Abstract
Cardiomiócitos cultivados podem ser usadas para estudar a biologia dos cardiomiócitos utilizando técnicas que são complementares a sistemas in vivo. Por exemplo, a pureza ea acessibilidade da cultura in vitro permite um controle fino sobre análises bioquímicas, imagens ao vivo e eletrofisiologia. cultura a longo prazo dos cardiomiócitos oferece acesso a abordagens experimentais adicionais que não podem ser concluídos em culturas de curto prazo. Por exemplo, a investigação in vitro de desdiferenciação, do ciclo celular de re-entrada e divisão de células tem, até agora, em grande parte sido restrita a cardiomiócitos de rato, que parecem ser mais robusta em cultura a longo prazo. No entanto, a disponibilidade de um rico conjunto de ferramentas de linhagens de camundongos transgênicos e modelos de doenças bem desenvolvidos tornar os sistemas de rato atraente para a investigação cardíaca. Embora existam vários relatos de rato adulto isolamento dos cardiomiócitos, alguns estudos demonstram sua cultura a longo prazo. Apresentado aqui, é um método passo-a-passo para oisolamento e longo prazo cultura de cardiomiócitos adultos do mouse. Em primeiro lugar, a perfusão de Langendorff retrógrada é usado eficientemente para digerir o coração com proteases, seguido por purificação por gravidade sedimentação. Após um período de desdiferenciação após o isolamento, as células gradualmente anexar à cultura e podem ser cultivadas por semana. ligado celular de adenovírus é utilizado para transduzir eficientemente os cardiomiócitos isolados. Esses métodos fornecem um simples sistema de modelo, mas poderosa para estudar a biologia cardíaca.
Introduction
Cardiomiócitos cultivados são frequentemente usados para monitorar o comportamento das células em um ambiente bem controlado in vitro. Por exemplo, as propriedades morfológicas celulares, eléctricos, bioquímicos, ou mecânicas pode ser estudada em substratos modificados, 1,2 em meio definido, e em resposta a fármacos de moléculas pequenas, péptidos, de regulação génica, 3 ou estimulação eléctrica. 4 O conteúdo celular pode também ser controlado usando co-culturas definidas. 5 Estas experiências in vitro são úteis em grande droga ou telas genéticos e complementar métodos in vivo para vários tipos de investigações envolvendo a biologia dos cardiomiócitos.
cultura de longo prazo permite avenidas experimentais que requerem períodos de tempo prolongados para alcançar a mudança fenotípica. Um exemplo oportuno é o da proliferação de cardiomiócitos de mamíferos adultos, onde desdiferenciação, ciclo celular re-entrada, e a divisão celular é normalmente estudado ao longo SEdias veral a semanas. 6,7 Aqui, o tempo de cultura estendido facilita a manipulação genética, 7,8 desdiferenciação funcional (por exemplo, a desmontagem sarcomérica) 9 e desdiferenciação potencialmente transcrição. 6 subsequente ciclo celular re-entrada e de divisão celular requer períodos de cultura ainda mais longos para observar, especialmente se vários ciclos de divisão são o objetivo experimental. A importância do ciclo celular cardiomiócitos é central para diversos trabalhos científicos recentes chave na regeneração do coração, onde o desdiferenciação e proliferação de cardiomiócitos pré-existentes tem sido mostrado responsável para a regeneração cardíaca no peixe-zebra e ratinhos neonatais. 10-12 Assim, a possibilidade para estimular a desdiferenciação do ciclo celular e re-entrada no cardiomiócitos adultos mamíferos continua a ser uma questão-chave na regeneração coração humano 13-15
Experimentos in vitro estudando o ciclo celular de cardio mamíferos I nmiócitos foram predominantemente utilizadas fontes de rato, devido à sua relativa facilidade de cultura a longo prazo em comparação com os modelos de ratinho. 16 No entanto, os sistemas de murideo oferecer uma rica fonte de ferramentas transgénicos bem caracterizados e modelos de doenças que são úteis em estudos in vitro e in vivo protocolos. Por exemplo, o rastreamento de linhagem baseada em Cre permitiu a identificação de cardiomiócitos pré-existentes como fonte de regeneração do miocárdio no coração neonatal do rato in vivo. 12 estudos in vitro de cardiomiócitos de rato neonatal traçado da linhagem permitiram a análise de interações com estromal células através de co-cultura com fibroblastos. 5 no entanto, devido aos seus desafios, 17 existem poucos relatos de cultura e isolamento de longo prazo de cardiomiócitos de rato adulto 18,19.
O isolamento dos cardiomiócitos viáveis de ratinho adulto para a cultura a curto prazo só é conhecido por ser uma tarefa difícil. este PROTOCol fornece instruções passo-a-passo sobre como conseguir cardiomiócitos viáveis de ratos adultos que podem ser usados tanto para curto prazo, bem como investigações de longo prazo. Cardiomiócitos isolados usando este protocolo pode ser eficientemente transduzidas com vetores adenovirais 20,21 e cultivadas durante semanas. Estes métodos proporcionam um sistema poderoso para estudar a biologia dos cardiomiócitos in vitro.
