Summary
Этот протокол описывает способ эффективного трансфекции миРНК в свежеизолированных ворсинчатыми cytotrophoblasts человека с использованием microporation и идентификации ДНК-белковых комплексов в этих клетках. Трансфицированные клетки можно контролировать с помощью Вестерн-блоттинга и EMSA анализы в течение времени культивирования 4-дневного периода.
Protocol
Комитет по этике UQAM одобрил эти протоколы, которые в соответствии с руководящими принципами комитета по этике St Luc-больница Клинический центр Университетский-де-Монреаль (Монреаль, Канада). Участники подписали форму информированного согласия.
1. Средний Получение и выделение первичных ворсинок Cytotrophoblasts
- Подготовка культуральной среды для первичных ворсинок cytotrophoblasts человека, дополнив модифицированную Dilbecco среду Eagle (DMEM) с 25 мМ HEPES, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), и 1% пенициллина / стрептомицина. Фильтр приготовленной среды через стерильный фильтр 0,22 мкм и хранить в -20 ° C морозильнике в аликвоты по 50 мл.
- Изолировать первичные ворсинчатых cytotrophoblasts из свежих плацентами следующих стандартных протоколов 3.
- Используя плоскогубцы, снимите плода мембрану из ткани, слегка царапая его, стараясь при этом не удалять ворсинок ткани. ОтрежьОставшиеся плацентарный ворсинки кубиками около 3 х 3 см с помощью скальпеля и ножниц. Тщательно промойте водой, содержащей 0,9% NaCl для удаления материнской крови.
- Держа каждый кубик с плоскогубцами, осторожно удалите ворсинок ткани из оставшихся сосудов и фиброзной ткани с помощью ножниц.
- От 15 до 30 мг ворсинок ткани, переваривать четыре раза в сбалансированном солевом растворе Хэнкса (HBSS) , содержащий трипсин (от 9,6 × 10 5 до 1,8 × 10 6 U; конечная концентрация 1,2 мг / мл) и ДНК - аза I (ДНКазы I) ( конечная концентрация 200 мкг / мл) в течение 30 мин при 37 ° с на водяной бане при непрерывном встряхивании.
Примечание: Используйте 150 мл общий объем для первого переваривания, 100 мл для второго переваривания и 75 мл для двух оставшихся варок.
- Соберите супернатант, содержащий диспергированные клетки и центрифуге при 1250 мкг в течение 15 мин без тормоза. Удалить супернатант и ресуспендирования клеток в 1 мл предварительно нагретой DMEM, содержащей1% пенициллина / стрептомицина.
- Слой диспергированные клетки поверх разрывной 5% - 70% градиентом поливинилпирролидона покрытием диоксида кремния (см таблицу 1 для градиента подготовки) и центрифугировать в течение 23 мин при 507 XG без тормоза. Удалите слой плотности между 1,017 до 1,033 стремлением и собирать слои между 40% и 50% в градиенте с новым пипеткой. Промыть клетки экстенсивно с 10 мл предварительно нагретой DMEM, содержащей 1% пенициллина / стрептомицина.
Примечание: Собранная фракция соответствует плотности между 1.048 и 1.062, которая укрывает трофобласта. - Граф клеток с использованием гемоцитометра. Вкратце, смешать клетки и добавить 10 мкл в новую пробирку микроцентрифужных. Добавьте 10 мкл трипанового синего и осторожно снова перемешать. Оформи клеточной суспензии и заполняют гемоцитометра камеры. Граф клеток под цели 10X.
- Поместите 1 х 10 6 и 4,5 × 10 6 клеток в отдельные пробирки для использования в разделах 1.3 и 2, соответствующиеLY. Семенной оставшихся клеток при плотности 1,5 × 10 6 клеток / лунку в среде , дополненной и культуры DMEM при 37 ° С и 5% СО 2 в течение не более 4 дней для других экспериментов.
- Используя плоскогубцы, снимите плода мембрану из ткани, слегка царапая его, стараясь при этом не удалять ворсинок ткани. ОтрежьОставшиеся плацентарный ворсинки кубиками около 3 х 3 см с помощью скальпеля и ножниц. Тщательно промойте водой, содержащей 0,9% NaCl для удаления материнской крови.
