Abstract
インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型を示しています。マイクロ流体デバイスの開発は、二十年以上のエンジニアに受け入れてきたが、それらの生物学的用途が限定されたまま。より生理学的に関連する生物学的用途によって検証試験管内微小血管モデル内のフィールドを進め、in vivoでおよびin vitroの研究で間のギャップを埋めることが重要です。ここで、我々は長期的な灌流能力を備えたマイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管網の開発のための詳細な手順を提示します。また、共焦点と従来の蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムでECの[Ca 2+] iおよび一酸化窒素（NO）の生産におけるアゴニスト誘発変化の定量的測定のためのアプリケーションを示しています。形成された微小血管ネット連続灌流との仕事は、ECの間でよく発達した接合部を示しました。 VEカドヘリン分布を静的培養EC単層よりも無傷の微小血管で観察されたものと近かったです。 EC過渡増加するATP誘発性の[Ca 2+] iとNO産生を定量的培養微小血管の機能性を検証し、個々の細胞レベルで測定しました。このマイクロ流体デバイスは、電気部品が近いin vivoでの従来の静的な2D培養に比べ細胞培養環境を作るよく制御され、生理学的に関連する流れ、下に成長することができます。マイクロチャンネルネットワーク設計は、非常に汎用性があり、製造プロセスが簡単で、再現性があります。デバイスは、容易に高解像度の画像化を可能にする共焦点又は従来の顕微鏡システムに一体化することができます。培養された微小血管ネットワークが初代ヒトのECにより形成することができるので、最も重要なのは、このアプローチはどのように調査するために有用なツールとして機能します病理学的に患者サンプルから変更された血液成分は人間のECに影響を与え、臨床問題への洞察を提供します。それはまた、薬物スクリーニングのためのプラットフォームとして開発することができます。
Introduction
インビボでの血管壁の内側を覆う内皮細胞（EC）は、常に流れるように露出しているが、培養された電気部品は、多くの場合、静的な条件下で増殖させ、炎症促進性の表現型1,2を示しています。マイクロフルイディクス技術は、所望の流れ条件の下で成長し、特に血管のECのために、培養細胞のための機会を提供する幾何学的に拘束されたマイクロスケール（サブミリメートル）チャネル3を介して正確に制御された流体を可能にします。これらの機能は、従来の静的な2D細胞培養物よりもin vivoでの細胞培養条件近づけます。彼らは、マイクロ流体デバイスは、血管系の種類をモデル化するために使用され、機械的および/または化学的な刺激に対するEC応答を研究する際に非常に重要です。
静的な細胞培養、生物医学Fにおける適応とマイクロフルイディクスのアプリケーションの上にマイクロチャネルネットワークによって実証利点にもかかわらずieldは限られたままです。最近のレビューによって報告された、この分野（85％）の出版物の大半は、エンジニアリングジャーナル4に残っています。マイクロ流体デバイスの性能は、ほとんどの生物学者は、このようなトランスウェルアッセイおよびこの小型化されたデバイスへのマクロスケール培養皿/ガラススライドのような現在の技術からスイッチするための十分な説得力はなかったです。マイクロフルイディクスは、前方にこのフィールドを移動するには学際的なコラボレーションを必要とする学際的なフィールドです。この技術的な記事の目的は、生物学的なアプリケーションおよびマイクロ流体微小血管の機能的検証を提供しながら、専門分野間の知識のギャップを減らし、生物学者によって製造手順が理解できるようにすることです。可視化実験プロトコルは、マイクロ流体デバイスとエンジニアと生物学者の間で緊密な連携を表し、それらの生物学的ユーティリティ、両方の製造を含みます。
我々は最近、いくつかの報告しましたマイクロ流体素子5でのin vitro微小血管ネットワークを使用して生物学的用途。適切マイクロチャネルネットワークの寸法を設計し、所望のせん断応力を適用するためには、数値モデルは密接に流れプロファイルを推定する計算流体力学ソフトウェアで構築されました。 すなわちコンフルエンスに達したマイクロチャンネル中に播種した一次ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVEC）を、連続灌流で3~4日で、マイクロチャネルの全内面を覆っ。適切なバリアの形成はVE-カドヘリン染色によって実証および静的細胞培養条件下で無傷の微小血管内に形成されたものと比較しました。個別に灌流し、無傷の微小血管6-8で開発された実験プロトコルを適用することにより、我々は定量的に蛍光とアデノシン三リン酸（ATP）に応答して、ECの変化の[Ca 2+] iおよび一酸化窒素（NO）の産生を測定しましたdicators共焦点と従来の蛍光顕微鏡。 ECにおけるアゴニスト誘導増加は、の[Ca 2+] iおよびNO産生は、微小血管の透過性6-15における炎症性メディエータによって誘発される増加のために必要な細胞内シグナルとして報告されています。いくつかの以前の研究は、DAF-2 DAロードマイクロ流体デバイス16,17の画像を示したが、適切な解像度およびデータ分析はまだ18を達成していませんでした。我々の知る限りでは、この研究は、内皮におけるアゴニスト誘導性の動的変化の[Ca 2+] iとNO産生利用マイクロ流体ベースのシステムの最初の定量的測定を示しています。
