Summary
In vitro kolonianalyser för att upptäcka självförnyelse och differentiering av stamceller som isolerats från vuxna murina bukspottkörteln utformas. I dessa analyser, pankreas stamceller ger upphov till cellkolonier i tre-dimensionell rymd i metylcellulosa innehållande halvfast medium. Protokoll för hantering av enskilda celler och karakterisering av enskilda kolonier beskrivs.
Abstract
Stem och progenitorceller från vuxna bukspottkörteln kan vara en potentiell källa av terapeutiska beta-liknande celler för behandling av patienter med typ 1-diabetes. Emellertid är det fortfarande okänt om stam- och stamfaderceller föreligger i den vuxna bukspottkörteln. Forskningsstrategier som använder cre-lox härstamning-spårning i vuxna möss har gett resultat som antingen stöd eller vederlägga idén att betacellerna kan genereras från kanalerna, den förmodade platsen där vuxna bukspottkörteln stamceller kan uppehålla sig. Dessa in vivo cre-lox linje-spårning metoder, dock inte kan svara på frågor om självförnyelse och flera härstamning differentiering-två kriterier som krävs för att definiera en stamcell. Till att börja ta itu med denna tekniska klyftan, utarbetade vi tre-dimensionella kolonianalyser för bukspottkörteln stamceller. Strax efter vår första publikation, andra laboratorier oberoende utvecklat en liknande, men inte identiska, metod som kallas organoid analysen. Jämfört med organoid analysen använder vår metodmetylcellulosa, som bildar viskösa lösningar som tillåter införande av extracellulära matrixproteiner vid låga koncentrationer. Metylcellulosa innehållande analyser tillåter lättare att upptäcka och analyser av progenitorceller vid encelliga nivå, som är kritisk när stamceller utgör en liten subpopulation, vilket är fallet för många vuxna organ stamceller. Tillsammans resultat från flera laboratorier visar i självförnyelse och flera härstamning vitro differentiering av pankreas stamceller-liknande celler från möss. De nuvarande protokoll beskriver två metylcellulosa-baserade kolonianalyser för att karakterisera mus pankreatiska progenitorceller; en innehåller ett kommersiellt preparat av murina extracellulära matrisproteiner och den andra en artificiell extracellulärt matrisprotein känt som ett laminin hydrogel. De tekniker som visas här är ett) dissociation i bukspottkörteln och sortering av CD133 + Sox9 / EGFP + duktala celler från vuxna möss, 2) enskild cell manipulation av sorted celler, 3) enda koloni analyser med hjälp av mikroflödes QRT-PCR och hel-mount immunofärgning, och 4) dissociation av primära kolonier i encelliga suspensioner och åter-plating i sekundära kolonianalyser för att bedöma självförnyelse eller differentiering.
Introduction
Bukspottkörteln består av tre stora cellinjer; körtelceller utsöndrar matsmältningsenzymer, utsöndrar kanaler mucin att parera patogener och transportera matsmältningsenzymer till tarmen, och endokrina celler utsöndrar hormoner, inklusive insulin och glukagon, som upprätthåller glukoshomeostas. Under fosterutvecklingen i bukspottkörteln, de tidiga duktala celler är källan till tri-potent progenitorceller som kan ge upphov till de tre linjerna i pankreata av vuxna djur 1,2. Eftersom vuxna stam- och stamfaderceller, såsom benmärgsstamceller, är redan framgångsrikt använts för att behandla olika sjukdomar 3, det finns stort intresse i att finna de stam- och stamfaderceller i den vuxna bukspottkörteln. Om isolering och manipulering av vuxna pankreatiska stam- och stamfaderceller vore möjligt skulle dessa celler kunna användas för att behandla sjukdomar såsom typ 1-diabetes, i vilken de insulinutsöndrande cellerna förstörs av autoimmunitet.
in vivo cre-lox härstamning-tracing tekniker, inada och medarbetare visade att vuxna murina duktala celler märkta med en markör, karbanhydras II, skulle kunna ge upphov till alla tre pankreas härstamningar 4. Men med hjälp av andra duktala markörer, såsom HNF1b 5 och Sox9 2 drogs slutsatsen att duktala celler är inte den viktigaste källan till betaceller hos vuxna möss.
För flera år sedan föreslog vi att orsaken till den ovannämnda diskussionen kan bero på brist på området 6,7 av lämpliga analytiska verktyg som kan användas för att mäta självförnyelse och flera härstamning differentiering-två kriterier som krävs för att definiera en stamcell. In vivo cre-lox härstamning-spårning teknik nämndaovan kan ge bevis för stamfader-avkomman förhållande på populationsnivå. Emellertid är detta härstamning spåra teknik begränsad i sin makt för att urskilja huruvida enskilda stamceller kan själv förnya och differentiera i flera linjer. Encelliga analys är viktigt eftersom om flera mono-potenta stamceller, var och en med en annan härstamning potential, analyserades tillsammans, kan de kollektivt verkar ha flera härstamning differentiering förmågor. Dessutom stamceller är oftast en mindre population av en vuxen organ. Verksamheten i en mindre cellpopulation kan maskeras av huvudpopulationen. Därför betyder ett negativt resultat från en populationsstudie anger inte nödvändigtvis frånvaro av stamceller. Slutligen innehåller cre-lox härstamning spårning för närvarande inte tillåta mätning av självförnyelse.