- Оценка чистоты изолированных первичных ворсинок cytotrophoblasts
- Спин 1 х 10 6 из свежеизолированных cytotrophoblasts в микропробирок при 300 х г. Жидкость над осадком сливают и добавляют 1 мл подогретой фосфатно-солевым буферным раствором (PBS). Центрифуга клетки при 300 мкг и удалить PBS путем аспирации.
- Добавить 1 мл холодного метанола к клеткам и инкубируют при -20 ° С в течение 20 мин. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и удаления метанола путем аспирации.
Внимание: Используйте канистру маску, защитные очки и резиновые перчатки при работе с метанолом. - Добавить 1 мл PBS при комнатной температуре в регидратации клеток, центрифугируют при 300 х г и удалить PBS с помощью аспирации.
- Инкубируйте клетки в PBS, содержащих FBS (1:50 [v / v] разбавления) и FcRблокирующий реагент (1:10) в течение 45 мин при комнатной температуре, чтобы исключить неспецифическое связывание.
- Промыть два раза с 500 мкл PBS при комнатной температуре, центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и удалить PBS путем аспирации. Ресуспендируют клеток в 100 мкл PBS при комнатной температуре.
- Инкубируйте клетки с мышиными моноклональными изотиоцианат флуоресцеина (FITC) -conjugated анти-человеческого клона цитокератина-7 антитела LP5K (1: 200) или контроль изотипа неспецифического антитела в PBS, содержащем 0,2% БСА в течение 45 мин при комнатной температуре темноте. Промыть клетки в PBS.
- Анализ клеток методом проточной цитометрии 3. С помощью клеточных препаратов, которые демонстрируют как минимум 96% СК-7-положительных клеток с помощью проточной цитометрии для дальнейших экспериментов.
2. миРНК Трансфекция человека первичных ворсинок Cytotrophoblasts
- Трансфекция первичных ворсинок cytotrophoblasts человека с использованием устройства microporation
- Подготовка 6-луночные планшеты, содержащие2 мл среды DMEM, дополненной для инкубации microporated клеток.
- После выделения первичных cytotrophoblasts (смотри раздел 1.2), возьмите аликвоты клеток в суспензии и определяют количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Перенесите 1,5 х 10 6 клеток в микроцентрифужных трубки и гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Промывают клетки с 1 мл PBS Дульбекко (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -бесплатно) и осаждения клеток центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Удалить супернатант и ресуспендирования клеток осторожно в 100 мкл буфера для ресуспендирования.
Примечание: Во избежание перегорания клеточной суспензии в течение более 15-30 мин при комнатной температуре, чтобы максимизировать жизнеспособность клеток и эффективность трансфекции. - Добавьте 300 нг Syncytin-2 миРНК (или одновременно зашифрованным миРНК) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и аспирация клеток-миРНК смеси с использованием 100 мкл трансфекции пипетку. Вставитьпипетка на станцию (см перечень материалов) и подвергать клетки к 1300 V одиночного импульса 30 мс.
- Сразу передачи клетки на 6-луночные планшеты (приготовленным на стадии 2.1.1), содержащих 37 ° С предварительно нагреты дополненной среде, чтобы избежать повреждения клеток.
- Повторите шаги 2.1.5 и 2.1.6 для остальных образцов.
- Осторожно покачайте планшет в течение 30 с, чтобы обеспечить равномерное распределение клеток. Инкубируйте планшет при 37 ° С в увлажненной СО 2 инкубаторе в течение 24 до 48 часов. Refresh культуральной средой через 24 часа после трансфекции.
- Оценка эффективности трансфекции методом Вестерн-блот-анализа (см шаги с 3 по 6).
- Липофекция миРНК в первичных cytotrophoblasts человека
- После выделения ворсинчатыми cytotrophoblasts, семена клеток при плотности 1,5 × 10 6 клеток на лунку в 6-луночные планшеты в 2 мл культуральной среды и инкубируют в течение 18 часов.
- Развести 300 нг Syncytin-2-специфической миРНК (или контрольно-вскарабкалсямиРНК) и 5 мкл на основе липида реагента для трансфекции в отдельных 1,5 мл пробирки в общем объеме 10 мкл и антибиотикам не содержащей сыворотки среде. Инкубировать в течение 5 мин.
