Abstract
Dyrkede cardiomyocytes kan brukes til å studere kardiomyocytt biologi ved hjelp av teknikker som er komplementære til in vivo systemer. For eksempel, renhet og tilgjengelighet av in vitro kultur gir god kontroll over biokjemiske analyser, live bildebehandling og elektrofysiologi. Langsiktig kultur cardiomyocytes tilbyr tilgang til flere eksperimentelle tilnærminger som ikke kan gjennomføres på kort sikt kulturer. For eksempel in vitro undersøkelse av dedifferentiation, cellesyklus re-entry, og celledeling har så langt stort sett vært begrenset til rotte cardiomyocytes, som synes å være mer robust i langsiktig kultur. Men tilgjengeligheten av en rik verktøysett av transgene mus linjer og velutviklede sykdomsmodeller lage muse systemer attraktivt for hjerteforskning. Selv om flere rapporter finnes av voksen mus kardiomyocytt isolasjon, noen studier viser deres langsiktige kultur. Presenteres her, er en steg-for-trinn metode forisolasjon og langsiktig kultur for voksne mus cardiomyocytes. Først blir retrograd Langendorff-perfusjon brukes for effektivt å fordøye hjerte med proteaser, etterfulgt av gravitasjonssedimentering rensing. Etter en periode med dedifferentiation etter isolasjon, cellene gradvis legge til kultur og kan dyrkes i flere uker. Adenovirus cellelysat brukes for effektivt å omsette de isolerte kardiomyocytter. Disse metodene gir en enkel, men kraftig modellsystem for å studere hjerte biologi.
Introduction
Dyrkede cardiomyocytes blir ofte brukt for å overvåke celle oppførsel i en godt kontrollert miljø in vitro. For eksempel kan morfologiske, elektriske, biokjemiske eller mekaniske celle egenskaper studeres på konstruerte underlag, 1,2 i definerte medier, og som svar på bioteknologiske legemidler, peptider, genregulering, tre eller elektrisk stimulering. 4 Den cellulære innhold kan også styres ved hjelp av definerte ko-kulturer. 5 Disse in vitro forsøk er nyttige i store medikament eller genetiske skjermer og komplement in vivo metoder for forskjellige typer av undersøkelser som involverer kardiomyocytt biologi.
Langsiktig kultur gjør eksperimentelle veier som krever lengre tid for å oppnå fenotypisk endring. Et betimelig eksempel er at av voksne pattedyr kardiomyocytt spredning, hvor dedifferentiation, cellesyklus re-entry, og celledeling er vanligvis studert over segVeral dager til uker. 6,7 Her letter den utvidede kultur tid genetisk manipulasjon, 7,8 funksjonell dedifferentiation (f.eks sarcomeric demontering) 9 og potensielt transkripsjonen dedifferentiation. 6 Etterfølgende cellesyklus re-entry og celledeling krever enda lengre kultur perioder å observere, spesielt hvis flere runder med delingen er den eksperimentelle mål. Betydningen av cardiomyocyte celle-syklus er sentral i flere nyere viktige vitenskapelige arbeider i hjertet gjenfødelse, der dedifferentiation og spredning av eksisterende cardiomyocytes har vist ansvarlig for hjerte regenerering i sebrafisk og neonatale mus. 10-12 Dermed muligheten å stimulere dedifferentiation og cellesyklus re-entry i pattedyr voksne cardiomyocytes fortsatt et sentralt spørsmål i menneskets hjerte regenerering 13-15
I n vitro eksperimenter studerer cellesyklus hos pattedyr cardiomyocytter har hovedsakelig benyttet rotte kilder, på grunn av deres relativt enkle langvarig kultur i forhold til musemodeller. 16 Imidlertid, murine systemer gir en rik kilde av velkarakteriserte transgene verktøy og sykdomsmodeller som er nyttige i både in vitro og in vivo protokoller. For eksempel har Cre-baserte avstamning aktiveres sporing identifisering av eksisterende cardiomyocytes som en kilde til regenererende myokard i neonatal mus hjerte in vivo. 12 In vitro studier av avstamning-spores neonatale mus cardiomyocytes har aktivert undersøkelse av interaksjoner med stromal cellene gjennom ko-kultur med fibroblaster. 5 imidlertid, på grunn av dens utfordringer og 17 noen rapporter foreligger i isolasjon og langtidskultur av voksne mus kardiomyocytter. 18,19
Isolasjon av levedyktige voksen mus cardiomyocytes for kortsiktig kultur alene er kjent for å være en utfordrende oppgave. dette protocol gir steg-for-steg instruksjoner om hvordan man skal oppnå levedyktige cardiomyocytes fra voksne mus som kan brukes for både kortsiktige og langsiktige undersøkelser. Cardiomyocytes isolert ved hjelp av denne protokollen kan effektivt transduced med adenovirus vektorer 20,21 og dyrket i flere uker. Disse metodene gir et kraftig system for å studere kardiomyocytt biologi in vitro.