Till att börja ta itu med den tekniska klyftan inom bukspottskörteln stamceller biologi, koloni 7-11 eller organoid 12-15 metoder och utrustning tabell), och den andra innehåller laminin hydrogel, en definierad artificiell ECM protein 7-11. Progenitorceller blandas i halvfast medium innehållande metylcellulosa. Metylcellulosa är en biologiskt inert och visköst material framställd från träfibrer och har rutinmässigt använts i hematopoietiska kolonianalyser 16. Metylcellulosa-innehållande halvfast medium begränsar förflyttningen av enkel progenitorceller så att de inte kan re-aggregat. Ännu, är mediet tillräckligt mjuk för att tillåta en stamfadercell att växa och differentiera till en koloni av celler i 3D-rymden. Efter tradition av hematologer, en pankreas stamceller som kunde ge upphov till en koloni av celler var named en pankreatisk kolonibildande enhet (PCFU). PCFUs, när den odlas i den murina ECM-innehållande kolonianalys, ger upphov till cystisk kolonier som benämns "ring" kolonier 7. Vid tillsats av en Wnt-agonist, R-spondin1, i den murina ECM-innehållande odlings vissa ring kolonier förvandlas till "Tät" kolonier 7. I den här artikeln, är dessa två typer av kolonier odlas i murin ECM kultur kollektivt kallade "Ring / Tät" kolonier. När Ring / Täta kolonier dissocierade till en enda cell fjädring och åter pläterad i kulturer som innehåller laminin hydrogel, "Endocrine / Acinar" kolonier bildas 7.
Använda enda koloni analyser, visade det sig att majoriteten av Ring / Täta och endokrina / Acinar kolonier, antingen från vuxna (2-4 månader gamla) 7,11 eller unga (1 vecka gamla) 9 murina bukspottkörteln, uttrycker alla tre härstamningsmarkörer. Detta tyder på att de flesta av de PCFUs ursprung är tri-potenta. I murina ECM-innehållande kolonianalys, vuxen mus PCFUs kraftigt själv förnya och expandera cirka 500.000 gånger under 11 veckor i kultur 7. Murin ECM stöder preferentiellt differentieringen av duktala celler över endokrina och acinära härstamningar, medan i närvaro av laminin hydrogel, är murina PCFUs uppmuntras att differentiera preferentiellt in i endokrina och acinarceller och i mindre utsträckning den duktal härstamning 7,9,11. Viktigt är Insulin + Glukagon - mono-hormonella celler genereras i laminin hydrogel kultur och utsöndrar insulin som svar på glukosstimulering in vitro 7,9, vilket tyder på funktionell mognad. Tri-härstamning differentiering potential 7,9 och självförnyelse 11 enskilda PCFUs bekräftas av encelliga mikromanipulation, det vill säga odling av en cell per brunn för kolonibildning. Tillsammans ger dessa resultat visar att det är självförnyande, tri-potent, faderliknande celler i postnatal mus bukspottkörteln som visar aktiviteter i 3D kultur.
De murina PCFU analyser som beskrivs i denna artikel härrör från en tidigare koloni analys utformad för progenitorceller differentierade från murina embryonala stamceller (mESCs) 17. Detta protokoll dokumenteras i detalj i en annan JUPITER publikation 18. Odlings komponenter och tekniker som krävs för att utföra den murina ECM-innehållande kolonianalys för vuxna PCFUs är desamma som för Mesc-härledda stamceller 17,18. Därför kommer dessa aspekter av analysen inte upprepas här; i stället följande procedurer kommer att tas upp: 1) dissociation av den vuxna bukspottkörteln och sortering CD133 + Sox9 / EGFP + duktala celler, som berikar PCFUs från vuxna möss 7, 2) encelliga manipulation av de sorterade cellerna, 3) enda koloni analyser med hjälp av mikroflödes QRT-PCR och hel-mount immunofärgning, och 4) dissociation av Colonies in encelliga fjädring och åter plätering i murin ECM eller laminin hydrogel kolonianalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiska riktlinjer: Vi följer de allmänt accepterade etiska normer i att bedriva forskning för att säkerställa kvaliteten och integriteten av resultaten. Djurförsök genomförs enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid City of Hope.
1. Förbered encelliga suspension från Adult Murin bukspottkörtlar
OBS: I tidigare publikationer 7,11, var CD-1 eller B6 bakgrunds möss används; båda bakgrunder gav liknande resultat. En transgen mus linje (betecknad Sox9 / EGFP) med förbättrade grönt fluorescerande protein drivet av Sox9 loci 19,20, skapades i CD-1 bakgrund.
- Avliva tre till fem vuxna möss med gas CO2 under 1-2 minuter eller tills andningen upphör. Därefter utföra halsdislokation på varje mus.
- Dissekera och Förbered bukspottkörtlar.
OBS: Dissekera mössen så snart som möjligt efter eutanasi. Detta är viktigt för att undvika autodigerering av bukspottkörteln på grundförändringar efter slakt.- Göra ett vertikalt snitt på mittlinjen av bukväggen av musen med sax och öppna bukhålan. Hitta mjälten och använder pincett för att försiktigt lyfta den. Skära bindväv mellan mjälten och mjälten loben av pankreas med sax.
- Upprepa denna praxis för tolvfingertarmen och magsår lober i bukspottkörteln. Placera de pankreatiska vävnader i en petriskål på is innehållande kall Dulbeccos modifierade fosfatbuffertlösning (DPBS), 0,1% bovint serumalbumin (BSA), och penicillin och streptomycin (P / S; komplett lösning betecknad som PBS / BSA).
- Avlägsna fettvävnader från bukspottkörteln under ett dissektionsmikroskop med användning av fin-spets pincett.
OBS: Detta är avgörande för hälsan hos de dissocierade pankreasceller i följande steg.- (Tillval) Kontrollera pancreata för grön fluorescens under fluorescensstereo hjälp av 488-509 nm excitation att säkerställaEGFP uttryck.
- I en vävnadskultur huva, skölj vävnaden tre gånger i följd i tre 100 mm petriskålar innehållande 10 ml kall PBS / BSA.