- Смешайте разбавленных реагентов и инкубировать в течение еще 20 мин при комнатной температуре с образованием комплекса трансфекцию. Добавьте 90 мкл и антибиотикам среде без сыворотки к смеси до конечного объема 100 мкл.
- Удалить культуральной среды из 6-луночные планшеты (этап 2.2.1). Добавляют 2 мл свежей среды и 100 мкл трансфекции смеси в каждую лунку. Инкубируйте клетки при 37 ° С в СО 2 инкубаторе в течение 24 до 48 часов. Refresh культуральной средой через 24 часа после трансфекции.
- Оценка эффективности трансфекции методом Вестерн-блот-анализа (см шаги с 3 по 6).
3. Получение лизатов из всей клетки культуры
- Выньте материал и промойте каждую лунку (от шагов , 2.1.8 и 2.2.4) с использованием предварительно нагретую DPBS (Mg 2+, Ca 2+ свободный), Аспирируйте DPBS и добавляют 500 мкл 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Инкубируют в течение 1-3 мин при температуре 37 ° С в СО 2 инкубаторе. Остановка обработки трипсином путем добавления 500 мкл сыворотки, содержащей ростовую среду.
Примечание: Используйте объем соответствующие средства массовой информации в соответствии с типом опоки / блюдо: 1 мл на 10 7 клеток / 100 мм блюдо / 150 см 2 колбу; 0,5 мл на 5 × 10 6 клеток / 60 мм блюдо / 75 см 2 колбу. - Передача клеток в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Промывают клетки с ДЗФР (Mg 2+, Ca 2+ -бесплатно) и Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре.
- Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул. Поместите пробирку на льду. Ресуспендируют осадок в 50-200 мкл охлажденного льдом Радио-иммунопреципитации анализ (РИПО) буфера (смотри таблицу 2 для буферной композиции) , содержащие свеже добавитьред протеазы и ингибиторы фосфатазы на 1x конечной концентрации. Вкратце, вихревые трубки и оставьте на льду в течение 30 мин.
- Спин при 16000 х г в течение 20 мин при температуре 4 ° С. Аккуратно положите трубку на льду. С помощью пипетки переносят супернатант в свежую предварительно охлажденной трубки микроцентрифужных держали на льду. Выбросите осадок.
4. Подготовка ядерных экстрактов из культивируемых клеток
- Для каждой скважины (этап 1.2.5), промыть культивируемые cytotrophoblasts дважды 1 мл подогретого ДЗФР (Mg 2+, Ca 2+ свободный). Отберите DPBS и добавить 500 мкл 0,25% трипсина / ЭДТА. Инкубируют в течение 1-3 мин при температуре 37 ° С в СО 2 инкубатор и прекратить лечение трипсина путем добавления 500 мкл сыворотки , содержащей ростовую среду.
- Передача клеток в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки с ДЗФР (Mg 2+, Ca 2+ -Free) и гранул клеток путем центрифугированияпри 300 х г в течение 2 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите все супернатант, не нарушая гранул и поместите трубку на льду.
- Извлечение ядерного белка в соответствии с инструкциями изготовителя. Определение концентрации белка в каждом образце с использованием количественного анализа белка (Bradford или анализа бицинхониновой кислоты (BCA)).
5. Подготовка проб и электрофорез
- Определить концентрацию белка для каждого клеточного экстракта с использованием анализа Количественную оценку белка (например, Брэдфорд 8 или 9 ВСА).
- В соответствии с инструкциями производителя (если антитела могут быть использованы в работе по уменьшению и денатурации условий), добавьте равный объем 2х Laemmli буфера выборок (таблица 2) до 20-30 мкг общего белка.
- Клеточные лизаты кипеть при 100 ° С в течение 5 мин. Аликвоты 50-100 мкл лизата, чтобы избежать повторных циклам замораживания / оттаивания и хранить оставшиеся пробирки при -20 ° С для последующего использования. В то время как образцы нагреваются, подготовить 1 л 1x рабочего буфера (таблица 2).
- Спин образцов при 16000 мкг в течение нескольких секунд и поместите их на лед.
- Нагрузку , равную количество белка в каждую лунку 12% SDS-PAGE гель (смотри таблицу 2 для гелевой композиции), а также маркер молекулярной массы. Выполнить гель течение от 1 до 2 ч при 100 В.
