Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים

Published: August 28, 2016 doi: 10.3791/54012
Automatic Translation
1, 1, 1
1Cardiovascular Research Institute, University of California, San Francisco

Abstract

ניתן להשתמש cardiomyocytes מתורבתות ללמוד ביולוגיה cardiomyocyte משתמשים בשיטות שאינן משלימות למערכות in vivo. לדוגמה, את הטוהר ונגישות של תרבות במבחנה מאפשרת בקרה טובה על ניתוחים ביוכימיים, הדמיה לחיות, ואת אלקטרופיזיולוגיה. לתרבות לטווח ארוך של cardiomyocytes מציע גישה גישות ניסיוניות נוספות שלא ניתן להשלים בתרבויות בטווח הקצר. לדוגמה, החקירה חוץ גופית של dedifferentiation, מחזור התא מחדש הכניסה, ואת חלוקת התא עד כה בעיקר הוגבלה cardiomyocytes עכברוש, אשר להיראות חזקים יותר בתרבות לטווח ארוך. עם זאת, את הזמינות של ערכת כלים עשירה של קווי עכבר מהונדסים ומודלי מחלה מפותחים להפוך את מערכות עכבר אטרקטיביות למחקר לב. למרות מספר דיווחים להתקיים בידוד cardiomyocyte עכבר בוגר, כמה מחקרים מראים לתרבות לטווח הארוכה שלהם. אנו מציגים כאן, היא שיטה צעד-אחר-צעד עבורתרבות בידוד ארוך טווח של cardiomyocytes עכבר הבוגר. ראשית, זלוף Langendorff מדרדר משמש לעכל את הלב בצורה יעילה עם פרוטאזות, ואחריו טיהור שקיעה הכבידה. לאחר תקופה של הבידוד הבא dedifferentiation, התאים לצרף בהדרגה לתרבות יכולים להיות מתורבת במשך שבועות. lysate התא Adenovirus משמש transduce cardiomyocytes מבודד ביעילות. שיטות אלה מספקות מערכת מודל עצמה פשוטה, אך ללמוד ביולוגית לב.

Introduction

Cardiomyocytes מתורבתות משמשים לעתים קרובות כדי לפקח על התנהגות התא בסביבה מבוקרת היטב במבחנה. לדוגמא, מורפולוגיים, חשמל, ביוכימיות, או תכונות תא מכאניות ניתן ללמוד על מצעים מהונדסים, 1,2 בתקשורת מוגדרת, ובתגובה לסמי מולקולה קטנות, פפטידים, ויסות גנים, 3 או גירוי חשמלי. 4 התוכן הסלולרי יכולות גם להיות נשלט באמצעות שיתוף תרבויות מוגדרות. 5 אלה ניסויים במבחנה שימושיים סמים גדולים או מסך גנטי ומשלימים בשיטות vivo עבור סוגים שונים של החקירות מעורבות ביולוגית cardiomyocyte.

לתרבות לטווח ארוכה מאפשרת אפיקים הניסיונות שדורשים תקופות ממושכות של זמן כדי להשיג שינוי פנוטיפי. דוגמא בזמן זה של התפשטות cardiomyocyte יונקת בוגרת, שבו dedifferentiation, מחזור תא מחדש כניסה, ועל חלוקת תאים בדרך כלל נלמד על several ימים עד שבועות. 6,7 כאן, בפעם התרבות המורחבת מקלת מניפולציה גנטית, 7,8 dedifferentiation התפקודית (למשל, פירוק sarcomeric) 9 ו dedifferentiation תעתיק פוטנציאלי. 6 מחזור התא לאחר הזנה חוזרת של חלוקת תא דורשת תקופות תרבות יותר אפילו להתבונן, במיוחד אם סיבובים של חלוקת מרובים הם המטרה הניסיונית. חשיבותו של מחזור התא cardiomyocyte הוא מרכזי כמה עבודות מדעיות המפתח האחרונות התחדשות הלב, שבו dedifferentiation ושגשוגם של cardiomyocytes קיימים הוכח אחראי התחדשות לב דג הזברה ועכברים בילוד. 10-12 בכך תסוכל האפשרות dedifferentiation מחזור התא כדי לעורר מחדש רשום cardiomyocytes המבוגר יונקים נשאר שאלת מפתח התחדשות לב אנושית 13-15

אני n ניסויים במבחנה לומדים את מחזור התא של פעילות אירובית יונקתמיוציטים בעיקר השתמשו מקורות חולדה, בשל הקלות היחסית שלהם לתרבות לטווח ארוכה בהשוואה לדגמי עכבר. 16 עם זאת, מערכות בעכברים מציעות משאב עשיר של כלים מהונדסים היטב מאופיינים ומודלים מחלים שהן שימושיות הן במבחנת in vivo פרוטוקולים. לדוגמא, מעקב שושלת מבוססת Cre אפשר זיהוי של cardiomyocytes קיים כמקור התחדשות שריר לב בלב העכבר בילוד in vivo. 12 במבחנת מחקרים של cardiomyocytes עכבר בילוד-לייחס שושלת אפשרה הבחינה של אינטראקציות עם סטרומה תאים דרך שיתוף תרבות עם פיברובלסטים. 5 עם זאת, בשל האתגרים שלה, 17 דיווחים מעטים נמצאים מתרבות הבידוד ארוך טווח של cardiomyocytes עכבר הבוגר. 18,19

הבידוד של cardiomyocytes עכבר בוגר קיימא לתרבות לטווח קצר בלבד ידוע להיות משימה מאתגרת. protoc זהol מספק צעד אחר צעד הוראות כיצד להשיג cardiomyocytes קיימא מעכברים בוגרים שיכולים לשמש הן לטווח הקצר כמו גם חקירות לטווח ארוך. Cardiomyocytes מבודד באמצעות פרוטוקול זה ניתן transduced ביעילות עם וקטורים adenoviral 20,21 ותרבותי במשך שבועות. שיטות אלה מספקים מערכת חזקה ללמוד ביולוגיה cardiomyocyte במבחנה.

השיטות שתוארו במסמך זה מבוססים על מספר גורמים מעבודות קודמות באמצעות וריאציות של זלוף Langendorff מדרדר. 18,22 למרות כמה פרוטוקולים פורסמו על הבידוד של cardiomyocytes עכבר בוגר לתרבות לטווח קצר ולימוד, 23-25 ​​היתרון של פרוטוקול זה הוא יכולת התרבות לטווח הארוך cardiomyocytes המבודד. זה יהיה שימושי בחקר תהליכים תאיים מעורבים ביטוי גנים מחוץ לרחם הדורשים פרקי זמן ארוכים, כגון אסטרטגיות לתכנות מחדש של תאים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הנהלים המפורטים כאן אושרו על ידי ועדת שימוש בבעלי חיים מוסדיים טיפול באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו.