微細加工技術は、ダウンして数ミクロンのマイクロチャネルを作製し、in vivoでの微小血管系の幾何学的構造を模倣するために複雑なパターンの開発を可能にする柔軟性を持っています。ここでは、分岐、3つのレベルを持つ典型的なマイクロチャネルネットワークを提示しました。このネットワークは、微細加工クリーンルーム及びソフトリソグラフィーで行われるフォトリソグラフィ技術の組合せによって製造されます。
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Protocol
1.マイクロ流体デバイスの製造
- SU-8 50マスター型の標準的なフォトリソグラフィ製作
- スピンコーティングする前に、シリコンウエハを清掃してください。 15分間イソプロピルアルコール（IPA）、続いて15分間アセトンで裸の2インチのシリコンウエハをすすぎます。 1時間150℃のホットプレート上に配置することによって、ウエハを脱水。脱水後、室温でウエハを冷却します。
- SU-8フォトレジストをシリコンウェハをコートをスピン。ウェハ上に2ミリリットルSU-8フォトレジストを追加します。 30秒毎分300回転/秒の加速度で1000rpmで、続いて10秒間100回転/秒の加速で500回転にウェハをランプアップします。 （補足ビデオ1を参照してください）
- プリベーク30分間、95℃で10分間、次いで、ソフトベーク65℃のホットプレート上のウエハ。
- スピンコートされたフォトレジストにフィルムマスクから設計パターンを変換するためにUV露光を使用してください。フィルムマスクのような薄い透明フィルム上にパターンを印刷します。の上にフィルムマスクを配置フォトレジストをコーティングし、スピンとを300mJ / cm 2の線量でUVにさらします。 （補足動画2を参照してください）
注：このプロトコルでは、マイクロチャネルネットワークのパターン（4幅100μmの娘チャネルに分岐する159ミクロン幅の広い母チャンネル）は、CADソフトウェアで設計されています。フィルム上のパターンは、クリアフィールドとして表示され、フィルムの残りはブラックインクで覆われています。 SU-8ネガ型フォトレジストであるため、UVに曝露されるフォトレジストの部分が架橋され、金型の開発（ステップ1.1.6）中の溶剤に不溶となるであろう。現像後、この不溶部分が設計されたネットワークのパターンを複製し、マスターモールドとしての役割を果たす。 - ポストベーク1分、10分後、95℃で65℃のホットプレート上で露光されたウエハ。
- マスターモールドを開発します。使用未架橋フォトレジストを除去するための溶媒としてのSU-8の開発者。 3分間のSU-8現像液にウェハを浸し、IPAですすぎます1分間。
- IPAリンス後には白スジの形成（非硬化フォトレジストの残留物）が存在しなくなるまで、この開発サイクルを2-3回繰り返します。静かに窒素ガスでウエハを乾燥し、顕微鏡下でのパターンの小さな特徴を調べます。必要に応じて追加の開発サイクルを繰り返します。
- ハード15分間、150℃のホットプレート上でウェーハを焼きます。
- ソフトリソグラフィー
- 手動重量で2部のポリジメチルシロキサン（PDMS）エラストマー（ベースと硬化剤）を混ぜます。 10：1の比。
- 脱ガス15分間ハウスバキュームに接続されたデシケーターとPDMS混合物。フォトレジストマスターモールドにPDMSソリューションをキャストします。 PDMSの厚さは、入口/出口管の安定した保持を提供するために、3 mm以上である必要があります。 15分間、再び脱ガスPDMS、および必要に応じて窒素ガスで残りの気泡を除去。 3時間65℃のオーブンでキャストPDMSを治します。
- の表面を清掃してくださいスコッチテープとプラズマクリーナー（30秒プラズマ処理）を有するガラスカバースリップ。 30秒間500回転/秒の加速レートで4,000 rpmのにランピングすることにより、カバーガラス上にスピンコート未硬化PDMS（0.5ミリリットル）。少なくとも30分間、65℃のオーブン中でPDMSをスピンコートしたカバースリップを硬化させます。
- カットし、マスターモールドから硬化PDMSをリリース。次に母チャンネルの先端に直径1mmの穴パンチャーを有する入口および出口を作成します。
- PDMSスピンコートしたカバーガラスにデバイスを結合。 1分間のプラズマクリーナーとPDMSとカバーガラスの表面を酸化させます。酸素プラズマ処理後、接合面での脱イオン水（DI水）の液滴を配置し、2つの部品を配置します。永久的な結合を達成するために30分間65℃のオーブンでデバイスを焼きます。
2.内皮細胞播種と文化
- デバイス滅菌およびフィブロネクチンコーティング
