Summary
자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.
Abstract
줄기 성인 췌장 전구 세포가 제 1 형 당뇨병 환자를 치료하기위한 치료제 베타 - 유사 세포의 잠재적 인 원인이 될 수있다. 줄기 및 전구 세포를 성인 췌장에 존재하는지 그러나, 아직 알려져 있지 않다. 성인 쥐 계통 추적 CRE-LOX를 사용하여 연구 전략 지원 또는 중 베타 세포 덕트 성인 췌장 전구 세포가 존재할 수있다 추정 위치에서 생성 될 수 있다는 생각을 반박한다는 결과를 수득 하였다. 이러한 생체 CRE-LOX 계보-추적 방법은, 그러나, 자기 갱신과 줄기 세포를 정의하는 데 필요한 멀티 혈통 분화 두 가지 기준의 질문에 대답 할 수 없습니다. 이 기술 격차를 해결하기 위해, 우리는 췌장 전구 세포에 대한 3 차원 식민지 분석을 고안했다. 곧 우리의 초기 발행 후, 다른 연구소는 독립적으로 organoid 분석라는 비슷하지만 동일하지, 방법을 개발했다. organoid 검정에 비해, 우리의 방법을 사용낮은 농도에서 세포 외 기질 단백질의 포함을 허용 점성 용액을 형성하는 메틸. 많은 성인 장기 줄기 세포의 경우, 상기 메틸 - 함유 분석은 쉽게 검출 및 선조 작은 서브 모집단을 구성 할 때 중요한 단일 세포 수준에서 선조 세포의 분석을 허용한다. 함께, 여러 실험실에서 결과는 마우스의 췌장 전구와 같은 세포의 체외 자기 갱신 및 멀티 혈통 분화에 보여줍니다. 현재의 프로토콜을 마우스 췌장 전구 세포의 특징을 두 메틸 계 콜로니 검정을 기술; 하나는 라미닌 하이드로 알려진 뮤린 세포 외 기질 단백질의 상업적 제조 및 다른 인공 세포 외 기질 단백질을 포함한다. 여기에 도시 된 기술은 1)은 췌장의 해리 CD133 + Sox9 / EGFP의 정렬 성체 생쥐 + 도관 셀은 S 2) 단일 세포 조작이다orted 세포, 3) 단일 콜로니는 자기 갱신 또는 차별화를 평가하기 위해 보조 식민지 분석에 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색 및 단일 세포 현탁액 및 재 도금에 차 식민지 4) 분리를 사용하여 분석한다.
Introduction
췌장은 세 가지 주요 세포 계통으로 구성된다; 선포 세포는 소화 효소가, 덕트가 병원균을 방어하고 장내에 소화 효소를 수송하는 점액 분비 분비 및 내분비 세포는 포도당 항상성을 유지하는 인슐린과 글루카곤을 포함한 호르몬을 분비. 췌장의 배아 발달 동안 초기 도관 세포는 성체 동물의 1,2- pancreata에서 세 계통 상승을 제공 할 수있는 트라이 강력한 선조 세포의 근원이다. 골수 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포 및 선조 세포는 이미 성공적으로 각종 질병 (3)을 치료하는 데 사용되기 때문에, 성인 췌장 줄기 및 전구 세포를 찾는데 큰 관심이있다. 분리 및 성인 췌장 줄기 및 전구 세포의 조작이 가능하다면,이 세포는 인슐린 분비 세포가자가 면역에 의해 파괴되는 제 1 형 당뇨병 등의 질병을 치료하는 데 사용할 수 있습니다.
생체 CRE-LOX 계보 - 추적 기술을,이나 다와 동료 마커, 탄산 탈수 효소 II 표지 성인 쥐 도관 세포, 세 췌장 계통 (4)을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. 그러나, 이러한 HNF1b 5 Sox9이 다른 도관 마커를 이용하면, 도관 세포는 성체 생쥐에서 베타 세포의 주요 원인없는 것으로 결론 지어졌다.
몇 년 전에, 우리는 전술 논쟁의 원인은 필요한 자기 갱신 멀티 혈통 분화 개의 조건을 측정하는데 사용될 수있는 적절한 분석 도구의 필드 -6,7-에서 부족에 기인 할 수 있음을 제안 줄기 세포를 정의합니다. 언급 된 생체 CRE-LOX 계보 - 추적 기술위의 인구 수준에서 조상 - 자손 관계에 대한 증거를 제공 할 수 있습니다. 그러나,이 혈통 추적 기술은 단일 전구 세포는 자기 갱신과 여러 계통으로 분화 할 수 있는지 여부를 식별하기 위해 힘 제한된다. 여러 모노 강력한 조상, 다른 혈통 잠재력이 각각 함께 분석 하였다 경우, 그들은 집단적으로 멀티 혈통 분화 능력을 가지고 나타날 수 있기 때문에 단일 세포 분석은 중요하다. 또한, 줄기 세포는 일반적으로 성숙한 기관의 작은 집단이다. 작은 세포 집단의 활성은 주요 집단에 의해 마스크 될 수있다. 따라서, 모집단 연구에서 부정 결과가 반드시 줄기 세포의 유무를 나타내지 않는다. 마지막으로, CRE-LOX 계보 추적은 현재 자기 갱신의 측정을 허용하지 않습니다.
췌장 전구 세포 생물학, 식민지의 분야에서 기술 격차를 해결하는 시작하려면 7-11 또는 12-15 organoid (방법 및 장비 표 참조)의 상업 준비를 포함, 다른 하나는 라미닌 하이드로 겔, 정의 된 인공 ECM 단백질 7-11 포함되어 있습니다. 전구 세포는 반고체 배지 함유 메틸 혼합한다. 메틸 목재 섬유로 제조 된 생물학적 불활성 점성 재료이고, 통상적으로 조혈 콜로니 분석 (16)에 사용되어왔다. 그들은 다시 집합체 수 없도록 메틸 - 함유 반고체 배지 단일 전구 세포의 이동을 제한한다. 그러나, 상기 매체가 전구 세포의 성장과 3 차원 공간에서 세포의 콜로니로 분화 할 수 있도록 충분히 부드러운 것이다. 혈액학의 전통에 따라, 세포의 식민지에 상승을 제공 할 수있는 선수는 췌장 전구 세포는 N이었다아메드 췌장 집락 형성 단위 (PCFU). 뮤린 ECM 함유 콜로니 에세이에서 성장시 PCFUs는 "링"콜로니 7 명명 낭성 콜로니를 야기. 의 Wnt 작용제를 첨가하면, R-spondin1는 쥐 ECM 함유 문화로, 일부 링 식민지는 "밀도"식민지 7 차례. 이 기사에서는 쥐 ECM 문화에서 자란 식민지의 두 가지 유형은 모두 "반지 / 밀도"식민지라고합니다. 벨소리 / 고밀도 콜로니가 단일 세포 현탁액 내로 해리 라미닌 하이드로 겔을 함유 배양에 재 플레이 팅하는 경우 "내분비 / 선포"7 콜로니를 형성한다.