Os métodos aqui descritos são baseados em vários elementos de obras anteriores usando variações da perfusão retrógrada Langendorff. 18,22 Apesar de vários protocolos foram publicados sobre o isolamento dos cardiomiócitos de rato adulto para a cultura de curto prazo e de estudo, a vantagem de 23-25 este protocolo é a capacidade de cultura do isolado cardiomiócitos longo prazo. Isso será útil no estudo de processos celulares que envolvem a expressão de genes ectópicos e que requerem períodos de tempo prolongados, tais como em estratégias de reprogramação celulares.
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Protocol
Todos os procedimentos descritos aqui foram aprovados pelo uso e cuidados Comitê Institucional Animal da Universidade da Califórnia, em San Francisco.
NOTA: Resumidamente, após extrair o coração do tórax rato, perfusão retrógrada coronariana é usado para digerir de forma eficiente a matriz extracelular com colagenase e XIV protease. Os ventrículos são, em seguida, isolado, dissociadas mecanicamente e filtrada para uma suspensão de células única. sedimentação por gravidade é realizada para isolar cardiomiócitos, que são separados a partir de células do estroma, como fibroblastos e as células endoteliais pela sua elevada densidade. Os cardiomiócitos purificadas podem ser cultivadas durante semanas a poliestireno revestidas com laminina e transduzidas com vectores de genes de adenovírus.
Isolamento 1. Cardiomyocyte
- Prepare tampões, Estação cirúrgico e aparelho de perfusão
- Prepare tampões e meios de comunicação de acordo com a Table 1.
- Ligue banho de água circulante, ajustar a temperatura de entrada de modo que a saída da camisa de água aquecida a uma temperatura de 37 ° C.
- sistema de perfusão limpo por lavagem com etanol 70%. Em seguida, remover todos os vestígios de etanol a partir do sistema, através de lavagem com vários volumes de água estéril.
- Carregar o sistema de perfusão com tampão de perfusão (Tabela 1). Em primeiro lugar a água de drenagem do sistema, em seguida, lavar com 2 volumes de tampão de perfusão. Em seguida, encher o espaço morto com tampão de perfusão de modo que a coluna interna do revestimento de calor é cheia com tampão de perfusão, mas a câmara de debubbling está vazia.
DICA: Garantir que não haja bolhas de ar estão presentes na linha de baixo da câmara de debubbling. Para remover as bolhas recalcitrantes, envolver todas as torneiras e permitir que a pressão para construir dentro da linha por alguns segundos. Em seguida, solte a torneira inferior, permitindo que o tampão de perfusão de alta pressão para jato da tomada; o fluxo rápido e turbulence vai ajudar a desalojar bolhas que são capturados perto da saída de perfusão. - Prepara-se uma seringa com a agulha para ser utilizada para o uso da aorta. Anexar uma agulha romba de 18 L a uma seringa de 1 mL cheio com tampão de perfusão. Remova as bolhas de ar e fixar o conjunto da seringa para um braço do iluminador de dissecação miscroscope com fita laboratório.
DICA: Para criar uma pipeta sem corte de uma agulha chanfrada, transecto o eixo da agulha com cortadores de fio. Então afiar a ponta com uma pedra de lixar até que a ponta é plana.
NOTA: Para reduzir o deslizamento da aorta a partir da agulha durante a canulação, encrespar o eixo da agulha de punção usando uma lâmina de barbear. Fixar a agulha pelo cubo e do eixo superior, em seguida, via a lâmina e para trás perpendicularmente ao eixo longo do eixo da agulha durante a rotação até várias ranhuras ter sido criado dentro de 1 cm da ponta da haste de agulha. Mudar para um novo aparelho de barbear quando a lâmina torna-se maçante. - Coloque um pano limpoprato de petri abaixo do microscópio de dissecação para conter o coração durante a canulação. Posicionar o braço iluminador de tal modo que a ponta da cânula é perto da borda do campo de visão, mas não obstruindo a dissecção. Assegurar a ponta da cânula é abaixo da borda da placa de Petri.
NOTA: Para ajudar a imobilizar o coração durante a dissecção, coloque uma pequena (~ 5-7 cm2) quadrada de 215 mesh micron na placa de Petri. Quando o coração é colocada sobre esta malha, que vai criar fricção para reduzir o deslizamento e rotação do coração durante a manipulação mecânica. - Laço 2 suturas soltas com nós overhand duplas em torno do cubo da cânula da agulha a ser utilizados para a fixação da aorta.
- Extracção do coração e canulação
- Administrar heparina (5 UI / g de peso corporal) por meio de injecção intraperitoneal. Esperar 20 min para permitir que a heparina para fazer circular para o coração.
- Anestesiar o rato por injeção intraperitonealião de carbamato de etilo de 20% (2 mg de carbamato de etilo / g de peso corporal). Observar de perto até que o mouse está sob anestesia profunda (aproximadamente 3-5 minutos).
NOTA: anestesia profunda é confirmado pela falta de ambos pitada dedo do pé e dos reflexos da córnea. Se o rato não atingiu anestesia profunda por 8-10 min, em seguida, administrar uma dose adicional de carbamato de etilo. Embora as respostas individuais à anestesia irá variar entre ratos, falha para entrar anestesia profunda após a primeira dose pode indicar carbamato de etila degradada, o que pode impedir a anestesia profunda, mesmo após a administração repetida. Para evitar a degradação, prepare uma solução fresca de carbamato de etila antes de cada utilização. - Imobilizar o mouse para a plataforma de cirurgia, assegurando cada membro com fita cirúrgica. Desinfectar a área da incisão com uma quantidade generosa de 70% de etanol. Seque com um laboratório-wipe.
