンプルをロードしてください。
- 15で2時間に1 1/2用ゲルを実行します。移行後0 V、蛍光体スクリーン下の露光カセット中のラップと位置でゲルとガラスを包みます。 24時間4℃でカセットを残します。
- 露光カセットから画面を削除し、スキャン用の蛍光撮像装置に挿入します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
満期妊娠からの新鮮な胎盤は、プロトコルのセクションで説明した実験のセットを行うために、ヒト初代絨毛細胞栄養層を分離するために使用されました。それらの単離に続いて、我々は最初のサイトケラチン7マーカー（ 図1）の使用を介して細胞栄養層の純度を分析しました。細胞調製物は、このように、モノクローナル抗サイトケラチン7抗体を用いて染色した。 図1は、標準的なフローサイトメトリーによって分析し、一次絨毛細胞栄養芽層の精製以下の典型的な実験の結果を表します。密度勾配のステップに続いて、（この場合、99％）> 97％の細胞が陽性にそれによって、この細胞型の浄化効率の非常に高い程度を示す、標準的な実験においてサイトケラチン7について染色されます。
それらの単離後、ヒト初代細胞栄養芽層を直接TRAのために使用することができますnsfection。二つの異なるプロトコルは、 すなわち、マイクロポおよび脂質ベースのトランスフェクションを評価しました。どちらのプロトコルはsyncytinの-2 mRNAに特異的なsiRNAを用いて試験し、スクランブルsiRNA（陰性対照）と比較しました。トランスフェクション効率は、次のウェスタンブロット分析によって評価しました。結果はsyncytinの-2の発現を有意にマイクロポ時栄養膜由来の抽出物中で（ 図2）をサイレンシングしたことを確認しました。 siRNAは脂質ベースのトランスフェクション試薬によってトランスフェクトした場合一方、有意なサイレンシングは認められませんでした。
また、新たに単離した細胞栄養上のEMSA実験を行いました。 syncytinの-2プロモーター領域由来の放射標識プローブを合成しました。 （WT称される; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 '）を合成したプローブは、以前CREB関連転写因子7を結合することが示されています。核EXTRの存在下で 24および48時間培養した絨毛細胞栄養芽層から作用し、syncytinの-2プロモーター由来のプローブは、二つのDNAタンパク質複合体の存在を示しました。 （両信号の特異性を確認し、観察された。冷無関係なオリゴヌクレオチドの過剰のない類似の競合（5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 'マウス神経クレストエンハンサー2）ながら100X冷WTオリゴヌクレオチドの添加は、複合体の形成のために競っ図3）。
フローサイトメトリーを介して、図の一次絨毛細胞栄養芽層の純度の1.評価を。絨毛細胞栄養芽層の新たに単離した調製物は、最初に透過処理した後、サイトケラチン7のための特定のアイソタイプ対照抗体（赤線）またはモノクローナル抗体（黒線）で標識しました。細胞をフローサイトメトリーにより分析しました。レ/ ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
脂質ベースのトランスフェクションおよびマイクロポ間のsiRNAのトランスフェクション効率の図2.比較は。新たに単離した絨毛細胞栄養層は、脂質ベースの試薬 または微小穿孔を用いてスクランブルコントロールsiRNA 対 syncytinの-2特異的siRNAの300 ngのトランスフェクトしました。 （A）ウエスタンブロット分析は、抗syncytinの-2および抗GAPDH抗体を用いて、各トランスフェクション条件から細胞抽出物について行きました。 （B）ウエスタンブロット分析からsyncytinの-2タンパク質レベルは（エラーバーはSDとして定義されて*** P <0.001）、GAPDHシグナルに対応する正規化以下のバンド強度の観点で定量しました。5 / 53995fig2large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