הערה: בקצרה, לאחר חילוץ בלב מחזה העכבר, זלוף מדרדר כלילית משמש לעכל את תאי מטריקס ביעילות עם collagenase ו פרוטאז XIV. תעלות חדרי המוח ואז מבודדים, ניתק מכאני ולסנן לתוך השעית תא בודדת. שקיעה הכביד מתבצעת על מנת לבודד cardiomyocytes, אשר מופרד מתאי סטרומה כמו פיברובלסטים ותאי האנדותל ידי הצפיפות הגבוהה שלהם. Cardiomyocytes מטוהרים יכול להיות מתורבת במשך שבועות על קלקר laminin מצופה transduced עם וקטורים הגן אדנווירוס.

1. בידוד Cardiomyocyte

  1. כן חוצצים, תחנת כירורגי מנגנון זלוף
    1. כן מאגרים ומדיה פי Table 1.
    2. הפעל במחזור אמבט מים, להגדיר טמפרטורת קלט כך פלט של ז'קט מים מחומם מגיע לטמפרטורה של 37 ג.
    3. מערכת זלוף נקי על ידי שטיפה עם אתנול 70%. ואז להסיר את כל העקבות של אתנול ממערכת על ידי שטיפה עם כמה כרכים של מים סטריליים.
    4. טען את מערכת זלוף עם חיץ זלוף (טבלה 1). מי ניקוז ראשית ממערכת, אז לשטוף עם 2 כרכים של חיץ זלוף. ואז למלא את החלל המת עם חיץ זלוף כך בטור הפנימי של הז'קט החום מתמלא חיץ זלוף, אבל קאמרי debubbling ריק.
      טיפ: ודא שאין בועות אוויר נוכחים בקו מתחת לתא debubbling. כדי להסיר בועות סרבניות, לעסוק כל והברזים למינים ולאפשר לחץ לבנות בתוך הקו במשך כמה שניות. לאחר מכן שחרר את הברזלים הנמוכים, מה שמאפשר למאגר זלוף בלחץ הגבוה כדי סילון המשקע; זרם turbulenc המהירדואר יעזור לסלק בועות, כי הם נתפסו ליד שפך זלוף.
    5. הכן מזרק עם מחט לשמש cannulation אבי העורקים. צרף מחט קהה 18 G מזרק 1 מ"ל מלא חיץ זלוף. הסר בועות אוויר ולתקן את הרכבת המזרק לזרוע אחת של נורת ה- לנתח miscroscope עם קלטת מעבדה.
      טיפ: כדי ליצור מחט חוד מעוגל מ מחט משופעת, transect פיר המחט עם מספרי תיל. אז לחדד את הקצה עם אבן מלטש עד הקצה שטוח.
      הערה: כדי להפחית חלקה של האאורטה מהמחט במהלך cannulation, לחספס את הפיר של מחט cannulation באמצעות סכין גילוח. אבטח את המחט על ידי הרכזת פיר העליון, ואז ראה את התער הלוך ושוב בניצב לציר הארוך של הפיר המחט תוך סיבוב עד חריצים כמה נוצרו בתוך 1 ס"מ של קצה מוט מחט. Switch to תער חדש כאשר הלהב הופך משעמם.
    6. מניחים נקייםצלחת פטרי מתחת למיקרוסקופ לנתח להכיל את הלב במהלך cannulation. מקם את זרוע הפנס כזה הקצה של הצינורית הוא סמוך לקצה שדה הצפייה, אך לא חוסם את לנתיחה. וודא שקצה הצינורית הוא מתחת לשפה של צלחת פטרי.
      הערה: כדי לסייע לשתק את הלב במהלך לנתיחה, במקום קטן (~ 5 - 7 ס"מ 2) מרובע של רשת 215 מיקרון בצלחת פטרי. כשהלב מושם על רשת זו, היא תיצור חיכוך להפחית זזה והסיבוב של הלב במהלך מניפולציה מכאנית.
    7. עניבת 2 תפרים עם קשר בוהן כפול רופף סביב הרכזת של מחט הצינורית לשמש securement של אב העורקים.
  2. הפקת לב Cannulation
    1. נהל הפרין (5 משקל גוף IU / g) באמצעות זריקה intraperitoneal. חכו 20 דקות כדי לאפשר הפרין לזרום אל הלב.
    2. להרדים את העכבר על ידי להזריק intraperitonealיון של carbamate אתיל 20% (משקל הגוף carbamate / g אתיל 2 מ"ג). ושים לב עד שהעכבר הוא בהרדמה עמוקה (כ 3 - 5 דקות).
      הערה: הרדמה עמוקה אושר על ידי חוסר הוא קמצוץ הבוהן ורפלקסים קרני. אם העכבר לא הגיע הרדמה עמוקה על ידי 8 - 10 דקות, ולאחר מכן לנהל מנה נוספת של carbamate אתיל. למרות התגובות הפרט הרדמה ינועו בין עכברים, כישלון להיכנס הרדמה עמוקה על המינון הראשון עשוי להצביע carbamate אתיל מושפל, אשר עלול למנוע הרדמה עמוקה גם לאחר מינון חזר. כדי למנוע הידרדרות, להכין פתרון חדש של carbamate אתיל לפני כל שימוש.
    3. לשתק את העכבר על פלטפורמת ניתוח על ידי הבטחת כל איבר בעזרת פלסטר. לחטא את אזור החתך עם כמות ליברלית של אתנול 70%. פאט יבש עם מעבדת לנגב.
    4. הרם את העור עם מלקחי רקמות ממש מתחת לעצם החזה. ביצוע חתך לרוחב עם מספריים קטנים, חיתוך throאיכס העור בבטן.
    5. השתמש hemostats להרים את בית החזה בעדינות דרך עצם החזה. בעזרת מספריים לנתיחה קטנים, להאריך את החתך בצורת V-צורה כלפי השחי. חותכים דרך הצלע הראשונה לנקב את הסרעפת בכל צד.
    6. המשך להרים את בית החזה עם hemostats ולהשתמש איריס מספרית קטנה transect הסרעפת לחלוטין. תשמור על עצמך לא לנקב את הלב.
    7. לחזור בו חזה rostrally באמצעות hemostats מצורף במהירות אך בזהירות להאריך את חתך V- צורה על ידי חיתוך דרך בית החזה כלפי השחי משני הצדדים. לחזור בו החלק האמצעי של בית החזה מלא להניח את hemostats המצורפת להחזיק במקום.
    8. הסר את קרום הלב באמצעות מלקחיים בסדר.
    9. בעודך מרים את הלב בעדינות בעזרת מלקחיים מעוקלים, transect הוורידים והעורקים מצורפים הלב. מיד למקום בלב במאגר זלוף קר כקרח להאט התכווצות שרירים.
    10. מניחים את הלב בצלחת פטרי תחתמיקרוסקופ לנתיחה (במקום על חתיכה קטנה של 215 מיקרומטר רשת לעזור לשתק במהלך דיסקציה). חתוך כל רקמה הלא לב עודפת באמצעות מספרי איריס בסדר. היזהר בעת חיתוך ליד אבי העורקים.
    11. Transect האאורטה ליד עורק brachioencephalic, ולדאוג לא לתת בועות או פסולת רקמות להיכנס הפתיחה.
    12. מלא את צלחת הפטר שמכילה את הלב עם חיץ זלוף קר כקרח כך שהרמה הנוזלית עולה מעל הפתיחה של הצינורית. נדן האאורטה על צינורית כך הטיפ הוא רק דיסטלי שסתום אבי העורקים.
      טיפ: כדי להפחית את הסיכון של תסחיף אוויר, מעט לדכא את המזרק על הצינורית לפני cannulation כדי להסיר בועות אוויר פוטנציאליות אשר עשויים פתחו בסוף הצינורית. בנוסף, לשמור על קצה של צינורית לבין אבי העורקים מתחת לפני השטח של הפתרון כדי למנוע החדרת בועות תוך לנדן האאורטה.
    13. חלק תפר משי מראש קשור 7-0 למטההפיר של המחט ומצבה cannulation בדיוק מעל קצה המחט. להדק את הקשר עם מלקחיים בסדר. חזור על פעולה זו עם תפר שני ממוקם ממש מעל לקומה הראשונה.