- Levante a pele com uma pinça, logo abaixo do esterno. Faça uma incisão lateral com uma tesoura pequena, corte through a pele e abdômen.
- Use hemostats para levantar delicadamente a caixa torácica através do esterno. Usando pequenas tesouras de dissecação, alargar a incisão em forma de V para o axilas. Corte através da primeira costela e perfurar o diafragma em cada lado.
- Continue a levantar a caixa torácica com hemostats e usar uma tesoura pequena Iris para transecto completamente o diafragma. Tome cuidado para não perfurar o coração.
- Retrair a caixa torácica rostralmente usando hemostats anexados e rapidamente, mas estenda cuidadosamente a incisão em forma de V, cortando através da caixa torácica em direção à axila em ambos os lados. Retrair a parte do meio da caixa torácica total e estabelecer as hemostats ligados para manter no lugar.
- Remover o pericárdio usando uma pinça fina.
- Enquanto suavemente levantar o coração usando uma pinça curva, transecto as veias e artérias ligadas ao coração. Colocar imediatamente o coração em tampão de perfusão gelada para retardar a contração muscular.
- Colocar o coração num prato de petri sobum microscópio de dissecção (local em um pequeno pedaço de 215 mm de malha para ajudar a imobilizar durante a dissecção). Apare qualquer tecido não cardíaca excesso usando finas íris tesoura. Tenha cuidado ao cortar perto da aorta.
- Transecto da aorta perto da artéria brachioencephalic, e tomar cuidado para não deixar bolhas ou restos de tecido entrar na abertura.
- Encher a placa de petri contendo o coração com tampão de perfusão de gelo frio de tal modo que o nível do líquido sobe acima da abertura da cânula. A bainha da aorta para a cânula de tal modo que a ponta é imediatamente distai à válvula aórtica.
NOTA: Para reduzir o risco de embolia gasosa, comprimir ligeiramente a seringa sobre a cânula antes da canulação, a fim de remover as bolhas de ar possíveis que podem ter desenvolvido no final da cânula. Para além disso, manter a ponta da cânula da aorta e sob a superfície da solução para evitar a introdução de bolhas enquanto embainhar a aorta. - Deslize um pré-amarrado 7-0 sutura de seda para baixoo eixo da agulha de punção e a posição imediatamente acima da ponta da agulha. Apertar o nó com uma pinça fina. Repita este passo com a segunda sutura colocado logo acima do primeiro.
NOTA: Verifique se a ponta da agulha está ainda acima da válvula aórtica antes e depois de apertar. - Lentamente deprimir a seringa para ejectar 0,5 ml de tampão de perfusão através da vasculatura coronária.
NOTA: Se a punção foi bem-sucedida, o sangue vai ser visualizado deixando a vasculatura coronária e pooling fora das veias dorsais e artérias.
IMPORTANTE: O tempo de abertura da cavidade torácica (em particular, a perfuração do diafragma) para perfusão inicial deve ser minimizada para reduzir a exposição hipóxica e maximizar a sobrevivência e a saúde dos cardiomiócitos isolados. Idealmente, este tempo deve ser inferior a 5 min.
- perfusão
NOTA: A perfusão retrógradaaparelho pode ser convenientemente operado em um ambiente limpo em um banco de laboratório padrão ou colocado em uma capela de fluxo laminar para maximizar a esterilidade. No entanto, após a perfusão é completa, os trabalhos devem ser realizados sob fluxo laminar, para minimizar a contaminação.- Gentil mas firmemente remover o hub cânula da seringa (usando luvas estéreis) lentamente torcendo e para trás. Ao puxar a agulha de punção para fora da seringa, lentamente ejectar tampão de perfusão dentro do cubo da agulha, a fim de evitar que as bolhas de ar durante a perfusão.
- Retire o tubo de recirculação de captura de baixo da porta de saída de perfusão e substituir com uma taça de captura de resíduos. Anexar o hub agulha para o adaptador luer que é fixo para a porta de saída de perfusão (Figuras 1, 2) na camisa de água, enquanto a bomba estiver em execução no nível mais baixo (15 RPM, ~ 6 ml / min).
DICA: Ao conectar o centro da agulha ao adaptador luer, permitir que o tampão de perfusão pingando para connecte para o líquido no centro da agulha, a fim de evitar a introdução de bolhas. - Perfundir o coração sem recirculação até 8 ml de tampão de perfusão foram aspirados pelo tubo de carga.
NOTA: O volume de tampão de perfusão aspirado pela mangueira de entrada neste passo assume um volume morto de 7 ml para o sistema de perfusão, dando um total de 15 ml de tampão de perfusão bombeado através do coração. - Remover o tubo de entrada a partir do tampão de perfusão. Permitir ar a ser aspirado pela entrada para menos do que o volume morto do sistema.
NOTA: O volume de ar aspirado neste passo deve ser ajustado para evitar que o ar entre na vasculatura coronária (ver o passo 1.3.7). - Colocar o tubo de entrada para o tampão de digestão (Tabela 1), um pouco acima do fundo do tubo. Alimentação lentamente e permitir que o tubo de entrada para aspirar um volume suficiente para evitar o enchimento excessivo do tubo.