Metodene som er beskrevet her er basert på flere elementer fra tidligere arbeider bruker varianter av Langendorff retrograd perfusjon. 18,22 Selv om flere protokoller har blitt publisert på isolering av voksne mus cardiomyocytes for kortsiktig kultur og studere, 23-25 fordelen av denne protokollen er evnen til kultur den isolerte cardiomyocytes langsiktig. Dette vil være nyttig ved undersøkelsen av cellulære prosesser som involverer ektopisk genekspresjon og som krever lengre tidsrom, for eksempel i cellulære omprogrammering strategier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer beskrevet her har blitt godkjent av Institutional Animal bruk og vedlikehold Utvalget ved University of California, San Francisco.
MERK: Kort, etter utpakking av hjertet fra musen thorax, er koronar retrograd perfusjon brukes til å effektivt fordøye den ekstracellulære matrise med collagenase og protease XIV. Ventriklene blir deretter isolert, mekanisk dissosiert og filtrert inn i en enkeltcellesuspensjon. Gravitasjonssedimentering er utført for å isolere kardiomyocytter, som er atskilt fra stromale celler som fibroblaster og endotelceller ved deres høye tetthet. De rensede cardiomyocytes kan dyrkes i flere uker på laminin belagt polystyren og omformet med adenovirus genet vektorer.
1. kardiomyocytt Isolation
- Forbered Buffere, Kirurgisk Station og Perfusjons Apparatus
- Forbered buffere og media ifølge Table en.
- Slå på sirkulerende vannbad, sett inngangs temperatur slik at produksjonen av oppvarmet vannkappen når en temperatur på 37 ° C.
- Ren perfusjon systemet ved spyling med 70% etanol. Og deretter fjerne alle spor av ethanol fra systemet ved spyling med flere volumer av sterilt vann.
- Laste perfusjon system med perfusjon buffer (tabell 1). Først renne vann fra systemet, og deretter skylle med 2 volumer av perfusjon buffer. Deretter fyller dødrom med perfusjon buffer slik at den indre søyle av varmen kappen er fylt med perfusjon buffer, men den debubbling kammeret er tomt.
TIPS: Sørg ingen luftbobler i linjen under debubbling kammeret. For å fjerne gjenstridige bobler, engasjere alle stoppekraner og la press for å bygge seg opp inne i kø for et par sekunder. Deretter slipper nedre stoppekran, slik at det høye trykket perfusjon buffer for å stråle ut av stikkontakten; rask flyt og turbulence vil hjelpe løsne bobler som er fanget i nærheten av perfusjon utløp. - Forbered en sprøyte med nål som skal brukes til aorta kanylering. Feste en 18 G butt nål til en 1 ml sprøyte fylles med perfusjon buffer. Fjern luftbobler og fikse den sprøyta på en arm av dissekere miscroscope lyset med lab tape.
TIPS: Hvis du vil opprette en sløv nål fra en skrå nål, transekt nålen akselen med avbitertang. Deretter hone tuppen med en sliping stein til tuppen blir flat.
MERK: For å redusere glidning av aorta fra nålen under kanylering, ru skaftet av kanylering nål ved hjelp av et barberblad. Fest nålen ved navet og øvre aksel, da så høvelen frem og tilbake vinkelrett på lengdeaksen til nålen akselen under rotasjon før flere spor er blitt opprettet i 1 cm fra spissen av nålen akselen. Bytt til en ny barberhøvel når bladet blir kjedelig. - Plasser en renpetriskål under disseksjonsmikroskop for å inneholde hjertet under kanylering. Plasser belysnings armen slik at spissen av kanylen er nær kanten av betraktningsfeltet, men ikke hindrer disseksjon. Sørge for at spissen av kanylen er under kanten av petriskålen.
MERK: For å immobilisere hjertet under disseksjon, plasserer en liten (~ 5-7 cm 2) kvadratet av 215 micron mesh i petriskål. Når hjertet er plassert på denne mesh, vil det skape friksjon for å redusere glidende og roterende av hjertet under mekanisk manipulering. - Bind 2 sting med løse doble burknop rundt navet av kanylen nål som skal brukes for feste av aorta.
- Hjerte Utvinning og Kanylering
- Administrere heparin (5 IU / g kroppsvekt) via intraperitoneal injeksjon. Vent i 20 min for å tillate at heparin for å sirkulere til hjertet.
- Anesthetize musen ved intraperitoneal injisererion av 20% etyl-karbamat (2 mg etylkarbamat / g kroppsvekt). Observere nøye før musen er under dyp anestesi (ca. 3-5 min).
MERK: Deep anestesi er bekreftet av en mangel på både tå klype og hornhinnen reflekser. Hvis musen ikke har nådd dyp bedøvelse med 8 - 10 min, og deretter administrere en tilleggsdose på etylkarbamat. Selv om enkelte reaksjoner på bedøvelse vil variere mellom mus, til svikt angi dyp anestesi ved første dosering kan indikere dårligere etylkarbamat, noe som kan være til hinder for dyp anestesi selv etter gjentatt dosering. For å hindre nedbrytning, utarbeide en ny løsning av etylkarbamat før hver bruk. - Immobilisere musen til kirurgi plattformen ved å sikre hver lem med kirurgisk tape. Desinfiser innsnitt området med en liberal mengde på 70% etanol. Tørk med en lab-tørke.