      הערה: וודא שקצה המחט הוא עדיין מעל מסתם אאורטלי לפני ואחרי ההידוק.
    14. לאט לדכא את המזרק כדי להוציא 0.5 מ"ל של חיץ זלוף דרך כלי הדם הכליליים.
      הערה: אם cannulation היה מוצלח, דם יהיה דמיין לעזוב את כלי דם הכליליים ואיגום מתוך הוורידים והעורקים הגבו.
      חשוב: השעה מן הפתיחה של חלל בית החזה (בפרט, ניקוב הסרעפת) לראשונה זלוף צריך להיות ממוזערת כדי להקטין את החשיפה היפוקסי ולמקסם את ההישרדות ובריאות של cardiomyocytes המבודד. באופן אידיאלי, הפעם צריך להיות פחות מ -5 דקות.
  3. זִלוּף
    הערה: זלוף המדרדרמנגנון יכול להיות מופעל בנוחות בסביבה נקיה על ספסל מעבדה סטנדרטי או להציב במנדף זרימה למינרית על מנת למקסם את העקרות. עם זאת, לאחר זלוף יושלם, עבודה צריכה להתבצע תחת זרימה למינרית כדי למזער זיהום.
    1. בעדינות אך בתקיפות להסיר את רכזת הצינורית מן המזרק (באמצעות כפפות סטריליות) על ידי הסיבוב הלוך ושוב לאט. תוך משיכת המחט cannulation הנחה של מזרק, לאט להוציא חיץ זלוף לרכזת המחט על מנת למנוע בועות אוויר במהלך זלוף.
    2. הסר את צינור הסירקולציה המחודשת לתפוס מלמטה פתח יציאת זלוף ולהחליף עם מבחנה לתפוס פסולת. צרף רכזת המחט למתאם luer כי הוא קבוע פתח יציאת זלוף (איורים 1, 2) על ז 'קט המים, תוך המשאבה פועלת על ההגדרה הנמוכה ביותר (15 סל"ד, ~ 6 mL / min).
      טיפ: כאשר אתם מחברים את הרכזת מחט למתאם luer, לאפשר למאגר זלוף נוטף להונותnect לנוזל ב רכזת המחט כדי למנוע החדרת בועות.
    3. Perfuse הלב ללא סחרור עד 8 מ"ל של חיץ זלוף כבר aspirated ידי צינור כניסת האוויר.
      הערה: היקף המאגר זלוף aspirated ידי צינור כניסת בשלב זה מניח נפח מת של 7 מ"ל עבור מערכת זלוף, נותן סך של 15 מ"ל של חיץ זלוף שאוב דרך הלב.
    4. הסר את צינור היניקה מן המאגר זלוף. אוויר אפשר להישאף על ידי הכניסה פחות הנפח המת של המערכת.
      הערה: נפח האוויר aspirated בשלב זה חייב להיות מותאם כדי למנוע אוויר מלהיכנס בכלי הדם הכליליים (ראה שלב 1.3.7).
    5. מניחים את צינור היניקה למאגר העיכול (טבלה 1), ממש מעל החלק התחתון של הצינור. Feed לאט ולאפשר את צינור היניקה לשאוב מספיק נפח כדי למנוע מילוי יתר הצינור.
    6. דמיינו ובצע את בועת אוויר ביןלמאגר זלוף למאגר העיכול כפי שהוא נוסע דרך ז'קט חום. שים לב רמת חיץ זלוף במרכז ז'קט החומה מתחיל לרדת פעם בועת האוויר מגיעה לתא מבעבע-דה. לאחר למאגר העיכול מגיע לתא מבעבע-דה, רמת נוזל בתוך המעיל החום יישאר יציב.
      חשוב: אם רמת חיץ זלוף טיפות נמוכה מדי, לסגור את השסתום לשקע ולפתוח את שסתום האוורור. אפשר לשלב לעלות לרמה נוחה (3 - 5 סנטימטרים מעל פתח היציאה). לאחר מכן, להפסיק את המשאבה זלוף ולסגור את שסתום האוורור. פתח את שסתום שקע היציאה ולהפעיל מחדש את משאבת זלוף.
    7. צפה הפתרון המתעורר מהלב. כאחרון למאגר זלוף עוזב את הלב ואת חיץ העיכול מתחיל במחזור דרך הלב, שינוי צבע חום בהיר יקוים בשל נוכחותם של collagenase.
    8. Perfuse הלב עם חיץ העיכולכ 10 - 15 דקות. הלב יתחיל רפוי כמו קולגן הוא מושפל והוא מאבד תמיכה מכאנית.
  4. דיסוציאציה וטיהור מכאניות
    1. הסר את הלב מן הצינורית עם מלקחיים ומניחים בצלחת פטרי יבשה. במהירות לקצץ רקמה נוספת-חדרית באמצעות מספרי איריס בסדר. מעבירים את החדרים כדי חיץ זלוף המכיל בצלחת פטרי טרי לשטוף. הזז את צלחת פטרי כדי ברדס סטרילי ולהעביר את החדרים כדי בצלחת פטרי טריה, יבשה.
    2. אסוף 7.5 מ"ל של חיץ העיכול מן ז'קט חום ולהוסיף 2.8 μl של 1 M CaCl 2, ומערבבים על ידי היפוך. להוסיף 2 - 3 מ"ל של חיץ העיכול עם CaCl 2 אל חדרי הלב בצלחת פטרי.
      הערה: ריכוז Ca 2 + הועלה מ 300 כדי 700 מיקרומטר
    3. במהירות triturate רקמת חדרית עם מלקחיים בסדר, כך שרוב החלקים הם קטנים מ -1 מ"מ 3. מוסיפים את להישארing חיץ העיכול Ca 2 + בתוספת משלב 1.3.2 אל חדרי הלב ניתק בצלחת פטרי ומערבבים ידי תסיסה עדינה.
    4. מניחים את צלחת פטרי בתוך 37 ° C חממה עם 5% CO 2. להתסיס את צלחת פטרי כל 2 דקות עד cardiomyocytes מספיק (ראה הערה להלן) שוחרר מן הרקמה.
      הערה: משך הדגירה ייתכן שיהיה צורך מותאם לכוונן את מידת העיכול בהתאם לצרכים של הניסוי. באופן כללי, פעמים הדגירה כבר להגדיל את התשואה וטוהר, אך הוא עשוי להפחית את שיעור מצורף תא והישרדות. 5 - 10 דקות הן בדרך כלל מספיק כדי להשיג תשואה גבוהה (~ 5 - 10 x 10 5 תאים לכל לב).
    5. מעבירים את צלחת פטרי בחזרה למכסה המנוע זרימה למינרית. בעזרת פיפטה העביר לחתוך בזווית של 45 מעלות, פיפטה הרקמה בעדינות כדי לנתק נוסף.
    6. יש להשתמש בכפפות סטריליות לקפל את רשת 215 מיקרומטר לתוך חרוט והחזק מעל חרוטי 50 מ"ל. פִּיפֵּטָההשעית הרקמה ניתקה על הרשת ולאפשר התסנין לנקז לתוך חרוטי 50 מיליליטר. השתמש 7.5 מ"ל של חיץ להפסיק מחומם מראש (טבלה 1) כדי לשטוף את cardiomyocytes מצלחת פטרי מבעד לרשת, שילוב עם תסנין הראשון.
      הערה: Ca 2 + מועלה סופי 1.1 מ"מ ואת FBS 2.5% הסופיים למאגר התחנה מנטרל פעילות הפרוטאז.
    7. מעבירים את ההשעיה התא חרוטי 15 מ"ל ולאפשר להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך 15 דקות.
    8. מוציאים בזהירות את supernatant עם טפטפת העברה כזו שרק 50 - 100 μl של פתרון נשאר מעל התאים. הוסף 10 מ"ל של התקשורת בתרבות מחומם מראש, equilibrated (טבלה 1) ומערבבים על ידי היפוך עדין. אפשר cardiomyocytes להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך 15 דקות.
      טיפ: כדי להגדיל טוהר, חזור על שלב 1.4.8 מועדפים.
    9. מוציאים בזהירות את supernatant עם טפטפת העברה כזו שרק 50 - 100 μl oפתרון f נשאר מעל התאים.