- Visualizar e acompanhar a bolhas de ar entreo tampão de perfusão e o tampão de digestão à medida que viaja através da camisa de calor. Observar o nível de tampão de perfusão no centro do revestimento de calor começará a cair uma vez que a bolha de ar chega à câmara de borbulhagem de. Uma vez que o tampão de digestão atinge a câmara-de borbulhar, o nível do líquido no revestimento de calor permanecerá estável.
IMPORTANTE: Se o nível de tampão de perfusão cai muito baixo, feche a torneira de saída e abra a torneira de ventilação. Permitir que o nível a subir para um nível confortável (3 - 5 polegadas acima do orifício de saída). Em seguida, parar a bomba de perfusão e fechar a torneira ventilação. Abrir a torneira porta de saída e reiniciar a bomba de perfusão. - Assista a solução que emerge do coração. Como o último do tampão de perfusão deixa o coração e o tampão de digestão começa a circular através do coração, mudança de cor de transparente para castanho claro irá ser observado devido à presença de colagenase.
- Perfundir o coração com tampão de digestãopara cerca de 10 - 15 min. O coração começará slouching como o colágeno é degradado e perde suporte mecânico.
- A dissociação mecânica e Purificação
- Retire o coração da cânula com uma pinça e coloque em um prato de petri seco. cortar rapidamente tecido extra-ventricular usando finas íris tesoura. Transfira os ventrículos para um prato contendo tampão de perfusão petri fresca para lavar. Mova a placa de Petri com um capuz estéril e transferir os ventrículos, um prato fresco petri seco.
- Recolha 7,5 ml de tampão de digestão da jaqueta de fogo e adicione 2,8 mL de 1 M CaCl 2, misturar por inversão. Adicionar 2 - 3 ml de tampão de digestão com CaCl2 para os ventrículos na placa de Petri.
NOTA: A concentração de Ca2 + é gerado a partir de 300 a 700 ^ M - Tritura-se rapidamente o tecido ventricular com uma pinça fina, de modo que a maioria das peças é menor do que 1 mm 3. Adicione o restanteing tampão de digestão Ca 2+ complementada a partir do passo 1.3.2 para os ventrículos dissociados na placa de Petri e misturar por agitação suave.
- Colocar a placa de petri em 37 ° C incubadora com 5% de CO 2. Agitar a placa de Petri cada 2 minutos até cardiomiócitos suficientes (ver nota abaixo) foram liberados a partir do tecido.
NOTA: A duração da incubação pode ter de ser ajustada para ajustar o grau de digestão de acordo com as necessidades da experiência. Geralmente, tempos de incubação mais longos, aumentam o rendimento e pureza, mas pode reduzir a taxa de ligação e sobrevivência celular. 5 - 10 minutos é geralmente suficiente para se conseguir um rendimento elevado (~ 5 - 10 x 10 5 células por coração). - Transferir a placa de petri de volta para uma câmara de fluxo laminar. Usando uma pipeta de transferência cortada num ângulo de 45 °, gentilmente pipeta o tecido a dissociar-se ainda mais.
- Use luvas estéreis para dobrar a malha de 215 mm em um cone e mantenha durante um cônico de 50 ml. Pipetaa suspensão de tecido dissociado sobre a rede e permitir que o filtrado para se escoar para os 50 ml cónico. Utilizar 7,5 mL de tampão de paragem pré-aquecido (Tabela 1) para lavar os cardiomiócitos a partir da placa de Petri através da malha, que combina com o primeiro filtrado.
NOTA: Ca2 + é elevado para um volume final de 1,1 mM e FBS a final, 2,5% no tampão de paragem neutraliza a actividade de protease. - Transferir a suspensão de células para uma cónico de 15 ml e deixa-se repousar por gravidade durante 15 minutos.
- Cuidadosamente remover o sobrenadante com uma pipeta de transferência de tal modo que apenas 50 - 100 ul de solução permanece acima das células. Adicionar 10 ml de pré-aquecido, meios de cultura equilibrada (Tabela 1) e misturar por inversão suave. Permitir que os cardiomiócitos para resolver pela força da gravidade para 15 min.
DICA: Para aumentar a pureza, repita o passo 1.4.8 se o desejar. - Remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta de transferência de modo que apenas 50 - 100 ul oF solução permanece acima das células.
2. Cultura cardiomiócitos
- Pré-revestimento de cultura de tecidos tratado com placas de petri com laminina (10 ug / ml) e armazenar a 37 ° C durante 2 h antes de plaqueamento de células. Imediatamente antes do plaqueamento, aspirar a solução de laminina a partir da placa de cultura de tecidos. Lavar uma vez com MEM ou PBS, em seguida, aspirar o líquido residual para remover laminina não adsorvida.
- Adicionar o suficiente pré-aquecido, meios de cultura equilibrada para alcançar densidade celular desejado, misturar por inversão suave. Placa desejada concentração de células no recipiente de cultura (tipicamente 5 - 20 x 10 4 células / cm2). Para avaliar o rendimento de isolamento de cardiomiócitos, contagem de células através de hemocitómetro ou teste da placa através da verificação da densidade ao microscópio. Um coração de ratinho adulto proporciona tipicamente 0,5 - 1,0 x 10 6 células, nesta fase do protocolo.