하나의 식민지 분석을 사용하여, 9 쥐의 췌장, 중 성인에서 (2-4개월 된) 7,11 또는 젊은 (1 주령) 링 / 밀도 및 내분비 / 선포 식민지의 대부분, 세 가지를 모두 표현하는 것으로 나타났습니다 혈통 마커. 이것은 원래 PCFUs 대부분 트라이 강력한 것을 시사. 쥐 ECM 함유 식민지 분석에서, 성인 쥐 PCFUs 견고하게 자기 갱신과 문화 7 11 주 동안 약 50 만 회를 확장합니다. 라미닌 하이드로 겔의 존재, 쥐 PCFUs는 내분비 및 선포 세포로 우선적으로 분화하도록 권장하고 유관 계통 7,9,11 너무 적은 반면 쥐 ECM은 우선적으로, 내분비 및 선포 계통을 통해 도관 세포의 분화를 지원합니다. 중요한 것은, 인슐린 + 글루카곤 - 모노 - 호르몬 세포 라미닌 하이드로 배양 생성 기능 성숙 시사 7,9 관내에서 자극 글루코오스에 반응의 인슐린을 분비한다. 7,9 잠재적 인 트라이 혈통 차별화와 개별 PCFUs의 자기 갱신 (11)는 콜로니 형성을 위해 잘 당 하나의 세포를 배양, 단일 셀의 미세 조작, 즉에 의해 확인된다. 함께, 이러한 결과는 자기 갱신, 트리 poten 존재한다는 증거를 제시t, 3D 문화 활동을 보여 출생 후의 쥐의 췌장 전구와 같은 세포.
이 문서에서 설명하는 쥐 PCFU 분석은 쥐의 배아 줄기 세포 (mESCs) 17에서 차별화 된 전구 세포 위해 설계된 이전의 식민지 분석에서 파생됩니다. 즉, 프로토콜은 다른 조브 간행물 (18)에 자세히 설명되어 있습니다. 배양 성분 성인 PCFUs 대한 뮤린 ECM 함유 콜로니 에세이를 수행하는데 필요한 기술은 MESC - 유래 전구 세포 (17, 18)와 동일하다. 따라서, 이러한 분석의 측면은 여기서 반복되지 않을 것이다; 대신 다음 절차는 해결 될 것입니다 : 1) 성인 췌장의 해리 성인 마우스 7, 2) 정렬 된 세포의 단일 세포 조작, 3) 단일 식민지에서 PCFUs을 풍요롭게 CD133 + Sox9 / EGFP + 도관 세포를 정렬 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색 및 콜로니 4) 분리를 사용하여 분석단일 세포 현탁액과로의 쥐 ECM 또는 라미닌 하이드로 겔 식민지 분석에 재 도금.
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Protocol
윤리 정책 : 우리는 품질 및 결과의 무결성을 보장하기 위해 연구를 수행에서 널리 윤리적 기준을 준수. 동물 실험은 희망의 도시에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행된다.
1. 성인 쥐 Pancreata에서 단일 세포 현탁액을 준비합니다
주 : 앞서 공보 7,11에서는 CD-1 또는 배경 B6 마우스가 사용되었다; 모두 배경이 유사한 결과를 얻었다. Sox9 궤적 (19, 20)에 의해 구동 강화 된 녹색 형광 단백질 (Sox9 / EGFP 지정) 형질 전환 마우스 라인은 CD-1 배경에서 만든.
- 1-2 분 동안 또는 호흡이 멈출 때까지 가스의 CO 2를 사용하여 3 ~ 5 성인 쥐를 안락사. 다음으로, 각 마우스의 자궁 전위를 수행합니다.
- 해부 및 Pancreata를 준비합니다.
참고 : 안락사 후 가능한 한 빨리 쥐를 해부하다. 이는 췌장의 자동 소화를 방지하는 것이 중요사후 변경.- 가위를 사용하여 마우스의 복부 벽의 중간 선에 세로 절개를하고 복강을 엽니 다. 비장을 찾아 조심스럽게 들어 올려 집게를 사용합니다. 비장과 위 췌장의 비장 엽 사이의 결합 조직을 잘라.
- 췌장의 십이지장과 위 엽이 연습을 반복합니다. (; PBS / BSA로 지정 완벽한 솔루션 P / S) 감기 둘 베코 개질 된 인산염 완충액 (DPBS), 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 페니실린 및 스트렙토 마이신을 함유하는 얼음에 페트리 접시에서 췌장 조직을 놓는다.
- 좋은 팁 집게를 사용하여 해부 현미경으로 췌장에서 지방 조직을 제거합니다.
주 : 이것은 다음 단계에서 해리 된 췌장 세포의 건강에 매우 중요하다.- (선택 사항) 확인하기 위해 488-509 nm의 여기를 사용하여 형광 실체 현미경 하에서 녹색 형광의 pancreata 확인EGFP 식입니다.
- 조직 배양 후드에서 티슈를 차가운 PBS / BSA 10ml를 포함하는 세 가지 100mm 배양 접시에서 세 번 순차적으로 헹군다.
- 가위를 사용하여 마우스의 복부 벽의 중간 선에 세로 절개를하고 복강을 엽니 다. 비장을 찾아 조심스럽게 들어 올려 집게를 사용합니다. 비장과 위 췌장의 비장 엽 사이의 결합 조직을 잘라.
- 조직의 작은 조각을 생성합니다.
- 가능한 한 많은 PBS / BSA를 제거하는 건조 멸균 페트리 접시에 해부 pancreata을 전송하고 얼음에 다른 건조 페트리 접시로 전송.
- 2 μL DNase의 I 주식 솔루션 (1 만 대 [MU] / ㎖) 1 ml의 PBS / BSA 당을 추가하여 DNase의 I를 포함하는 PBS / BSA를 준비합니다.
참고 :이 솔루션은 PBS / BSA / DNase의 I. 하나의 분류 실험을 커버 할, 한 번에이 솔루션의 ~ 200 mL로 지정되어 있습니다. - 2 ~ 3 분 동안 또는 조직이 미세 조각 때까지 스프링 가위를 사용하여 pancreata을 말하다. 차가운 PBS / BSA /의 DNase I의 2-3 ml의를 일시 중단 페트리 접시에 조직 조각에 추가합니다.
- 10 ml를 피펫으로 얼음에 50 ML 원뿔 튜브에 조직 조각을 전송합니다. PBS / BS와 10 ㎖의 총량을 가지고가능한 많은 조직을 회수 한 후 A / 리터의 DNase.
- 주로 단일 세포로 췌장 조각 다이제스트.
- 조직 조각 / 350-450 μL에 10 ml의 콜라게나 제 B (100 ㎎ / ㎖ 스톡)를 첨가하고, 3 ~ 4 분 동안 소용돌이 8 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 조직을 배양한다. 작성이어서 실온에서 50 ML 튜브의 벽 아래 조직 용액을 스프레이 16 ½ G 바늘로 10 ML의 주사기를 사용합니다. 이 일곱 번 반복합니다.