2. Cardiomyocyte תרבות

  1. רקמה טרום מעיל שטופלו תרבות בצלחות פטרי עם laminin (10 מיקרוגרם / מ"ל) ולאחסן ב -37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות לפני ציפוי התאים. רק לפני ציפוי, לשאוב את הפתרון laminin מהצלחת בתרבית רקמה. שטפי פעם עם MEM או PBS, ואז לשאוב נוזל שיורי להסיר laminin הלא adsorbed.
  2. הוסף מספיק מחוממת מראש, תקשורת ותרבות equilibrated כדי להשיג צפיפות תאים רצוי, ומערבב על ידי היפוך עדין. פלייט הרצוי ריכוז של תאים לתוך כלי התרבות (בדרך כלל 5 - 20 x 10 4 תאים / 2 ס"מ). כדי להעריך את התשואה של בידוד cardiomyocyte, לספור את התאים באמצעות hemacytometer או מבחן צלחת על ידי בדיקת צפיפות תחת מיקרוסקופ. לב עכבר בוגר בדרך כלל מספק 0.5 - 1.0 x 10 6 תאים בשלב זה של הפרוטוקול.
    עצה: אם אתה משתמש 96 צלחות היטב, השתמש micropip μl 1,000ette עם קצה לחתוך בזווית של 45 מעלות כדי למזער נזק לתאים בשל גזירה כוח. הנח את קצה פיפטה כזאת שזה נוגע בתחתית הבאר במהלך הפליטה של ​​תרחיף תאים כדי למזער כניסתה של בועות.
  3. הזז את צלחת תרבית תאים ללא דיחוי על 37 מעלות צלזיוס חממה עם 5% CO 2 ולחות 95%. שינוי בתקשורת לפי הצורך כדי למנוע החמצה: כל 1 - 5 ימים, תלוי צפיפות התאים. מזער טיפול של מנת התרבות במהלך 3 ראשונים - הימים 6 עד מאפשר הצרוף אל פני שטח תרבית תאים.
    הערה: כדי למזער הפרעת תא במהלך שינויי תקשורת כאשר התאים לא מחוברים באופן מלא, לבצע שינוי למחצה בתקשורת. לאט לשאוב התקשורת, תוך שמירה על קצה פיפטה מתחת לפני השטח של התקשורת. ואז לאט להוסיף מדיה נוספת על ידי שמירה על קצה פיפטה בדיוק מעל פני השטח של התקשורת נגד הקיר של מנת התרבות.
  4. כדי להעריך את הכדאיות של cardiomyocytes, לבדוקהמורפולוגיה תחת מיקרוסקופ brightfield. טרי cardiomyocytes מבודד לשמור על מורפולוגיה מוט בצורה בערך עם קצוות חדים, ברורים תחת תאורת brightfield (איור 2).
    הערה: אשר הכדאיות מכתים את התאים עם trypan כחול.
  5. כדי להעריך את הטוהר של בידוד cardiomyocyte, לבדוק את המורפולוגיה תא לזהות cardiomyocytes. כתם הגרעינים עם Hoescht 33342 לזהות תאים בסך הכל.
    הערה: cardiomyocytes ניתן לזהות מתוך הלא-cardiomyocytes ידי המורפולוגיה האופיינית שלהם (מוט בצורת) וגודל (כ 100 - 200 מיקרומטר באורך). לחלופין, cardiomyocytes טרי המבודד יהיה כתם חיובי עבור סמנים ספציפיים cardiomyocyte, כגון-actinin אלפא 26 (איור 3 ג, ד) או ט טרופונין הלבבי 27

3. תמרת ג'ין עם Adenovirus

  1. כן lysate תא אדנו באמצעות מ הוקםethods. 21 transduce cardiomyocytes באמצעות lysate תא מתאי המפיק אדנווירוס 10. ביום 0 או 1 יום לאחר בידוד, בזהירות להוסיף lysate התא לתקשורת המכיל את cardiomyocytes.
    הערה: הכנת אדנו כיילתי גבוה תשיג ביטוי חזק כ -48 - 72 שעות. התאם את הריבוי של זיהום כדי להתאים את תכנון הניסוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מבוגר סוג בר ICR (CD1) הלב העכבר בדרך כלל מניבה 500,000 עד 1 cardiomyocytes מתוך בידוד מוצלח. מייד לאחר בידוד, התאים לשמור על חזות בעיקר בצורת מוט (איור 3 א) עם סרקומר בשלמותה וניתן להשתמש בו ללימודים פונקציונליים המעורבים contractility cardiomyocyte. אחוז גבוה של שריר הלב בצורת מוט (מעל 90%) הוא אינדיקציה של זלוף ועיכול יעיל. Cardiomyocytes בת קיימא תהיה גדולה (~ 100 - 200 מיקרומטר אורך) ו נראה שיש לך הממברנה חיצונית חדה תחת (איור 3 א) תאורת brightfield. Immunostaining עבור סמנים sarcomeric ספציפי cardiomyocyte, כגון-actinin אלפא, תגרום דפוס פסים ברורים sarcomeric (איור 3 ג). בשילוב עם ניתוח מורפולוגי מכתים גרעיני עם DAPI, immunostaining ניתן להשתמש כדי להעריך את הטוהר של cardiomyocytes המבודד. Fibrאובלסט יהיה קטן ועגול רק לאחר בידוד, אך יצרף במהירות ולהפיץ דק על פלסטיק תרבית תאים, ובכך לאפשר הבחנה קליל מן cardiomyocytes.