- Løft huden med vev tang rett under brystbenet. Lag en lateral snitt med liten saks, klippe through huden og magen.
- Bruk hemostats å løfte brystkasse forsiktig via brystbenet. Ved hjelp av små disseksjon saks, forlenge innsnitt i en V-form mot armhulene. Skjær gjennom første ribben og punktere membranen på hver side.
- Fortsett å løfte brystkasse med hemostats og bruke små iris saks til helt transekt membranen. Pass på å ikke punktere hjertet.
- Trekk inn brystkasse rostrally ved hjelp av vedlagte hemostats og raskt, men nøye forlenge den V-formede innsnitt ved å skjære gjennom brystkasse mot armhulene på begge sider. Trekk den midtre delen av brystkasse fullt og legge ned de vedlagte hemostats å holde på plass.
- Ta hjerteposen ved hjelp av fine tang.
- Mens forsiktig løfte hjertet bruker buede tang, transekt venene og arteriene knyttet til hjertet. Umiddelbart plassere hjertet i iskald perfusjon buffer for å redusere muskel sammentrekning.
- Plasser hjerte i en petriskål i henholden disseksjon mikroskop (sted på et lite stykke av 215 pm sikt for å bidra til å immobilisere under disseksjon). Trim overflødig ikke-kardiale vev ved hjelp av gode iris saks. Vær forsiktig når du skjærer i nærheten av aorta.
- Transektet aorta nær brachioencephalic arterien, og tar seg ikke å la bobler eller vevsrester gå inn i åpningen.
- Fyll petriskål inneholdende hjerte med iskald buffer perfusjon slik at væskenivået stiger over åpningen av kanylen. Kappe aorta på kanylen slik at spissen er like distalt for aortaventilen.
TIPS: For å redusere risikoen for luft emboli, svakt trykk sprøyten på kanylen før kanylering for å fjerne mulige luftbobler som kan ha utviklet seg ved enden av kanylen. I tillegg holder tuppen av kanylen og aorta under overflaten av løsningen for å unngå innføring av bobler mens vindsperre aorta. - Skyv en pre-bundet 7-0 silke sutur nedskaftet på nålen og kanylering posisjon like over tuppen av nålen. Stram knuten med fine tang. Gjenta dette trinnet med andre sutur plassert rett ovenfor først.
MERK: Pass på tuppen av nålen er fortsatt over aortaklaffen før og etter innstramming. - Sakte trykke sprøyten for å løse ut 0,5 ml perfusjon buffer gjennom koronar blodkar.
MERK: Hvis kanylering var vellykket, vil blodet bli visualisert forlater koronar blodkar og pooling ut av rygg vener og arterier.
VIKTIG: Tiden fra åpning av brysthulen (særlig punktering av membranen) førstegang perfusjon bør minimaliseres for å redusere hypoksisk eksponering og maksimere overlevelse og helse for de isolerte cardiomyocytes. Ideelt sett bør denne tid være mindre enn 5 min.
- perfusjons
MERK: retrograd perfusjonApparatet kan enkelt betjenes i et rent miljø på en standard laboratoriebenk eller plassert i en laminær strømningshette for å maksimere sterilitet. Men etter perfusjon er ferdig, arbeidet skal utføres under laminær å redusere forurensning.- Forsiktig men bestemt fjerne kanylen fra navet sprøyten (ved hjelp av sterile hansker) ved sakte vridning frem og tilbake. Trekk i kanylering nålen ut av sprøyten, langsomt løse ut perfusjon buffer i nål-muffen for å hindre at luftbobler under perfusjon.
- Fjern den resirkulerende fangst røret fra under perfusjon utgangsporten og erstatte med en avfalls fangst beger. Fest nålen hub til luer adapter som er festet til perfusjon utløpsåpningen (figur 1, 2) på vannkappe, mens pumpen kjører på laveste innstilling (15 RPM, ~ 6 ml / min).
TIPS: Når du kobler nålen hub til luer adapter, la dryppende perfusjon buffer å lurekontak- ten til væsken i nål-muffen for å unngå innføring av luftbobler. - Perfuse hjertet uten resirkulering inntil 8 ml perfusjon buffer er aspirert av inntaksslangen.
MERK: Volumet av perfusjon buffer suges av inntaksslangen på dette trinnet forutsetter en død volum på 7 ml for perfusjon system, som gir en total på 15 ml perfusjon buffer pumpes gjennom hjertet. - Fjern innløpsrøret fra perfusjon buffer. At luften kan suges inn ved innløpet for mindre enn dødvolumet av systemet.