- Göra ett vertikalt snitt på mittlinjen av bukväggen av musen med sax och öppna bukhålan. Hitta mjälten och använder pincett för att försiktigt lyfta den. Skära bindväv mellan mjälten och mjälten loben av pankreas med sax.
- Generera små bitar av vävnader.
- Överför dissekerade pancreata till en torr steril petriskål för att ta bort så mycket PBS / BSA som möjligt, och överföra dem till en annan torr petriskål på is.
- Förbered PBS / BSA innehållande DNas I genom att tillsätta 2 pl DNas I stamlösning (1 miljon enheter [MU] / ml) per 1 ml PBS / BSA.
OBS: Denna lösning betecknas PBS / BSA / DNas I. Gör ~ 200 ml av denna lösning på en gång, som kommer att omfatta ett sorteringsexperiment. - Finhacka pancreata med Spring sax för 2-3 minuter eller tills vävnaden är i fina bitar. Tillsätt 2-3 ml kall PBS / BSA / DNas I till vävnadsbitar i petriskålen att avbryta dem.
- Överför vävnadsbitar till en 50 ml koniskt rör på is med en 10 ml pipett. Bringa den totala volymen till 10 ml med PBS / BSA / DNas l efter att återhämta så mycket vävnad som möjligt.
- Smälta bukspottskörteln Pieces in Mestadels enskilda celler.
- Lägg kollagenas B (100 mg / ml lager) vid 350-450 ^ il / 10 ml till vävnaden bitar och inkubera vävnaden vid 37 ° C i ett vattenbad under 8 min, virvlande varje 3-4 min. Använd en 10 ml spruta med en 16 ½ G nål för att upprätta och därefter spruta vävnads lösning ner väggen i 50 ml rör vid RT. Upprepa detta sju gånger.
NOTERA: Använd tillräckligt med kraft för att bryta upp cellkluster men undvika generebubblor som kan döda cellerna. - Återgå röret till vattenbadet vid 37 ° C under 8 minuter och blanda genom att snurra varje 3-4 min. Spruta vävnaden upp och ner sju gånger, såsom nämnts ovan, och placera ett prov (10 | j, l) av vävnaden lösning på torr petriskål. Observera vävnaden lösningen under en inverterad fas-kontrast, ljusmikroskop med en 10X objektiv. Räkna med enskilda celler och några små stora cell kluster för att vara närvarande.
- Hantera cellerna på is från denna punkt på att bromsa eller stoppa aktiviteten av kollagenas. Justera volymen till 50 ml med användning av kall PBS / BSA / DNas I. Centrifugera cellerna vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C, och återsuspendera i 5 ml kall PBS / BSA / DNas I med användning av en P1000 pipett.
- Lägg kollagenas B (100 mg / ml lager) vid 350-450 ^ il / 10 ml till vävnaden bitar och inkubera vävnaden vid 37 ° C i ett vattenbad under 8 min, virvlande varje 3-4 min. Använd en 10 ml spruta med en 16 ½ G nål för att upprätta och därefter spruta vävnads lösning ner väggen i 50 ml rör vid RT. Upprepa detta sju gånger.
- Filter för att ge enkelcellsuspensioner och tvätt.
- Filtrera cellerna genom en 70 | im nylonnät filterkoppen och därefter genom en 40 | im nylonnät filterkoppen.
- Resuspendera cellerna i 5 ml kall PBS / BSA / DNas I och räkna cellerna.
OBS: För 2-4 månader gamla B6 eller CD-1-möss, kan varje bukspottkörteln ge ~ 5 eller 10 miljoner celler, respektive. Dessa siffror kan variera mellan olika experimental. Om överdriven cellfragment återfinns vid räkna, bringa volymen till 50 ml med kall PBS / BSA / DNas I och centrifugera cellerna vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. - Justera volymen av cellsuspensionen till en koncentration av 2 x 107 celler / ml med hjälp av kall PBS / BSA / DNas I.
2. Sortera cellerna att berika Pancreatic kolonibildande stamfäder
OBS: Från B6-möss, CD133 + men inte CD133 - celler anrikas för PCFUs 7,9,11. CD133 + celler representerar ~ 13% av den totala dissocierade pankreasceller efter alla grind parametrar tillämpas 11. Från CD-1-möss, CD133 + Sox9-EGFP + celler representerar typiskt ~ 4% av de totala pankreasceller, och denna cellpopulation anrikad för PCFUs 7. Sortering av CD133 + Sox9 / EGFP + celler beskrivs här.
- Färga Dissocierade pankreatiska celler.
- Blockera hela pankreas singel-cellsuspension för att reducera icke-specifik bindning genom att inkubera encelliga suspension med anti-mus CD16 / 32 vid 10 | ig / ml slutlig koncentration i 5 min på is.
- Ta en portion av 1 x 10 6 celler (50 &# 181; l) för att färga med isotypkontroll-antikropp, biotin-konjugerad rått-IgG 1 vid 5 | ig / ml slutkoncentration, under 20 min på is, virvlande varje 5-7 min.
- Ta en portion av 1 x 10 6 celler (50 | il) och hålla på is som en ofärgade kontroll.
- Fläcka återstoden av cellerna med en biotin-konjugerad anti-mus-CD133 primära antikroppen, vid 5 ^ g / ml slutkoncentration, under 20 min på is, virvlande varje 5-7 min.
- Tvättceller.
- Tvätta isotypkontroll och primära antikroppsfärgade prov genom att bringa volymen till 1 ml med PBS / BSA / DNas I och centrifugera vid 400 xg under 5 min vid 4 ° C. Upprepa detta tvättsteg.
- Resuspendera isotypkontroll och primära antikroppsfläckade prover i PBS / BSA / DNas I, så att den slutliga koncentrationen är 2 x 10 7 celler / ml.