אחוז נמוך של cardiomyocytes בצורת מוט הוא אינדיקציה בידוד מוצלח. זה יכול לנבוע אי cannulate האאורטה במהירות אחרי הלב מופק מן החי. זלוף לא יעיל, עקב תסחיף אוויר או cannulation שגוי למשל, יכול גם להשפיע על המורפולוגיה הכדאיות של cardiomyocytes.

אחרי כמה ימים בתרבות, cardiomyocytes להניח מורפולוגיה מעוגלת (איור 3 ב). בתוך 1 - 2 שבועות, cardiomyocytes חיים לצרף המצע ולהתחיל להפיץ (איור 3D, E). ניתן לזהות תאים מתים על ידי הכללת כחול trypan. בידוד והתרבות מוצלח יניבו כ -50% מתגוררים אירובייםmyocytes לאחר שבוע 1. זיהום על ידי אי-cardiomyocytes, כגון פיברובלסטים יגרמו אחוז גבוה של תאים אלה מאוחר יותר בתרבות בשל פוטנציאל השגשוג שלהם. זה יכול להימנע על ידי הגדלת מספר sedimentations הכביד ו / או באמצעות ציפוי מראש להגדיל את הטוהר. 28

התמרה עם אדנו ניתן להשתמש כדי להשיג ביטוי גנים חזק תוך 48 - 72 שעות (איור 3E). Adenovirus סרוטיפ 5 היא יעילה transducing cardiomyocytes עכבר בוגר במבחנה בשל הביטוי הגבוה של הקולטן coxackie-אדנו, אבל יכולה להיות תלויה בסוג הדפסה. 20

איור 1
איור 1. ציוד בידוד Cardiomyocyte ומכשור. (א) מכשירי ניתוח המשמשים לחלץ את העכברלב cannulate האאורטה, מלמעלה למטה: hemostats, מלקחי רקמות, מלקחיים מעוקלים, דומון # 5 מלקחיים בסדר, מספריים לנתח קטנים, איריס מספרית בסדר, מספריים לסחוט בסדר (B) מערכת זלוף Langendorff בשימוש לעכל את לב העכבר. . מאגרים זלוף הם aspirated דרך צינור היניקה (1) על ידי משאבת זלוף (2) ודרך הצינור מוצא משאבה (3) ליציאת הכניסה על ז'קט מים המחומם (4). המאגרים זלוף מתחממים הז'קט המים החמים כשהם נוסעים דרך שפופרת זכוכית ספירלה, תא debubbling, ולאחר מכן מתוך מחט cannulation המחובר ליציאה לשקע זלוף (5), אשר מחוברת על ידי שסתום. צינור החרוטים מתחת תופס המאגרים זלוף, אשר מחדש שהופצו דרך צינור היניקה. יציאת הלחץ (6), יציאת ציות (7) ופורקים (8) להישאר סגור במהלך זלוף על מנת לשמור על קצב זרימה מתמיד. ז'קט המים מחוממים על ידי אמבט מים במחזור להיכנס דרך ה כניסת ז'קט דואר (9) ו לשקע (10) יציאות. דוכן טבעת משמש להחזיק את הז'קט מים המחומם במצב אנכי (מלחציים אדומים, בסיס שחור מתחת מתלת צינור חרוטים הסגולה). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. סכמטי סקירה כללית של זלוף מערכת. חלקים חשובים של מנגנון זלוף מסומנים כנזכר בכתב היד. כיוון זרימת חיץ זלוף מסומן בחצים. הערה המיקום של צינורית אבי העורקים, קצה אשר צריך להיות גלוי דרך אבי העורקים שקוף, להבטיח שזה ממוקם מעל שסתום אבי העורקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ילדה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1"> איור 3
איור 3. מבודד למבוגרים עכבר cardiomyocytes. Cardiomyocytes בודד זורע על 96 צלחות היטב מצופים Laminin כמתואר בפרוטוקול בזאת. (א) טרי cardiomyocytes מבודד, זורע כ 8,000 תאים / 2 סנטימטר. שים לב טרי מבודד, cardiomyocytes הקיימא להופיע כ מוט בצורה עם קצוות חדים (חץ לבן). עם זאת, שריר לב כי נראה שיש לך הממברנה חיצונית מפוזרת תחת brightfield מת. במהלך כמה ימים הראשונים של התרבות, cardiomyocytes להניח צורה מעוגלת (B). (ג) Immunostaining עבור אלפא-actinin (ירוק) מגלה פסים sarcomeric מאפיין בתוך cardiomyocyte ב-בידוד פוסט D1. כתם גרעיני (DAPI) בכחול. התוכניות הנצפות ביותר תקריב תמונה של האזור המתואר בתמונה התחתונה. (ד) (E) Brightfield ותמונות epifluorescent להראות cardiomyocytes ביום 11-בידוד פוסט transduced עם נושאת אדנו עיתונאי GFP תחת שליטה של מקדם CMV ( מתנה מרוברט ג'רארד ב UT Southwestern). התאים היו זורעים כ 18,000 תאים / 2 ס"מ והיו transduced ביום 0 באמצעות ריבוי של זיהום של כ -800 יחידות פלאק יוצרי (PFU) לכל תא. ברי סולם:. 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

חיץ בידוד Cardiomyocyte (מ.ח.)
להוסיף 900 ​​מ"ל מים ultrapure כדי מבחנה נקייה תחת magערבוב מגנטי.
מוסיפים את הרכיבים חיץ בטבלה כמצוין.
רְכִיב MW Conc הסופי (מ"מ) 1X (g / L)
NaCl 58.44 120 7.013
KCl 74.55 5.4 .403
Na 2 HPO4.7H 2 O 268.07 0.33 .088
MgSO 4 .7H 2 O 246.48 0.5 0.123
טאורין 125.1 30 3.753
BDM 101.1 10 1.011
HEPES 238.3 25 5.958
גלוקוז 180.16 22 3.964
התאם את השנינות pHh 5 M NaOH.
כוון את עוצמת הקול עד 1 ליטר עם מי ultrapure.
סינון סטרילי w / 0.22 מיקרומטר מסנן אבק.
הוסף 0.5 μl של 0.1 U / ml אינסולין לליטר חיץ בידוד cardiomyocyte.
חיץ זלוף
רְכִיב סופי נפח (מ"ל)
מ.ח. - 200
EGTA (0.4M) 0.4 מ"מ 0.2
סה"כ - 200
חיץ עיכול
רְכִיב סופי כמות
מ.ח. - 15 מ"ל
CaCl2 (1M) 300מיקרומטר 4.5 μl
פרוטאז XIV 0.2 מ"ג / מ"ל 3 מ"ג
collagenase II 2.4 מ"ג / מ"ל 36 מ"ג
סה"כ - 15 מ"ל
חיץ עצור
רְכִיב סופי נפח (מ"ל)
חיץ זלוף 95% 14.25
CaCl2 (1M) 1.5 מ"מ 22.5
FBS 5% 0.75
סה"כ - 15 מ"ל
תקשורת ותרבות
רְכִיב סופי % נפח (מ"ל)
תקשורת MEM 90% 90
FBS 10% 10
Primocin 0.2% 0.2
סה"כ 100% 100 מ"ל
אפשר התקשורת והתרבות לאזן על 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני.