- 酸化からの入口/出口の周りにPDMS表面の疎水性を保持します。酸化を防止するために、スコッチテープの小さなストライプと入口と出口の周りにPDMSの表面を覆います。この手順では、充填工程（2.1.3）の間に、すべてのデバイスの上面の上に広がるのDI水を防止することができます。
- 酸素プラズマFOとPDMS装置を扱いますR 5分では、このように、表面が親水性に変化するマイクロチャネルを通る流体の流れを促進し、充填手順（2.1.3）に捕捉気泡を防止します。
- 入口からDI水でデバイスを埋めるために取り付けられた針またはピペットで注射器のいずれかを使用してください。出口に蓄積されたDI水（30-50μL）の液滴があるまで充填を続けます。マイクロチャネル内に閉じ込められた気泡があるかどうかを確認するために、顕微鏡下でデバイスを調べます。ティッシュペーパーとの入口と出口での過度の水滴を除去します。
- 層流バイオセーフティフード内で3時間の最小値のためのUVとペトリ皿の中でデバイスを滅菌します。 、蒸発を防ぐPDMSの薄片と入口/出口をカバーするには、皿の内側に濡れたティッシュペーパーを入れ、パラフィルムで皿を包みます。
- コートフィブロネクチンを持つデバイス。 （冷蔵庫に/ mlのフィブロネクチンで一晩100μgので被覆次いで、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で最初にデバイスをリンス4°C）。入口で溶液の液滴を配置し、その後、ハウス真空、針またはピペットで注射器と出口で負圧を作成します。
- 細胞培養培地でデバイスを記入してください。細胞培養培地をロードする前に3回手動でPBSでデバイスを洗浄します。 37℃のインキュベーター内でデバイスをウォームアップ。
- ECの播種および長期灌流
注：従来の静的な2DのEC文化と比較すると、連続灌流を用いたin vitro微小血管ネットワークモデルは、より近いin vivoの条件に細胞培養環境を作りました。このプロトコルで実証インビトロ微小血管ネットワークは二週間まで維持することができます。十分に制御された灌流は、連続的に、栄養素を補給廃棄物を削除して、過合流EC単層の防ぐことができます。したがって、異なるphysiologica下で細胞および血行力学環境を模倣し、長期の研究に拡張することができますリットルおよび病理学的条件。- 8％のデキストラン（モル重量7万）でHUVEC培地中の一次のHUVEC（MCDB 131）を混合します。デキストランは、ローディング媒体の粘度を増加させ、より良い細胞播種の結果を達成するために使用されます。推奨される細胞密度は、約2~4×10 6細胞/ mlです。
- デバイスに細胞を播種します。入口の上に細胞の10-20μlの液滴を配置します。出口でのガラスパスツールピペットを使用して、デバイス、または毛細管作用を傾けることのいずれかによって穏やかな流れを導入します。成功したセルの負荷のための鍵は、最小のチャネル内の流速1mm未満/秒を制御することです。
- 細胞播種を確認してください。最初の播種後、顕微鏡下で播種の状態をチェックする前に、（37℃、5％CO 2の加湿雰囲気下）、15〜20分間デバイスをインキュベートします。必要であれば、所望の細胞密度を達成するために追加のセル負荷を行います。
- 穏やかに37（細胞培養培地でデバイスをリンス°C）は、デキストランを除去しました。文化（37℃、5％のCO 2）インキュベーターの最初の6時間の流れの不在下での装置。
- 長期灌流用チューブの接続を設定します。移動を防止するためにペトリ皿にデバイスをテープ。入口と出口のチューブ挿入用のシャーレのふたに小さな穴を作成します。細胞培養培地灌流用の針で注射器に入口チューブを接続します。ごみ収集作業員への出口チューブを接続します。
インキュベーターの外に灌流ポンプを配置しながら、細胞培養インキュベーターに入れ、デバイスと廃棄物の収集をし、長い入口チューブにより、デバイスとそれを接続します。注意してください。灌流速度は、実験設計によって決定されます。本発明の装置では、0.35マイクロリットル/分の灌流速度と1-2ダイン/ cm 2の間のせん断応力範囲を使用しています。この灌流条件では、HUVECを約3-4日でコンフルエンスに達します。
3. Immunofluorescent染色
- 室温で15分間すすぎ、そして30分間ブロッキングの1％BSA PBSを1倍、続いて4℃で30分間、2％パラホルムアルデヒドの灌流によってデバイスでのECを修正しました。細胞培養に用いたものと同じである灌流速度を使用します。
- 0.1％トリトンX-100抗体染色のために固定された電気部品を透過。 VEカドヘリンをラベルに5-7分間トリトンでデバイスを灌流し、ラベルF-アクチンへ3分。
- デバイスに抗体をロードします。従来のソリューションを洗い流すために15分間、1×PBSでデバイスを灌流。手動での2μg/ mlの（総容量は20-50μlである）の濃度で、デバイスへのVEカドヘリン（抗ヤギ）に対する一次抗体をロードします。 4°Cで一晩冷蔵庫にデバイスを保管してください。 45〜60分間7μgの/ mlの濃度でシリンジポンプによって二次抗体（ロバ抗ヤギ）を灌流。