참고 : 셀 클러스터를 중단하지만, 세포를 죽일 수있다 생성하는 거품을 방지하기 위해 충분한 힘을 사용합니다. - 37에서 물을 욕조에 튜브를 반환 8 분 동안 C를 °마다 3-4 분 소용돌이에 의해 혼합한다. 전술 한 바와 같이, 최대 일곱 번 아래 조직 주사기 드라이 페트리 접시에 조직 샘플 용액 (10 μL)을 배치했다. 10 배 대물 렌즈와 조직 반전, 위상차에 따라 솔루션, 광학 현미경을 관찰합니다. 단일 세포와 약간의 작은 크기 다 기대엘 클러스터가 존재합니다.
- 느리게 또는 콜라게나 제의 활동을 중지하는이 시점에서 얼음에 세포를 처리합니다. 나는 P1000의 피펫을 사용하여 차가운 PBS / BSA는 / DNase의 5ml에 4 ° C에서 5 분 400 XG에 차가운 PBS / BSA / DNase의 I. 원심 분리기에게 세포를 사용하여 50 ㎖에 볼륨과에 resuspend을 조정합니다.
- 조직 조각 / 350-450 μL에 10 ml의 콜라게나 제 B (100 ㎎ / ㎖ 스톡)를 첨가하고, 3 ~ 4 분 동안 소용돌이 8 분 동안 수욕에서 37 ℃에서 조직을 배양한다. 작성이어서 실온에서 50 ML 튜브의 벽 아래 조직 용액을 스프레이 16 ½ G 바늘로 10 ML의 주사기를 사용합니다. 이 일곱 번 반복합니다.
- 단일 세포 현탁액 및 세척을 얻었다 필터링합니다.
- 70 ㎛의 나일론 메쉬 필터 컵을 통해 후 40 ㎛의 나일론 메쉬 필터 컵을 통해 세포 필터.
- 차가운 PBS / BSA /의 DNase I 5ml에 세포를 재현 탁하고, 세포를 계산.
주 2 ~ 4 개월 B6 또는 CD-1 마우스의 경우, 각 췌장은 각각 ~ 5 천만 세포를 얻을 수 있습니다. 이 번호는 서로 다른 experimentalists에 따라 다를 수 있습니다. 과도한 세포 파편이 계산에서 발견되면, 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에 50 차가운 PBS / BSA / DNase의 I와 ㎖의 원심 분리기 세포에 볼륨을 가지고. - 2 × 106의 농도로 세포 현탁액의 양을 조정차가운 PBS / BSA / DNase의 I.의 사용을 107 세포 / ml의
2. 췌장 콜로니 형성 전구 세포를 풍부하게하기 위해 셀 정렬
참고 : B6 마우스, CD133 +하지만 CD133에서 - 세포 PCFUs 7,9,11에 대한 충실. CD133 + 세포는 모든 게이팅 파라미터 11 적용된 후 전체의 13 % ~ 췌장 세포를 해리 나타낸다. CD-1 쥐에서 CD133 + Sox9-EGFP + 세포는 일반적으로 전체 췌장 세포의 ~ 4 %를 나타내고,이 세포 인구는 PCFUs 7 충실. CD133 + Sox9 / EGFP + 세포의 정렬은 여기에 설명되어 있습니다.
- 해리 췌장 세포를 얼룩.
- 얼음에 5 분간 10 μg의 / ml의 최종 농도로 항 - 마우스 CD16 / 32 단일 세포 현탁액을 배양하여 비특이적 결합을 감소시키기 위해 전체 췌장 단일 세포 현탁액을 차단.
- (50 일 × 10 6 세포의 나누어지는을 제거# 181; L)을 5-7 분마다 소용돌이, 얼음에 20 분 동안, 5 μg의 / ㎖ 최종 농도의 이소 타입 대조군 항체, 비오틴 - 컨쥬 게이트 쥐의 IgG1로 착색한다.
- 1 × 10 6 세포 (50 μL)의 분취 량을 제거하고 흠없는 컨트롤로 얼음에 보관하십시오.
- 매 5-7 분 소용돌이, 얼음에 20 분 동안, 5 μg의 / ml의 최종 농도에서, 바이오틴 - 컨쥬 게이트 화 항 마우스 CD133 차 항체와 세포의 나머지 얼룩.
- 세척 세포.
- 4 ° C에서 5 분 동안 400 XG에서 PBS / BSA / DNase의 I 1 ml의 부피와 원심 분리기를 데려하여 이소 제어 및 차 항체 염색 샘플을 씻으십시오. 이 세척 단계를 반복합니다.
- 최종 농도가 2 × 107 세포 / ㎖ 정도로, PBS / BSA /의 DNase I의 아이소 타입 컨트롤과 차 항체 염색 된 샘플을 재현 탁.
- 2 & #에서 스트렙 타비 딘과 이소 제어 및 차 항체 염색 샘플 (STV) 라벨이 지정된 알로 (APC)를 얼룩181; g / ㎖의 최종 농도. 매 5-7 분 소용돌이, 얼음에 15 분 동안 품어.
- 세포와 4 ', 6-diamidino-2-페닐 인돌 (DAPI) 염색을 세척.
- 단계 2.2에서와 같이, PBS / BSA / DNase의 I와 두 번 이소 제어 및 차 항체 염색 샘플을 씻으십시오. DAPI (0.2 μg의 / ml의 최종 농도)와 PBS / BSA / DNase의 I의 세포를 재현 탁. 이소 타입의 대조군 샘플의 최종 부피는 0.5 ml이어야한다.
주 : 정렬이 사용하는 차 항체 염색 시료의 최종 밀도가 적절한 지 확인합니다. 5 × 106 세포의 농도 / ㎖ 일상적 정렬에 사용된다. - 정렬하기 전에 20 μm의 메쉬를 통해 모든 세포를 필터 PBS / BSA / PS / DNase의 I. 0.5 ml의에 흠 세포의 볼륨을 조정하고 어둠 속에서 얼음에 세포를 유지합니다.
- 단계 2.2에서와 같이, PBS / BSA / DNase의 I와 두 번 이소 제어 및 차 항체 염색 샘플을 씻으십시오. DAPI (0.2 μg의 / ml의 최종 농도)와 PBS / BSA / DNase의 I의 세포를 재현 탁. 이소 타입의 대조군 샘플의 최종 부피는 0.5 ml이어야한다.
- 셀의 정렬.
- 정렬에 80 μm의 이상 노즐을 사용합니다.
주 : 쥐의 췌장 내분비 세포가 물리적 스트레스에 대한 경향이 있습니다. 호Wever에게는 쥐 PCFUs는 분류기 (7) 통과로 인한 스트레스에 의해 영향을받는 것으로 나타나지 않습니다. - 분류기에 셀 이벤트 분석 파라미터를 획득. 전방 및 측면 산란 영역에 대한 게이트 세포는 세포 파편 7을 제외합니다. 전방 및 측면 산란 폭에 대한 게이트 셀의 이중선을 제외합니다. 게이트 DAPI + 죽은 세포 (7)을 제외합니다. 이소 타입의 대조군 세포의 값에 기초하여 EGFP 및 CD133-APC 신호 (도 1)에 대한 파라미터를 선택 게이팅.
- 5 % 소 태아 혈청 (FCS)이 보충 된 DMEM / F12 배지 150 ml를 함유 5 ㎖ 폴리스틸렌 튜브에 정렬 된 셀들을 수집. 원심 분리기는 DMEM / F12 또는 PBS / BSA / DNase의 하나의 작은 볼륨에서 5 분 및 재현 탁 (~ 200 μL) 400 XG에 정렬 된 인구 내가 5 % FCS로 보충. 얼음에 사용할 때까지 세포를 유지합니다.
- 정렬에 80 μm의 이상 노즐을 사용합니다.
- 분류기에서 얻은 CD133 + Sox9-EGFP + 세포의 수를 계산합니다. 걸릴10 μl의 세포 샘플이 세포 밀도를 결정하는 hemacytometer로 세포를 세고.
참고 : 분류기에서 기계 카운트가 종종 신뢰할 수 있기 때문에 Hemacytometer 사용을 권장합니다.
3. 플레이트 쥐 ECM 단백질을 포함하는 식민지 분석에 정렬 셀
참고 : 다른 조브 간행물 (18)의 쥐 ECM 함유 식민지 분석으로 세포의 도금에 대한 자세한 프로토콜을 참조하십시오.
- 문화 미디어를 준비합니다.
- DMEM / F12 배지, 1 % (중량 / V) 메틸, 5 % (V / V) 뮤린 ECM 단백질 50 %를 함유하는 배지를 준비 (V / V) MESC 유래 췌장 같은 세포 조정 배지, 5 % (V / V) FCS, 10 밀리몰 / L의 니코틴 아미드 10 NG / ml의 인간 재조합 티빈 B, 0.1 nmol의 / L 엑센 딘 -4, 1 NG / ㎖ 혈관 내피 성장 인자-A. 조건화 배지를 생성하기위한 방법은 다른 18 상세한된다.
- 매체에 RSPO-1의 750 NG / ㎖ 추가경우 고밀도 콜로니 형성이 요구된다.
- 3주 대한 CO 2, 37 ° C에서 뮤린 ECM 단백질 배양 부화 5 %.
한 셀 당 음 4. 문화 정렬 된 셀
참고 : 다음 절차는 손과 입 피펫을 사용하여 단일 세포 조작에 적용됩니다. 또 다른 방법은 미세 조작기를 구입하는 것입니다. 일반적인 미세 조작기는 조이스틱 작동, 모터 플랫폼과 거꾸로 현미경을 포함한다.
- 유리 파스퇴르 피펫을 준비합니다.
- 분젠 버너를 사용하여 미세한 점 (오프닝에서 ~ 30 μm의)에 유리 파스퇴르 피펫의 팁을 그립니다. 유리 파스퇴르 피펫은 오퍼레이터로부터의 공기 흐름에 대한 장벽을 생성하기 위해 스토퍼면을 가져야한다.
- 멸균 20 분 동안 121 ° C에서의 골조 유리 파스퇴르 피펫 압력솥.
- 문화 96 웰 플레이트를 준비합니다.
- 추운 반 고형 배지 협정 준비전술 한 프로토콜 (18)에 보내고.
- 도 1 mL를 주사기를 사용하여 / 100 μL에 낮은 결합 평평한 바닥 96 웰 플레이트의 내부 웰에 분배 매체. 습도를 유지하기 위해 멸균 물을 외부 우물을 입력합니다.
- 사용할 때까지 얼음에 배양 접시를 놓습니다.
- 정렬 된 셀을 준비합니다.
- ~ 5 ML의 폴리스티렌 튜브에 10 % FCS, 1 %의 메틸 셀룰로오스를 포함하는 DMEM / F12 / PS의 2.5 ml의 최종 부피에 정렬에서 수집 한 6,000 셀을 추가합니다. 성분을 혼합하는 것이 강하게 흔든다. 5 분 동안 또는 거품이 튜브의 상단에 떠 때까지 기다립니다. 이 단계는 얼음상에서 수행 될 필요가 없다.
- 18 ½ G 바늘로 1 ML의 주사기를 사용하여 1 ㎖ / 접시에 두 개의 35mm 요리에 셀 솔루션을 분배.
- 부드럽게 손으로 접시를 흔들어 접시에 세포 솔루션을 확산. 반 고체 배지가 잘 CANN의 여백에 하나의 세포로, 35 밀리미터 접시의 가장자리에 도달하는 것을 허용하지 않습니다오티는 명확하게 반전 광학 현미경을 이용하여 관찰 될 수있다.
- 현미경 주위에 작업 영역을 준비합니다.
- 모든 세포없이 DMEM / F-12 배지 1 % 메틸 셀룰로스를 함유하는 용액 ( "무 세포"배지)를 확인하고 (접시 당 1 ml)로 두 35mm 페트리 접시로 (4.3.2에서 설명) 용액을 조제 .
- 면도하고 70 % 알코올 용액으로 역 위상차 현미경 주변 작업 영역 와이프.
- 입 조각과 피펫을 조립합니다.
- 단계 4.1에서 제조 한 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 선택합니다. 유리 파스퇴르 피펫의 상단에 1 ml의 플라스틱 피펫 팁의 넓은 끝을 연결합니다. 하나 얇은 고무 튜브의 단부와 상기 튜브의 타단에 마우스 피스에 1 ml의 플라스틱 피펫 팁의 작은 단부를 연결. 같은 그룹의 여러 셀을 따기에 대해 동일한 유리 피펫을 사용합니다.
- 의 입으로 흡입, 작은 볼륨 (~ 10 μL 50)에 의해 작성"무 세포"는 반 - 고체 용액을 유리 파스퇴르 피펫 단계 4.4.1 않았다.
주 : 유리 파스퇴르 피펫의 좁은 오프닝에서 반고체 용액 유동 저항을 만들고 세포의 오염을 뽑 방지하기위한 장벽을 제공한다.
- 단일 셀을 선택합니다.
- 현미경 무대에 정렬 된 세포를 포함하는 35mm 접시를 놓고 뚜껑을 제거합니다.
- 적절한 셀에 10 배 대물 렌즈와 초점을 사용하여 세포를 찾아 것이 포착 할 수 있습니다.
- 찾아 다음 관심의 셀에 피펫 팁의 개구부를 배치합니다. 입으로 흡입을 적용합니다.
주 : 이후 과정에서 상기 셀을 잃을 위험이 없도록 세포의 움직임은 매우 느릴 것이다. 피펫의 개구로 진입하는 셀의 움직임을 보여야한다. 흐름이 너무 빨리 이동하면 좁은 입구에 피펫로 변경합니다.
- 문화를 잘으로 단일 셀을 입금.
- 셀이 피펫에 있으면, 마우스 피스의 개구를 막아 흐름을 중지 혀를 사용한다. 반 고체 매체가 흐르는 중지되었는지 확인하기 위해 반 고체 배지에서 팁을 인출하기 전에 잠시 일시 중지합니다.
- 단계 4.2에서 제조 된 96 웰 플레이트의 우물에 피펫의 팁을 놓습니다. 부드럽게 입 조각으로 불어 천천히 세포를 밀어 넣습니다. 마크는 셀 웰이 퇴적 한 후, 웰에 두 셀 도금 방지한다.
- 단일 세포는 문화 우물에 배치되어 있는지 확인합니다.
- '더 셀'중간 단계 4.4.1에서 제조에 피펫 팁을 배치합니다. 현미경 팁의 개구를 관찰하면서, 잔류 반고체 용액을 누른다. 더 셀이 피펫의 팁을 유출하지 예상된다.
- 두 번 확인하려면 하나의 세포가 이식 된 문화 잘 위치를 찾을 수 있습니다.
- 업에 대한 문화 5 %에서 37 ° C에서 단일 세포는 CO 2삼주합니다.
5. 미세 유체 QRT-PCR 분석을위한 세미 솔리드 문화에서 개별 식민지를 선택
참고 : 도금 쥐 ECM 함유 식민지 분석에 CD133 + Sox9이 / EGFP + 세포를 분류 3 주 후, 링 또는 밀도 식민지 7 (그림 2)이 형성되어있다. 링 / 밀도 식민지가 단일 세포 현탁액으로 해리과 라미닌의 하이드로 겔 문화로 재 도금하는 경우, 내분비 / 선포 식민지 후 약 1 주일 (7) (그림 2)이 생성된다. 각 식민지의 혈통 구성을 확인하려면 마이크로 유체 QRT-PCR 분석은 혈통 마커 (7)의 발현을 감지하는 데 사용됩니다. 사전 증폭, 콜로니는의 TaqMan 프로브 혼합, 반응 완충액 및 첨자 III (21)를 포함하는 마스터 믹스를 혼합한다. 48.48 어레이 칩이어서 미세 PCR 반응 (21)에 사용된다.
- 사전 증폭 PCR을 준비48 프로브를 포함하는 혼합한다.
- 피펫 1.5 ML 튜브에 각각의 TaqMan 프로브 (20 배 주)의 1.5 μL. 150 μL에 볼륨을 조정 TE 버퍼의 78 μl를 추가합니다.
- 제조업체 (21)로부터 프로토콜에 따라 마스터 믹스를 준비합니다.
- PCR을위한 얇은 벽의 반응 관에 적합한 각 0.2 ml의에 마스터 믹스 9 μl를 놓고 최대 48 튜브에 대해이 단계를 반복합니다.
- 반 고체 문화에서 하나의 식민지를 선택합니다.
참고 : 반지 / 밀도 식민지 ~ 50에서 400 μm의 9,11에 이르기까지 직경, 내분비 / 선포 식민지보다 큰. 따라서, 하나의 반지 / 밀도 식민지는 곡선 모양으로 구부려 10 μL 피펫 팁이 장착 P10의 피펫을 사용하여 선택됩니다. 작은 내분비 / 선방 식민지 (그림 2) 따기를 들어, 4 단계를 참조하십시오.- 높은 배율 (예를 들어, 20X 대물 렌즈)에서 관심의 식민지를 찾아 배율을 줄이고, aspirat식민지를 전자. (선택 사항) 식민지의 보이는 특성을 문서화하는이 단계에서 식민지의 위상 대비 이미지를 가져 가라.
- 마스터 믹스 9 μl를 포함하는 PCR 튜브에 식민지를 전송합니다.
- 다음 식민지를 선택합니다. 총 최대 45 콜로니 컨트롤 3 점을 떠나, PCR 실행에 따라 분석 될 수있다.
- 프리 앰프와 RNA 추출 및 cDNA 합성.
- 적극적으로 열 반응을 수행하기 전에 샘플을 소용돌이.
- 제조업체의 지침 (21)에 따라 열 사이클링 반응을 수행합니다. 링 / 밀도 식민지는 내분비 / 선방 식민지는 16 ~ 20주기를 요구하고, 하나의 세포는 22 사이클을 필요로 14주기를 요구한다.
주 : 사전 증폭 된 cDNA는 마이크로 유체 PCR 분석 전에 -20 ℃에서 저장 될 수있다.
- 제조자의 지시 (21)에있어서, 미세 유체 칩을 사용하여, 후속 PCR 반응을 실행.
- 수확은 식민지를 수정합니다.
- 단계 4 또는 5.4와 같이 현미경 하에서 콜로니를 선택하고, 4 % 파라 포름 알데히드 용액에 추가. 부드러운 흔들림 4 ° C에서 O / N을 품어.
- 실온에서 10 ~ 30 분 동안 두 번 1X PBS로 식민지를 씻으십시오. 파라핀으로 밀봉 1.5 ml의 튜브를 4 ° C에서 고정 식민지를 저장합니다.
- 항체와 식민지를 얼룩.
- 차단 버퍼 200 μL (5 % 당나귀 및 / 또는 염소 혈청, 1X PBS에서 0.1 % 트리톤 X-100)를 포함하는 투명한 바닥 96 웰 블랙 플레이트 잘 하나에 전송 식민지. 부드러운 흔들림 4 ° C에서 O / N을 품어.
- 버퍼를 차단하여 (햄스터 500 항 점액 1 항체 예 1) 미리 결정된 농도 차 항체 희석. 잘 차 항체의 200 μL와 깨끗한에 식민지를 전송, 부드러운 흔들림으로 4 ° C에서 O / N을 품어. WPBS, 0.1 % 트윈 각 세척 실온에서 10 분 동안 1X PBS 200 μL / 0.1 % 트윈 20으로 새 웰에 20 전송 콜로니를 함유하는 콜로니 3 회 화산재.
- 차단 버퍼를 사용하여 : 미리 정해진 농도 (염소 항 - 아르메니아어 햄스터 항체 2,000 예를 들면, 1)에 차 항체를 희석. 어둠 속에서 해결책을 유지합니다. 이차 항체의 200 μl를 포함하는 우물을 청소하고, 실온에서 2 시간 동안 배양 식민지를 전송합니다. PBS로 식민지를 3 회 반복한다 / 0.1 % 트윈 20, 단계 6.2.2에서와 같이.
- DAPI와 카운터 얼룩 식민지와 공 초점 현미경으로 시각화.
- PBS는 300 nm의 DAPI를 포함하여 우물에 식민지를 전송하고 실온에서 5 분 동안 품어.
- 시각화를위한 35mm의 유리 바닥 페트리 접시에 DAPI 염색 식민지를 전송합니다. 증발을 방지하기 위해 식민지의 상단에 커버 슬립을 놓습니다.
- 이미지를 캡처하는 공 초점 현미경을 사용합니다. DAPI의 stainin을 시각화하는 방법g는 730-950 nm 인 이광자 여기 파장을 사용한다. 519 및 561 nm의 방출 파장과 형광 색소를 여기 458 nm의 파장을 갖는 아르곤 레이저를 사용한다. 665 나노 미터의 방출 파장의 형광 색소를 여기 633 nm의 파장을 갖는 헬륨 - 네온 레이저를 사용한다.
7. 해리와 재 판 보조 식민지 분석 실험에 기본 벨소리 / 밀도 식민지
참고 : 모든 절차는 무균 조건 하에서 수행되어야한다. 같은 차가운 PBS / BSA 얼음 또는 세척 세포에 세포를 넣어 가능한 한 많은이 절차의 세포에 차가운 충격을 피하십시오. 이러한 관행은 재 도금 세포의 생존 능력을 감소시킨다.
- 솔루션을 준비합니다.