- Färga isotypkontroll och primär antikropp-färgade prover med streptavidin (STV) -märkt allofykocyanin (APC) vid 2 & #181; g / ml slutkoncentration. Inkubera i 15 minuter på is, virvlande varje 5-7 min.
- Tvätta celler och 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) färgning.
- Tvätta isotypkontroll och primära antikropps färgades proverna två gånger med PBS / BSA / DNas I, som i steg 2,2. Resuspendera cellerna i PBS / BSA / DNas I med DAPI (0,2 | j, g / ml slutkoncentration). Den slutliga volymen av provet isotypkontroll bör vara 0,5 ml.
OBS: Se till att den slutliga densiteten av den primära antikropps färgade provet är lämplig för sorteraren som ska användas. En koncentration av 5 x 10 6 celler / ml används rutinmässigt för att sortera. - Justera volymen av ofärgade celler till 0,5 ml med PBS / BSA / PS / DNas I. Filter alla celler genom en 20 um mesh före sortering och hålla cellerna på is i mörker.
- Tvätta isotypkontroll och primära antikropps färgades proverna två gånger med PBS / BSA / DNas I, som i steg 2,2. Resuspendera cellerna i PBS / BSA / DNas I med DAPI (0,2 | j, g / ml slutkoncentration). Den slutliga volymen av provet isotypkontroll bör vara 0,5 ml.
- Sortering av celler.
- Använd en 80 pm eller större munstycke för sortering.
OBS: Murina bukspottkörteln endokrina celler är benägna att fysisk stress. hoWever behöver murina PCFUs verkar inte påverkas av stress som orsakas av att passera genom en sorterare 7. - Förvärva cell händelser och analysparametrar på sorterare. Gate cellerna för framåt och sidospridningsområden för att utesluta celldebris 7. Gate för framåt- och sidospridningsbredder att utesluta cell dubletter. Grind för att utesluta DAPI + döda celler 7. Välj grind parametrar för EGFP och CD133-APC signaler baserat på värdena från isotyp kontrollcellerna (Figur 1).
- Samla in de sorterade cellerna in i 5 ml polystyrenrör innehållande 1,5 ml DMEM / F12-medium kompletterat med 5% fetalt kalvserum (FCS). Centrifugera de sorterade populationerna vid 400 xg under 5 min och återsuspendera i en liten volym (~ 200 | al) av antingen DMEM / F12 eller PBS / BSA / DNas I som kompletterats med 5% FCS. Hålla cellerna på is fram till användning.
- Använd en 80 pm eller större munstycke för sortering.
- Räkna antalet CD133 + Sox9-EGFP + celler erhållna från sorteraren. ta en10 | il cellprovet och räkna cellerna med en hemacytometer för att bestämma celldensitet.
OBS: hemacytometer användning rekommenderas därför att maskin räknas från sorteraren är ofta otillförlitliga.
3. Platta de sorterade cellerna i kolonin analys innehållande Murina ECM-proteiner
OBS: Se de detaljerade protokoll för plätering av celler i mus-ECM-innehållande kolonianalys i en annan JUPITER publikation 18.
- Förbered Kultur Media.
- Förbereda ett odlingsmedium innehållande DMEM / F12-medium, 1% (vikt / volym) metylcellulosa, 5% (v / v) murina ECM-proteiner, 50% (volym / volym) konditionerat medium från Mesc-härledda pankreatiska liknande celler, 5% (volym / volym) FCS, 10 mmol / L nikotinamid, 10 ng / ml humant rekombinant aktivin B, 0,1 nmol / L exendin-4, och 1 ng / ml vaskulär endoteltillväxtfaktor-A. Metoder för att generera det konditionerade mediet beskrivs på annat håll 18.
- Med 750 ng / ml av RSPO-1 till medietom Tät kolonibildning är önskvärd.
- Inkubera den murina ECM protein odling vid 37 ° C och 5% CO2 under 3 veckor.
4. Odlings de sorterade cellerna på en cell per brunn
OBS: Följande procedurer gäller att manipulera enstaka celler genom att använda handen och munnen pipetter. Ett alternativt tillvägagångssätt är att köpa en mikromanipulator. En typisk mikromanipulator innefattar ett inverterat mikroskop med en joystick-styrd, motordriven plattform.
- Förbered Glas Pasteur pipetter.
- Med användning av en Bunsenbrännare, dra ut spetsen på en glas pasteurpipett till en fin spets (~ 30 | j, m vid öppnandet). Glas Pasteur pipetter bör ha en bomullspropp för att skapa ett hinder för luftflödet från operatören.
- Autoklavera de flammig glaspasteurpipetter vid 121 ° C under 20 min för sterilisering.
- Förbered 96 brunnar för kultur.
- Förbered kallt halvfast odlingsmedium Accordning till den tidigare beskrivna protokoll 18.
- Fördela substratet in i de inre brunnarna på en låg-bindande flatbottnad 96-brunnsplatta vid 100 | il / brunn med användning av en 1 ml spruta. Fyll de yttre brunnarna med sterilt vatten för att upprätthålla fuktigheten.
- Placera odlingsskål på is fram till användning.
- Framställa de sorterade celler.
- Lägg ~ 6000 celler som samlats in från en sorterare till 2,5 ml slutlig volym av DMEM / F12 / PS innehållande 10% FCS och 1% metylcellulosa i ett 5 ml polystyrenrör. Skaka kraftigt för att blanda komponenterna. Vänta i 5 min eller till dess att bubblorna flyter till toppen av röret. Detta steg behöver inte utföras på is.
- Fördela cellen lösningen till två 35 mm skålar vid 1 ml / skål med hjälp av en 1 ml spruta med en 18 ½ G-nål.