- ファロイジンでEC F-アクチンにラベルを付けます。 1×PBS FOでデバイスを灌流手動で7-10分間ファロイジン（10μg/ ml）をロードする前に、R 15分。
- ラベルEC核は（材料リストを参照してください）。
- 1×PBSでデバイスをすすぎ、およびイメージングするまで4℃でそれを維持します。
内皮の4蛍光イメージングの[Ca 2+] i の
- アルブミン（10 mg / mlで）37℃で15分間-Ringer溶液でデバイスを灌流。細胞培養に用いたのと同じ灌流速度を使用します。アルブミン-リンゲル液のすべての成分の濃度は、 物質一覧に記載されています。
- ECのための共焦点システムのfluo-4 AMでの[Ca 2+] i のイメージングを設定します。 Ca 2+イメージングのための共焦点顕微鏡システムを使用してください。励起用アルゴンレーザー（488 nm）を使用し、510〜530 nmのように発光帯を設定します。 512×512走査フォーマットで：25X目標（0.95水浸、NA）を使用して画像を収集します。私の各スタックのための2ミクロンのzステップとスキャン間隔を使用します20秒の魔術師。
- アルブミン - リンゲル液とルーメンのfluo-4 AMを洗い流した後、37℃で40分間のfluo-4 AM（5μM）を持つデバイスを灌流。
- フルオ4ロードされた微小血管の画像を取得します。 10分間のベースラインの画像を収集します。 ATP（10μM）でデバイスを灌流し、20分間の蛍光強度（FI）の変更を記録。
一酸化窒素生産の5蛍光イメージング
- 15分間のアルブミン - リンゲル液でデバイスを灌流。細胞培養に用いたものと同じである灌流速度を使用します。
- ATP誘導性の一酸化窒素産生を測定するための蛍光イメージングシステムをセットアップします。 12ビットのデジタルCCDカメラと一酸化窒素測定のためのコンピュータ制御シャッターを備えた顕微鏡を使用します。光源として75 Wキセノンランプを使用してください。
注：干渉フィルタ（40分の480 nm）をダイクロイックミラーによってDAF-2 DA用の励起および発光波長を選択バンドパス障壁と（505 nm）を（50分の535 nm）で。画像を収集するために：20X対物レンズ（NA0.75）を使用してください。光退色最小限に抑えるために、干渉フィルタの前に中性濃度フィルタ（0.5 N）を位置決めし、0.12秒の露光時間を制限します。 - DAF-2 DA（5μM）で細胞をロードします。 37℃で約35-40分間、DAF-2 DAを持つデバイスを灌流。最初のロード後にDAF-2の蛍光強度（FI DAF）のベースラインを記録します。
注：DAF-2 DAは実験7を通して灌流液で連続的に存在しています。 - DAF-2画像を収集します。 5分間FI DAFのベースラインを記録します。 ATP（10μM）でデバイスを灌流し、1分間隔で30分間の画像を収集。同じ焦点面に細胞の同一グループからのすべての画像を収集します。
6.データ解析
- 手動で個々の細胞レベルで収集した画像からの利益（ROIを）の地域を選択します。各ROIは、蛍光輪郭によって示すことができる一つの個別のセルの面積をカバーします。
- バックグラウンド蛍光を減算し、各ROIの平均FIを計算します。
- ECにおけるATP誘導性の変化を測定した[Ca 2+] iとNO産生。 （FI 0アルブミン -リンガー灌流中の平均ベースラインFIは、ATPを添加する前に、あるFI / FI 0 * 100）のFluo-4 FIの変化を計算することにより、ECの[Ca 2+] i の中のATP誘導性の変化を定量化マイナス測定バックグラウンド。経時FI DAFの第一の差動変換を行うことにより、NO産生量を定量化しません。
注：FI DAFの時間経過は、時間とともに累積NO産生を表します。したがって、NO産生率は、基礎とATPが条件刺激の両方の下でFI DAFのプロファイルに基づいて計算されていません。データ分析及び実験手順の詳細は、以前の刊行物7に記載されています。
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Representative Results
このセクションでは、このプロトコルを使用して開発した培養微小血管網で得られた結果の一部を示しています。マイクロチャネルのパターンは、3レベルの分岐ネットワーク（ 図1A）です。この設計では、4幅100μm娘チャネルに再び2 126ミクロン幅チャネル、および支店に159μmの広い母のチャネルブランチ。 3次元数値シミュレーションは、このマイクロチャネルネットワーク内のせん断応力の3つの異なるレベルを示し0.35μL/分の流速（ 図1B）、下のせん断応力分布を推定するために行きました。マイクロチャネル内の層流は、乱れまたは二次流の存在なしに流体力学的に安定であることが予測されます。 SU-8マスター型は、標準的なフォトリソグラフィ工程（ 図1C）で作製した後、PDMSデバイスは、マイクロチャネルねを複製するために、ソフトリソグラフィ技術によって作製しました透明、通気性足場（ - E 図1D）にtworkデザイン。 EC播種（ 図1F - G）の後、連続灌流の3-4日、ECがコンフルエンスに達したし、正常にマイクロチャンネルの内面を覆っていました。