טבלה 1: פתרונות חוצצים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לבריאות הכללית של cardiomyocytes המבודד תלויה במספר היבטים החשובים של פרוטוקול זה. ראשית, זהו הזמן של מיצוי לב זלוף הוא קריטי וצריכה להתבצע 5 דקות או פחות. הסרת סידן עוזרת לניתק תאי תאי אינטראקציות, אבל יכולה להשפיע בריאות לטווח ארוכת תא שלילי. 29-32 לכן, אנו מוצאים את זה מספיק כדי להסיר סידן במהלך הדקות הראשוניות של זלוף ידי EGTA (חומצת tetraacetic אתילן גליקול) קלאציה, 22 אבל מהר מאוד לשחזר סידן במהלך עיכול השלבים הבאים.

השימוש פרוטאז XIV משפר באופן משמעותי את יעילות העיכול לעומת Collagenase לבד. פעולה זו מפחיתה אי התאמה עקב השתנות אצווה collagenase, 18,24, ומגביר את הטוהר של cardiomyocytes ידי הקלת ההפרדה במהלך שקיעה הכבידה. עם זאת, יתר העיכול ימנע מצורף יעיל למצע התרבות, כך אני איזון עדיןs required לייעל תא תשואה וטוהר תוך שמירה מצורף התא ואת הכדאיות. לפיכך, ריכוז של פרוטאזות ואורך העיכול יכול להיות שונה כדי להתאים את מטרות הניסוי. באופן כללי, במידה פחותה של עיכול תשפר את הקובץ המצורף והישרדות של cardiomyocytes. שימוש טריפסין דווח כמה פרוטוקולי בידוד cardiomyocyte. 18 עם זאת, תוספת של טריפסין לקוקטייל פרוטאז משמש כאן (collagenase ו- XIV פרוטאז) מפחיתים את יכולת הקיום ארוך הטווח של cardiomyocytes בתרבות, אולי בשל יתר עיכול או מחשוף של פני שטח חיוניים ו / או חלבונים תאים מטריקס.

הכללת butanedione monoxime (BDM) במהלך בידוד מעכב התכווצות שריר לב, ובכך מקטינה השלכות שליליות בשל התכווצות מסוף, הוצאה אנרגטית, ופרדוקס סידן. 29,33 עם זאת, מניסיוננו, הסרת BDM לפני התרבות מזרזת dedifferentiatio n ומאפשרת לתאים להסתגל לתרבות בשני ממדים.

חשוב לציין כי כל התאמה לטווח ארוך לתרבות 2-D עשוי להשפיע על היבטים פונקציונליים של cardiomyocytes, כגון התכווצות. לפיכך, ניסויי התכווצות ו אלקטרופיזיולוגיה צריכות להתבצע מייד לאחר בידוד, כאשר ילידי ארגון sarcomeric עדיין לא נפגע. יתר על כן, כמו כל ניסוי במבחנה, התאים בתרבית הם נטולי השפעות חיצוניות מסוימות נוכחיות in vivo, כגון איתות לחות או חיסונית. מצד השני, יכולות להיות מיושמות שיתוף תרבויות מוגדרות ללמוד את יחסי הגומלין בין cardiomyocytes סוגי תאים אחרים. 5,34 בנוסף, בתרבות במבחנה יכול לשמש כדי לחקור התנהגות cardiomyocyte עם אותות מולקולריים שהוגדרו בתקשורת ובתרבות. לפיכך, המטרות הכוללות של הניסוי יש לשקול בזהירות ומשקליו נגד המגבלות והיתרונות של מערכת התרבות הזאת.

הילדה = "jove_content"> הפרוטוקול המתואר כאן משתמש 10% בסרום שור עובר (FBS) כדי לשפר את הכדאיות של cardiomyocytes העיקרי בתרבות. 35 יצוין כי FBS וסר מן החי אחר מכילים רכיבים ידועים כי עשוי להשפיע על פיזיולוגיה הסלולר . 36,37 למרות נוכחות היטב להערכה של גורמי גדילה FBS, 38 התרבויות cardiomyocyte המוצגים כאן אינם מתרבים. במקום זאת, בלוק מחזור התא נראה נכס מתמשך של cardiomyocytes עכבר בוגר vivo לשעבר, מופצת מעת היציאה מחזור התא שלהם בתקופה הסב-לידתית של פיתוח. 12,39 מאפיין זה הוא עניין מרכזי בתחום של רפואה רגנרטיבית הלב, שבו נטילה של cardiomyocytes יונקים בוגרים כדי פנוטיפ שגשוג הייתה המטרה רדף בכבדות. 3,26,40-42 יש לציין, הוא כרגע לא ברור מה dedifferentiation תואר נדרש cardiomyocytes כדי להזין מחדש את מחזור התא, אך contribution של dedifferentiation התחדשות חוליות תחתונות נתמך היטב 43,44,10,11 יתר על כן, dedifferentiation נצפה ויותר בהתרבות cardiomyocyte והתחדשות לב במערכות יונקות, לפחות ברמה התפקודית, כוללים פירוק myofibrillar 6,12,9 לפיכך, המדינה של בידול של cardiomyocytes בתרבות יש לשקול בזהירות ומתנגן בהתאם לצרכים של מטרות המחקר. ככזה, תנאי ההתרבות עלולים להיות שונים כדי לצמצם עוד יותר ריכוז בסרום, תחליפים בסרום מוגדרים לשימוש או סרום ללא מדיה. לדוגמה, cardiomyocytes עכברוש מבוגר מפגין סרקומר מאורגן היו לטווח ארוך תרבותי ללא בסרום, אך גורמי גדילה כגון גורם גדילה פיברובלסטים, גורם הגדילה באפידרמיס, ו triiodothyronine שימשו בתקשורת מוגדר. 45 זה מתקבל על הדעת כי ניסוחים מדיה דומה, או אפשריות אחרות ניסוחים כגון אלה מותאמים differentiפרוטוקולים ation, ניתן להשתמש 46 לשמור cardiomyocytes עכבר בוגר מובחנים היטב בתרבות המציגים מבנים sarcomeric-מאורגן. ניסוחים חלופיים יכולים להתפתח גם להשיג פנוטיפים אחרים (כגון cardiomyocytes דה-המובחן מאוד) 6 בהתאם לצרכימים של הניסוי, אבל עבודה נוספת תידרש.