- 사전 따뜻한 세척 버퍼 (DMEM / F12, P / S 0.1 %의 BSA) 37 ° C의 물을 욕조한다.
- 사전 따뜻한 96 웰 플레이트 (평평한 바닥 낮은 바인딩)를 37 ° C 배양기에서. 두 번째 한 접시의 잘 100 ㎕를 0.25 % 트립신 EDTA 용액 100 ㎕를 100 % FCS 추가잘.
- 식민지를 수집합니다.
- 단계 5.4에 설명 된대로 선택하고 10 μl를 피펫 팁을 사용하여 차 문화에서 20 개 이상의 링 / 밀도 식민지 총 풀.
- 5 분 동안 400 XG에 1.5 ML 튜브와 스핀에 따뜻한 (적어도 RT) 세척 버퍼 (~ 1,000 μL)에 식민지를 놓습니다. 뜨는을 제거합니다.
- 트립신을 사용하여 단일 세포 현탁액에 식민지를 떼어 놓다.
- (7.1에서 준비) 따뜻한 트립신 용액이 들어있는 우물에, 식민지를 포함하는 나머지 볼륨 (20 μL 이하)를 전송합니다.
- 1.5 분 동안 37 ° C를 인큐베이터 (안 수조)에서 접시를 품어. 플레이트를 제거하고 식민지를 몇 번 피펫. 또 다른 1.5 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 접시와 피펫 최대를 제거하고 몇 번 더 아래로 식민지를 해체 할 수 있습니다. 식민지가 단일 세포 현탁액에 주로 분산되었는지 여부를 확인하기 위해 현미경으로 확인합니다.식민지의 오버 소화를하지 마십시오.
- FCS를 첨가함으로써 트립신의 반응을 정지.
- 세포를 포함하는 우물에 따뜻한 FCS 100 μl를 전송합니다. 피펫 위로 몇 번 아래로. 1000 μL 따뜻하게 세척 완충액을 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 세포를 옮긴다. RT에서 5 분 400 XG에 원심 분리기.
- 따뜻한 버퍼로 두 번 씻으십시오.
- 세포 버퍼 또는 배지 200 ~에서 μl를 다시 일시 중지합니다.
- hemacytometer를 이용하여 세포의 수를 계산. RT에서 세포 현탁액을 유지.
- 플레이트를 다시 뮤린 ECM 단백질 (5 % v / v)로 또는 라미닌 하이드로 겔 (100 μg의 / ㎖)를 포함하는 이차 콜로니 분석으로 세포를 분해하고, 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포를 배양한다.
참고 : 쥐 ECM 단백질로 세포를 다시 도금의 경우 2 ~ 3 주 동안 잘 문화 당 2,500-5,000 세포를 사용합니다. 라미닌 하이드로 겔 문화로 재 pating의 경우 7-12 일 동안 잘 문화 당 10,000-25,000 세포를 사용합니다.
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Representative Results
성인 췌장 전구 세포는 형광 활성화 세포 분류 (도 1)에 의해 농축 될 수있다. ~ Sox9 20 75킬로바이트 상류 ~ 150킬로바이트 하류 서열을 여기서 사용 Sox9 / EGFP 유전자 변형 마우스 선 먼저 GENSAT 뇌 아틀라스 프로젝트 (19)의 결과로 생성하고, EGFP 리포터를 함유하는 세균 인공 염색체가 제어 . 이러한 쥐, EGFP 효율적 특히 22 췌장 관 라벨. 췌장 조달 및 단일 세포 현탁액 내로 해리 및 STV - APC와 접합 이차 항체로 염색 하였다 비오틴과 접합 항 CD133 항체로 염색 하였다. 생성 된 세포는 적절한 게이팅 파라미터들 (도 1)와 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 다른 게이팅 매개 변수를 사용하여 얻은 세포 분류와의 메틸 셀룰로오스 함유 식민지 분석에 도금 될 수있다콜로니 형성. 이전 연구에서, 콜로니 형성 능력 만 정렬 CD133 + Sox9 / EGFP + 7 도관 세포에서 발견되는 것으로 관찰되었다.
거꾸로, 위상차, 광학 현미경 (도 2)를 이용하여 관찰로 메틸 - 함유 콜로니 검정에서 형성된 콜로니를, 그 모폴로지에 따라 분류 하였다. 그 후, 각각의 식민지가 유전자 발현을위한 미세 유체 QRT-PCR 분석 (그림 3) 나에 의해 손으로 수확하고 분석했다 단백질 발현 (그림 4)에 대한 면역 염색 전체 마운트합니다. 발표 된 연구 7,9,11을에서, 많은 개별 식민지 이러한 식민지의 시작 PCFUs의 대부분이 있음을 나타내는 덕트 (점액-1), 선포 (아밀라아제) 및 내분비 (인슐린) 세포 계보 마커를 표명 한 것으로 나타났습니다 트라이 강력한. 각 식민지에있는 3 개의 세포 계통의 비율 그러나, 유형 및 메틸 - 함유 콜로니 검정의 7,9 존재 ECM 단백질의 농도에 의해 영향을 받았다. 쥐 ECM 단백질은 우선적으로 내분비 및 선포 세포 계통 7,9,11의 분화를 지원 라미닌 하이드로 겔 반면 PCFUs의 자기 갱신과 유관 세포 분화를 자극.