EC Fアクチンおよび核は、蛍光ネットワーク内で標識し、共焦点画像で示されました。残りの70％が優勢周辺F-アクチン5との石畳のパターンを維持したのに対し、1.0ダイン/ cm 2のせん断応力下では、HUVECの約30％は、増加した中央のストレスファイバーと流れ方向に沿って細長いです。剪断誘導性の細胞形状の変化は、一般的に2次元の静的細胞培養で観察されたものよりも目立た現れます。実際に、インビボ条件下で、電気部品は、容器の異なる種類の異なるセル形状を有するが、容易に流動CHAに応答して細胞の形状を変更しませんNGES。より多くの研究が、この差はインビボ条件に近いチャネルの形状および灌流環境の結果であったかどうかを決定するために必要とされます。
我々はまた、成功したECにおけるATP誘導変化の[Ca 2+] iとNO産生（ 図4、図 5）を測定しました。 ECにおけるATP誘導性の一過性の増加の[Ca 2+] iとNO産生。平均ピークFIのFLUO-4は、ATP灌流開始後35±10秒で発生したベースラインの187±22％でした。 NO産生率は、ATP暴露の最初の5分以内に、毎分1.18±0.37 AUに毎分0.15±0.05 AUの基礎レベルから増加しました。すべての結果は平均値±標準誤差（SE）として報告しました。彼らは個別に灌流し、無傷の小静脈6,9,14,19から得られた結果と同等です。
図1：マイクロ流体デバイスの作製とECロード （A）マイクロチャネルネットワークの概略図。マイクロチャネルの幅と分岐角度は、各分岐レベルで示されています。 （B）、せん断応力分布の数値シミュレーション。流速は0.35μL/ minです。現像後のマイクロチャネルの高さは80μmです。これらの2つの図は、追加の詳細5で前回公表から変更されています。 （C）マスターモールドの開発。マイクロチャネルネットワークのマスターモールドは、シリコンウェハ上のSU-8フォトレジストを用いて製造されます。 （D）ソフトリソグラフィのプロセス。 PDMS混合物をマスターモールド上にキャストし、オーブンで硬化されます。基板への（E）接着PDMSチャンネル。この装置に用いられる基板は、カバーガラスのSPIですnはPDMSの薄層で被覆されました。入口と出口は穴パンチャーを使用して作成されます。 （FとG）EC搭載。細胞溶液の約10μlの入口に配置されています。穏やかな流れは、その後、毛管流を経由して出口にパスツールピペットを配置することによって誘導される。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：培養マイクロチャネルネットワークにおけるEC F-アクチンの共焦点画像 （A）ネットワーク設計の概略図。 Bに示す選択された領域- Dは、グラフに示されています。 （B - D）in vitroでの微小血管網のEC F-アクチン（赤）と核（青）の共焦点画像B 1。 >、C 1およびD 1は、投影マイクロチャネル画像スタックの上半分からの画像、及びB 2、C 2、D 2は、画像スタックの下半分から画像投影されています。 D 1、スケールバー= 100μmの- E.は、断面図は、B 1に1-1 '、2-2'、3-3 'として示されています。これらの画像は以前の出版物5から適合されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：静的培養EC単層と無傷のラット腸間膜の細静脈と共に培養した微小血管ネットワークにおけるVEカドヘリン分布の比較（。
図4：ECにおけるATP誘導性の増加の[Ca 2+ P>] I。実験は4装置から行われた、デバイスあたり7〜12のROI（個々のEC）は、データ分析のために選択しました。 （A）ATPの時間経過（10μM）は1代表的な実験からECの[Ca 2+] i の （のFluo 4 FI / FI SE±0×100％）の変化を誘発しました。 （B）（データはAに示されている）代表的な実験のイメージ。これは、以前に公開された図5である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：ATP誘導性のNO産生実験は3デバイスで実施され、装置あたり11から12のROI（個々のEC）は、データ分析のために選択しました。 （ DAF±SEの栄>）の時間依存的変化は、基底条件下およびATPへの暴露後のECに）Y軸を残しました。 NO産生率（DF / dtは、点線）は、蓄積されたFI DAF（右Y軸）の最初の差動変換に由来しませんでした。 （B）1実験からの代表的な画像。 FI DAFはさらにNO供与体、ニトロプルシドナトリウム（SNP）後に増加し、NOと反応する細胞内のDAF-2の十分な量を示す、灌流液に添加しました。これは、以前に公開された図5である。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この記事では、の[Ca 2+] iおよびNO産生が、マイクロ流体デバイスを用いて培養微小血管ネットワーク、ECジャンクションおよび細胞骨格F-アクチン分布の特徴付け、およびECの定量的測定の開発のための詳細なプロトコルを提示します。灌流マイクロ流体デバイスは、生体内微小血管の形状とせん断流動条件の近いシミュレーションを可能にするin vitroモデルを提供します。培養された微小血管ネットワークは、初代ヒトECを用いて形成することができるので、この方法は患者のサンプルから変更された血液成分を培養微小血管への患者の血液サンプルの直接灌流により人間のECにどのように影響するかを病理学的に調査し、臨床への洞察を提供するための有用なツールとして機能することができます問題。微小血管開発人間のECは、ヒトおよび動物の組織との間の薬物応答の潜在的矛盾を回避するために、薬物スクリーニングのために使用することができます。