6. Перенос белка из геля на мембрану
- Активация поливинилиденфторид (ПВДФ) мембрану с метанолом в течение 1 мин и полоскание с раздаточной 1x буферным раствором / 10% метанола. В соответствии с инструкциями изготовителя, передачи в течение 30 мин до 1 ч в зависимости от размера белка.
Примечание: эффективность передачи может быть оценена с помощью Понсо Red окрашивания перед стадией блокирования.
7. Антитело Окрашивание
- Блок мембраны в течение 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 ° С с использованием 5% блокирующего раствора.
- Инкубируйте мембрану с анти-Syncytin-2 антитела (4 мкг / мл; 1: 5000) , 6 или с анти-глицеральдегид-3-фосфат - дегидрогеназы (GAPDH; 0,4 мкг / мл; 1: 500) в 5% блокирующего раствора в течение ночи при 4 ° С (анти-Syncytin-2) или в течение 45 мин при комнатной температуре. Промыть мембрану три раза в Трис-солевом буфере (Tween TBST, см таблицу 2 буферной композиции) в течение 5 мин.
- Инкубируйте мембраны с соответствующим пероксидазой хрена (HRP) анти-кроличий или анти-мышь (1: 10000) в 5% блокирующем буфере в TBST при комнатной температуре в течение 1 часа. Промыть мембрану три раза в TBST в течение 5 минут, а затем промыть в TBS. Обнаружение сигналов с использованием хемолюмияесценции на основе промокательной субстрата.
8. радиоактивной из одноцепочечный олигонуклеотид
- реакции фосфорилирования
- В пробирку микроцентрифужных, добавить 50 нг передней олигонуклеотида наряду с 1x T4 буфера полинуклеотид-киназы, 1 UТ4 полинуклеотид - киназы и 20 мкКи (γ- 32 P) АТР и составляют объем реакционной смеси до 20 мкл с нуклеазы без воды.
- Инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин. Остановить реакцию добавлением 5 мкл 0,5 М ЭДТА. Составляют объем до 50 мкл с нуклеазы без воды.
- Удаление неинкорпорированных нуклеотидов из олигонуклеотидов
- Подготовьте колонку G-25 , уравновешенную TE буфера (таблица 2) , следуя инструкциям изготовителя. Поместите колонку в свежей ДНКазой свободной 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
- Медленно добавляют 50 мкл зонда (из стадии 8.1.2) через смолу, стараясь не нарушить слой смолы. Спин в течение 2 мин при 350 мкг для сбора очищенного образца в центрифужную пробирку на 1,5 мл. Промыть колонку G-25 с 36 мкл нуклеазы без воды и спина в течение 2 мин при 350 мкг, чтобы собрать его в микроцентрифужных трубки.
- Скрещивание с комплементарной цепью олаigonucleotide
- Перенос радиоактивно меченого зонда (86 мкл) в 1,5 мл трубки микроцентрифужных и добавляют 200 нг обратного олигонуклеотида и 1 раз в буфере для отжига (таблица 2). Тепло 5 мин при 95 ° С и оставляют на ночь при комнатной температуре для охлаждения.
- Подготовить нерадиоактивных двухцепочные олигонуклеотиды добавлением 50 нг немеченного прямого и обратного олигонуклеотида и 1 раз в буфере для отжига в 1,5 мл трубки микроцентрифужных. Составляют объем до 100 мкл с нуклеазы без воды. Тепло и держать при комнатной температуре, как описано в пункте 8.3.1.
9. Подготовка неденатурирующем полиакриламидном геле для EMSA
- Подготовьте 4% нативный гель (10 х 12 см) с 1,5 мм пространства-расчески (смотри таблицу 2 для гелевой композиции). Очистите все стеклянные пластины с использованием дистиллированной воды.
Примечание: Очень важно, чтобы пластины быть полностью свободным от ионного детергента, как SDS. - Сразу рнаше решение акриламид между пластинами и позволяют полимеризации продолжить (примерно 30 мин).
- Соберите устройство электрофореза и заполнить бак с 0,5 × КЭ. Предварительно запустить гель в течение 30 мин до 1 ч при 150 В до загрузки образца.