תפקידיו של פיברובלסטים היו מעורבים בבקרה של מחזור תא בילוד עכבר cardiomyocyte 5 והבחנות cardiomyocyte עכבר בוגר (באמצעות איתות IL6 היפרטרופית) בתרבות לטווח ארוכה. 19 לפיכך, צמיחת פיברובלסטים בתרבות תטופלנה בפרשנויות ניסיון . צמיחת פיברובלסטים בתרבות יכול להיות נשלט על ידי תוספת של צמיחה הגבלת תרכובות כמו ציטוזין arabinoside 19 (AraC) או באמצעות צעדים מראש ציפוי. 28 עם זאת, AraC יהיה גם לעכב את הצמיחה של cardiomyocytes, כך אלטרנטיבהשיטות יש להשתמש כדי לשלוט על צמיחה של הפיברובלסטים מחקרים לגבי מחזור התא cardiomyocyte. בפרוטוקול המתואר כאן, טוהר cardiomyocyte ראשוני יכול להיות מוגבר על ידי חזרה על צעד השקיעה הכביד (ראה 1.4.8).

השיטות בזאת לספק מערכת במבחנה, שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד את אופי המצור מחזור התא cardiomyocyte יונקים בוגרים. בניגוד תאים ראשוניים מאורגניזמים אחרים, כגון עכברים או שפן ניסיונות, cardiomyocytes העכבר הראשי מציע שפע של כלים גנטיים חזקים היטב מאופיינים, כמו שושלת מבוססת Cre התחקות מודלים עקומים, 47 אשר ניתן להשתמש בם בקלות לזהות תאים שמקורם cardiomyocytes קיים. 12,48 בנוסף, cardiomyocytes בעכברים הבוגר העיקרי שהיה נתון לתנאים התפתחותי היליד שתוצאתן מצור מחזור התא, בניגוד שורות תאים ו ES בדיל או תאי iPSC 46 אשר, למרות convenien שלהםce והתאמת מסכי סמים גדולים, 2 יכולים בעלת תועלת מוגבלת בניסויי חיטוט אופי יציאת מחזור תא cardiomyocyte המבוגר.

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה לבודד cardiomyocytes מבוגר עכבר התרבות. מספר שיטות בעבר הדגימו את הבידוד של cardiomyocytes עכבר בוגר ללימוד לטווח קצר, אך עד כה, כמה דוחות קיימים של תרבות ארוכת הטווח של cardiomyocytes מבוגר ועכבר. 18,19 היכולת לשמר cardiomyocytes עכבר בוגר בתרבות צריכה לאפשר במחקר in vitro של ביולוגיה cardiomyocyte בתנאים ניסיוניים המחייבות בדיקה לטווח ארוך. לדוגמה, ביטוי גנים ניתן להשפיע באמצעות וקטורים אדנו, אשר בדרך כלל דורשים כמה ימים כדי להשיג ביטוי מלא. שינויים וניתוח פנוטיפי לאחר עשויים לדרוש תקופות ארוכות יותר אפילו זמן תלוי מטרות הניסוי. השיטות שהוצגו כאן לאפשר התרבות של cardiom עכבר בוגרyocytes במשך כמה שבועות. זה אמור לספק מערכת חזקה לחקירת שאלות זהיר בביולוגיה cardiomyocyte, כגון אלה הנוגעים לרגולציה מחזור התא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

פרויקט זה מומן על ידי תוכנית UCSF למחקר ביו-רפואי פריצת דרך (מומן בחלקו על ידי הקרן סנדלר), עבור לנתיב NIH כדי פרס העצמאות (R00HL114738), וקרן הבן אדוארד Mallinckrodt. ג'יי ג'יי היה נתמך על ידי מענק דוקטורט מ- NIH (T32HL007731). המחברים אחראים בלעדי לתוכן של עבודה זו, אשר לא בהכרח מייצגת את הדעות הרשמיות של NIH.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Heated water jacket Radnoti 158831
Circulating heated water bath, Isotemp Fisher Scientific 3013
Laboratory pump Watson-Marlow 323
Hemostats Exelta 63042-090
Tissue forceps VWR 470128034
Dumont #7 curved forceps FST 91197-00
Dumont #5 fine forceps FST 11251-20
Small dissection scissors VWR 470128034
Extra fine bonn scissors FST 14084-08
Fine spring scissors FST 91500-09
Name Company Catalog Number Comments
Materials
NaCl Sigma S9888
KCl Sigma P9541
Na2HPO4.7H2O Fisher S25837
MgSO4.7H2O Fisher S25414
Taurine Sigma 86329
Butane dione monoxime (BDM) Sigma B0753
HEPES Fisher  BP310100
Glucose Sigma G-7021
Insulin Novo Nordisk 393153
EGTA Amresco 0732-288
Protease, type XIV Sigma P5147
Collagenase II Worthington LS004176
MEM Corning 15-010-CV
FBS, heat inactivated JRS 43613
Primocin Invitrogen NC9141851
Ethyl Carbamate Alfa Aesar AAA44804-18
215 micron mesh Component supply U-CMN-215-A
20 G blunt ended needle Becton Dickinson 305183
20 G beveled needle Becton Dickinson 305176
Lab tape VWR 89097-990
Surgical tape 3M 1527-0
Silk suture, 7-0 Teleflex 15B051000
Mouse anti-alpha-actinin antibody Sigma A7811
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody Thermo Fisher A21121