그림 1. 흐름이 도관 세포 마커, Sox9 궤적 기반 EGFP 기자가 사용되었다 포함 된 CD133 및 Sox9. Sox9 / EGFP 유전자 변형 마우스에 따라 염색 패턴을 보여주는 성인 쥐에서 해리 췌장 세포의 세포 계측법 분석. 췌장 CD133 + Sox9 / EGFP + 셀의 대표 정렬 게이트 (빨간색 상자)가 표시됩니다. CD133 + Sox9 / EGFP + 세포 PCFUs 7 충실.레 / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
다른 형태학 그림 2. 식민지가 메틸 셀룰로오스 함유 식민지 분석에서 생성되었다. 반지의 대표 현미경을, 가시 광선에 의해 조명 위상차 현미경에서 밀도 및 내분비 / 선포 식민지가 표시됩니다. 갓 분류 PCFUs가 삼주 7 쥐 ECM 단백질 배양을 포함하는 배양 배지에 도금 할 때 반지와 밀도 식민지가 생성됩니다. 내분비 / 선포 콜로니 ~ 7 일주하는 라미닌 하이드로 겔을 함유하는 배양 배지로 해리 링 또는 밀집 콜로니 셀 재 도금 배양 한 후에 형성된다. 링과 밀도 식민지에 대한 스케일 바는 100 μm의 =. 엔도 / 선포 식민지 = 25 μ를위한 가늠자 바;. m 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도관, 선포 및 내분비 세포 마커를 발현 쥐 ECM 단백질에서 재배 그림 3. 개별 식민지. 각각의 링 식민지의 미세 유체 QRT-PCR 분석의 대표 결과. 각 열은 하나의 식민지를 나타냅니다. 유전자의 발현 수준은 높은 발현 및 낮은 발현을 나타내는 차가운 색상을 나타내는 따뜻한 색상 여기 열 맵으로 표현된다. 단일 콜로니 많은 덕트 내분비 또는 선포 세포 계통을 나타내는 마커의 각 패널의 유전자 중 적어도 하나를 표현한다. 이러한 데이터는 개별 식민지의 많은 트라이 혈통 마커를 표현하고, 제안을 입증의 대부분이원래 PCFUs는 트라이 강력한입니다. 이 그림은 이전에 게시 된 그림 7에서 수정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 두 개의 링 식민지는 유관 마커 점액 1 (녹색)의 단백질 발현을 보여주는의 점액 1. 대표 결과 링 식민지의 면역 염색을 전체 - 마운트 유관 단백질 마커를 표명했다. 핵은 반대 염색 DAPI (파란색)에 있습니다. 이 반지 식민지에서 많은 세포가 점액 1 단백질을 발현. 이 쥐 ECM 단백질에서 재배 링 식민지 mucin1 및 기타 유관 세포 마커의 높은 수준 (그림 3의 따뜻한 색) 표현하는 것을 보여주는 미세 유체 QRT-PCR 결과와 일치한다. 스케일 바는 대표50 μm의이야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 자기 갱신과 문화의 개별 전구 세포의 멀티 혈통 분화 측정 5. 췌장 식민지 분석. 대표적인 워크 플로가 제공됩니다. 배양액은 반고체되도록 우리 췌장 콜로니 검정은 점성 물질 메틸 셀룰로스를 포함한다. 반고체 배지 이동을 제한하고 (적색으로 표시된) 하나의 선조 세포의 응집을 방지한다. 그러나 매체는 단일 전구 세포 자체 갱신 및 / 또는 차별화하고 (여러 빨간색 동그라미로 표시) 세포의 식민지로 성장할 수 있도록 충분히 부드러운. 대조적으로, 하나의 셀은 그 <콜로니 형성 능력이없는EM> 즉, (파란색으로 표시)이 아닌 전구 세포는 단일 세포로 남아 또는 문화에서 시간이 지남에 죽는다. 메틸는 낮은 농도에서 ECM 단백질과 같은 5 % 쥐 ECM 단백질 100 μg의 / ㎖ 라미닌 하이드로 겔의 포함 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
췌장 식민지 분석 및 단일 콜로니는 여기에 설명 분석 지난 수십 년 23 조혈 전구 세포의 생물학을 해독에서 중요한 역할을 한 메틸 셀룰로오스 함유 조혈 식민지 분석에 의해 영감을했다. 이 분석에서 (그림 5), 췌장 세포로 도금 해리 메틸 셀룰로오스 함유 링, 밀도 또는 내분비 / 선포 식민지 (7)의 형성을 지원하는 적절한 성장 인자와 ECM 단백질과 반 고형 미디어를. 세포 콜로니에 상승을 부여 할 수있는 하나의 전구 세포는 PCFU 불린다. 미세 유체 QRT-PCR 및 전체 마운트 면역 염색을 사용하여 개별 식민지를 특징으로, 원래 PCFUs의 계보 잠재력을 추론 할 수있다. 그것은 성인 쥐 PCFUs의 대부분은 트라이 강력한, 체외 7,9에 도관, 선포하고, 내분비 계통 세포에 상승을 제공 할 수 있다는 사실을 발견했다. MUR 동안오프라인의 ECM 단백질 덕트 계통으로 트라이 강력한 PCFU의 분화를 촉진, 라미닌 하이드로 겔은 강력한 내분비 및 선포 세포 계보 차별화 7,9를 할 수 있습니다. 단일 세포 현탁액과로 분해 할 수있는 PCFUs, 반지 또는 기본 쥐 ECM 식민지 분석에서 재배 밀도 식민지의 체외 자기 갱신 능력 평가하기 위해 보조 쥐 ECM 식민지 분석 (7)에 재 도금. 그것은 PCFUs이 11주 7 이상 ~ 쥐 ECM 단백질의 50 만 배 확대 한 것으로 나타났습니다. 중요한 단계에 걸쳐 소화 콜라게나 제에 의한 췌장 세포의 피, 다시 도금하기 전에 해리 링 / 밀도 식민지 세포에 감기 충격을 최소화 해부 pancreata에서 지방 조직의 제거를 포함한다. 단일 세포의 미세 조작을 마스터하는 것은 약간의 시간이 걸릴 수 있습니다; 인내와 연습이 필요합니다.
2 차원 배양 (24), (S)을 포함하여, 다른 췌장 전구 세포 분석법에 비해다음과 같이 uspension "pancreasphere"(25)와 organoid 분석 12-15, 여기에 설명 된 메틸 셀룰로오스 함유 식민지 분석의 주요 장점은. 먼저, 농도를 광범위에 첨가하고 ECM 단백질의 조정이 용이하게 달성 될 수있다. 메틸 셀룰로스가 반고체 배지 차원 특성을 부여하는 물질이기 때문이다. 반대로 organoid 배양 방법은 33 %의 v / V 이상에서 존재하는 뮤린 ECM 단백질의 응고에 의존한다. 적은 1 % 정도 뮤린 ECM 단백질은 전구 세포 분석에서 ECM 단백질 농도의 중요성을 강조하는 내분비 세포 (9)의 분화를 억제 할 수 있음을 유의한다. 둘째, 식민지 균일하게 잘 문화에 분산되어 정확하게 계산 될 수있다. 셋째, 단일 콜로니를 쉽게 후속 분석을 위해 뽑아서 할 수 있습니다. 넷째, 메틸 - 함유 반고체 배지를 쉽게 유지할 수없고 매체변화는 문화의 과정이 필요합니다. 마지막으로, 세포의 다수 (24 웰 플레이트 당 25,000 세포까지)이 도금 될 수 있으며, 이들이 도금 셀들 중 작은 모집단하더라도 전구 세포의 활동을 검출하기위한들을 효율적 이러한 콜로니 검정에서 검사.
여기에 설명 된 췌장 전구 세포가 기능적 분석법에 기초하지만, 마커를 기반으로하지 않는, 췌장 전구 세포로 분석한다. 이는 췌장 전구 세포가 발현 어떤 마커 몰라도 연구 될 수 있다는 것을 의미한다. 성인 췌장 전구 세포가 표현할 수있는 특정 어떤 마커에 대한 약간의 지식이 있기 때문에 중요하다. 또한, 배아 췌장 전구 세포에 대한 마커 성인 전구 세포 연구에 적합하지 않을 수 있습니다. 기능 분석을 사용하여, 하나는 제 등 CD133 같이 PCFU 활성을 갖는 하위 집단을 결정함으로써 특정 전구 세포 마커를 식별하기 시작할 수있다 + </ SUP> Sox9 / EGFP + 세포가 여기에 나와 있습니다. 이것은, 차등 PCFU 함유 인구에 의해 발현되는 유전자의 RNA-서열을 사용 하였다 식별 할 수있다. 후보 표지자는 시험 및 시험 관내에서와 같이 상기 전구 세포의 분화 능력을 추적하는 추적 생체 혈통 분석 기법에 의해 확인 될 수있다.