10. ДНК реакции связывания
- В 1,5 трубки микроцентрифужных мл, добавляют 10 мкг ядерного экстракта (стадия 4.3) , в 1x Gel Смена буфера для связывания (таблица 2) и составляют конечный объем до 10 мкл с нуклеазы без воды. В качестве контроля, подготовить трубку, без ядерного экстракта. Для реакции конкуренции, добавить 1 мкл холодной неспецифической или специфической двухцепочечной олигонуклеотида (этап 8.3.2).
- Добавить 1 мкл радиоактивного зонда со стадии 8.3.1 к каждой реакции. Инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре в течение 20 мин. Добавляют 1 мкл 10х буфера гель загрузки на реакцию и загружать каждую пробу на гель, приготовленный в разделе 9.
- Выполнить гель в течение 1 1/2 до 2 часов при температуре 150 В. После миграции, обернуть гель и стекло в полиэтиленовую пленку и положение в кассете экспозиции под люминесцентным экраном. Оставьте кассету при температуре 4 ° С в течение 24 ч.
- Удалить экран из кассеты экспонирования и вставить в устройство формирования изображения люминофора для сканирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Свежий плацента от срока беременности были использованы для выделения первичных ворсинчатых cytotrophoblasts человека провести множество экспериментов, представленных в разделе протокола. После их изоляции, мы сначала проанализировали чистоту cytotrophoblasts через использование цитокератин-7 маркера (рисунок 1). Клеточные препараты , таким образом , окрашивали с использованием моноклонального анти-Цитокератин-7 антитела. На рисунке 1 представляет результаты типичного эксперимента После очистки первичных ворсинок cytotrophoblasts, анализировали стандартным проточной цитометрии. После стадии градиента плотности,> 97% клеток (в данном случае, 99%) положительно окрашивали на цитокератином-7 в стандартных экспериментах, демонстрируя тем самым очень высокую степень эффективности в очистке этого типа клеток.
После того, как их выделения, первичные cytotrophoblasts человека могут быть непосредственно использованы для TRAnsfection. Два разных протоколов , были оценены, то есть, microporation и на основе липидов трансфекции. Оба протокола были протестированы с siРНК, специфичную Syncytin-2 мРНК и по сравнению с зашифрованным миРНК (отрицательный контроль). Эффективность трансфекции была следующей оценивали с помощью Вестерн-блот-анализа. Результаты подтвердили , что экспрессия Syncytin-2 был значительно подавлен в цитотрофобласта полученных экстрактов на microporation (рисунок 2). С другой стороны, никакого существенного глушение не было отмечено, когда siРНК, трансфицировали реагентом для трансфекции на основе липида.
Мы также проводили эксперименты EMSA на свежеизолированных cytotrophoblasts. синтезировали радиоизотопный зонд, который возник из области промотора Syncytin-2. Синтезированный зонд (называемый WT, 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') было показано ранее для связывания CREB связанных 7 факторов транскрипции. При наличии ядерного ЕхПИ действует от 24 до 48 ч, культивированных ворсинчатыми cytotrophoblasts, то Syncytin-2-промотор-полученный зонд показал наличие двух ДНК-белковых комплексов. Добавление 100x холодного WT олигонуклеотида конкурировали за образование комплекса, в то время как ни одного подобного конкуренции с избытком холодной несвязанной олигонуклеотида (мышь нервном гребне Enhancer 2, 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') не наблюдалось, что подтверждает специфичность обоих сигналов ( Рисунок 3).