MERK: Volumet av luft suges i dette trinnet må justeres for å hindre at luft kommer inn i koronar blodkar (se trinn 1.3.7). - Plasser innløpsrøret inn i fordøyelsesbufferen (tabell 1), like over bunnen av røret. Strøm langsomt og tillate innløpsrøret for å suge opp tilstrekkelig volum for å unngå overfylling av røret.
- Visualiser og følg luftboble mellomperfusjon buffer og fordøyelsen bufferen når den sendes gjennom varmekappen. Observere nivået av perfusjon buffer i sentrum av den varme jakken begynner å falle når luftboblen når de-boblende kammeret. Når fordøyelse bufferen når frem til de-boblende kammer, vil væskenivået i varmeveks kappen forblir stabil.
VIKTIG: Hvis nivået av perfusjon buffer blir for lavt, lukke uttaket kranen og åpne ventilen kranen. Tillat nivået å stige til et behagelig nivå (3 - 5 inches over utløpsåpningen). Stopp så perfusjon pumpen og lukke ventilen stoppekranen. Åpne utløpsåpningen kranen og start perfusjon pumpen. - Se løsningen dukker opp fra hjertet. Som den siste av perfusjonen buffer forlater hjertet og fordøyelse buffer begynner å sirkulere gjennom hjertet, vil fargeendring fra klar til lys brun holdes på grunn av tilstedeværelsen av kollagenase.
- Perfuse hjertet med fordøyelsen bufferi omtrent 10 - 15 min. Hjertet begynner slouching som kollagen brytes ned og det taper mekanisk støtte.
- Mekanisk Dissosiasjon og rensing
- Ta hjertet fra kanylen med pinsett og legg dem i en tørr petriskål. Raskt trim ekstra ventrikkel vev ved hjelp av gode iris saks. Overfør ventriklene i en ny petriskål som inneholdt perfusjon buffer for å vaske. Flytt petriskål til en steril hette og overføre ventriklene til en frisk, tørr petriskål.
- Samle 7,5 ml fordøyelsen buffer fra varmen jakken og legge til 2,8 mL av en M CaCl 2, bland ved inversjon. Tilsett 2 - 3 ml buffer fordøyelse med CaCl2 til ventriklene i en petriskål.
MERK: Konsentrasjonen av Ca 2+ er hevet fra 300 til 700 mikrometer - Raskt triturer det ventrikulære vev med fine tang, slik at de fleste biter er mindre enn 1 mm 3. Tilsett forbliing Ca 2+ supplert fordøyelse buffer fra trinn 1.3.2 til de dissosierte ventriklene i petriskålen og bland ved forsiktig omrøring.
- Sett petriskål i en 37 ° C inkubator med 5% CO2. Vend petriskål hver 2 min før tilstrekkelige cardiomyocytes (se merknad nedenfor) har blitt løslatt fra vevet.
MERK: Lengden av inkuberingen kan måtte justeres for å finjustere graden av fordøyelse i samsvar med behovene i eksperimentet. Vanligvis lengre inkubasjonstider øke utbytte og renhet, men kan redusere frekvensen av celleadhesjon og overlevelse. 5 - 10 minutter er vanligvis tilstrekkelig til å oppnå et høyt utbytte (~ 5 - 10 x 10 5 celler per hjerte). - Overfør petriskål tilbake til en laminær strømningshette. Ved hjelp av en overføringspipetten skjære i 45 ° vinkel, forsiktig pipette vevet til ytterligere distansere.
- Bruk sterile hansker for å brette 215 mikrometer mesh til en kjegle og holder over en 50 ml konisk. pipettedet dissosierte vev suspensjonen på trådduken og lar filtratet kan renne ned i 50 ml konisk. Bruk 7,5 ml forvarmet stoppbuffer (tabell 1) for å vaske kardiomyocytter fra petriskålen gjennom mesh, og kombinerer med det første filtrat.
MERK: Ca 2+ heves til finalen 1,1 mM og den siste 2,5% FBS i stopp buffer nøytraliserer protease aktivitet. - Overfør cellesuspensjonen til en 15 ml konisk og tillat avsetning av tyngdekraften i 15 min.
- fjern supernatanten med en overføring pipette slik at apparatet bare 50 - 100 ul av oppløsningen holder seg over cellene. Tilsett 10 ml forvarmet, likevekt kultur media (tabell 1) og bland ved forsiktig vending. La de cardiomyocytes å bosette av tyngdekraften i 15 min.
TIPS: For å øke renheten, gjenta trinn 1.4.8 som ønsket. - Fjern forsiktig supernatanten med en overføring pipette slik at bare 50-100 ul of oppløsning holder seg over cellene.
2. kardiomyocytt Culture
- Pre-coat vev kultur behandlet petriskåler med laminin (10 mikrogram / ml) og oppbevar ved 37 ° C i 2 timer før plating celler. Like før plettering, suge laminin oppløsningen fra vevskulturplaten. Vask en gang med MEM eller PBS, deretter aspirer resterende væske for å fjerne ikke-adsorberte laminin.