EMSA分析により同定図3 DNA-タンパク質複合体。24または48時間培養した一次絨毛細胞栄養芽層からの核抽出物は、WTプローブが特異的または非特異的の過剰（100倍）の有無にかかわらずsyncytinの-2のプロモーター領域に対応すると共にインキュベートしました寒さのオリゴヌクレオチド。 DNA-タンパク質複合体は、ネイティブゲル上移行時に分離しました。特定の信号および無料のプローブは、ゲルの右側に示されています。核抽出物の非存在下でインキュベートしたWTプローブはまた、陰性対照として使用しました。 CT NE =栄養膜細胞の核抽出物。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| パーコール最終の％ | パーコール（90％）（ML）の体積 | HBSSの容量（ml） |
| 70 | 2.33 | 0.67 |
| 65 | 2.17 | 0.83 |
| 60 | 2.00 | 1.00 |
| 55 | 1.83 | 1.17 |
| 50 | 1.67 | 1.33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1.33 | 1.67 |
| 35 | 1.17 | 1.83 |
| 30 | 1.00 | 2.00 |
| 25 | 0.83 | 2.17 |
| 20 | 0.67 | 2.33 |
| 15 | 0.50 | 2.50 |
| 10 | 0.33 | 2.67 |
| 5 | 0.17 | 2.83 |
表1の5％-70％ ポリビニルピロリドン被覆シリカ 勾配設定。
| バッファ | 組成 | コメント/説明 |
| PBS 1× | 0.9 mMのCaCl 2を、2.7のKCl、1.5mMのKH 2 PO 4、0.5mMのMgCl 2を、136.9 mMのNaClおよび0.8 mMののNa 2 HPO 4 | |
| RIPAバッファー | 150mMのNaCl、1.0％NP-40または0.1％トリトンX-100、0.5％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、50mMのトリス塩酸pH8.0の | |
| レムリ試料緩衝液 | 4％SDS、10％2- mercaptoethanoL、20％グリセロール、ブルー0.004％ブロモフェノール、0.125 Mトリス-HCl、pH6.8の | |
| 10×ランニングバッファー | 25mMのトリス塩基、190 mMグリシン、0.1％SDS | |
| 10倍の転送バッファ | 25mMのトリス塩基、192mMのグリシン | |
| TBSTバッファー（1x） | pH7の10mMのトリス-HCl、15mMの塩化ナトリウム、0.05％ツイーン20 | よく混ぜ、ろ過します。フィルタリングに失敗すると、膜の「スポッティング」につながることができます。 |
| ブロッキング緩衝液 | 5％ミルクまたはBSA（ウシ血清アルブミン）をTBST 1×緩衝液に添加しました | |
| TEバッファー | 10mMのトリス-HCl（pH8.0）、1mMのEDTA | |
| アニーリング緩衝液 | 1MのNaCl、50mMのトリス塩酸pH7.5で、100mMのMgCl 2を、0.2 mMのEDTA、1mMのDTT | |
| 結合バッファー5Xゲルシフト | 20％グリセロL、5mMのMgCl 2、2.5mMのEDTA、2.5mMのDTT、250mMの塩化ナトリウム、50mMのトリス-HCl（pH7.5）および0.25 mg / mlでのポリ（ジDC）。 | |
| ローディングバッファー | 250mMのトリス-HCl（pH7.5）、0.2％ブロモフェノールブルーおよび40％グリセロール | |
| TBE 5倍 | トリス塩基の54グラムと20ミリリットルの0.5M EDTAを含んで1 Lの脱イオン水、ホウ酸の27.5グラム、pHが8を溶解 | |
| 4％ネイティブゲル | TBE 5×バッファー | 6.0ミリリットル |
| 29：1のアクリルアミド/ビスアクリルアミド（30％w / v）の | 10ミリリットル | |
| （w / v）の40％アクリルアミド | 0.75ミリリットル | |
| 100％グリセロール | 1.5ミリリットル | |
| 蒸留水 | 41.5ミリリットル | |
| 過硫酸アンモニウム25％ | 250ミリリットル | |
| TEMED | 75ミリリットル | |
| 4％STACSDS-PAGEのための王ジェル（6ミリリットル） | ddH 2 O | 4.1ミリリットル |
| 30％アクリルアミド | 1.0ミリリットル | |
| 1.0 Mトリス | 0.75ミリリットル | |
| 10％SDS | 60μlの | |
| 10％APS | 60μlの | |
| TEMED | 6μlの | |