Рисунок 1. Оценка чистоты первичных ворсинок cytotrophoblasts через проточной цитометрии. Свежевыделенные препараты ворсинчатыми cytotrophoblasts впервые были проницаемыми , а затем метили управления изотипа антитела (красная линия) или моноклональное антитело , специфичное для цитокератина-7 (черная линия). Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. ле / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Сравнение эффективности трансфекции миРНК между липидной основе трансфекции и microporation. Свежевыделенные ворсинчатые cytotrophoblasts трансфицировали 300 нг Syncytin-2-специфических миРНК против зашифрованным миРНК управления с использованием липидной основе реагента или microporation. (A) западные анализы блот проводили на клеточных экстрактах из каждого состояния трансфекцией с использованием анти-Syncytin-2 и анти-GAPDH антитела. (Б) Уровни Syncytin-2 протеина из западных анализов блот количественно определяли с точки зрения интенсивности полос после нормализации с соответствующими GAPDH сигналы (Отрезки ошибок определяются как SD, *** р <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. ДНК-белковых комплексов , идентифицированные с помощью анализа EMSA. Ядерные экстракты из первичных ворсинок cytotrophoblasts культивировали в течение 24 или 48 часов инкубировали с зондом WT , соответствующий промоторной области Syncytin-2 с избытком (100х) специфических или неспецифических или без холодные олигонуклеотиды. ДНК-белковые комплексы были разделены на миграцию на родном геле. Конкретные сигналы и свободные зонды обозначены на правой стороне геля. WT зонда инкубируют в отсутствие ядерного экстракта был также использован в качестве отрицательного контроля. CT NE = цитотрофобласта экстракты ядер. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| % От Перколла финала | Объем перколлом (90%) (мл) | Объем HBSS (мл) |
| 70 | 2,33 | 0,67 |
| 65 | 2,17 | 0,83 |
| 60 | 2.00 | 1,00 |
| 55 | 1,83 | 1.17 |
| 50 | 1,67 | 1,33 |
| 45 | 1,50 | 1,50 |
| 40 | 1,33 | 1,67 |
| 35 | 1.17 | 1,83 |
| 30 | 1,00 | 2.00 |
| 25 | 0,83 | 2,17 |
| 20 | 0,67 | 2,33 |
| 15 | 0,50 | 2.50 |
| 10 | 0,33 | 2,67 |
| 5 | 0,17 | 2,83 |
Таблица 1. 5% -70% Установка поливинилпирролидона покрытием кремнезема градиент.
| буфер | Состав | Комментарии / Описание |
| PBS 1X | 0,9 мМ CaCl 2, 2,7 мМ KCl, 1,5 мМ KH 2 PO 4, 0,5 мМ MgCl 2, 136,9 мМ NaCl и 0,8 мМ Na 2 HPO 4 | |
| РИПО буфера | 150 мМ NaCl, 1,0% NP-40, или 0,1% Тритона Х-100, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS (додецилсульфата натрия), 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0 | |
| Laemmli буфера для образца | 4% ДСН, 10% 2-mercaptoethanoл, 20% глицерина, 0,004% бромфенол синий, 0,125 М Трис-HCl, рН 6,8 | |
| 10x работает буфер | 25 мМ Трис-основание, 190 мМ глицина, 0,1% SDS | |
| буфер передачи 10x | 25 мМ Трис-основание, 192 мМ глицин | |
| буфер TBST 1x | 10 мМ Трис-HCl, 15 мМ NaCl, 0,05% твин-20 при рН 7 | Хорошо перемешать и отфильтровать. Неспособность фильтра может привести к "пятнистость" мембраны. |
| Блокирующий буфер | 5% молока или БСА (бычий сывороточный альбумин) добавляли к TBST 1x буфер | |
| TE буфера | 10 мМ Трис-HCl (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА | |
| Отжиг буфер | 1 М NaCl, 50 мМ Трис-HCl , рН 7,5, 100 мМ MgCl 2, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ | |
| 5x гель сдвиг буфера для связывания | 20% глицерол, 5 мМ MgCl 2, 2,5 мМ ЭДТА, 2,5 мМ ДТТ, 250 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5) и 0,25 мг / мл поли (ди-ПСТ). | |
| Загрузка буфера | 250 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 0,2% бромфенолового синего и 40% глицерина | |
| КЭ 5x | Растворить 54 г трис-основани и 27,5 г борной кислоты в 1 л деионизированной воды, которая включает в себя 20 мл 0,5 М ЭДТА, рН 8 | |
| 4% нативный гель | буфер КЭ 5x | 6,0 мл |
| 29: 1 акриламид / бис-акриламид (30% вес / об) | 10 мл | |
| 40% акриламид (вес / объем) | 0,75 мл | |
| 100% глицерина | 1,5 мл | |
| Дистиллированная вода | 41,5 мл | |
| Аммоний персульфат 25% | 250 мл | |
| TEMED | 75 мл | |
| 4% StacKing Гель (6 мл) для SDS-PAGE | DDH 2 O | 4,1 мл |
| 30% акриламид | 1,0 мл | |
| 1,0 М Трис | 0,75 мл | |
| 10% ДСН | 60 мкл | |
| 10% APS | 60 мкл | |
| TEMED | 6 мкл | |
| 12% Разделительный гель (10 мл) для SDS-PAGE | DDH 2 O | 3,3 мл |
| 30% акриламид | 4,0 мл | |
| 1,5 М Трис | 2,5 мл | |
| 10% ДСН | 100 мкл | |
| 10% APS | 100мкл | |
| TEMED | 4 мкл |