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Patel, A. K., Celiz, A. D., et al. A defined synthetic substrate for serum free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
  2. Mathur, A., Loskill, P., et al. Human iPSC-based Cardiac Microphysiological System For Drug Screening Applications. Sci Rep. 5, 8883 (2015).
  3. Mahmoud, A. I., Kocabas, F., et al. Meis1 regulates postnatal cardiomyocyte cell cycle arrest. Nature. 497 (7448), 249-253 (2013).
  4. Baumgartner, S., Halbach, M., et al. Electrophysiological and morphological maturation of murine fetal cardiomyocytes during electrical stimulation in vitro. J Cardiovasc Pharmacol Ther. 20 (1), 104-112 (2015).
  5. Ieda, M., Tsuchihashi, T., et al. Cardiac fibroblasts regulate myocardial proliferation through beta1 integrin signaling. Dev Cell. 16 (2), 233-244 (2009).
  6. Zhang, Y., Li, T. S., et al. Dedifferentiation and proliferation of mammalian cardiomyocytes. PLoS One. 5 (9), e12559 (2010).
  7. Engel, F. B., Schebesta, M., et al. p38 MAP kinase inhibition enables proliferation of adult mammalian cardiomyocytes. Gene Dev. 19 (10), 1175-1187 (2005).
  8. Sakurai, T., Lanahan, A., Woolls, M. J., Li, N., Tirziu, D., Murakami, M. Live cell imaging of primary rat neonatal cardiomyocytes following adenoviral and lentiviral transduction using confocal spinning disk microscopy. J Vis Exp. (88), e51666 (2014).
  9. Ahuja, P., Perriard, E., Perriard, J. C., Ehler, E. Sequential myofibrillar breakdown accompanies mitotic division of mammalian cardiomyocytes. J Cell Sci. 117 (Pt 15), 3295-3306 (2004).
  10. Kikuchi, K., Holdway, J. E., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4(+) cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  11. Jopling, C., Sleep, E., Raya, M., Martì, M., Raya, A., Izpisúa Belmonte, J. C. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  12. Porrello, E. R., Mahmoud, A. I., et al. Transient Regenerative Potential of the Neonatal Mouse Heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  13. Heallen, T., Morikawa, Y., et al. Hippo signaling impedes adult heart regeneration. Development. 140 (23), 4683-4690 (2013).
  14. Lin, Z., Zhou, P., et al. Pi3kcb links Hippo-YAP and PI3K-AKT signaling pathways to promote cardiomyocyte proliferation and survival. Circ Res. 116 (1), 35-45 (2015).
  15. Zebrowski, D. C., Vergarajauregui, S., et al. Developmental alterations in centrosome integrity contribute to the post-mitotic state of mammalian cardiomyocytes. eLife. 4, e05563 (2015).
  16. Schluter, K. D., Piper, H. M. Practical Methods in Cardiovascular Research. , Springer. Berlin Heidelberg: Berlin, Heidelberg. (2005).
  17. Zhou, Y. Y., Wang, S. Q., et al. Culture and adenoviral infection of adult mouse cardiac myocytes: methods for cellular genetic physiology. Am J Physiol Heart Circ Phys. 279 (1), H429-H436 (2000).
  18. Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
  19. Fredj, S., Bescond, J., Louault, C., Potreau, D. Interactions between cardiac cells enhance cardiomyocyte hypertrophy and increase fibroblast proliferation. Journal of Cellular Physiology. 202 (3), 891-899 (2005).
  20. Li, Z., Sharma, R. V., Duan, D., Davisson, R. L. Adenovirus-mediated gene transfer to adult mouse cardiomyocytes is selectively influenced by culture medium. J Gene Med. 5 (9), 765-772 (2003).
  21. Luo, J., Deng, Z. L., et al. A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasy system. Nat Protoc. 2 (5), 1236-1247 (2007).
  22. Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J Physiol Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
  23. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357 (2014).
  24. Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am J Physiol Heart Circ Phys. 271 (3), H1250-H1255 (1996).
  25. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
  26. Di Stefano, V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J Biol Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
  27. Malouf, N. N., McMahon, D., Oakeley, A. E., Anderson, P. A. A cardiac troponin T epitope conserved across phyla. J Biol Chem. 267 (13), 9269-9274 (1992).
  28. Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and culture of neonatal mouse cardiomyocytes. J Vis Exp. (79), e50154 (2013).
  29. Daly, M. J., Elz, J. S., Nayler, W. G. Contracture and the calcium paradox in the rat heart. Circ Res. 61 (4), 560-569 (1987).
  30. Piper, H. Culturing of calcium stable adult cardiac myocytes. J Mol Cell Cardiol. 14 (7), 397-412 (1982).
  31. Ashraf, M. Correlative studies on sarcolemmal ultrastructure, permeability, and loss of intracellular enzymes in the isolated heart perfused with calcium-free medium. Am J Pathol. 97 (2), 411-432 (1979).
  32. Piper, H. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovasc Res. 45 (1), 123-127 (2000).
  33. Higuchi, H., Takemori, S. Butanedione monoxime suppresses contraction and ATPase activity of rabbit skeletal muscle. J Biochem. 105 (4), 638-643 (1989).
  34. Rother, J., Richter, C., et al. Crosstalk of cardiomyocytes and fibroblasts in co-cultures. Open biology. 5 (6), 150038 (2015).
  35. Fujio, Y., Nguyen, T., Wencker, D., Kitsis, R. N., Walsh, K. Akt Promotes Survival of Cardiomyocytes In Vitro and Protects Against Ischemia-Reperfusion Injury in Mouse Heart. Circulation. 101 (6), 660-667 (2000).
  36. Dambrot, C., Braam, S. R., Tertoolen, L. G. J., Birket, M., Atsma, D. E., Mummery, C. L. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. Journal of cellular and molecular medicine. 18 (8), 1509-1518 (2014).
  37. Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: Comparison with serum-supplemented medium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 128 (1), 376-382 (1985).
  38. Zheng, X., Baker, H., Hancock, W. S., Fawaz, F., McCaman, M., Pungor, E. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnology progress. 22 (5), 1294-1300 (2006).
  39. Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development. Am J Physiol. 271 (5 Pt 2), H2183-H2189 (1996).
  40. Engel, F. B., Hsieh, P. C. H., Lee, R. T., Keating, M. T. FGF1/p38 MAP kinase inhibitor therapy induces cardiomyocyte mitosis, reduces scarring, and rescues function after myocardial infarction. P Natl Acad Sci USA. 103 (42), 15546-15551 (2006).
  41. Tian, Y., Liu, Y., et al. A microRNA-Hippo pathway that promotes cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration in mice. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra38 (2015).
  42. Soonpaa, M. H., Koh, G. Y., et al. Cyclin D1 overexpression promotes cardiomyocyte DNA synthesis and multinucleation in transgenic mice. J Clin Invest. 99 (11), 2644-2654 (1997).
  43. Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev Biol. 365 (2), 339-349 (2012).
  44. Wu, C. H., Huang, T. Y., Chen, B. S., Chiou, L. L., Lee, H. S. Long-Duration Muscle Dedifferentiation during Limb Regeneration in Axolotls. PLoS One. 10 (2), e0116068 (2015).
  45. Nag, A. C., Lee, M. L., Kosiur, J. R. Adult cardiac muscle cells in long-term serum-free culture: myofibrillar organization and expression of myosin heavy chain isoforms. In vitro cellular & developmental biology journal of the Tissue Culture Association. 26 (5), 464-470 (1990).
  46. Lian, X., Hsiao, C., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. P Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Sohal, D. S., Nghiem, M., et al. Temporally Regulated and Tissue-Specific Gene Manipulations in the Adult and Embryonic Heart Using a Tamoxifen-Inducible Cre Protein. Circ Res. 89 (1), 20-25 (2001).
  48. Hsieh, P. C. H., Segers, V. F. M., et al. Evidence from a genetic fate-mapping study that stem cells refresh adult mammalian cardiomyocytes after injury. Nat Med. 13 (8), 970-974 (2007).

Tags

ביולוגיה תאית גיליון 114 בידוד cardiomyocyte תרבות שיטה תמרה מבוגר עכבר
בידוד, תרבות התמרה של cardiomyocytes עכבר למבוגרים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N.… More

Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), e54012, doi:10.3791/54012 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter