Summary
In vitro koloni assays til påvisning selvfornyelse og differentiering af stamceller isoleret fra voksne murine bugspytkirtlen er udformet. I disse assays pancreatiske progenitorer medfører cellekolonier i 3-dimensionalt rum i methylcellulose indeholdende halvfast medium. Protokoller for håndtering enkelte celler og karakterisering af de enkelte kolonier beskrives.
Abstract
Stem og stamceller fra voksne bugspytkirtlen kunne være en potentiel kilde til terapeutiske beta-lignende celler til behandling af patienter med type 1-diabetes. Det er dog stadig uvist, om der findes stamceller og progenitorceller i den voksne pancreas. Forskning strategier via cre-lox afstamning-sporing i voksne mus har givet resultater, som enten støtte eller afkræfte den idé, at betaceller kan genereres fra kanalerne, den formodede sted, hvor voksne bugspytkirtlen stamfædre kan opholde. Disse in vivo cre-lox slægt-tracing metoder kan imidlertid ikke besvare spørgsmål fra selvfornyelse og multi-slægt differentiering-to kriterier, der er nødvendige for at definere en stamcelle. Til at begynde at behandle dette tekniske hul, vi udtænkt 3-dimensionelle koloni assays for bugspytkirtlen forfædre. Kort efter vores indledende offentliggørelse, andre laboratorier uafhængigt udviklet en lignende, men ikke identiske, metode kaldet organoide assay. Sammenlignet med den organoide assay vores fremgangsmåde anvendermethylcellulose, der danner viskose opløsninger, som tillader optagelse af ekstracellulære matrixproteiner ved lave koncentrationer. De methylcellulose-holdige analyser tillader lettere påvisning og analyser af stamceller på enkelt-celle niveau, som er afgørende, når stamfædre udgør en lille sub-population, som det er tilfældet for mange voksne orgel stamceller. Sammen resultater fra flere laboratorier demonstrerer in vitro selvfornyelse og multi-slægt differentiering af pancreasstamfaderceller-lignende celler fra mus. De nuværende protokoller beskriver to methylcellulose-baserede koloniassays at karakterisere muse pancreas progenitorer; Den ene indeholder et kommercielt præparat af murine ekstracellulære matrixproteiner, og den anden en kunstig ekstracellulært matrixprotein kendt som en laminin hydrogel. De her viste teknikker er 1) dissociation af bugspytkirtlen og sortering af CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler fra voksne mus, 2) enkelt celle manipulation af sorted celler, 3) enkelt koloni analyser bruger mikrofluid QRT-PCR og hel-mount immunfarvning, og 4) dissociation af primære kolonier i encellede suspensioner og re-plating til sekundære koloni analyser til at vurdere selvfornyelse eller differentiering.
Introduction
Bugspytkirtlen er sammensat af tre store cellelinier; acinære celler udskiller fordøjelsesenzymer, kanaler udskiller mucin at afværge patogener og transportere fordøjelsesenzymer til tarmen, og endokrine celler udskiller hormoner, herunder insulin og glukagon, der opretholder glukose homøostase. Under fosterudviklingen i bugspytkirtlen, de tidlige duktale celler er kilden til tri-potente stamceller er i stand til at give anledning til de tre slægter i pancreas af voksne dyr 1,2. Fordi voksne stamceller og progenitorceller, såsom knoglemarvsstamceller, der allerede med succes anvendes til behandling af forskellige sygdomme 3, der er en intens interesse i at finde stilken, og progenitorceller i den voksne pancreas. Hvis isolering og manipulering af voksne pancreas stamceller og progenitorceller var muligt, kunne disse celler anvendes til at behandle sygdomme, såsom type 1 diabetes, hvor insulin-udskillende celler ødelægges af autoimmunitet.
in vivo cre-lox afstamning-tracing teknikker, inada og kolleger viste, at voksne murine duktale celler mærket med en markør, kulsyreanhydrase II, kunne give anledning til alle tre pancreas afstamninger 4. Men ved hjælp andre duktale markører, såsom HNF1b 5 og Sox9 2, blev det konkluderet, at duktale celler ikke den største kilde til betaceller i voksne mus.
For flere år siden, foreslog vi, at årsagen til den førnævnte debat kan skyldes manglen på området 6,7, af passende analytiske værktøjer, som kan bruges til at måle selvfornyelse og multi-slægt differentierings--to kriterier er nødvendige for at definere en stamcelle. In vivo cre-lox afstamning-tracing teknik nævntovenfor kan dokumentere for stamfader-afkom forhold på befolkningsniveau. Men denne slægt sporing teknik begrænset i sin magt for at skelne, om enkelte stamceller kan selv forny og differentiere i flere slægter. Single-celle analyse er vigtigt, fordi hvis flere mono-potente stamceller, hver med en forskellig afstamning potentiale, blev analyseret sammen, kan de tilsammen synes at have multi-slægt differentiering evner. Desuden stamceller er normalt en mindre population af en voksen organ. Aktiviteterne i en mindre celle population kunne være maskeret af den større population. Derfor er et negativt resultat fra en population undersøgelse ikke nødvendigvis viser forekomst af stamceller. Endelig er cre-lox afstamning sporing ikke tillader i øjeblikket måling af selv-fornyelse.
For at begynde at behandle den tekniske kløft på området pancreasstamfadercelle biologi, koloni 7-11 eller organoide 12-15 Metoder og udstyr tabel), og den anden indeholder laminin hydrogel, en defineret kunstig ECM protein 7-11. Progenitorceller blandes i halvfast medium indeholdende methylcellulose. Methylcellulose er et biologisk inert og tyktflydende materiale fremstillet af træfibre, og har været rutinemæssigt anvendt i hæmatopoietiske koloniassays 16. Den methylcellulose indeholdende halvfast medium begrænser bevægelsen af enkelte progenitorceller, så de ikke kan re-aggregat. Men mediet er blød nok til at tillade en progenitorcelle at vokse og differentiere til en koloni af celler i 3D rummet. Efter traditionen af hæmatologer, en pancreasstamfadercelle der var i stand til at give anledning til en koloni af celler var named en pancreas kolonidannende enhed (PCFU). PCFUs, når der dyrkes i murine ECM-holdige koloni assay, giver anledning til cystisk kolonier, der er opkaldt "Ring" kolonier 7. Ved tilsætning af et Wnt-agonist, R-spondin1, ind i den murine ECM-holdige kultur, nogle Ring kolonier bliver til "Tætte" kolonier 7. I denne artikel, er disse to typer af kolonier dyrket i murine ECM kultur samlet benævnt "Ring / Tætte" kolonier. Når Ring / Tætte kolonier dissocieret til enkelt celle suspension og re-belagte i kulturer, der indeholder laminin hydrogel, "Endokrine / Acinære" kolonier dannes 7.
Brug enkelt koloni analyser, blev det konstateret, at størstedelen af Ring / Tætte og endokrine / Acinære kolonier, enten fra voksne (2-4 måneder gamle) 7,11 eller unge (1 uge gammel) 9 murine bugspytkirtel, udtrykker alle tre afstamning markører. Dette antyder, at de fleste af de PCFUs oprindelse er tri-potente. I det murine ECM-holdige koloni assay, voksne murine PCFUs håndfast selv forny og udvide cirka 500.000 gange over 11 uger i kultur 7. Murin ECM understøtter fortrinsvis differentieringen af duktale celler frem endokrine og acinære afstamninger, hvorimod i nærvær af laminin hydrogel, er murine PCFUs tilskyndes til at differentiere fortrinsvis i endokrine og acinære celler og i mindre grad til duktalt afstamning 7,9,11. Vigtigt er, Insulin + Glucagon - mono-hormonale celler genereres i laminin hydrogel kultur og udskille insulin i respons på glucose stimulation in vitro 7,9, hvilket tyder på funktionelle modenhed. Tri-slægt differentiering potentiale 7,9 og selv-fornyelse 11 af individuelle PCFUs bekræftes af encellede mikromanipulering, dvs. dyrkning én celle pr godt for kolonidannelse. Tilsammen udgør disse resultater beviser, at der er selvfornyende, tri-Potent, progenitor-lignende celler i postnatal murine bugspytkirtlen, der viser aktiviteterne i 3D kultur.
De murine PCFU analyser beskrevet i denne artikel stammer fra en tidligere koloni assay designet til stamceller differentieret fra murine embryonale stamceller (mESCs) 17. Det protokol er dokumenteret i detaljer i en anden JOVE publikation 18. De kultur komponenter og teknikker, der kræves for at udføre den murine ECM-holdige koloni assay for voksne PCFUs er de samme som for Mesc-afledte stamfædre 17,18. Derfor vil disse aspekter af analysen ikke gentages her; i stedet følgende procedurer vil blive behandlet: 1) dissociation af den voksne bugspytkirtlen og sortering CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler, som beriger PCFUs fra voksne mus 7, 2) encellede manipulation af de sorterede celler, 3) single-koloni analyser ved hjælp microfluidic QRT-PCR og hel-mount immunfarvning, og 4) dissociation af Colonies mod enkelt-cellesuspension og re-plating i murine ECM eller laminin hydrogel koloniassays.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etisk Statement: Vi overholder de bredt accepterede etiske standarder i at udføre forskning for at sikre kvaliteten og integriteten af resultaterne. Dyreforsøg er udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på City of Hope.
1. Forbered Single-celle Suspension fra Adult Murine pancreata
BEMÆRK: I tidligere publikationer 7,11, blev CD-1 eller B6 baggrund mus anvendt; begge baggrunde gav lignende resultater. En transgene mus linje (betegnet Sox9 / EGFP) med forbedret grøn fluorescens protein drevet af Sox9 loci 19,20, blev oprettet i CD-1 baggrund.
- Afliv 3 til 5 voksne mus ved hjælp af gas CO 2 for 1-2 min, eller indtil vejrtrækning stopper. Dernæst udføre cervikal dislokation på hver mus.
- Dissekere og Forbered pancreas.
BEMÆRK: Dissekere musene snarest muligt efter eutanasi. Dette er vigtigt for at undgå auto-fordøjelse af pancreas skyldigeændringer efter slagtning.- Lav en lodret snit på midterlinjen af bugvæggen af musen med en saks og åbne bughulen. Find milten og bruge pincet til forsigtigt at løfte den. Skær bindevæv mellem milt og milt lap af pancreas med en saks.
- Gentag denne praksis efter duodenale og gastriske kamre af bugspytkirtlen. Placer pancreas væv i en petriskål på is indeholdende kold Dulbeccos modificerede phosphatpufferopløsning (DPBS), 0,1% bovint serumalbumin (BSA), og penicillin og streptomycin (P / S; komplet løsning betegnet som PBS / BSA).
- Fjern fedtvæv fra bugspytkirtlen under et dissektionsmikroskop under anvendelse af fin-spids pincet.
BEMÆRK: Dette er afgørende for sundheden for de dissocierede pancreas celler i de følgende trin.- (Valgfrit) Markér pancreas for grøn fluorescens under fluorescens stereomikroskop ved hjælp 488-509 nm excitation at sikreEGFP ekspression.
- I en vævskultur hætte, skylles vævet tre gange sekventielt i tre 100 mm petriskåle indeholdende 10 ml koldt PBS / BSA.
- Lav en lodret snit på midterlinjen af bugvæggen af musen med en saks og åbne bughulen. Find milten og bruge pincet til forsigtigt at løfte den. Skær bindevæv mellem milt og milt lap af pancreas med en saks.
- Generer små stykker væv.
- Overfør det dissekerede pancreas til en tør steril petriskål at fjerne så meget PBS / BSA som muligt, og overføre dem til en anden tør petriskål på is.
- Forbered PBS / BSA indeholdende DNase I ved tilsætning af 2 pi DNase I stamopløsning (1 million enheder [MU] / ml) per 1 ml PBS / BSA.
BEMÆRK: Denne opløsning betegnes PBS / BSA / DNase I. Make ~ 200 ml af denne opløsning på en gang, som vil dække en sortering eksperiment. - Hak pancreas hjælp foråret saks i 2-3 min, eller indtil vævet er i fine stykker. Tilsæt 2-3 ml kold PBS / BSA / DNase I til vævet stykker i petriskålen at suspendere dem.
- Overfør vævsstykkerne til et 50 ml konisk rør på is med en 10 ml pipette. Bring det samlede volumen til 10 ml med PBS / BSA / DNase l efter udvinding så meget væv som muligt.
- Fordøje bugspytkirtlen brikker på Mostly enkeltceller.
- Tilføj collagenase B (100 mg / ml stamopløsning) ved 350-450 pi / 10 ml til vævet stykker og inkuberes vævet ved 37 ° C i et vandbad i 8 minutter, hvirvlende hver 3-4 min. Anvend en 10 ml sprøjte med en 16 ½ G nål til at udarbejde og efterfølgende sprøjte vævet opløsningen ned væg 50 ml rør ved stuetemperatur. Gentag dette syv gange.
BEMÆRK: Brug tilstrækkelig kraft til at bryde op celle klynger, men undgå at skabe bobler, der kan dræbe cellerne. - Retur slangen til vandbad ved 37 ° C i 8 min og blandes ved omrystning hver 3-4 min. Syringe vævet op og ned syv gange, som nævnt ovenfor, og placere en prøve (10 ul) af vævet opløsning på en tør petriskål. Overhold vævet løsning under et omvendt fase-kontrast, lys mikroskop med en 10X objektiv. Forvent enkelte celler og nogle små mellemstore cell klynger for at være til stede.
- Håndter cellerne på is fra dette punkt på at bremse eller stoppe aktiviteten af collagenase. Juster rumfang på 50 ml ved anvendelse kold PBS / BSA / DNase I. Centrifuger cellerne ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C, og resuspender i 5 ml kold PBS / BSA / DNase I under anvendelse af en P1000 pipette.
- Tilføj collagenase B (100 mg / ml stamopløsning) ved 350-450 pi / 10 ml til vævet stykker og inkuberes vævet ved 37 ° C i et vandbad i 8 minutter, hvirvlende hver 3-4 min. Anvend en 10 ml sprøjte med en 16 ½ G nål til at udarbejde og efterfølgende sprøjte vævet opløsningen ned væg 50 ml rør ved stuetemperatur. Gentag dette syv gange.
- Filter til Udbytte enkelt celle suspensioner og Wash.
- Filtrere celler gennem en 70 um nylon mesh filter kop og derefter gennem en 40 um nylon mesh filter cup.
- Resuspender cellerne i 5 ml kold PBS / BSA / DNase I og tælle cellerne.
BEMÆRK: 2-4 måneder gamle B6 eller CD-1 mus, kan hver bugspytkirtlen giver ~ 5 eller 10 millioner celler. Disse tal kan variere mellem forskellige eksperimentalister. Hvis overdreven cellerester findes ved at tælle, bringe volumenet til 50 ml med kold PBS / BSA / DNase I og centrifugeres cellerne ved 400 x g i 5 min ved 4 ° C. - Justere lydstyrken af cellesuspensionen til en koncentration på 2 x 107 celler / ml ved anvendelse af kold PBS / BSA / DNase I.
2. Sortere Celler til Berig bugspytkirtlen kolonidannende Progenitorer
BEMÆRK: Fra B6 mus, CD133 + men ikke CD133 - celler er beriget for PCFUs 7,9,11. CD133 + celler udgør ~ 13% af den samlede dissocierede pancreasceller efter alle gating parametre anvendes 11. Fra CD-1 mus, CD133 + Sox9-EGFP + celler repræsenterer typisk ~ 4% af de samlede bugspytkirtlen celler, og denne celle population er beriget til PCFUs 7. Sortering af CD133 + Sox9 / EGFP + celler er beskrevet her.
- Farv den dissocierede pancreasceller.
- Blokere hele pancreas enkelt cellesuspension for at reducere ikke-specifik binding ved at inkubere enkeltcelle-suspension med anti-muse CD16 / 32 ved 10 ug / ml slutkoncentration i 5 minutter på is.
- Fjern en portion af 1 x 10 6 celler (50 &# 181; l) at farve med isotypekontrolantistof, biotin-konjugeret rotte-IgG1 ved 5 ug / ml endelig koncentration, i 20 minutter på is, hvirvlende hver 5-7 min.
- Fjern en portion af 1 x 10 6 celler (50 pi) og holde på is som en uplettet kontrol.
- Farv resten af cellerne med et biotin-konjugeret anti-muse CD133 primært antistof, ved 5 ug / ml endelig koncentration, i 20 minutter på is, hvirvlende hver 5-7 min.
- Vask celler.
- Vask isotypekontrol og primære antistof-farvede prøver ved at bringe rumfanget til 1 ml med PBS / BSA / DNase I og centrifugeres ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C. Gentag dette vasketrin.
- Resuspender isotypekontrol og primære antistof-farvede prøver i PBS / BSA / DNase I, så slutkoncentrationen er 2 x 10 7 celler / ml.
- Farv den isotypekontrol og primære antistof-farvede prøver med streptavidin (STV) -mærket allophycocyanin (APC) ved 2 & #181 g / ml slutkoncentration. Der inkuberes i 15 minutter på is, hvirvlende hver 5-7 min.
- Vask celler og 4 ', 6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) farvning.
- Vask isotypekontrol og primære antistof-farvede prøver to gange med PBS / BSA / DNase, som i trin 2.2. Resuspender cellerne i PBS / BSA / DNase I med DAPI (0,2 ug / ml slutkoncentration). Det endelige volumen af kontrolprøven isotypen bør være 0,5 ml.
BEMÆRK: Sørg for, at den endelige tæthed af det primære antistof-farvede prøve er hensigtsmæssigt for sorteringsanlæg, der skal bruges. En koncentration på 5 x 10 6 celler / ml anvendes rutinemæssigt til sortering. - Juster lydstyrken af de ufarvede celler til 0,5 ml med PBS / BSA / PS / DNase I. Filter alle celler gennem en 20 um mesh før sorteringen og holde cellerne på is i mørke.
- Vask isotypekontrol og primære antistof-farvede prøver to gange med PBS / BSA / DNase, som i trin 2.2. Resuspender cellerne i PBS / BSA / DNase I med DAPI (0,2 ug / ml slutkoncentration). Det endelige volumen af kontrolprøven isotypen bør være 0,5 ml.
- Sortering af celler.
- Brug en 80 pm eller større dyse til sortering.
BEMÆRK: Murine pankreatiske endokrine celler er tilbøjelige til fysisk stress. HoWever, behøver murine PCFUs ikke ud til at blive påvirket af stress forårsaget ved at passere gennem en sorteringsanlæg 7. - Erhverve celle begivenheder og parametre analyse på sorteringsanlæg. Gate cellerne i fremad og sidespredning områder at udelukke cellerester 7. Gate for fremadgående og sidespredning bredder at udelukke celledubletter. Gate at udelukke DAPI + døde celler 7. Vælg gating parametre for EGFP og CD133-APC-signaler baseret på værdierne fra isotype kontrolceller (figur 1).
- Indsamle de sorterede celler i 5 ml polystyrenrør indeholdende 1,5 ml DMEM / F12-medium suppleret med 5% føtalt kalveserum (FCS). Centrifuger de sorterede populationer ved 400 xg i 5 minutter og resuspender i et lille volumen (~ 200 pi) af enten DMEM / F12 eller PBS / BSA / DNase I suppleret med 5% FCS. Holde cellerne på is indtil brug.
- Brug en 80 pm eller større dyse til sortering.
- Tæl antallet af CD133 + Sox9-EGFP + celler opnået fra sorteringsanlæg. Tag en10 pi celleprøve og tælle cellerne med et hæmacytometer til bestemmelse af celletætheden.
anbefales hæmacytometer brug, fordi maskinen tæller fra sorteringsanlæg er ofte upålidelige: BEMÆRK.
3. Plade De sorterede celler i Colony Assay Indeholder murine ECM Proteiner
BEMÆRK: Der henvises til de detaljerede protokoller til plettering af celler i murine ECM-holdige koloni assay i en anden JOVE publikation 18.
- Forbered Kultur Medier.
- Forbered et dyrkningsmedium indeholdende DMEM / F12-medium, 1% (vægt / vol) methylcellulose, 5% (v / v) murine ECM-proteiner, 50% (v / v) konditioneret medium fra Mesc-afledte pancreas-lignende celler, 5% (vol / vol) FCS, 10 mmol / l nikotinamid, 10 ng / ml humant rekombinant activin B, 0,1 nmol / l exendin-4, og 1 ng / ml vaskulær endotelvækstfaktor-A. Fremgangsmåder til generering af den konditionerede medium er beskrevet detaljeret andetsteds 18.
- Tilføj 750 ng / ml af RSPO-1 til mediethvis der ønskes Tætte kolonidannelse.
- Inkubér det murine ECM protein kultur ved 37 ° C og 5% CO2 i 3 uger.
4. Kultur de sorterede celler ved 1 celle pr Well
BEMÆRK: Følgende procedurer gælder for manipulere enkelte celler ved hjælp af hånd og mund pipetter. En alternativ metode er at købe en mikromanipulator. En typisk mikromanipulator omfatter et omvendt mikroskop med en joystick-betjent, motoriseret platform.
- Forbered Glas Pasteur pipetter.
- Ved hjælp af en bunsenbrænder, trække ud spidsen af et glas Pasteur-pipette til en fin spids (~ 30 um ved åbningen). De glas Pasteur-pipetter bør have en bomuld prop for at skabe en barriere for luftstrømmen fra operatøren.
- Autoklaver Flammet glas Pasteur-pipetter ved 121 ° C i 20 minutter til sterilisering.
- Forbered 96-brønds plader for kultur.
- Forbered kold halvfast dyrkningsmedium overenskomsting til den tidligere beskrevne protokol 18.
- Substratet doseres ind i de indre brønde i en plade med 96 brønde med lav bindende fladbundede 100 pl / brønd med en 1 ml sprøjte. Fyld de ydre brønde med sterilt vand for at opretholde fugtighed.
- Placer dyrkningsskålen på is indtil brug.
- Forbered sorterede celler.
- Tilføj ~ 6.000 celler opsamlet fra et sorteringsanlæg til 2,5 ml slutvolumen på DMEM / F12 / PS indeholdende 10% FCS og 1% methylcellulose i et 5 ml polystyrenrør. Ryst kraftigt for at blande komponenterne. Vent i 5 minutter, eller indtil boblerne flyder op til overfladen af røret. Dette trin er ikke nødvendigt at gøre dette på is.
- Dispensere cellen løsning på to 35 mm skåle ved 1 ml / skål under anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 18 ½ G nål.
- Spred celle løsning i skålen ryst forsigtigt skålen ved hånden. Lad ikke halvfast medium for at nå margenen af 35 mm skål, som de enkelte celler i margenen af brønden cannot observeres tydeligt ved anvendelse af et inverteret lysmikroskop.
- Forbered Working området omkring en mikroskop.
- Foretag en opløsning indeholdende DMEM / F-12-medium og 1% methylcellulose uden nogen celler ( "no-celle 'medium), og dispensere opløsning (som beskrevet i 4.3.2) i to 35 mm petriskåle (1 ml pr skål) .
- Rengør og tør arbejdsområdet omkring en omvendt fase-kontrast mikroskop med en 70% alkohol løsning.
- Saml Pipette med mundstykket.
- Vælg en steril glas Pasteur-pipette, der blev udarbejdet i trin 4.1. Fastgør den store ende af en 1 ml plastik pipette tip til toppen af glasset Pasteur-pipette. Fastgør den lille ende af 1 ml plastik pipette tip til den ene ende af et tyndvægget gummislange, og mundstykket til den anden ende af røret. Brug samme glas pipette til at afhente flere celler i samme gruppe.
- Udarbejder ved munden sugning, et lille volumen (~ 10 til 50 pi) af"No-celle" halvfast opløsning fremstillet i trin 4.4.1 med glasset Pasteur pipette.
BEMÆRK: halvfast løsning på den smalle åbning af glasset Pasteur-pipette skaber flow modstand og giver en barriere for at forhindre forurening af de celler, der skal plukkes.
- Vælg en enkelt celle.
- Placer 35 mm skål indeholdende de sorterede celler på mikroskopbordet og fjern låget.
- Find cellerne ved hjælp af en 10X objektiv og fokus på en egnet celle skal plukkes.
- Find og placere åbningen af pipettespidsen ved siden af cellen af interesse. Der suges gennem munden.
BEMÆRK: Bevægelsen af cellen skal være ganske langsomt, således at der ikke er risiko for at miste cellen under processen senere. Bevægelsen af cellen ind i åbningen af pipetten skal være synlig. Hvis flowet bevæger sig for hurtigt, skifte til en pipette med en smallere åbning.
- Depositum enkelt celle i en kultur Well.
- Når cellen er i pipetten, bruge tungen til at stoppe strømmen ved at blokere åbningen af mundstykket. Pause kortvarigt før tilbagetrækning af tip fra den semi-fast medium for at sikre, at den halvfast medium er holdt op med at strømme.
- Placér spidsen af pipetten i en brønd i pladen med 96 brønde fremstillet i trin 4.2. Skub celle langsomt ud ved forsigtigt at blæse ind i mundstykket. Mark brønden, efter at cellen er deponeret, at undgå plating to celler i en brønd.
- Sørg for, at en enkelt celle er placeret i en kultur Well.
- Placér pipettespidsen i "no-cell" medium forberedt i trin 4.4.1. Under iagttagelse åbningen af spidsen under mikroskopet, skubbe det resterende halvfaste opløsning. Forventer ingen celle til at flyde ud af spidsen af pipetten.
- At dobbelttjekke, finde placeringen i kulturen godt, hvor enkelt celle blev implanteret.
- Kultur de enkelte celler ved 37 ° C i 5% CO2 i optil 3 uger.
5. Vælg Individuel Kolonier fra Semi-solid kultur for Mikrofluid QRT-PCR-analyse
BEMÆRK: Tre uger efter udpladning sorteret CD133 + Sox9 / EGFP + celler i det murine ECM-indeholdende koloni assay Ring eller Tætte kolonier dannet 7 (figur 2). Når ring / Tætte kolonier dissocieres i enkelt cellesuspension og re-udpladet i laminin hydrogel kultur, er Endocrine / Acinære kolonier genereret efter cirka en uge 7 (figur 2). For at bestemme afstamning sammensætningen af hver koloni, er mikrofluid QRT-PCR-analyse anvendes til påvisning af ekspression af afstamning markører 7. For præ-amplifikation, en koloni er blandet i en master-blanding indeholdende en TaqMan probe mix, reaktionsbuffer, og SuperScript III 21. Den 48,48-chip efterfølgende anvendes til mikrofluide PCR-reaktioner 21.
- Forbered pre-forstærkning PCRbland indeholdende 48 prober.
- Pipetter 1,5 pi af hver TaqMan probe (20x stamopløsning) i et 1,5 ml rør. Tilføj 78 pi TE-buffer til at justere lydstyrken til 150 pi.
- Forbered master mix ved at følge protokoller fra producenten 21.
- Placer 9 pi mester blandes ind hver 0,2 ml tyndvæggede reaktionsrør egnede til PCR, og gentage dette trin for op til 48 rør.
- Pick enkelte kolonier fra halvfast kultur.
BEMÆRK: Ring / Tætte kolonier er større end endokrine / Acinære kolonier, med diameter fra ~ 50 til 400 um 9,11. Derfor er enkelt ring / Tætte kolonier plukket ved hjælp af en P10 pipette udstyret med en 10 pi pipettespids, der er bøjet i en buet form. For at vælge den lille Endokrine / Acinære kolonier (figur 2), henvises til trin 4.- Find en koloni af interesse under høj forstørrelse (f.eks 20X objektiv), reducere forstørrelsen, og aspirate kolonien. (Valgfrit) Tag et fase-kontrast billede af kolonien på dette trin for at dokumentere de synlige karakteristika kolonien.
- Overfør kolonien i PCR-rør indeholdende 9 pi store blanding.
- Vælg den næste koloni. Op til 45 kolonier i alt kan analyseres pr PCR-kørsel, hvilket efterlader 3 spots for kontrol.
- RNA-ekstraktion og cDNA syntese med præ-amplifikation.
- Vortex prøverne kraftigt, før du udfører den termiske reaktion.
- Udfør termisk cykling reaktioner ifølge producentens anvisninger 21. Ring / Tætte kolonier kræver 14 cykler, Endocrine / Acinære kolonier kræver 16-20 cykler, og enkelte celler kræver 22 cyklusser.
BEMÆRK: Pre-amplifikationsprodukter cDNA'er kan opbevares ved -20 ° C forud for mikrofluid PCR-analyse.
- Kør efterfølgende PCR-reaktioner under anvendelse af en mikrofluid chip, ifølge producentens anvisninger 21.
- Høst og Fix Kolonier.
- Saml kolonierne under mikroskopet, som i trin 4 eller 5.4, og tilføje dem til en 4% paraformaldehydopløsning. Inkuber O / N ved 4 ° C med forsigtig rystning.
- Vask kolonier med 1X PBS to gange i 10-30 minutter ved stuetemperatur. Opbevar de faste kolonier ved 4 ° C i 1,5 ml rør forseglet med paraffin.
- Farv de Kolonier med antistoffer.
- Overfør kolonier til en brønd i en 96-brønds sort plade med en klar bund indeholdende 200 pi blokeringspuffer (5% æsel og / eller gedeserum, 0,1% Triton X-100 i 1 x PBS). Inkuber O / N ved 4 ° C med forsigtig rystning.
- Fortynd det primære antistof til en forud bestemt koncentration (fx 1: 500 for hamster anti-mucin 1 antistof) under anvendelse af blokerende buffer. Overfør kolonierne til en ren godt med 200 pi primært antistof, og inkuber O / N ved 4 ° C med forsigtig rystning. Wash kolonierne 3 gange med PBS indeholdende 0,1% Tween 20. Overfør kolonierne i en ny brønd med 200 pi 1x PBS / 0,1% Tween 20 i 10 minutter ved stuetemperatur i hver vask.
- Fortynd det sekundære antistof til en forud bestemt koncentration (fx 1: 2.000 for gede-anti-armensk hamster antistof) under anvendelse af blokerende buffer. Opløsningen opbevares i mørke. Overfør kolonierne til at rense brønde indeholdende 200 pi sekundært antistof, og inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur. Vask kolonierne 3 gange med PBS / 0,1% Tween 20, som i trin 6.2.2.
- Counter-pletten kolonier med DAPI og visualisere med konfokal mikroskopi.
- Overfør kolonierne i brønde med PBS indeholdende 300 nM DAPI og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Overfør DAPI-farvede kolonier til en 35 mm glas-bottom petriskål til visualisering. Placer en dækglas på toppen af kolonierne for at forhindre fordampning.
- Brug et konfokalt mikroskop til at fange billeder. For at visualisere DAPI staining, bruge to-foton excitation bølgelængde på 730-950 nm. Brug en argon laser med en bølgelængde på 458 nm til ophidse fluorokromer med emissionsbølgelængder på 519 og 561 nm. Brug en helium-neon-laser med en bølgelængde på 633 nm til ophidse fluorokromer med emissionsbølgelængder på 665 nm.
7. afstand og Re-plade Primær Ring / Dense Kolonier i Sekundære Colony Analyser
BEMÆRK: bør udføres Alle procedurer under sterile forhold. Undgå kuldechok til cellerne i denne procedure så meget som muligt, såsom at sætte celler på is eller vaske celler med kold PBS / BSA. Denne praksis reducerer levedygtigheden af re-belagte celler.
- Forbered Solutions.
- Pre-varm vaskebuffer (DMEM / F12; P / S; 0,1% BSA) i et 37 ° C vandbad.
- Pre-varme en plade med 96 brønde (flad bund, lav binding) i en 37 ° C inkubator. Tilsæt 100 pi 100% FCS til en brønd af pladen og 100 pi 0,25% trypsin-EDTA-opløsning til en andengodt.
- Saml Kolonier.
- Pluk og samle i alt 20 eller flere Ring / Tætte kolonier i primære kulturer ved hjælp af 10 pi pipettespidser, som beskrevet i trin 5.4.
- Placer kolonierne i varmt (mindst RT) vaskepuffer (~ 1.000 pi) i et 1,5 ml rør og centrifugering ved 400 xg i 5 min. Fjern supernatanten.
- Dissociere Kolonier i Single-celle suspensioner Brug af trypsin.
- Overfør det resterende volumen (20 pi eller mindre), som indeholder de kolonier i brønden, der indeholder varm trypsin-opløsning (fremstillet i 7.1).
- Inkubér pladen i en 37 ° C inkubator (ikke et vandbad) i 1,5 min. Fjern pladen og pipette kolonierne et par gange. Der inkuberes ved 37 ° C i yderligere 1,5 min.
- Fjern pladen og pipette op og ned et par gange mere for at bryde op kolonierne. Check under mikroskop for at se, om kolonierne er dispergeret overvejende i enkelt-cellesuspension.Undgå overdreven nedbrydning af kolonierne.
- Stands Trypsin reaktionen ved tilsætning FCS.
- Overfør 100 ul varme FCS i brønden, der indeholder cellerne. Pipette op og ned et par gange. Overfør cellerne i et 1,5 ml rør indeholdende 1.000 pi varm vaskebuffer. Centrifuger ved 400 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask to gange med varm puffer.
- Resuspender cellerne i ~ 200 pi buffer eller dyrkningsmediet.
- Tæl antallet af celler ved hjælp af et hæmacytometer. Hold cellesuspensionen ved stuetemperatur.
- Re-plade dissocierede celler til sekundære koloniassays indeholder enten murine ECM-proteiner (5% volumen / volumen) eller laminin hydrogel (100 ug / ml) og inkuber cellerne ved 37 ° C med 5% CO2.
BEMÆRK: re-plating celler i murine ECM-proteiner, bruge 2,500-5,000 celler per brønd og kultur i 2-3 uger. Til re-gende i laminin hydrogel kultur, bruge 10.000-25.000 celler per brønd og kultur for 7-12 dage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voksne pancreasstamfaderceller kan beriges ved fluorescens-aktiveret cellesortering (figur 1). Den Sox9 / EGFP transgene mus linje bruges her blev først frembringes som resultat af GENSAT Brain Atlas Project 19 og den EGFP reporter er under kontrol af en bakteriel kunstigt kromosom indeholdende ~ 75 kb opstrøms og ~ 150 kb nedstrøms sekvenser af Sox9 20 . I disse mus, EGFP etiketter pancreas kanaler effektivt og specifikt 22. Pancreas blev anskaffet og dissocieret til en enkelt-cellesuspension, og farvet med anti-CD133-antistoffer konjugeret med biotin, efterfulgt af farvning med sekundære antistoffer konjugeret med STV-APC. De resulterende celler blev analyseret ved flowcytometri med passende gating parametre (figur 1). Celler opnået ved hjælp af forskellige gating parametre kan sorteres og udpladet i methylcellulose indeholdende koloniassays forkolonidannelse. I tidligere undersøgelser, blev det bemærket, at kolonidannende evne kun findes i den sorterede CD133 + Sox9 / EGFP + duktale celler 7.
De dannede kolonier i methylcellulose indeholdende koloniassays blev klassificeret efter deres morfologier, som observeret ved anvendelse af et omvendt fase-kontrast, lysmikroskop (figur 2). Efterfølgende individuelle kolonier blev håndplukket og analyseret ved mikrofluid QRT-PCR-analyse for genekspression (figur 3) eller ved hel-mount immunfarvning til proteinekspression (figur 4). I publicerede undersøgelser 7,9,11, blev det konstateret, at mange individuelle kolonier udtrykte afstamning markører for kanalen (mucin-1), acinære (amylase) og endokrine (insulin) celler, hvilket indikerer, at hovedparten af de initierende PCFUs for disse kolonier er tri-potent. Andelen af de tre cellelinier i hver koloni Imidlertid var påvirket af de typer og koncentrationer af ECM-proteiner til stede i methylcellulose indeholdende koloniassays 7,9. Murine ECM-proteiner stimuleret selv-fornyelse af PCFUs og ductal celledifferentiering mens laminin hydrogel fortrinsvis støttet differentiering af endokrine og acinære cellelinier 7,9,11.
Figur 1. Flow cytometri analyse af dissocierede pancreasceller fra voksne mus viser farvningsmønstre ifølge to duktale cellemarkører, CD133 og Sox9. Sox9 / EGFP transgene mus, der indeholdt Sox9 loci-drevet EGFP reporter blev anvendt. Et repræsentativt sortering port (rød boks) for pancreas CD133 + Sox9 / EGFP + celler er vist. CD133 + Sox9 / EGFP + celler er beriget til PCFUs 7.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Kolonier med forskellige morfologier blev dannet i methylcellulose indeholdende koloniassays. Repræsentative mikrofotografier af Ring, er tætte og endokrine / Acinære kolonier fra en fasekontrastmikroskop belyst af synligt lys vist. Ring og Tætte kolonier genereres, når frisk sorteret PCFUs er belagt i dyrkningsmedium indeholdende murine ECM proteiner og dyrket i 3 uger 7. Endokrine / Acinære kolonier dannet efter fornyet udpladning den dissocierede Ring eller Tætte kolonidannende celler i dyrkningsmedium indeholdende en laminin hydrogel og dyrket i ~ 1 uge 7. Scale barer for Ring og Tætte kolonier = 100 um. Scale bar for Endo / Acinar kolonier = 25 μ;. m Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Individuelle kolonier dyrket i murine ECM-proteiner udtrykt markører til duktale, acinære og endokrine celler. Repræsentative resultater af microfluidic QRT-PCR-analyse af individuelle Ring kolonier. Hver kolonne repræsenterer en enkelt koloni. Ekspressionsniveauerne af gener er udtrykt som en varme-map her, med varmere farver indikerer højere udtryk og koldere farver indikerer lavere udtryk. Mange af de enkelte kolonier udtrykke mindst et af generne i hvert panel for markører indikative for kanalen, endokrine eller acinært celle afstamning. Disse data viser, at mange af de individuelle kolonier udtrykker tri-afstamningsceller markører, og antyder, at de fleste af dePCFUs oprindelse er tri-potent. Dette tal er modificeret fra en tidligere publiceret figur 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. To Ring kolonier udtrykte en duktalt protein markør Mucin 1. Repræsentative resultater af hel-mount immunfarvning af Ring kolonier, viser protein udtryk for en duktalt markør Mucin 1 (grøn farve). Kernerne er counter-farvet med DAPI (blå farve). Mange celler i disse Ring kolonier udtrykker mucin 1-protein. Dette er i overensstemmelse med de mikrofluide QRT-PCR resultater, der viser, at Ring kolonier dyrket i murine ECM-proteiner udtrykker høje niveauer (varmere farver i figur 3) af mucin1 og andre duktale cellemarkører. Målestokken repræsenterers 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Pancreas koloni assays til måling af selv-fornyelse og multi-slægt differentiering af individuelle stamceller i kultur. Repræsentant workflow præsenteres. Vores pancreas koloniassays indeholder et viskost materiale, methylcellulose, således at dyrkningsmediet bliver halvfast stof. Halvfast medium begrænser bevægelser og forhindrer sammenlægning af flere progenitorceller (angivet med rødt). Men mediet er blød nok til at tillade en enkelt progenitorcelle til forny sig selv og / eller differentiere, og vokse til en koloni af celler (ved flere røde cirkler). Derimod enkelte celler, der ikke har kolonidannende evner, <em> dvs. ikke-progenitorceller (vist med blåt), forbliver som enkelte celler eller dø med tiden i kultur. Methylcellulose tillader også inddragelse af ECM-proteiner ved lave koncentrationer, såsom 5% murine ECM proteiner eller 100 pg / ml laminin hydrogel. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De pancreas koloni assays og enkelt koloni analyser beskrevet her blev inspireret af de methylcellulose-holdige hæmatopoietisk koloni analyser, der har spillet store roller i decifrere biologi hæmatopoietiske stamceller i de seneste årtier 23. I disse assays (figur 5), dissocierede pancreasceller udplades i methylcellulose indeholdende halvfast medier med passende vækstfaktorer og ECM-proteiner, der understøtter dannelsen af Ring, tætte eller endokrine / Acinære kolonier 7. En enkelt progenitorcelle, der kan give anledning til en koloni af celler betegnes en PCFU. Ved at karakterisere de enkelte kolonier ved hjælp mikrofluid QRT-PCR og hel-mount immunfarvning kan afstamning potentialer de PCFUs oprindelse udledes. Det blev konstateret, at et flertal af voksne murine PCFUs er tri-potente, som kan give anledning til duktalt, acinære, og endokrine afstamning celler in vitro 7,9. Mens muroffline-ECM-proteiner fremmer differentieringen af tri-potent PCFU dybt kanalen afstamning, laminin hydrogel tillader robust endokrine og acinar cellelinje differentiering 7,9. For at vurdere in vitro selvfornyelse kapacitet PCFUs, Ring eller Tætte kolonier dyrket i en primær murine ECM koloni assay kan adskilles i enkelt-celle suspension og re-belagte i en sekundær murine ECM koloni assay 7. Det blev konstateret, at PCFUs udvidet ~ 500.000 gange i murine ECM-proteiner i løbet af 11 uger 7. De kritiske trin omfatter fjernelse af fedtvæv fra dissekeret pancreas, undgå overdreven fordøjelse af pancreas celler ved collagenase, og minimere koldt chok for dissocierede Ring / Tætte koloni celler, før re-plating. Mastering mikromanipulering af enkelte celler kan tage lidt tid; tålmodighed og praksis er påkrævet.
Sammenlignet med andre pancreasstamfadercelleoverfladerne assays, herunder 2D kultur 24, de suspension "pancreasphere" 25 og de organoide assays 12-15, de store fordele ved methylcellulose-holdige kolonier assays beskrevet her er som følger. For det første kan tilsætningen og tuning af ECM proteiner til et bredt område af koncentrationer nemt opnås. Dette skyldes, methylcellulose er det stof, som giver 3D arten af den halvfaste medium. I modsætning hertil organoide dyrkningsmetoder afhænger af størkning af murine ECM-proteiner, som er til stede ved 33% v / v eller højere. Det bemærkes, at så lidt som 1% murine ECM protein kan inhibere differentiering af endokrine celler 9, hvilket understreger betydningen af ECM proteinkoncentration i progenitorceller assay. For det andet er kolonier jævnt fordelt på tværs af kultur godt og kan tælles præcist. Tredje, enkelte kolonier let kan håndplukkes til efterfølgende analyse. For det fjerde har methylcellulose indeholdende halvfast medium er let at vedligeholde, og ingen mediumændring er påkrævet i løbet af kulturen. Endelig kan et stort antal celler (op til 25.000 celler pr plade med 24 brønde) udplades og undersøges i disse koloniassays, hvilket gør dem effektive til påvisning stamceller aktiviteter, selvom de er en mindre population blandt de udpladede celler.
Pancreasstamfadercelleoverfladerne assays beskrevet her, er baseret på funktionel, men ikke markørbaseret, analyser af pancreasstamfadercellerne. Det betyder, at pancreasstamfaderceller kan studeres uden at vide hvad markører de udtrykker. Dette er vigtigt, fordi der er lidt viden om, hvad markører de voksne pancreasstamfaderceller kan udtrykke. Derudover kan markører for embryonale pancreasstamfaderceller ikke være hensigtsmæssige til at studere de voksne stamceller. Ved at bruge funktionelle analyser, kan man begynde at identificere specifikke stamceller markører ved først at bestemme den delpopulation, der har PCFU aktivitet, såsom CD133 + </ sup> Sox9 / EGFP + celler illustreret her. Dette kan efterfølges af identifikationsnummeret, anvendelse af RNA-seq, af gener, som udtrykkes differentielt ved PCFU-holdige befolkning. Ansøgerlandene markører kan derefter testes og verificeres af assays, såsom in vitro og in vivo slægt sporing teknikker, der sporer de differentiering evner stamceller.
Begrænsningerne af in vitro methylcellulose-holdige koloni analyser er tredoblet. Første, selv om analyserne efterligne in vivo mikromiljø i bugspytkirtlen ved at tilvejebringe ECM-proteiner og vækstfaktorer til pancreasstamfadercellerne i 3D rummet i kultur, er forholdene ikke er identiske. Endvidere er strukturerne af epiteliale celler in vivo sprængt ved dissociation i enkelte celler, som kunne have væsentlige konsekvenser. Derfor vil det være vigtigt at kontrollere stamceller i opfølgende undersøgelser ved hjælp in vivo 18. Disse udefinerede komponenter kan påvirke funktionen af specifikke vækstfaktorer på progenitorceller indirekte og mere arbejde er nødvendigt for at skabe et fuldt defineret sæt dyrkningsbetingelser. Endelig slægt opsporing forsøg viste acinære-til-beta-celler 26,27 eller alfa-celler-til-beta-celler 28 konverteringer in vivo i voksne mus. De methylcellulose dyrkningsbetingelser beskrevet her, kan være specifikt for kanal-til-beta-celle kun konvertering. Andre ukendte dyrkningsbetingelser kan være behov for ikke-kanalsystemer celler til at konvertere til beta-celler i kultur.
Der er flere tilfælde, hvor fejlfinding kan være nødvendige. For eksempel, hvis dissocierede celler er sammenklumpede sammen, anvende højere doser af DNase I i opløsninger. DNase I er vigtigt at forhindre sammenfiltring af dissocierede pancreatiske celler forårsaget af DNA molecules frigivet af de døde celler (se trin 1.3.2).
Alternativt, hvis hakket væv pind i 10 ml pipette, hakke vævet i mindre stykker. Åbningen af 10 ml pipette bør være bred nok til vævsstykkerne til at passere gennem efter collagenase fordøjelse. Hvis stykker sidde fast på spidsen af den 10 ml pipette, indikerer dette, at hakning af vævet ved foråret saks ikke er tilstrækkelig (se trin 1.3.4).
Et andet problem, der kan opstå, er ingen kolonivækst i murine ECM-proteiner fra dissocierede bugspytkirtelceller (dvs. usorterede celler). Hvis dette sker, skal du ikke forsøge at bryde alle de klynger i enkelte celler under bugspytkirtlen dissociation skridt, da dette kan resultere i overspaltning og celledød. Hvis der er store stykker, røret tilbage til 37 ° C i et par (4) min og sprøjte 7 gange eller mindre. Recheck cellerne under mikroskop. Den maksimale tid for collagenase B behandling er 30 min. Depending på kollagenase anvendes, kan det optimale tidspunkt for fordøjelsen forskellig (se trin 1.4.2).
Desuden kan klumper af murine ekstracellulære matrixproteiner i dyrkningsbrønde observeres efter inkubation. For at undgå dette, skal du sørge for, at alle de kultur komponenter, der kommer i kontakt med murine ekstracellulære matrixproteiner holdes koldt på is for at undgå for tidlig størkning før inkubering i 37 ° C (se trin 3).
Desuden kan det være svært i optagning en celle ad gangen i et glas Pasteur-pipette. En løsning på dette er at reducere densiteten af de frisk sorterede celler udpladet i halvfast medium for at sikre, at en celle har tilstrækkelig afstand fra de andre celler. Dette vil undgå optagning flere celler samtidigt. Desuden er det bedre at placere fokus i mikroskopet nær bunden af den semi-fast medium, da det er lettere at samle op enkeltceller med hånden nær dette plan uden en mikromanipulator (se trin 4.6.2).
Desuden kan det være uklart, om enkelt celle manipulation er vellykket. En løsning er at praktisere det enkelt celle mikromanipulering før selve forsøget. Når cellen er samlet op i glasset Pasteur pipette cellen til en 35 mm petriskål indeholdende 1 ml 1% methylcelluloseopløsning uden celler ( "no-cell« medium fremstillet i trin 4.4.1). Visualisere og placere åbningen af spidsen af Pasteur-pipette i fokus under mikroskop, og skub cellen langsomt ud. Forvent det enkelt celle til langsomt vises omkring spidsen af pipetten og derefter flytte ind i den "no-cell 'medium (se trin 4.8.2).
Endelig kan der opstå nogen koloni vækst i sekundære kulturer fra dissocierede primær Ring / Tætte kolonier. For fejlfinding, sikre, at celler fra dissocierede primære kolonier holdes i RT før plating til sekundære kulturer. Til dyrkning i murine ECM-proteiner, tilføjcellerne sidste til røret indeholdende koldt dyrkningsmedium før blanding 18 for derved at minimere eksponering af cellerne til kold temperatur, som kan dræbe den dissocierede celler opnået fra primære kolonier. Men den genbelægning af celler i laminin hydrogel ikke behøver at blive udført på is før 37 ° C inkubation (se trin 7).
Sammenfattende har to methylcellulose-holdige koloniassays blevet anvendt til at karakterisere progenitor-lignende celler fra pancreas af voksne 7,11 og postnatal ung mus 9,10, samt af levere fra unge mus 10. Fremtidige ansøgninger vil blive rettet mod identifikation og karakterisering af de humane kolonidannende stamceller fra kadaver bugspytkirtlen organer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Lucy Brown og Alexander Spalla fra Analytical cytometri Core på City of Hope for hjælp til sortering. Dette arbejde understøttes delvist af National Institutes of Health (NIH) giver R01DK081587 og R01DK099734 til HTK, og U01DK089533 til ADR, og af National Science Foundation tilskud NSF-DMR-1.206.121 og California Institute for regenerativ medicin tilskud RB5-07398 til DAT Understøtter fra Joseph J. Jacobs Institut for Molekylær Engineering for Medicin på Caltech til DAT, og dem fra Oxnard Foundation og Ella Fitzgerald Foundation til HTK er også taknemmeligt anerkendt.
Finansiering: Dette arbejde understøttes delvist af National Institutes of Health (NIH) giver R01DK081587 og R01DK099734 til HTK, og U01DK089533 til ADR, og af National Science Foundation tilskud NSF-DMR-1.206.121 og California Institute for regenerativ medicin tilskud RB5-07398 til DAT Understøtter fra Joseph J. JacobsInstitut for Molekylær Engineering for Medicin på Caltech til DAT, og dem fra Oxnard Foundation og Ella Fitzgerald Foundation til HTK er også taknemmeligt anerkendt. Forskning rapporteret i denne publikation indgår arbejde udført i Analytisk cytometri Core og Light Microscopy Digital Imaging Core støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under award nummer P30CA33572.
Undersøgelse sponsor: Sponsor deltog ikke i undersøgelsen design, indsamling, analyse, eller fortolkningen af data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