- Sprid cellen lösningen i skålen genom att försiktigt gungande skålen för hand. Låt inte halvfast medium för att nå kanten av 35 mm skålen, som enskilda celler på marginalen av brunnen cannOT observeras tydligt med ett inverterat ljusmikroskop.
- Förbered Arbetsområdet Runt ett mikroskop.
- Göra en lösning innehållande DMEM / F-12-medium och 1% metylcellulosa utan några celler ( "no-cell" medium), och dispensera lösningen (som beskrivs i 4.3.2) i två 35 mm petriskålar (1 ml per skål) .
- Ren och torka av arbetsområdet runt en inverterad faskontrastmikroskop med en 70% alkohollösning.
- Montera pipetten med munstycket.
- Välj en steril glas pasteurpipett som framställdes i steg 4,1. Fästa den stora änden av en 1 ml plast pipettspetsen till toppen av glaset pasteurpipett. Anslut den lilla änden av en ml plast pipettspetsen till en ände av en tunnväggig gummislang, och munstycket till den andra änden av röret. Använd samma glaspipett för att plocka upp flera celler i samma grupp.
- Upprätta genom munnen sug, en liten volym (~ 10 till 50 pl) av"No-cell" halvfast lösning i steg 4.4.1 med glas pasteurpipett.
OBS: Det halvfasta lösningen vid den smala öppningen av glaset pasteurpipett skapar flödesmotstånd och tillhandahåller en barriär för att förhindra kontaminering av de celler som skall plockas.
- Välj en enda cell.
- Placera 35 mm skål som innehåller de sorterade cellerna på mikroskopets objektbord och ta bort locket.
- Hitta cellerna med hjälp av en 10X objektiv och fokusera på en lämplig cell som ska plockas.
- Hitta och placera öppningen av pipettspetsen bredvid cellen av intresse. Avsugning genom munnen.
OBS: Rörelsen hos cellen bör vara ganska långsam, så att det inte finns någon risk för att förlora cellen under processen senare. Rörelsen av cellen som kommer in i öppningen av pipetten ska vara synlig. Om flödet rör sig för fort, ändra till en pipett med en smalare öppning.
- Deponera en enda cell i en odlingsbrunn.
- När cellen är i pipetten, använd tungan för att stoppa flödet genom att blockera öppningen av munstycket. Gör en kort paus innan du drar spetsen från halvfast medium för att säkerställa att det halvfasta medium har slutat flöda.
- Placera spetsen på pipetten in i en brunn i 96-brunnars platta som framställts i steg 4,2. Driva cellen långsamt ut genom att försiktigt blåsa i munstycket. Märk väl efter cellen avsätts för att undvika plätering två celler i en brunn.
- Se till att en enda cell placeras i en odlingsbrunn.
- Placera pipettspetsen i "no-cell" medium framställt i steg 4.4.1. Under iakttagande öppnandet av spetsen under mikroskop, trycka ut den återstående halvfasta lösning. Förväntar ingen cell att strömma ut spetsen på pipetten.
- Till dubbelkolla, hitta platsen i kulturen väl där enda cell implanterades.
- Kultur de enskilda cellerna vid 37 ° C i 5% CO2 i upptill 3 veckor.
5. Välj Individuella kolonier från Halvfast Kultur för mikroflödes QRT-PCR-analys
NOTERA: Tre veckor efter plätering sorterade CD133 + Sox9 / EGFP + celler in i murina ECM-innehållande kolonianalys, Ring eller Täta kolonier bildas 7 (Figur 2). När Ring / Täta kolonier dissocierade till en enda cell fjädring och åter pläterad i laminin hydrogel kultur, Endocrine / Acinar kolonier genereras efter ungefär en vecka 7 (Figur 2). För att bestämma härstamning sammansättningen av varje koloni, är mikroflödes QRT-PCR-analys användas för att detektera uttrycket av härstamningsmarkörer 7. För pre-förstärkning, är en koloni blandas i en huvudblandning innehållande en TaqMan sondblandning, reaktionsbuffert, och Upphöjd III 21. Den 48,48 array chip därefter används för mikroflödes PCR-reaktioner 21.
- Förbered förförstärkning PCRblanda innehållande 48 prober.
- Pipettera 1,5 | il av varje TaqMan sond (20x stock) i ett 1,5 ml rör. Lägg 78 pl TE-buffert för att justera volymen till 150 pl.
- Förbered Master Mix genom att följa protokoll från tillverkaren 21.
- Placera 9 il huvudblandning i vardera 0,2 ml tunnväggiga reaktionsrör lämpliga för PCR, och upprepa detta steg för upp till 48 rör.
- Plocka enskilda kolonier från den halvfasta kultur.
OBS: Ring / Täta kolonier är större än endokrina / Acinar kolonier med diametrar från ~ 50 till 400 pm 9,11. Därför är enkel ring / Täta kolonier plockas med hjälp av en P10 pipett utrustad med en 10 mikroliter pipettspets som är böjd till en krökt form. För att plocka den lilla endokrina / Acinar kolonier (Figur 2), se steg 4.- Leta upp en koloni av intresse under hög förstoring (t.ex. 20X objektiv), minska förstoringen, och aspirate kolonin. (Tillval) Ta en fas-kontrastbild av kolonin i detta steg för att dokumentera de synliga egenskaperna hos kolonin.
- Överför kolonin i PCR-rör innehållande 9 il huvudblandning.
- Välj nästa kolonin. Upp till 45 kolonier totalt kan analyseras per PCR-körning, lämnar 3 platser för kontroller.
- RNA-extraktion och cDNA-syntes med pre-amplifiering.
- Vortexa proverna kraftigt före utförande av den termiska reaktionen.
- Utför de termiska cykel reaktioner enligt tillverkarens anvisningar 21. Ring / Täta kolonier kräver 14 cykler, endokrina / Acinar kolonier kräver 16-20 cykler, och enstaka celler kräver 22 cykler.