DICA: Se estiver usando placas de 96 poços, use uma micropip 1.000 ulette com uma ponta de corte com um ângulo de 45 ° para minimizar os danos celulares, devido à força de cisalhamento. Colocar a ponta da pipeta de modo a que estiver em contacto com o fundo do poço, durante a ejecção de suspensão de células a fim de minimizar a introdução de bolhas. - Mover o prato de cultura de células prontamente para uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2 e 95% de humidade. Mudança de mídia conforme necessário para evitar a acidificação: a cada 1 - 5 dias, dependendo da densidade celular. Minimizar manuseamento da placa de cultura durante as primeiras 3 - 6 dias para facilitar a fixação à superfície de cultura de células.
NOTA: Para minimizar a perturbação celular durante alterações na mídia quando as células ainda não estão totalmente ligados, execute uma mudança de meia-media. Lentamente, aspirar a mídia, mantendo a ponta da pipeta logo abaixo da superfície da mídia. Em seguida, adicionar lentamente meios adicional, mantendo a ponta da pipeta apenas acima da superfície dos meios contra a parede da placa de cultura. - Para avaliar a viabilidade de cardiomiócitos, verifiquea morfologia sob microscopia de campo claro. Recém cardiomiócitos isolados manter uma morfologia mais ou menos em forma de haste com bordas afiadas, distintas sob iluminação de campo claro (Figura 2).
NOTA: Confirme viabilidade por coloração das células com azul de tripano. - Para avaliar a pureza do isolamento dos cardiomiócitos, verifique a morfologia celular para identificar cardiomiócitos. Manchar os núcleos com Hoescht 33342 para identificar células totais.
NOTA: Os cardiomiócitos podem ser identificados a partir de não-cardiomiócitos pela sua morfologia característica (rod-shaped) e tamanho (cerca de 100-200 mm de comprimento). Alternativamente, recentemente isolados cardiomiócitos vai manchar positivo para marcadores específicos de cardiomiócitos, como a alfa-actinina 26 (Figura 3C, D) ou troponina T. 27
3. Transdução Gene com Adenovírus
- Prepare lisado celular utilizando adenovírus m estabelecidaétodos. 21 transduzir os cardiomiócitos usando ligado de células a partir de células produtoras de adenovirus 10. No dia 0 ou dia 1 após o isolamento, adicione cuidadosamente o ligado celular para a mídia que contém os cardiomiócitos.
NOTA: A preparação de adenovírus título elevado irá atingir forte expressão em cerca de 48-72 h. Ajuste a multiplicidade de infecção de acordo com o delineamento experimental.
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Representative Results
Um tipo adulto selvagem ICR (CD1) do coração do rato normalmente produz 500.000 a 1 milhão de cardiomiócitos a partir de um isolamento bem sucedido. Imediatamente após o isolamento, as células principalmente manter uma aparência em forma de haste (Figura 3A) com sarcómeros e intactas podem ser utilizados para estudos funcionais que envolvem a contractilidade dos cardiomiócitos. Uma elevada percentagem dos cardiomiócitos em forma de haste (acima de 90%) é uma indicação de perfusão eficaz e digestão. Cardiomiócitos viáveis serão grandes (~ 100-200 uM de comprimento) e parecem ter uma membrana exterior afilado sob iluminação de campo claro (Figura 3A). A imunocoloração para marcadores específicos de cardiomiócitos sarcoméricas, tais como alfa-actinina, irá resultar num padrão de bandas distinto sarcomérica (Figura 3C). Em conjunto com a análise morfológica e de coloração nuclear com DAPI, a imunocoloração pode ser utilizada para avaliar a pureza dos cardiomiócitos isolados. FIBRoblasts será pequeno e redondo, logo após o isolamento, mas vai rapidamente anexar e espalhado em plástico de cultura de células, permitindo assim distinção fácil de cardiomiócitos.
Uma percentagem baixa de cardiomiócitos em forma de haste é uma indicação de um isolamento vencida. Isto pode resultar de uma falha para canular a aorta rapidamente após o coração é extraído a partir do animal. perfusão ineficaz, devido à embolia gasosa ou canulação incorreta por exemplo, também podem afetar a morfologia e viabilidade dos cardiomiócitos.
Depois de vários dias de cultura, os cardiomiócitos assumir uma morfologia arredondada (Figura 3B). Dentro de 1 - 2 semanas, os cardiomiócitos vivo anexar ao substrato e começar a espalhar (Figura 3D, E). As células mortas podem ser identificados pela inclusão de azul de tripano. Um isolamento bem sucedido e cultura irá produzir cerca de 50% cardio ao vivomiócitos após 1 semana. A contaminação por não-cardiomiócitos, tais como fibroblastos irá resultar numa elevada percentagem destas células posteriores na cultura devido ao seu potencial proliferativo. Isto pode ser evitado através do aumento do número de sedimentações de gravidade e / ou através de pré-metalização para aumentar o grau de pureza 28.