ve_contentは ">このプロトコルに示したマイクロ流体デバイスの基板は、ガラスカバースリップ（150-180ミクロン）をスピンコートPDMSの薄い層である。PDMSのこの薄い層は、高解像度と生きている組織のリアルタイムのために不可欠ですイメージング、大きな開口数の対物レンズは、通常、短い作動距離を有しているからである。マイクロチャネル（サブミリ範囲）内の層流が非常に低いレイノルズ数を有し、圧力差が流量に線形に関連して、このようにせん断応力分布が単に依存していますチャネル形状であるため、高精度の灌流ポンプ20によって十分に制御することができる。我々の本研究では、HUVEC培養された微小血管ネットワークに適用せん断応力の範囲内である1〜10ダイン/ cm 2の間でした静脈系21,22で測定されたせん断応力の範囲。このような平行流室などのマクロ流体システムは、複雑なフローパターンを欠いている。大規模フローチャンバー（ミリメートルcmの範囲で）、電気部品は、一般的にのみin vivoでの微小血管に幾何学的類似性を欠く、底面（2D単層）で栽培されています。フローチャンバーの幅が2mmを超えると、均一な流れが数百ミクロン離れて側壁23から数mm離れた出口/入口から、通常、その領域に閉じ込められます。チャンバーの幅は、センチメートルの範囲に増加すると、流れは、様々な流線に分化し、流速は、全領域24を横切って変化します。さらに、大規模なフローチャンバーは、マイクロチャネルと同様のせん断応力を達成するには、少なくとも100倍以上の灌流液を消費します。マイクロチャネルネットワーク内のせん断応力分布は、数値モデリングツールを使用してシミュレートすることができ、固定非圧縮性ナビエ・ストークス方程式は、ほとんどの有限要素ソフトウェアにより解決することができます。マイクロ流体デバイスは、SINGLで作ることができます電子マスク微細加工プロセス。培養された微小血管の開発の成功は、しかし、詳細に特別な注意を必要とします。マイクロチャネルへの溶液をロードした後、各デバイスは、ECの播種前に顕微鏡下でバブルトラップのためにチェックする必要があります。気泡が発生した場合、PDMSは、空気透過性材料であるように、閉じた入口と出口に油圧を印加することにより、この段階でそれを強制することが可能です。目的の灌流速度を維持するために、漏れのないタイトなフィッティングが針/チューブ接続のすべてのために必要です。一致した穴パンチャーとチューブサイズはタイトなフィッティングを実現するために重要です。流量の正確な配信を保証するために、灌流ポンプおよびデバイス上の注射器は、同じレベルに配置する必要があります。灌流液を変更するには、挿入されたチューブを穏やかに任意のストレッチを避けるために、デバイスから切断する必要があります。せん断応力を増加させるために、（例えば、18時間の増加の10段階として）工程が増加しているrecommen急激な流量変化を避けるために、DEDは、ECの剥離を引き起こしました。
以前の研究では、個別に灌流し、無傷の微小血管は、ECにおけるアゴニスト誘導性の増加は、の[Ca 2+] i の 、およびその後の内皮一酸化窒素合成酵素（eNOS）の活性化およびNO産生が炎症状態6,7の下で増加した微小血管透過性のために必要なシグナルであることが示された上で行わ、9-13,25。それは一般的に赤血球、凝集した血小板、および損傷組織によって、またはin vivoでの炎症状態の下でリリースされているので、このプロトコルでは、我々は、代表的なアゴニストとしてATPを選択します。蛍光カルシウム指示薬、のFluo-4 AMは、ATPへの曝露後の内皮の変化の[Ca 2+] Iを測定しました。 EC培養微小血管内の[Ca 2+] iの応答は、無傷の微小血管7,9に見られるものと類似しています。 EC NO産生を測定することは、生物学者のための技術的に困難となっています。現在までに、カルシウム指示薬と同様にNO濃度の動的変化の検出を可能にするいかなる蛍光標識されていません。 DAF-2 DAは広くNO産生を評価しないために使用されています。しかし、適切な使用、データの解釈、およびデータ分析は、ユーザーの注意を引く必要があります。 NOの存在下でのDAF-2TにDAF-2の化学的変換は、26（片道換算）不可逆的であるため、検出されたDAFの蛍光強度プロファイルは、NO濃度の変化を表すものではありません。その代わりに、それは時間とともに蓄積DAF-2T産生を示します。 DAF-2蛍光（FI DAF）曲線を累積これに基づいて、NO産生率（DF / DT）は、FI DAF 7,11の第一差動変換により導出することができません。すなわち、FI曲線の傾きは、NO産生率を示し、プラトー期にはさらに、NO産生を増加させないことを示します。変換後、データは、このプロトコルPRから生成します基底NO産生率と微小血管ネットワーク内の個々のECレベルでの時間的および空間分解能でATPに応答して、NO産生の変化の両方をesented。