Таблица 2. Состав буферов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Исследования в области плацентарной функции и человеческого развития были значительно улучшены с помощью протоколов, направленных на оптимизацию изоляции различных популяций плацентарных клеток. Одним из наиболее хорошо изученных плацентарной клеточной популяции остается ворсинчатого cytotrophoblasts, изучение которых значительно извлекли выгоду из оптимизированных протоколов, позволяющих эффективную и надежную изоляцию. Это позволило в дальнейшем ряд экспериментов, таких как трансфекция и промоторов исследований. С помощью описанного выше протокола 3, могут быть получены чистые популяции первичных ворсинок cytotrophoblasts. CK-7 представляет собой промежуточный белок нить, которая выражается в cytotrophoblasts. Моноклональные антитела против этого белка, используются для определения чистоты этого трофобласта населения после их выделения из плаценты 10. Препараты определяются так, чтобы быть чистым, когда 96% клеток являются позитивными для CK-7. Клетки затем могут быть непосредственно использованы для трансфекции. протоколы Трансфекциявключая основанные на липидах подходы широко используются для передачи нуклеиновых кислот в первичные клетки 11,12. Тем не менее, токсичность липидный препарат в некоторых клетках становится недостатком. Microporation представляет собой технологию электропорации с использованием наконечника пипетки в качестве электропорации пространства, который создает минимальную тепло, ионы металлов, растворение, изменение рН и образование оксида; все из которых могут быть вредными для клеток. На основании данных, представленных в настоящем документе, microporation представляет собой более эффективный подход для доставки миРНК, чем на основе липида протокола трансфекции, о чем можно судить по Вестерн-блот-анализа. Используя подход EMSA, зонд , предназначенный против выбранной области промотора Syncytin-2 , который , как известно, связывают важные факторы для его деятельности 7 был протестирован. Зонд инкубировали с ядерным экстрактом из изолированных cytotrophoblasts. Как показано на рисунке 3, были получены специфические сигналы.
Различные протоколы, описанные здесь чпр оптимизировано в последние годы. Тем не менее, все они опираются на препараты цитотрофобласта высокого качества, которые зависят от определенного числа критических шагов. В первую очередь, после родов, плацента должны храниться в буферном растворе и клетки должны быть изолированы от них не более чем через 5 часов после погружения в раствор. Трипсин и ДНКазы лечения также имеют большое значение и должны быть тщательно предприняты, чтобы максимально повысить качество подготовки цитотрофобласта. Обширные скрубберах плацентарный ворсинок и сокращение времени, необходимого для их изоляции являются дополнительные улучшения, которые могут сильно модернизируют эффективность изоляции числа клеток. Выход этого протокола дополнительно зависит от оптимального центрифугирования во время стадии градиента плотности, который следует тщательно контролировать. Неспособность правильно сбалансировать трубы также приведет к искажению градиента и значительно сократить число клеток.
Протокол трансфекции описываютd здесь, была протестирована на протяжении нескольких лет. Хотя условия, необходимые для microporation, как правило, просты, оптимизация трансфекции для различных первичных клеток, тем не менее требуется. Это также включает в себя оптимизацию количества трансфицированных нуклеиновой кислоты (миРНК или плазмидной ДНК). Таким образом, для протокол, описанный здесь, оптимизация различных концентраций миРНК рекомендуется идентифицировать эффективно налагая гнет миРНК. Добавление соответствующего объема подвески к осадку клеток до microporation и полной суспензии клеток, являются дополнительными факторами, которые влияют на эффективность трансфекции.
Эксперименты EMSA также необходимость оптимизации. Учитывая разнородность, связанный с донорами Плацента и различной цитотрофобласта эффективности изоляции и чистотами эксперименты EMSA необходимо повторять до 5 раз, чтобы подтвердить результаты. Кроме того, имея высокое количество клеток имеет важное значение для обеспечения достаточного PROTEв уровнях подготовки ядерного экстракта и последующего обнаружения комплексов белок / ДНК. Кроме того, высоко радиоактивные олигонуклеотидные зонды должны быть подготовлены и должны быть подготовлены свежие из недавно приобретенного радиоактивного АТФ.