| SDS-PAGEのために12％分離ゲル（10ml）で | ddH 2 O | 3.3ミリリットル |
| 30％アクリルアミド | 4.0ミリリットル | |
| 1.5 Mトリス | 2.5ミリリットル | |
| 10％SDS | 100μlの | |
| 10％APS | 100μlの | |
| TEMED | 4μlの |
バッファの表2の組成物。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ヒト胎盤機能と開発に関する研究が大幅に様々な胎盤細胞集団の分離を最適化することを目的としたプロトコルによって改善されました。最もよく研究さ胎盤細胞集団の一つは研究が大幅に効率的で信頼性の高い分離を可能にする最適化されたプロトコルから恩恵を受けている、絨毛細胞栄養芽層のまま。これはさらに、そのようなトランスフェクションおよびプロモーターの研究などの実験の数を可能にしました。前述のプロトコル3を使用して、一次絨毛細胞栄養芽層の純粋な集団を得ることができます。 CK-7細胞栄養層で発現される中間フィラメントタンパク質です。このタンパク質に対するモノクローナル抗体は、胎盤10からのそれらの単離後に、この栄養膜集団の純度を決定するために使用されます。調製物は、細胞の96％は、CK-7陽性である場合、純粋であると定義されます。細胞は、その後、トランスフェクションのために直接使用することができます。トランスフェクションプロトコル関与する脂質ベースのアプローチは広く初代細胞11,12に核酸を転送するために使用されます。しかし、いくつかの細胞内脂質製剤の毒性は不利となります。微小穿孔は、最小限の熱、金属イオンの溶出はpH変化、酸化物形成の発生エレクトロポレーション空間として、ピペットチップを用いてエレクトロポレーション技術です。これらの全ては、細胞に有害であることができます。ウェスタンブロット分析により判断されるように、本明細書に提示したデータに基づいて、マイクロポは、脂質ベースのトランスフェクションプロトコルよりもsiRNA送達のためのより効率的なアプローチです。 EMSAのアプローチを用いて、その活性7のための重要な要素を結合することが知られているsyncytinの-2プロモーターの選択された領域に対して設計されたプローブを試験しました。プローブは、単離された細胞栄養層からの核抽出物とインキュベートしました。 図3に示されるように、特定のシグナルが得られました。
異なるプロトコルは、本明細書に記載さ時間近年では最適化されてAVE。しかし、彼らはすべての重要なステップの特定の数に依存し、高品質の細胞栄養芽層の準備、に依存しています。まず第一に、出産後、胎盤は、緩衝液、細胞内に保持する必要があるがわずか5時間溶液に浸漬された後、それらから分離されなければなりません。トリプシンおよびDNアーゼトリートメントも非常に重要であり、慎重に栄養膜準備の品質を最大化するために行われるべきです。それらの単離のために必要な時間の胎盤の絨毛および削減の大規模なスクラブが強く、細胞数の分離の効率をアップグレードすることができ、両方の追加の改善、です。このプロトコルの収率はさらに密接に監視する必要があり、密度勾配ステップ、中に最適な遠心分離によって異なります。適切に管のバランスをとるために失敗すると、また勾配の歪みにつながり、深刻な細胞数が減少します。
トランスフェクションプロトコルは、記述しますD本明細書中に数年間にわたってためにテストされています。マイクロポのために必要な条件は、一般的に簡単ですが、様々な初代細胞のためのトランスフェクションの最適化は、それにもかかわらず、必要とされます。これはまた、トランスフェクトされた核酸（siRNA又はプラスミドDNA）の量を最適化することを含みます。プロトコルは、ここで説明するためにこのように、様々なsiRNAは濃度の最適化を効率的に抑制するsiRNAを同定することをお勧めします。マイクロポ前に細胞ペレットを適切なサスペンション容積、細胞の完全な懸濁液の添加は、トランスフェクション効率に影響する追加の要因です。
EMSA実験はまた、最適化を必要としています。胎盤ドナーと変化する細胞栄養芽層分離効率および純度に関連した不均一性を考慮すると、EMSA実験は、結果を確認するために5回まで繰り返す必要があります。さらに、高い細胞数を有する十分proteを確保することが重要です核抽出物の調製およびタンパク質/ DNA複合体のその後の検出におけるレベルです。さらに、高レベル放射性オリゴヌクレオチドプローブを用意しなければならない、と最近購入した放射性ATPからの新鮮な準備する必要があります。