それは、光学的に透明な非毒性、及びガス透過性ソフトエラストマー27-30そのまま現在PDMSは、広く、マイクロ流体の用途に使用されてきました。 PDMSは、透水性ではないので、我々は直接EC単層の透過性を測定することができませんでした。他の人が焦点を当ててきたが、この制限を克服するために、いくつかのアプリケーションは、チャンネル31内に透過性の膜を統合する、またはマイクロピラー又はマイクロ孔32,33と通気性「窓開口部」を作成するように、チャネル壁構造を改変しましたこのようなヒドロゲルデバイスまたはヒドロゲル/ PDMSハイブリッドデバイス17,34-36を使用するなど、デバイス材料の変更。このような装置の欠点は、脱水への脆弱な性質とそれらの比較的弱いメートルですストレスや圧力に耐えるためにechanicalプロパティ。機械的強度と透過性材料の将来の発展はさらに、デバイスとより広範な生物学的用途のためにその可能性を向上します。
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Disclosures
著者らは、開示することは一切競合する利益や利害を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、国立心肺血液研究所によってサポートされていましたHL56237、糖尿病および消化器の国立研究所腎臓病研究所DK97391-03、国立科学財団（NSF-1227359およびEPS-1003907）を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| Acetone | Fisher Scientific | A929 | |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31 AA | |
| Bovine Albumin | MP Biomedicals | 810014 | |
| Bovine Brain Extract (BBE) | Lonza | CC-4098 | |
| Cover-slip | Fisher Scientific | 12-542C | |
| DAF-2 DA | Calbiochem | 251505 | |
| Dextran | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody | Life technologies | A-11055 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-250 | |
| DRAQ5 (nuclei staining) | Cell Signaling Technology | 4084 | |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | Sigma-Aldrich | E2759-15MG | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000-044 | |
| Fibronectin | Gibco | PHE0023 | |
| Fluo-4 AM | Life technologies | F-14201 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Gentamicin (50 mg/ml) | Gibco | 15750-078 | |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | 12-548B | |
| Glass Pasteur pippette | VWR | 14672 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3393-10KU | |
| HEPES Buffered Saline Solution | Lonza | CC-5024 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Lonza | CC-2517 | |
| Isopropyl alcohol (IPA) | VWR | 89125 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030-081 | |
| Mammalian Ringer Solution Ingredient | |||
| NaCl (132 mM) | Fisher Scientific | S671-3 | |