NOT: Pre-amplifiering cDNA kan lagras vid -20 ° C före mikroflödes PCR-analys.
- Köra efterföljande PCR-reaktioner, med användning av ett mikrofluidchip, enligt tillverkarens instruktioner 21.
- Harvest och Fix kolonier.
- Plocka upp kolonierna under mikroskop, som i steg 4 eller 5,4, och lägga till dem i en 4% paraformaldehydlösning. Inkubera O / N vid 4 ° C med försiktig skakning.
- Tvätta kolonier med 1 x PBS två gånger för 10-30 min vid RT. Lagra de fasta kolonier vid 4 ° C i 1,5 ml rör förslutna med paraffin.
- Färga kolonier med antikroppar.
- Överför kolonier till en brunn i en 96-väl svartplåt med en tydlig botten innehållande 200 pl blockeringsbuffert (5% åsna och / eller getserum, 0,1% Triton X-100 i 1x PBS). Inkubera O / N vid 4 ° C med försiktig skakning.
- Späd den primära antikroppen till en förutbestämd koncentration (t.ex., 1: 500 för hamster-anti-mucin en antikropp) med användning av blockeringsbuffert. Överföra kolonierna till en ren väl med 200 | il av primär antikropp, och inkubera O / N vid 4 ° C med försiktig skakning. Waska kolonierna 3 gånger med PBS innehållande 0,1% Tween 20. Överför kolonierna till en ny brunn med 200 pl 1 x PBS / 0,1% Tween 20 under 10 min vid RT i varje tvätt.
- Späd den sekundära antikroppen till en förutbestämd koncentration (t.ex., 1: 2000 för get-anti-Armenian hamster-antikropp) med användning av blockeringsbuffert. Förvara lösningen i mörker. Överföra kolonierna för att rengöra brunnar innehållande 200 | il sekundär antikropp, och inkubera i 2 h vid RT. Tvätta kolonierna 3 gånger med PBS / 0,1% Tween 20, som i steg 6.2.2.
- Motfärgning kolonier med DAPI och visualisera med konfokalmikroskopi.
- Överföra kolonierna i brunnar med PBS innehållande 300 nM DAPI och inkubera i 5 min vid rumstemperatur.
- Överföra DAPI-färgade kolonier till en 35 mm glasbottnade petriskål för visualisering. Placera ett täckglas ovanpå kolonierna för att förhindra avdunstning.
- Använd ett konfokalmikroskop att fånga bilder. Att visualisera DAPI staining, använd två-foton-excitation våglängd av 730-950 nm. Använda en argonlaser med en våglängd av 458 nm för att excitera fluorokromer med emissionsvåglängder på 519 och 561 nm. Använda en helium-neonlaser med en våglängd av 633 nm för att excitera fluorokromer med emissionsvåglängder på 665 nm.
7. dissociera och Re-platta Primär Ring / Dense Kolonier i Sekundära kolonianalyser
OBS: Alla procedurer bör utföras under sterila förhållanden. Undvika köldchock till cellerna i detta förfarande så mycket som möjligt, till exempel sätta celler på is eller tvätta celler med kall PBS / BSA. Sådana metoder minskar livskraft åter pläterade celler.
- Förbered Solutions.
- Pre-warm tvättbuffert (DMEM / F12; P / S; 0,1% BSA) i en 37 ° C vattenbad.
- Pre-värma en 96-brunnars platta (plan botten, låg bindning) i en 37 ° C inkubator. Tillsätt 100 | il 100% FCS till en brunn i plattan och 100 | il 0,25% trypsin-EDTA-lösning till en andraväl.
- Samla Kolonier.
- Välj och samla totalt 20 eller fler Ring / Täta kolonier i primära kulturer med hjälp av 10 mikroliter pipettspetsar, som beskrivs i steg 5,4.
- Placera kolonierna i varmt (minst RT) tvättbuffert (~ 1000 | il) i ett 1,5 ml rör och centrifugera vid 400 xg under 5 min. Avlägsna supernatanten.
- Dissociera kolonierna i encelliga suspensioner med användning av trypsin.
- Överför den återstående volymen (20 ^ eller mindre), som innehåller kolonierna, i den brunn som innehåller varm trypsinlösning (framställd i 7,1).
- Inkubera plattan i en 37 ° C inkubator (inte ett vattenbad) under 1,5 min. Avlägsna plattan och pipet kolonierna några gånger. Inkubera vid 37 ° C under ytterligare 1,5 min.
- Avlägsna plattan och pipett upp och ner några gånger för att bryta upp kolonierna. Kontrollera under mikroskop för att se om kolonierna har spridits huvudsakligen till encelliga suspension.Undvik över nedbrytning av kolonierna.
- Stoppa Trypsin reaktionen genom tillsats av FCS.
- Överför 100 pl varma FCS i den brunn som innehåller cellerna. Pipettera upp och ner några gånger. Överföra celler i ett 1,5 ml rör innehållande 1,000 | il varm tvättbuffert. Centrifugera vid 400 xg under 5 min vid RT.
- Tvätta två gånger med varmt buffert.
- Återsuspendera cellerna i ~ 200 | il buffert eller odlingsmedium.
- Räkna antalet celler med användning av en hemacytometer. Håll cellsuspensionen vid RT.
- Re-plattan dissocierade celler till sekundära kolonianalyser innehållande antingen murina ECM-proteiner (5% v / v) eller laminin hydrogel (100 | j, g / ml) och inkubera cellerna vid 37 ° C med 5% CO2.