- Legg nok forvarmes, likevekt kultur media for å oppnå ønskede celletetthet, bland ved forsiktig vending. Plate ønskede konsentrasjon av celler i kulturbeholderen (typisk 5 - 20 x 10 4 celler / cm2). For å vurdere utbyttet av kardiomyocytt isolasjon, telle cellene via hemacytometer eller test-plate ved å kontrollere tettheten under et mikroskop. En voksen mus hjerte gir vanligvis 0,5 - 1,0 x 10 6 celler på dette stadiet av protokollen.
TIPS: Hvis du bruker 96-brønners plater, kan du bruke en 1000 mL micropipEtte med en spiss skjære i 45 ° vinkel for å redusere celleskader på grunn av skjærkraft. Plassere pipettespissen slik at den berører bunnen av brønnen under utstøting av cellesuspensjon for å minimalisere innføring av bobler. - Flytt cellekulturskål umiddelbart til en 37 ° C inkubator med 5% CO2 og 95% fuktighet. Endre media som nødvendig for å hindre forsuring: hver 1 - 5 dager avhengig av celletetthet. Minimerer håndtering av kulturskålen i løpet av de første 3 - 6 dager for å lette festing til cellekulturoverflaten.
MERK: For å minimere celle forstyrrelse under medie endringer når cellene ikke har fullt vedlagt, utføre en halv media endring. Sakte suge mediet samtidig pipettespissen like under overflaten av mediet. Sett deretter langsomt til ytterligere media ved å holde pipettespissen like over overflaten av mediet mot veggen av kulturskålen. - For å vurdere levedyktigheten til cardiomyocytes, sjekkmorfologi henhold lysfelt mikroskopi. Ferskt isolerte cardiomyocytes opprettholde en omtrent stavformet morfologi med skarpe, klare kanter henhold lysfelt belysning (figur 2).
MERK: Bekreft levedyktighet ved farging av cellene med trypan blå. - For å vurdere renheten av kardiomyocytt isolasjon, kontroller cellemorfologi for å identifisere kardiomyocytter. Flekk kjernene med Hoescht 33342 for å identifisere de totale celler.
MERK: cardiomyocytes kan identifiseres fra ikke-kardiomyocytter ved deres karakteristiske morfologi (stavformet) og størrelse (ca. 100-200 mikrometer i lengde). Alternativt vil nyisolerte kardiomyocytter flekken positive for cardiomyocyte-spesifikke markører, slik som alfa-actinin 26 (figur 3C, D) eller kardial troponin T. 27
3. Gene Transduksjon med Adenovirus
- Forbered adenovirus cellelysat ved hjelp av etablerte methods. 21 transduce de cardiomyocytes bruker cellelysat fra adenovirus produsentceller 10. På dag 0 og dag 1 etter isolering, tilsett forsiktig cellelysatet til media inneholdende kardiomyocytter.
MERK: Et høyt titer adenovirus forberedelse vil oppnå sterke uttrykk i ca 48-72 timer. Juster infeksjonsmultiplisitet som passer til den eksperimentelle design.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En vill type voksen ICR (CD1) mus hjerte gir vanligvis 500 000 til 1 million cardiomyocytes fra en vellykket isolasjon. Umiddelbart etter isolering, cellene opprettholde en stort sett stangformet utseende (figur 3A) med intakte sarcomeres og kan anvendes for funksjonelle studier som involverer kardiomyocytt kontraktilitet. En høy prosentandel av stavformede kardiomyocytter (over 90%) er en indikasjon på effektiv perfusjon og fordøyelse. Levedyktige cardiomyocytes vil være store (~ 100-200 mikrometer i lengde), og synes å ha en skarp ytre membran i henhold til lysfelt belysning (figur 3A). Farging for cardiomyocyte-spesifikke sarcomeric markører, slik som alfa-actinin, vil resultere i en distinkt sarcomeric båndmønster (figur 3C). I forbindelse med morfologisk analyse og nukleær farging med DAPI, kan immunfarging brukes til å vurdere renheten av de isolerte kardiomyocytter. Fibroblasts vil være liten og rund like etter isolasjon, men vil raskt feste og spredt tynt på cellekultur plast, og dermed gjør lettvinte forskjell fra cardiomyocytes.
En lav prosentandel av stavformede kardiomyocytter er en indikasjon på en mislykket isolasjon. Dette kan skyldes en manglende evne til raskt å cannulate aorta etter at hjertet blir ekstrahert fra dyret. Ineffektiv perfusjon, på grunn av luft emboli eller uriktig kanylering for eksempel, kan også påvirke morfologien og levedyktighet av kardiomyocytter.