| KCl (4.6 mM) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| CaCl2 · 2H2O (2.0 mM) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| MgSO4 ·7H2O (1.2 mM) | Fisher Scientific | M63-500 | |
| Glucose (5.5 mM) | Fisher Scientific | BP350-1 | |
| NaHCO3 (5.0 mM) | Fisher Scientific | S233-500 | |
| Hepes Salt (9.1 mM) | Research Organics | 6007H | |
| Hepes Acid (10.9 mM) | Research Organics | 6003H | |
| MCDB 131 Culture Medium | Life technologies | 10372-019 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Phalloidin (F-actin staining) | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life technologies | 14040-133 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning Corporation | Sylgard 184 | |
| Scalpel | Exel Int | 29552 | |
| Scotch tape | 3M | 34-8711-3070-3 | |
| Silicon wafer | VWR | 14672 | |
| SU-8 photoresist | MicroChem | SU-8 2050 Y111072 | |
| SU-8 developer | MicroChem | Y020100 | |
| tissue culture flasks | Sigma-Aldrich | Z707503-100EA | |
| Triton X-100 | Chemical Book | T6878 | |
| Trypsin Neutralizer solution | Gibco | R-002-100 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Gibco | R-001-100 | |
| Tubing | Cole-Parmer | PTFE microbore tubing, 0.012" ID x 0.030" OD | |
| VE-cadherin | Santa Cruz Biotechnology | SC-6458 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar hood | NuAire | NU-425 Class II, Type A2 | |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SL | |
| Desiccator | Bel-Art | F42022 | |
| Hotplate | Wenesco | HP-1212 | |
| Incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Isotemp oven | Barnstead | 3608-5 | |
| Lithography bench | Karl Suss | MA6 Contact Lithography | |
| Optical microscope | Nikon | L200 ND & Diaphod 300 | |
| Shutter for the CCD camera | Sutter Instrument | Lambda 10-2 | |
| Plasma cleaner | PVA TePla/Harrick plasma | M4L/PDC-32G | |
| Spin coater | Brewer Science | Cee 200X | |
| Syringe pump system | Harvard Apparatus | 703005 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CAD software | Autodesk | AutoCAD 2015 | |
| CFD simulation software | COMSOL | COMSOL Multiphysics 4.0.0.982 | |
| Images acquire and analyse for NO production | Universal Imaging | Metafluor |
References
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