OBS: För åter plätering celler i murina ECM-proteiner, använda 2,500-5,000 celler per brunn och kultur i 2-3 veckor. För åter gande i laminin hydrogel kultur, använda 10,000-25,000 celler per brunn och kultur för 7-12 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vuxna pankreas progenitorceller kan berikas genom fluorescensaktiverad cellsortering (Figur 1). Den Sox9 / EGFP transgen mus linje som används här för första gången genereras som ett resultat av den GENSAT Brain Atlas Project 19, och den EGFP reporter är under kontroll av en bakteriell artificiell kromosom som innehåller ~ 75 kb uppströms och ~ 150 kb nedströmssekvenser av Sox9 20 . I dessa möss, EGFP etiketter bukspottkörteln kanaler effektivt och specifikt 22. Pankreas anskaffades och dissocieras till en enkelcellsuspension, och färgades med anti-CD133-antikroppar konjugerade med biotin, följt av färgning med sekundära antikroppar konjugerade med STV-APC. De resulterande cellerna analyserades genom flödescytometri med lämpliga grindparametrarna (Figur 1). Celler erhållna med användning av olika grindningsparametrar kan sorteras och ströks in i metylcellulosa innehållande kolonianalyser förkolonibildning. I tidigare studier, konstaterades att kolonibildande förmåga endast återfinns i den sorterade CD133 + Sox9 / EGFP + duktala celler 7.
Kolonierna som bildas i metylcellulosa innehållande kolonianalyser klassificerades enligt deras morfologi, som observerades med hjälp av en inverterad, faskontrast, ljusmikroskop (Figur 2). Därefter individuella kolonier var handplockade och analyseras av mikroflödes QRT-PCR-analys för genuttryck (Figur 3) eller genom hela montering immunfärgning för proteinuttryck (Figur 4). I publicerade studier 7,9,11, visade det sig att många individuella kolonier uttryckte härstamningsmarkörer för kanal (mucin-1), acinar (amylas) och endokrina (insulin) celler, vilket indikerar att majoriteten av den initierande PCFUs för dessa kolonier är tri-potent. Proportionen av de tre cellinjer i varje koloni Dock påverkades av de typer och koncentrationer av ECM-proteiner som förekommer i metylcellulosa innehållande kolonianalyser 7,9. Murina ECM-proteiner stimuleras självförnyelse av PCFUs och duktal celldifferentiering medan laminin hydrogel företrädesvis stödde differentiering av endokrina och acinar cellinjer 7,9,11.
Figur 1. Flödescytometri analys av dissocierade pankreasceller från vuxna möss visar färgningsmönster enligt två duktala cellmarkörer, CD133 och Sox9. Sox9 / EGFP transgena möss som innehöll Sox9 loci drivna EGFP reporter användes. Ett representativt sorteringsgrinden (röd ruta) för pancreatic CD133 + Sox9 / EGFP + celler visas. CD133 + Sox9 / EGFP + celler anrikas för PCFUs 7.les / ftp_upload / 54016 / 54016fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Kolonier med olika morfologier genererades i metylcellulosa innehållande kolonianalyser. Representativa mikrofotografier av Ring, är täta och endokrina / Acinar kolonier från en faskontrastmikroskop belyst med synligt ljus visas. Ring och tät kolonier genereras när nyligen sorterade PCFUs stryks i odlingsmedium innehållande murina ECM-proteiner och odlades under 3 veckor 7. Endokrina / Acinar kolonier bildas efter åter plätering av dissocierade ring eller Täta koloni celler i odlingsmedium innehållande en laminin hydrogel och odlades under ~ 1 vecka 7. Skala barer för Ring och tät kolonier = 100 nm. Skalstrecket för Endo / körtel kolonier = 25 μ;. m klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Individuella kolonier odlas i murina ECM-proteiner uttryckta markörer för duktala, körtel och endokrina celler. Representativa resultat av mikroflödes QRT-PCR-analys av enskilda ring kolonier. Varje kolumn representerar en enda koloni. De expressionsnivåer av gener uttrycks som ett värme karta här, med varmare färger som indikerar högre uttryck och kallare färger som indikerar lägre uttryck. Många av de enkla kolonier uttrycker åtminstone en av generna i varje panel för markörerna som är indikativa för kanalen, endokrin eller acinar cell lineage. Dessa data visar att många av de individuella kolonier uttrycker tri-härstamning markörer, och tyder på att de flesta avPCFUs ursprung är tri-potenta. Denna siffra ändras från en tidigare publicerad figur 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Två ring kolonier uttryckte en duktal proteinmarkör mucin 1. Representativa resultat av hela montering immunfärgning av ring kolonier, som visar proteinuttryck av en duktal markör mucin 1 (grön färg). Kärnorna är motfärgades med DAPI (blå färg). Många celler i dessa ring kolonier uttrycker mucin ett protein. Detta överensstämmer med de mikroflödes QRT-PCR-resultat som visar att ring kolonier odlade i murina ECM-proteiner uttrycker höga nivåer (varmare färger i figur 3) av mucin1 och andra duktala cellmarkörer. Skalstrecket representerarär 50 pm. klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Bukspottkörtelkolonianalyser för mätning av självförnyelse och flera härstamning differentiering av enskilda stamceller i kultur. Representant arbetsflöde presenteras. Våra pankreatiska kolonianalyser innehåller ett visköst material, metylcellulosa, så att odlingsmediet blir halvfast. Halvfast medium begränsar rörelsen och förhindrar aggregation av enkel progenitorceller (markerade med rött). Emellertid är mediet tillräckligt mjuk för att tillåta att en enda ursprungscell till självförnya och / eller differentiera, och växa till en koloni av celler (som representeras av flera röda cirklar). I kontrast, enskilda celler som inte har kolonibildande förmåga, <em> dvs icke-progenitorceller (indikeras i