Etter flere dager i kultur, er kardiomyocytter anta en avrundet morfologi (figur 3B). Innen 1 - 2 uker, levende cardiomyocytes feste til underlaget og begynner å spre (figur 3D, E). Døde celler kan identifiseres ved trypanblått inkludering. En vellykket isolasjon og kultur vil gi ca 50% bor cardiomuskelceller etter en uke. Forurensning av ikke-kardiomyocytter, slik som fibroblaster vil resultere i en høy prosentandel av disse cellene i kultur senere på grunn av deres proliferative potensial. Dette kan unngås ved å øke antallet av tyngde sedimentations og / eller gjennom pre-pletteringen for å øke renheten. 28
Transduksjon med adenovirus kan benyttes for å oppnå sterk genekspresjon i løpet av 48-72 timer (figur 3E). Adenovirus serotype 5 er effektiv på transducing voksen mus cardiomyocytes in vitro på grunn av den høye uttrykk for coxackie-adenovirus reseptoren, men kan være avhengig av type media som brukes. 20
Figur 1. kardiomyocytt Isolasjon og instrumentering. (A) Kirurgiske instrumenter brukes til å trekke musehjerte og cannulate aorta, fra topp til bunn: hemostats, vev tang, buede tang, Dumont # 5 fine tang, små dissekere saks, fine iris saks, fine klem saks (B) Langendorff perfusjon systemet brukes til å fordøye musen hjertet. . Perfusjon buffere suges gjennom innløpsrøret (1) ved hjelp av perfusjon pumpe (2) og gjennom pumpeutløpsrøret (3) inn i innløpsåpningen på den oppvarmede vannkappe (4). Perfusjonen buffere blir varmet av den oppvarmede kjølekappen etter hvert som de beveger seg gjennom spiralen glassrøret, den debubbling kammeret, og deretter ut av den kanylering nål festet til den perfusjon utløpsåpning (5), som er forbundet med en stoppekran. Den koniske rør under fanger perfusjon buffere, som er re-sirkulert gjennom innløpsrøret. Den trykkport (6), samsvar port (7) og ventilen (8) forblir lukket under perfusjon, for å opprettholde en konstant strømningshastighet. Vannkappen er oppvarmet av et sirkulerende vannbad inn gjennom the jakke innløp (9) og utløps (10) porter. En ring stativet er brukt til å holde det oppvarmede vannet jakke i en vertikal posisjon (rød klemmer, svart base under den lilla konisk tube stativ). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Skjematisk oversikt over Perfusjons System. Viktige deler av Perfusjons Apparatus er merket som nevnt i manuskriptet. Flyten retning av perfusjon buffer er angitt med piler. Legg merke til plasseringen av aorta kanylen, bør spissen som er synlig gjennom gjennomskinnelig aorta, slik at den er plassert ovenfor aortaklaffen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Isolert Adult Mouse cardiomyocytes. Cardiomyocytes ble isolert og Last inn Laminin-Coated 96 brønners plater som beskrevet i protokollen Heri. (A) Fersk isolert cardiomyocytes, seeded på ca 8000 celler / cm2. Legg merke til at nylig isolerte, levedyktige cardiomyocytes vises omtrent stavformet med skarpe kanter (hvit pilspiss). Men cardiomyocytes som synes å ha en diffus ytre membran i henhold lysfelt er døde. I løpet av de første dagene av kultur, cardiomyocytes anta en avrundet form (B). (C) farging for alpha-actinin (grønn) viser karakteristiske sarcomeric banding i en kardiomyocytt på d1 post-isolasjon. Nuclear flekk (DAPI) vises i blått. Mest viser zoomet bilde av skissert regionen i nedre bilde. (D) (E) Lysfelt og epifluorescent bildene viser cardiomyocytes på dag 11 etter isolering transduced med adenovirus bærer en GFP reporter under kontroll av en CMV-promoter ( en gave fra Robert Gerard ved UT Southwestern). Celler ble sådd ut ved omtrent 18 000 celler / cm 2 og ble transdusert på dag 0 ved hjelp av et mangfold av infeksjon på ca. 800 plaque-dannende enheter (PFU) per celle. Skala barer:. 50 mikrometer Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Kardiomyocytt isolasjon buffer (CIB) | |||
| Legg 900 ml ultrarent vann til en ren beholder i henhold magmagnetisk omrøring. | |||
| Tilsett bufferkomponenter i tabellen som angitt. | |||
| Komponent | MW | Sluttkonsentrasjon (mM) | 1X (g / L) |
| NaCl | 58.44 | 120 | 7,013 |
| KCl | 74.55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 HPO4.7H 2 O | 268,07 | 0,33 | 0,088 |