制限一連の提示プロトコルで強調されなければなりません。これは、第一の分析フローサイトメトリーは、細胞調製物中の合胞体栄養細胞断片の潜在的な存在を評価することができないことが強調される必要があります。他のプロトコルは、フローサイトメトリー、または抗体結合磁気ビーズ13,14の使用を使用してソートするように、この問題を解決するために提案されています。これは、これらの断片は、通常、細胞培養ウェルに付着しないと、多くの場合、細胞洗浄工程の後に除去されることかかわらず、言及されるべきです。提示されたプロトコルの別の制限は、一次絨毛細胞栄養層は、細胞培養において非常に限られた生存時間を有することです。したがって、関係なく、選択された方法、VILの安定なトランスフェクションのLOU細胞栄養芽層は達成できないままになります。 EMSAは、このプロトコルで説明したように、分析し、また、一定の制限を持っています。シグナルの特異性は容易に過剰の非標識オリゴヌクレオチドを用いた競合実験によって評価することができるが、結合した要因は、スーパーシフト信号が得られる特定の転写因子に対する抗体を用いて同定することができます。 EMSA実験はさらに、それはインビトロ DNA-タンパク質相互作用を研究するように限定されるもので残ります。 インビボプロトコールにおけるそのようなChIPアッセイのような、より代表的設定を、用いた実験、およびより最近は、さらに、EMSAの結果を確認するために必要とされます。
栄養膜細胞の単離およびトランスフェクションのために、本明細書に記載されているプロトコルは、特定の遺伝子の一過性のサイレンシングまたは過剰発現は、特定の栄養膜細胞型の機能、増殖または分化における役割を理解するために必要とされる研究のための重要な用途を有しています。また、トランスフェクションの際に、T発現タンパク質のaggedバージョンは、細胞内の追跡に適していると、このような共焦点顕微鏡のような標準的な技術によって分析し、フローサイトメトリーになります。 EMSAプロトコルは、プロモーターの調節と関係がある転写因子に関連する複雑な詳細を研究するために使用することができます。また、この実験的なアプローチは、研究者は胎盤形成不全や絨毛細胞栄養層で発現する遺伝子の変化した規制に関連する特定の疾患の発症に関与する因子を同定することができます。
結論として、ヒト初代細胞栄養芽層が容易に胎盤から単離し、そのようなsiRNAトランスフェクションとEMSAなどの標準プロトコル、に適していることができます。このようなリポフェクション15およびヌクレオ16のような異なるトランスフェクション手順は、利用可能であるが、微小穿孔は、限られたセルドとのアプローチを提供し、孤立した絨毛細胞栄養芽層のsiRNAトランスフェクションのための非常に効率的な方法と思われますATHと比較的低コスト。絨毛細胞栄養芽層の文脈では、この方法は、異なる遺伝子のサイレンシングおよび細胞型の様々な機能または特性のその含意の評価を可能にすべきです。さらに、発現ベクターのトランスフェクションは、このプロトコルを使用しても実現可能であるとするsiRNAベースのアプローチに相補的なデータが得られます。 EMSAに関しては、この技術は、DNアーゼIフットプリント、メチル化干渉アッセイ、クロマチン免疫沈降クロマチン立体構造解析などの代替アプローチと比較した場合に、タンパク質-DNA複合体の評価をより迅速かつ簡単な方法を提供します。したがって、この技術は、分析または他のエンハンサー/サプレッサを含むDNA領域の検査標準プロモーターに貴重なままです。それは機能レベルでの潜在的な意味合いで、遺伝子の調節に関する情報を追加するよう絨毛細胞栄養芽層のための信頼性の高い使用の私達のデモは、重要です。彼らにもかかわらず、文化の中で限られた時間は、一次絨毛細胞栄養芽層は、標準的な研究に適しており、より多くの最近のだけでなく、有益な方法に適応する必要があります。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、カナダの国立科学と工学研究評議会（NSERC）（＃298527）（BB）からの助成金によってサポートされていました。 CTは、制度FAREの奨学金によってサポートされていました。 AVはNSERC・グラハム・ベル博士によってサポートされていました奨学金。 BBは、ヒトRetrovirology（ティア2）にカナダの研究の椅子を開催しました。テキストの改訂で助けをベアトリクスBeisnerに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