Ряд ограничений следует подчеркнуть, в представленном протоколе. Это в первую очередь необходимо подчеркнуть, что проточная цитометрия анализ не может оценить потенциальное присутствие фрагментов syncytiotrophoblast в клеточных препаратах. Другие протоколы были предложены , чтобы решить эту проблему, например, сортировка с использованием проточной цитометрии или использование связанных антител магнитных шариков 13,14. Следует отметить, однако, что эти фрагменты обычно не прилипать к клеточной культуры лунок и часто удаляются после стадии промывки клеток. Другим ограничением представленному протоколу является то, что первичные ворсинчатые cytotrophoblasts имеют очень ограниченное время выживания в культуре клеток. Следовательно, независимо от выбранного способа, стабильной трансфекции дерЛоус cytotrophoblasts останется недостижимой. EMSA анализ, как описано в данном протоколе, также имеют определенные ограничения. Хотя специфичность сигналов легко может быть оценена с помощью экспериментов конкуренции с избыток немеченного олигонуклеотиды, связанные факторы могут быть идентифицированы только с использованием антител против специфических факторов транскрипции, в результате supershifted сигналов. Эксперименты EMSA , кроме того , по- прежнему ограничены , как это в пробирке исследования ДНК-белковых взаимодействий. Эксперименты с более репрезентативными параметрами, такими как ChIP анализа, а также более поздние в протоколах естественных условиях необходимы для дальнейшего подтверждения результата EMSA.
Описанные в настоящем документе для цитотрофобласта изоляции и трансфекцией протоколы имеют важные приложения для исследований, в которых переходная глушителей или избыточная экспрессия специфических генов, необходимых для понимания их роли в функции, пролиферации или дифференцировки определенного типа трофобласта клеток. Кроме того, при трансфекции, тagged версии экспрессированных белков будут пригодны для внутриклеточного отслеживания и анализа с помощью стандартных методик, таких как конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. Протокол EMSA может быть использован для изучения сложных деталей, относящихся к регуляции промотора и замешанных факторов транскрипции. Кроме того, этот экспериментальный подход позволит исследователям выявить факторы, участвующие в развитии некоторых заболеваний, связанных с дефицитом плацентации и измененном регуляции генов, выраженных в ворсинчатыми cytotrophoblasts.
В заключение, первичные cytotrophoblasts человека могут быть легко изолированы от плаценте и поддаются стандартным протоколам, таким как миРНК трансфекции и EMSA. Хотя различные процедуры трансфекции, такие как липофекции 15 и nucleofection 16 доступны, microporation кажется очень эффективный метод миРНК трансфекции изолированных ворсинчатыми cytotrophoblasts, предлагая подход с ограниченным клеток деATH и относительно низкая стоимость. В контексте ворсинчатыми cytotrophoblasts, такой подход должен позволять глушителей различных генов и оценку их последствий в различных функций или характеристик типа клеток. Кроме того, трансфекция векторов экспрессии также возможно с использованием этого протокола и даст дополнительные данные для подхода на основе миРНК. Что касается EMSA, этот метод обеспечивает более быстрый и простой метод оценки комплексов белок-ДНК по сравнению с альтернативными подходами, такими как ДНКазы I футпринтинга, анализа интерференции метилирования, иммунопреципитации хроматина и хроматина конформации анализов. Следовательно, этот метод остается ценным в стандартный промотор анализа или испытания любых других / регионах ДНК-супрессоров, содержащие энхансер. Наша демонстрация его надежного использования для ворсинок cytotrophoblasts имеет важное значение, поскольку это добавляет информацию о регуляции генов, с возможными последствиями на функциональном уровне. Несмотря на ихограниченное время в культуре, первичные ворсинчатые cytotrophoblasts подходят для стандартных исследований и должны быть адаптированы к более поздние, а также информативных методов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантом Национального и технических наук Научно-исследовательский совет Канады (NSERC) (# 298527) (BB). КТ была поддержана институциональной FARE науки. AV была поддержана Ph.D. NSERC Грэм Белл стипендия. BB провели исследования Канады кресло в ретровирусологии человека (уровень 2). Благодаря Беатрикс Beisner за помощь в пересмотре текста.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