A transdução com adenovírus pode ser usado para conseguir a expressão do gene forte dentro de 48-72 horas (Figura 3E). Adenovírus serotipo 5 é eficientes na transdução de cardiomiócitos de rato adulto in vitro devido à elevada expressão do receptor coxackie por adenovírus, mas pode depender do tipo de material utilizado. 20
Figura 1. Cardiomyocyte Equipamentos Isolamento e Instrumentação. Instrumentos cirúrgicos (A) utilizado para extrair o mousecoração e canulação da aorta, de cima para baixo: hemostats, uma pinça, pinça curva, Dumont # 5 pinça fina, pequenas tesouras de dissecação, muito bem íris tesouras, tesouras do aperto finas (b) O sistema de perfusão Langendorff usado para digerir o coração mouse. . tampões de perfusão são aspirados através do tubo de entrada (1) pela bomba de perfusão (2) e através do tubo de saída da bomba (3) para a porta de entrada na camisa de água aquecida (4). Os buffers de perfusão são aquecidos pelo revestimento de água aquecida enquanto viajam através do tubo em espiral de vidro, a câmara de debubbling, e, em seguida, para fora da agulha canulação ligado ao orifício de saída de perfusão (5), que está ligada por uma torneira de passagem. O tubo cônico abaixo pega os buffers de perfusão, que são re-circulado através do tubo de entrada. A abertura de pressão (6), o cumprimento da porta (7) e de ventilação (8) permanecem fechados durante a perfusão, a fim de manter uma taxa de fluxo constante. A camisa de água é aquecida por um banho de água circulante que entra através thentrada e jaqueta (9) e de saída (10) portas. Um posto anel é utilizado para manter a jaqueta aquecida de água em uma posição vertical (braçadeiras vermelhas, base preta abaixo do rack roxo tubo cônico). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Esquema Visão de Perfusão do sistema. Partes importantes do aparelho de perfusão são rotulados como referido no Manuscrito. A direção do fluxo de tampão de perfusão é indicado por setas. Observe o posicionamento da cânula aórtica, cuja ponta deve ser visível através da aorta translúcida, garantindo que é colocado acima da válvula aórtica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Isolado de ratinho adulto cardiomiócitos. Os cardiomiócitos foram isolados e semearam-se sobre Laminina-revestidas placas de 96 poços tal como descrito no protocolo Nisto. (A) cardiomiócitos isolados de fresco, semeadas a aproximadamente 8000 células / cm2. Note-se que recentemente isolados, cardiomiócitos viáveis aparecem cerca de bastonete com bordas afiadas (seta branca). No entanto, os cardiomiócitos que parecem ter uma membrana externa difusa sob brightfield estão mortos. Durante os primeiros dias de cultura, os cardiomiócitos assumir uma forma arredondada (B). (C) imunomarcação para alfa-actinina (verde) revela bandas sarcomérica característica em uma cardiomiócitos em D1 pós-isolamento. mancha nuclear (DAPI) mostrados em azul. Imagem da região delimitada superior mostra ampliada de imagem inferior. (D) (E) de campo claro e imagens de epifluorescência mostram cardiomiócitos no dia 11 pós-isolamento transduzidas com adenovírus transportando um repórter GFP sob o controlo de um promotor de CMV ( um presente de Robert Gerard em UT Southwestern). As células foram semeadas a aproximadamente 18000 células / cm2 e foram transduzidas no dia 0 com uma multiplicidade de infecção de aproximadamente 800 unidades formadoras de placas (PFU) por célula. Barras de escala:. 50 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Tampão de isolamento dos cardiomiócitos (CIB) | |||
| Adicione 900 ml de água ultrapura para um copo limpo sob magagitação magnética. | |||
| Adicionar os componentes do tampão na tabela como indicado. | |||
| Componente | MW | Final Conc (mM) | 1X (g / L) |
| NaCl | 58,44 | 120 | 7,013 |
| KCl | 74.55 | 5.4 | 0,403 |
| Na 2 S 2 HPO4.7H | 268,07 | 0,33 | 0,088 |
| MgSO 4 .7H 2 O | 246,48 | 0,5 | 0,123 |
| taurina | 125,1 | 30 | 3.753 |
| BDM | 101,1 | 10 | 1.011 |
| HEPES | 238,3 | 25 | 5.958 |
| Glicose | 180.16 | 22 | 3,964 |
| Ajustar o pH witH 5 M NaOH. | |||
| Ajustar o volume a 1 litro com água ultrapura. | |||
| Filtrar em condições estéreis W / 0,22 um filtro de vácuo. | |||
| Adicionar 0,5 uL de 0,1 U / ml de insulina por litro de tampão de isolamento dos cardiomiócitos. | |||
| tampão de perfusão | |||
| Componente | Final | Volume (ml) | |
| CIB | - | 200 | |
| EGTA (0,4 M) | 0,4 mM | 0,2 | |
| Total | - | 200 | |
| tampão de digestão | |||
| Componente | Final | Quantidade | |
| CIB | - | 15 ml | |
| CaCl2 (1 M) | 300? M | 4,5 ul | |
| protease XIV | 0,2 mg / mL | 3 mg | |
| colagenase II | 2,4 mg / mL | 36 mg | |
| Total | - | 15 ml | |
| tampão de paragem | |||
| Componente | Final | Volume (ml) | |
| tampão de perfusão | 95% | 14.25 | |
| CaCl2 (1 M) | 1,5 mM | 22,5 | |
| FBS | 5% | 0,75 | |
| Total | - | 15 ml | |
| Mídia cultural | |||
| Componente | Final % | Volume (ml) | |
| media MEM | 90% | 90 | |
| FBS | 10% | 10 | |
| Primocin | 0,2% | 0,2 | |
| Total | 100% | 100 ml | |
| Permitir que os meios de cultura para equilibrar a 37 ° C, 5% de dióxido de carbono. | |||
Tabela 1: As soluções e tampões.
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Discussion
A saúde geral dos cardiomiócitos isolados depende de vários aspectos importantes deste protocolo. Em primeiro lugar, o tempo de extracção coração a perfusão é crítica e deve ser realizado em 5 minutos ou menos. A remoção do cálcio ajuda a dissociar as interacções célula-célula, mas podem ter um impacto negativo a saúde das células a longo prazo. 29-32 Assim, considera-se suficiente para remover o cálcio durante os primeiros poucos minutos de perfusão de EGTA (ácido tetracético de etileno-glicol) de quelação, 22, mas rapidamente restaurar cálcio durante a digestão e os passos subsequentes.
A utilização de protease XIV melhora muito a eficiência da digestão em comparação com colagenase sozinha. Isso reduz a inconsistência devido à colagenase variabilidade lote, 18,24 e aumenta a pureza de cardiomiócitos, facilitando a separação durante a sedimentação por gravidade. No entanto, a sobre-digestão irá impedir a fixação eficiente para o substrato de cultura, de modo que um equilíbrio delicado de is necessário para otimizar o rendimento e pureza celular, mantendo a fixação das células e viabilidade. Assim, a concentração de proteases e comprimento de digestão pode ser modificado de acordo com os objectivos experimentais. Em geral, um menor grau de digestão irá aumentar a fixação e a sobrevivência dos cardiomiócitos. A utilização de tripsina foi relatado em alguns protocolos de isolamento de cardiomiócitos. 18 No entanto, a adição de tripsina para o cocktail de protease usado aqui (colagenase e protease XIV) reduz a viabilidade a longo prazo dos cardiomiócitos em cultura, talvez devido à sobre-digestão ou clivagem de superfície essenciais e / ou proteínas de matriz extracelular.
A inclusão de monoxime butanodiona (BDM) durante o isolamento inibe a contração do músculo cardíaco e, portanto, reduz consequências negativas devido à contratura terminal, o gasto de energia, eo paradoxo de cálcio. 29,33 No entanto, em nossa experiência, a remoção de BDM antes da cultura agiliza dedifferentiation e permite que as células se adaptar a cultura em duas dimensões.
É importante notar que as adaptações de longo prazo para a cultura 2-D pode afectar aspectos funcionais dos cardiomiócitos, tais como contractilidade. Assim, contratilidade e eletrofisiologia experimentos deve ser realizada logo após o isolamento, quando a organização sarcomérica nativa ainda está intacto. Além disso, como com todas as experiências in vitro, as células em cultura são desprovidos de certos influências extrínsecos presentes in vivo, tal como a sinalização imune humoral ou. Por outro lado, co-culturas definidos podem ser implementados para estudar as interacções entre cardiomiócitos e outros tipos de células. 5,34 Além disso, a cultura in vitro pode ser utilizado para estudar o comportamento dos cardiomiócitos com sinais moleculares definidos nos meios de cultura. Assim, os objetivos gerais do experimento deve ser cuidadosamente considerada e pesado contra as limitações e vantagens deste sistema de cultura.
35 Deve notar-se que FBS e outros soros derivados de animais contêm componentes desconhecidos que podem afectar a fisiologia celular . 36,37 Apesar da presença bem apreciada de fatores de crescimento em FBS, 38 das culturas de cardiomiócitos aqui apresentadas não proliferar. Pelo contrário, o bloqueio do ciclo celular parece ser uma propriedade persistente de cardiomiócitos de rato adulto ex vivo, mantida desde a sua saída do ciclo celular durante o período perinatal de desenvolvimento. 12,39 Esta propriedade é de grande interesse para o campo da medicina regenerativa cardíaca, onde reversão de cardiomiócitos de mamíferos adultos para um fenótipo proliferativa tem sido um objectivo fortemente perseguido. 3,26,40-42 Notavelmente, não está claro o que desdiferenciação grau é necessário para cardiomiócitos para re-entrar no ciclo celular, mas o contribution da desdiferenciação da regeneração em vertebrados inferiores é bem suportado 43,44,10,11 Além disso, desdiferenciação está cada vez mais sendo observado na proliferação de cardiomiócitos e regeneração cardíaca em sistemas de mamíferos, pelo menos a nível funcional, incluindo a desmontagem myofibrillar 6,12,9 Assim, o estado de diferenciação de cardiomiócitos em cultura deve ser cuidadosamente considerada e modulado de acordo com as necessidades dos objetivos da pesquisa. Como tal, as condições de cultura podem, potencialmente, ser adicionalmente modificado para reduzir a concentração de soro, usar substitutos de soro definidas ou meios isentos de soro. Por exemplo, os cardiomiócitos de ratos adultos exibem sarcómeros organizados foram cultivadas a longo prazo, sem soro, mas factores de crescimento tais como o factor de crescimento de fibroblastos, factor de crescimento epidérmico, e triiodotironina foram usadas em meios definidos. 45 É concebível que formulações de meios semelhantes, ou potencialmente outros as formulações, tais como aqueles adaptado de diferenciaramprotocolos ation, 46 pode ser usada para manter cardiomiócitos de rato adulto bem diferenciadas em cultura que exibem estruturas sarcoméricas altamente organizados. Formulações alternativas também podem ser desenvolvidas para alcançar outros fenótipos (tais como cardiomiócitos altamente diferenciadas de 6) dependendo das necessidades da experiência, mas será necessário mais trabalho.