| MgSO4 .7H 2 O | 246,48 | 0.5 | 0,123 |
| taurin | 125,1 | 30 | 3,753 |
| BDM | 101,1 | 10 | 1,011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5,958 |
| glukose | 180,16 | 22 | 3,964 |
| Juster pH viddh 5 M NaOH. | |||
| Juster volumet til en L med ultrarent vann. | |||
| Steril filter m / 0,22 mikrometer vakuum filter. | |||
| Tilsett 0,5 mL av 0,1 U / ml insulin pr liter av kardiomyocytt isolasjon buffer. | |||
| perfusjon buffer | |||
| Komponent | Slutt | Volum (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4 M) | 0,4 mm | 0.2 | |
| Total | - | 200 | |
| fordøyelse buffer | |||
| Komponent | Slutt | Beløp | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1M) | 300iM | 4,5 mL | |
| protease XIV | 0,2 mg / ml | 3 mg | |
| Collage II | 2,4 mg / ml | 36 mg | |
| Total | - | 15 ml | |
| Stopp buffer | |||
| Komponent | Slutt | Volum (ml) | |
| perfusjon buffer | 95% | 14.25 | |
| CaCl2 (1M) | 1,5 mm | 22.5 | |
| FBS | 5% | 0,75 | |
| Total | - | 15 ml | |
| Kultur media | |||
| Komponent | endelig% | Volum (ml) | |
| MEM media | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0.2 | |
| Total | 100% | 100 ml | |
| Tillat kulturmedium for å ekvilibrere ved 37 ° C, 5% karbondioksid. | |||
Tabell 1: Løsninger og buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den generelle helsen til de isolerte cardiomyocytes avhenger av flere viktige aspekter ved denne protokollen. For det første er den tiden fra hjertet til utvinning perfusjon kritisk og bør utføres i 5 minutter eller mindre. Fjerning av kalsium bidrar til å dissosiere celle-celleinteraksjoner, men kan ha en negativ innvirkning celle helse på lang sikt. 29-32 Således er det funnet tilstrekkelig til å fjerne kalsium i løpet av de første få minutter av perfusjon med EGTA (etylenglykol-tetraeddiksyre) chelatering, 22 men raskt gjenopprette kalsium under fordøyelsen og etterfølgende trinn.
Anvendelsen av protease-XIV forbedrer fordøyelsen effektivitet sammenlignet med kollagenase alene. Dette reduserer inkonsistens på grunn av kollagenase batch variasjon, 18,24 og øker renheten av cardiomyocytes ved å tilrettelegge for separasjon under gravitasjon sedimentering. Likevel, over-fordøyelsen vil hindre effektiv tilknytning til kultur underlaget, så en fin balanse ier påkrevet for å optimalisere celle utbytte og renhet mens cellebinding og levedyktighet vedlikehold. Således kan konsentrasjonen av proteaser og lengde av fordøyelse modifiseres for å passe til de eksperimentelle målene. Generelt vil en mindre grad av fordøyelse forbedre feste og overlevelse av kardiomyocytter. Bruk av trypsin har blitt rapportert i noen kardiomyocytt isolasjonsmetoder. 18 Men tilsetning av trypsin til proteasen cocktail som brukes her (kollagenase og protease XIV) reduserer den langsiktige levedyktigheten av kardiomyocytter i kultur, kanskje på grunn av over-fordøyelse eller spalting av essensielle overflate og / eller ekstracellulære matriksproteiner.
Inkludering av butandionmonoksim (BDM) under isolasjon hemmer hjertemuskelsammentrekning, og dermed reduserer negative konsekvenser som følge av terminal kontraktur, energiforbruk, og kalsium paradoks. 29,33 Men i vår erfaring, fjerning av BDM før kultur ekspederer dedifferentiation og gjør det mulig for cellene å tilpasse seg til kulturen i to dimensjoner.
Det er viktig å merke seg at langvarige tilpasninger til 2-D-kultur kan påvirke funksjonelle aspekter av kardiomyocytter, slik som kontraktilitet. Derfor bør kontraktilitet og elektrofysiologiske eksperimenter skal utføres kort tid etter isolering, da mors sarcomeric organisasjonen er fortsatt intakt. Videre, som med en hvilken som helst in vitro eksperiment, ble cellene i kultur er blottet for visse ytre påvirkninger er tilstede in vivo, slik som humoral eller immun signalering. På den annen side kan defineres ko-kulturer bli gjennomført for å studere interaksjoner mellom kardiomyocytter og andre celletyper. 5,34 tillegg, in vitro-kultur kan brukes til å studere kardiomyocytt oppførsel med definerte molekyl signaler i kulturmedier. Derfor bør de overordnede målene for forsøket vurderes nøye og veies mot de begrensninger og fordeler denne kulturen systemet.
35 Det skal bemerkes at FBS og andre dyre-avledet sera inneholder ukjente komponenter som kan påvirke cellulær fysiologi . 36,37 tross for godt verdsatt tilstedeværelse av vekstfaktorer i FBS, trenger 38 til cardiomyocyte kulturer som presenteres her ikke sprer. Snarere virker cellesyklus blokk å være en vedvarende egenskap av voksne mus cardiomyocytes ex vivo, er opprettholdt fra deres cellesyklusen exit i perinatalperioden av utviklingen. 12,39 Denne egenskapen av stor interesse for feltet av hjerte regenerativ medisin, der hjemfall av voksne pattedyr cardiomyocytes til en proliferativ fenotype har vært et tungt forfulgt mål. 3,26,40-42 Spesielt er det foreløpig uklart hvilken grad dedifferentiation er nødvendig for cardiomyocytes å gå inn igjen i cellesyklusen, men contribution av dedifferentiation til gjenfødelse i lavere virveldyr er godt støttet 43,44,10,11 Videre dedifferentiation blir i økende grad sett i kardiomyocytt spredning og hjerte regenerering i pattedyrsystemer, i det minste på funksjonelt nivå, inkludert myofibrillar demontering 6,12,9 derfor bør staten differensiering av cardiomyocytes i kultur vurderes nøye og modulert i henhold til behovene til forskning mål. Som sådan, dyrkningsforholdene kan potensielt bli ytterligere modifisert for å redusere serumkonsentrasjon, anvender definerte serumerstatninger eller serumfrie medier. For eksempel, voksen rotte kardiomyocytter oppviser organisert sarcomeres ble dyrket langvarig uten serum, men vekstfaktorer, slik som fibroblastvekstfaktor, epidermal vekstfaktor, og trijodtyronin ble anvendt i definert medium. 45 Det er tenkelig at lignende medier formuleringer, eller eventuelt annen formuleringer slik som de som er tilpasset fra differensiertasjon protokoller, kan 46 brukes til å opprettholde godt differensierte voksen mus cardiomyocytes i kulturen som viser velorganiserte sarcomeric strukturer. Alternative formuleringer kan også bli utviklet for å oppnå andre fenotyper (for eksempel høyt de differensierte kardiomyocytter) 6 avhengig av behovene av eksperimentet, men ytterligere arbeid vil være nødvendig.
Rollen av fibroblaster har vært innblandet i kontrollen av neonatal mus kardiomyocytt cellesyklus 5 og voksne mus kardiomyocytt differensiering (gjennom hypertrofisk IL6 signalering) i langsiktig kultur. 19 Derfor veksten av fibroblaster i kultur skal regnskapsføres i eksperimentelle tolkninger . Veksten av fibroblaster i kultur kan bli kontrollert ved tilsetning av vekstbegrensende forbindelser som cytosinarabinosid 19 (AraC) eller gjennom pre-pletteringstrinnet. 28 Imidlertid vil AraC også hemme veksten av kardiomyocytter, så alternativfremgangsmåter bør brukes til å kontrollere veksten av fibroblaster i studier angående kardiomyocytt cellesyklusen. I protokollen som er beskrevet her, kan innledende kardiomyocytt renhet bli styrket ved å gjenta gravitasjon sedimente trinn (se 1.4.8).
Fremgangsmåtene heri tilveiebringe et system in vitro som kan brukes til å studere natur voksne pattedyr kardiomyocytt cellesyklus blokade. I motsetning til primære celler fra andre organismer, som for eksempel rotte eller marsvin, muse cardiomyocytes byr på et vell av kraftige og godt karakterisert genetiske verktøy, for eksempel Cre-baserte avstamning sporing knock-in-modeller, 47 som kan brukes til å enkelt identifisere celler avledet fra pre-eksisterende cardiomyocytes. 12,48 tillegg har primær voksne murine cardiomyocytes blitt utsatt for de innfødte utviklings forhold som fører til cellesyklus blokade, i motsetning til cellelinjer og differensierte ES eller IPSC celler 46 som, til tross for deres convenience og tilpasning til store narkotika-skjermer, to kan ha begrenset nytte i eksperimenter sondering natur voksen kardiomyocytt cellesyklus exit.
Denne protokollen skisserer en pålitelig metode for å isolere og kultur voksen mus cardiomyocytes. Flere metoder har tidligere vist isolering av voksne mus cardiomyocytes for kortsiktig studie, men til dags dato, noen rapporter eksisterer av den langsiktige kultur for voksen-mus cardiomyocytes. 18,19 Evnen til å opprettholde voksen mus cardiomyocytes i kultur skal mulig in vitro studie av kardiomyocytt biologi under eksperimentelle forhold som krever langsiktig undersøkelse. For eksempel kan genekspresjon bli manipulert ved hjelp av adenovirusvektorer, som typisk krever noen få dager for å oppnå full ekspresjon. Påfølgende fenotypiske endringer og analyse kan kreve enda lengre perioder avhengig av eksperimentelle mål. Metodene som presenteres her tillate kulturen i voksen mus cardiomyocytes i flere uker. Dette bør gi et kraftig system for etterforskningen av forsvarlig spørsmål i kardiomyocytt biologi, slik som de knyttet til cellesyklusregulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av UCSF Program for Gjennombrudd Biomedical Research (finansiert delvis av Sandler Foundation), NIH Pathway to Independence Award (R00HL114738) og Edward Mallinckrodt Jr. Foundation. JJ ble støttet av en postdoktorstipend fra NIH (T32HL007731). Forfatterne er selv ansvarlig for innholdet i dette arbeidet, som ikke nødvendigvis representerer den offisielle visninger av NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
References
- Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
- Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
- Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
- Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
- Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
- Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
- Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
- Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
- Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
- Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
- Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
- Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
- Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
- Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
- Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
- Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
- Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
- Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
- Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
- Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
- Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
- Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
- Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
- Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
- Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
- Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
- Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
- Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
- Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
- Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
- Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
- Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
- Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
- Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
- Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
- Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
- Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
- Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).