체외 메틸 셀룰로오스 함유 식민지 분석의 한계는 배입니다. 분석법 문화 차원 공간에서의 췌장 전구 세포로 ECM 단백질 성장 인자를 제공함으로써 췌장의 생체 내 미세 환경을 모방하지만 첫째, 조건은 동일하지 않다. 또한, 생체 내에서 상피 세포의 구조는 중요한 결과를 가져올 수있다 단일 세포로 분리하여 파쇄된다. 따라서, 생체 내에서 사용하는 후속 연구에서 선조 세포를 확인하는 것이 중요 할 것이다 18 미정 시약을 함유한다. 이러한 정의 요소 간접적 전구 세포의 특정 성장 인자의 기능에 영향을 미칠 수있는 많은 작업은 배양 조건을 완전하게 정의 세트를 생성하는데 필요하다. 마지막으로, 혈통 추적 실험은 성인 마우스 생체 내에서 26, 27 또는 알파 세포 간 베타 세포를 선포 - 투 - 베타 세포 28 변환을 보여 주었다. 여기에 설명 된 메틸 셀룰로오스 배양 조건은 덕트 - 투 - 베타 세포의 변환만을위한 특정 할 수있다. 비 덕트 세포 배양 베타 세포로 변환하기위한 다른 미지의 배양 조건이 필요할 수있다.
문제 해결이 필요할 수 있습니다 몇 가지 경우가 있습니다. 해리 세포가 함께 뭉쳐 경우 예를 들어, 솔루션의 DNase I의 고용량을 사용합니다. DNase의 I는 DNA 미주리에 의한 해리 췌장 세포의 엉킴을 방지하는 것이 중요하다죽은 세포에 의해 발표 lecules (단계 1.3.2 참조).
다진 조직을 10 ml를 피펫에 붙어있는 경우 또는, 작은 조각으로 조직을 말하다. 10 ml를 피펫의 개방 폭만큼 조직 조각 콜라게나 소화 한 후 통과 할 수 있어야한다. 조각은 10 ml를 피펫의 끝에 붙어 얻을 경우,이 봄 가위로 조직의 닦지 (단계 1.3.4 참조) 충분하지 않은 것을 나타냅니다.
발생할 수있는 또 다른 문제는 해리 췌장 세포 (즉, 정렬되지 않은 세포)에서 쥐 ECM 단백질에는 식민지의 성장입니다. 이 경우이 overdigestion 세포 사망을 초래할 수 있으므로, 췌장 해리 단계에서 단일 세포로 모든 클러스터를 중단하지 마십시오. 큰 조각이 있으면 몇 (4) 및 주사기 분 동안 37 ℃로 7 배 이하 튜브를 반환한다. 현미경으로 세포를 다시 확인. 콜라게나 제 B 처리의 최대 시간은 30 분이다. 디사용 된 콜라게나 제에 epending, 소화를위한 최적의 시간 차이 (단계 1.4.2 참조) 할 수 있습니다.
또한, 문화 우물에서 쥐의 세포 외 기질 단백질의 덩어리는 배양 후 관찰 할 수있다. 이를 방지하기 위해 쥐의 세포 외 기질 단백질과 접촉 문화의 모든 구성 요소가 37 ° C (3 단계 참조) 이전에 배양에 조기 응고를 방지하기 위해 얼음에 차가운 유지되어 있는지 확인합니다.
또한, 유리 파스퇴르 피펫으로 한 번에 하나의 셀을 따기 어렵다. 이에 대한 해결책은 세포가 다른 세포로부터 충분한 거리를 가지고 있는지 확인 반고체 배지에서 도금 갓 분류 세포의 농도를 감소시키는 것이다. 이는 동시에 여러 세포 발생을 방지한다. 또한,이 비행기 근처 손으로 하나의 셀을 선택하기 쉽다는 마이크로없는 한, 반고체 배지 하단 현미경의 초점을 배치하는 것이 좋다조작 (단계 4.6.2 참조).
또한, 단일 세포 조작이 성공 불분명 할 수있다. 용액을 실제 실험 전에 단일 세포 미세 조작을 실시 할 수있다. 세포를 유리 파스퇴르 피펫에 포착되면, 세포없이 1 % 메틸 셀룰로오스 용액 1 ㎖를 함유하는 35mm 페트리 접시 ( '아니오 셀 중형 단계 4.4.1에서 제조)에 세포를 옮긴다. 시각화 및 현미경 초점에서 파스퇴르 피펫의 팁의 개구부를 배치하고 천천히 세포를 밀어 넣습니다. 하나의 세포가 천천히 피펫의 팁 주위에 표시 한 후 '더 셀'중간 (단계 4.8.2 참조)로 이동할 것으로 예상된다.
마지막으로, 더 콜로니 성장은 해리 기본 벨소리 / 밀도 식민지에서 차 문화에서 발생하지 않을 수 있습니다. 문제 해결을 위해 해리 기본 식민지에서 세포가 차 문화에 도금하기 전에 RT에 보관되어 있는지 확인합니다. 쥐 ECM 단백질에 배양를 들어, 추가이에 의해 주 콜로니로부터 얻어진 해리 된 세포를 죽일 수있다 저온에 세포의 노출을 최소화 (18)를 혼합하기 전에 차가운 배양 배지를 함유하는 튜브 마지막 셀. 그러나, 라미닌 하이드로으로 셀 재 도금은 37 ° C에서 항온 처리한다 (단계 7 참조) 전에 얼음상에서 수행 될 필요가 없다.
요약하면, 두 메틸 - 함유 군집 분석은 물론 어린 마우스 (10)의 간에서 7,11 젊은 성인 및 생후 마우스 9,10의 pancreata에서 선조 유사 세포를 특성화하는 데 사용되어왔다. 미래의 애플리케이션은 사체 췌장 기관으로부터 인간 콜로니 형성 전구 세포의 동정 및 특성화에 관한 것이다.
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Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
우리는 정렬에 도움을 희망의 도시에서 분석 세포 계측법 코어에서 루시 브라운과 알렉산더 Spalla 감사합니다. 이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소 DAT 지지대에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 R01DK081587 및 R01DK099734 HTK, 그리고 ADR에 U01DK089533 및 부여에 의해 부분적으로 지원 HTK 푸에르 테 재단과 엘라 피츠 제럴드 재단의 조셉 J. 제이콥스 DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소, 이들로부터 감사 인정도 있습니다.
자금 조달 :이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원됩니다 HTK에 R01DK081587 및 R01DK099734을 부여하고, ADR에 U01DK089533, 그리고에 재생 의학 부여 RB5-07398에 대한 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 부여 NSF-DMR-1206121 캘리포니아 연구소 DAT는 조셉 J. 제이콥스에서 지원DAT에 캘리포니아 공과 대학에서 의학 분자 공학 연구소와 옥스 나드 재단과 HTK에 엘라 피츠 제럴드 재단들도 기꺼이 인정한다. 이 책에서보고 된 연구는 보너스 번호 P30CA33572에서 국립 보건원의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 지원되는 분석 세포 계측법 코어 및 광학 현미경 디지털 이미징 코어에서 수행 한 작업을 포함했다.
연구 스폰서 : 스폰서는 데이터의 연구 설계, 수집, 분석 또는 해석에 참여하지 않았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
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