O papel de fibroblastos tem sido implicada no controlo do ciclo neonatal rato cardiomiócitos célula 5 e diferenciação de cardiomiócitos de ratinho adulto (através de sinalização IL6 hipertrófica) em cultura a longo prazo. 19 Assim, o crescimento de fibroblastos em cultura deve ser contabilizadas de interpretações experimentais . O crescimento de fibroblastos em cultura pode ser controlada por adição de crescimento restringindo compostos como o citosina-arabinósido 19 (AraC) ou por meio de etapas de pré-plaqueamento. 28 No entanto, AraC também vai inibir o crescimento de cardiomiócitos, de modo alternativométodos devem ser utilizados para controlar o crescimento de fibroblastos em estudos sobre o ciclo celular de cardiomiócitos. No protocolo aqui descrito, a pureza dos cardiomiócitos inicial pode ser aumentada através da repetição do passo de sedimentação gravidade (ver 1.4.8).
Os métodos aqui proporcionam um sistema in vitro que pode ser usado para estudar a natureza do bloqueio do ciclo celular de mamífero adulto de cardiomiócitos. Em contraste com as células primárias a partir de outros organismos, tais como o rato ou cobaia, os cardiomiócitos primários de rato oferecem uma grande variedade de ferramentas genéticas potentes e bem caracterizados, tais como a linhagem baseada-Cre rastreio modelos knock-in, 47 que podem ser usadas para facilmente identificar células derivadas de cardiomiócitos pré-existente. 12,48 Além disso, adultos cardiomiócitos primários de murino foram submetidos às condições de desenvolvimento nativas que resultam no bloqueio do ciclo celular, ao contrário de linhas de células ES e células diferenciadas ou iPSC 46 que, apesar da sua convenience e adaptabilidade às grandes telas de drogas, 2 pode ter utilidade limitada em experiências sondando a natureza do adulto cardiomiócitos saída do ciclo celular.
Este protocolo descreve um método confiável para isolar e cultura cardiomiócitos do rato adulto. Vários métodos têm anteriormente demonstrado o isolamento de cardiomiócitos de rato adultas para o estudo a curto prazo, mas até à data, existem poucos relatos de a cultura de longo prazo de cardiomiócitos de rato adulto-18,19. A capacidade de manter cardiomiócitos de rato adulto em cultura devem permitir o estudo in vitro da biologia cardiomiócitos sob condições experimentais que necessitam de exame a longo prazo. Por exemplo, a expressão do gene pode ser manipulada utilizando vectores de adenovírus, os quais tipicamente requerem alguns dias para se conseguir a expressão completa. alterações fenotípicas subsequentes e análises podem exigir ainda mais longos períodos de tempo, dependendo objetivos experimentais. Os métodos aqui apresentados permitem a cultura de cardiom de ratinho adultoyocytes por várias semanas. Isso deve fornecer um sistema poderoso para a investigação de questões prudentes em biologia cardiomiócitos, tais como as relativas à regulação do ciclo celular.
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Acknowledgments
Este projecto foi financiado pelo Programa de UCSF para Breakthrough Biomedical Research (financiado em parte pela Fundação Sandler), o NIH Pathway to Prêmio Independência (R00HL114738), e da Fundação Edward Mallinckrodt Jr.. JJ foi apoiado por uma bolsa de pós-doutorado do NIH (T32HL007731). Os autores são os únicos responsáveis pelo conteúdo deste trabalho, o que não representa necessariamente a posição oficial do NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Heated water jacket | Radnoti | 158831 | |
| Circulating heated water bath, Isotemp | Fisher Scientific | 3013 | |
| Laboratory pump | Watson-Marlow | 323 | |
| Hemostats | Exelta | 63042-090 | |
| Tissue forceps | VWR | 470128034 | |
| Dumont #7 curved forceps | FST | 91197-00 | |
| Dumont #5 fine forceps | FST | 11251-20 | |
| Small dissection scissors | VWR | 470128034 | |
| Extra fine bonn scissors | FST | 14084-08 | |
| Fine spring scissors | FST | 91500-09 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Na2HPO4.7H2O | Fisher | S25837 | |
| MgSO4.7H2O | Fisher | S25414 | |
| Taurine | Sigma | 86329 | |
| Butane dione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| HEPES | Fisher | BP310100 | |
| Glucose | Sigma | G-7021 | |
| Insulin | Novo Nordisk | 393153 | |
| EGTA | Amresco | 0732-288 | |
| Protease, type XIV | Sigma | P5147 | |
| Collagenase II | Worthington | LS004176 | |
| MEM | Corning | 15-010-CV | |
| FBS, heat inactivated | JRS | 43613 | |
| Primocin | Invitrogen | NC9141851 | |
| Ethyl Carbamate | Alfa Aesar | AAA44804-18 | |
| 215 micron mesh | Component supply | U-CMN-215-A | |
| 20 G blunt ended needle | Becton Dickinson | 305183 | |
| 20 G beveled needle | Becton Dickinson | 305176 | |
| Lab tape | VWR | 89097-990 | |
| Surgical tape | 3M | 1527-0 | |
| Silk suture, 7-0 | Teleflex | 15B051000 | |
| Mouse anti-alpha-actinin antibody | Sigma | A7811 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 antibody | Thermo Fisher | A21121 |
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