blått), kvarstår som enskilda celler eller dö under tiden i kultur. Metylcellulosa medger också införandet av ECM-proteiner vid låga koncentrationer, såsom 5% mus ECM-proteiner eller 100 mikrogram / ml laminin hydrogel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bukspottkörtelns kolonianalyser och enda koloni analyser beskrivs här inspirerades av metylcellulosa innehållande hematopoietiska kolonianalyser som har spelat viktiga roller i dechiffrera biologi hematopoetiska progenitorceller under de senaste decennierna 23. I dessa analyser (Figur 5), dissocierade bukspottkörtelceller stryks i metylcellulosa innehållande halvfast media med lämpliga tillväxtfaktorer och ECM-proteiner som stöder bildandet av ring, tät eller endokrina / Acinar kolonier 7. En enda stamfadercell som har förmåga att ge upphov till en koloni av celler benämns en PCFU. Genom att karakterisera individuella kolonier med hjälp av mikroflödes QRT-PCR och hel-mount immunofärgning kan härstamningen potentialerna hos PCFUs ursprung härledas. Det konstaterades att en majoritet av vuxna murina PCFUs är tri-potenta, som kan ge upphov till duktal, acinar och endokrina härstamningsceller in vitro 7,9. medan murine ECM-proteiner uppmuntra differentieringen av tri-potent PCFU mot kanal härstamning tillåter laminin hydrogel robust endokrina och acinar cell härstamning differentiering 7,9. För att bedöma självförnyelse kapacitet in vitro av PCFUs, Ring eller Täta kolonier odlas i en primär mus ECM kolonianalys kan skiljas i encelliga fjädring och åter pläterad i en sekundär mus ECM kolonianalys 7. Det konstaterades att PCFUs expand ~ 500.000 gånger i murina ECM-proteiner under 11 veckor 7. De kritiska steg omfatta avlägsnande av fettvävnader från dissekerade pankreata undvika över nedbrytning av pankreasceller genom kollagenas, och minimera köldchock de dissocierade ring / Täta koloniceller innan de plating. Mastering mikromanipulation av enskilda celler kan ta lite tid; tålamod och praxis krävs.
Jämfört med andra pankreatiska progenitorceller analyser, inklusive 2D kultur 24, Suspension "pancreasphere" 25 och organoid analyserna 12-15, de stora fördelarna med metylcellulosa innehållande kolonianalyser som beskrivs här är följande. För det första kan tillsatsen och trimning av ECM-proteiner till ett brett intervall av koncentrationer vara lätt att uppnå. Detta beror på att metylcellulosa är det ämne som ger 3D-naturen hos det halvfasta medium. I motsats härtill organoid odlingsmetoder att bero på stelning av de murina ECM-proteiner, som är närvarande vid 33% v / v eller högre. Det noteras att så lite som 1% murina ECM protein kan hämma differentieringen av endokrina celler 9, vilket understryker vikten av ECM proteinkoncentration i stamcellstransplantation analysen. För det andra är kolonier jämnt fördelade över odlingsbrunn och kan räknas exakt. Tredje, enkla kolonier kan lätt handplockade för efterföljande analys. För det fjärde är metylcellulosa-innehållande halvfast medium lätt att underhålla, och inget mediumändring krävs under loppet av odlingen. Slutligen kan ett stort antal celler (upp till 25.000 celler per 24-brunnar) pläteras och undersökas i dessa kolonianalyser, vilket gör dem effektiva för detektering av progenitorceller aktiviteter även om de är en mindre population bland de strukna cellerna.
Bukspottkörtelns stamcell analyser som beskrivs här baseras på funktionella, men inte markörbaserade analyser av pankreas stamceller. Detta innebär att bukspottkörteln progenitorceller kan studeras utan att veta vad markörer de uttrycker. Detta är viktigt eftersom det finns lite kunskap om vilka specifika markörer vuxna pankreas progenitorceller kan uttrycka. Dessutom kan markörer för embryonala pankreas progenitorceller vara olämpliga för att studera vuxna stamceller. Genom att använda funktionsanalyser, kan man börja att identifiera specifika progenitorceller markörer genom att först bestämma under befolkningen som har PCFU aktivitet, såsom CD133 + </ sup> Sox9 / EGFP + celler illustreras här. Detta kan följas av identifiering, med hjälp av RNA-punkter, av gener som differentiellt uttrycks av PCFU innehållande befolkningen. Kandidat markörer kan sedan testas och kontrolleras av analyser som in vitro och in vivo härstamning spåra tekniker som spårar differentierings förmågor stamceller.
Begränsningarna för in vitro metylcellulosa innehållande koloni analyser är trefaldigt. Först, även om analyserna likna mikromiljön i bukspottkörteln in vivo genom att tillhandahålla ECM-proteiner och tillväxtfaktorer till de pankreatiska progenitorceller i 3D-rymd i kultur, villkoren inte är identiska. Dessutom är strukturerna hos epitelceller in vivo sönder genom dissociation till enstaka celler, som kan ha viktiga konsekvenser. Därför är det viktigt att kontrollera progenitorceller i uppföljande studier med hjälp av in vivo 18. Dessa odefinierade komponenter kan påverka funktionen av specifika tillväxtfaktorer på stamceller indirekt och det krävs mer arbete för att skapa en helt definierad uppsättning odlingsbetingelser. Slutligen, härstamning spåra experiment visade acinar-till-beta-celler 26,27 eller alfaceller mot betacellerna 28 omvandlingar in vivo hos vuxna möss. De metylcellulosa odlingsbetingelser som beskrivs här kan vara specifik för kanal-betacellernas bara konvertering. Andra okända odlingsbetingelser kan behövas för icke-gångceller att konvertera till betaceller i kultur.
Det finns flera fall där felsökning kan behövas. Till exempel om dissocierade celler är hopklumpade tillsammans, använda högre doser av DNase I i lösningar. DNas I är viktigt att förhindra trassel av dissocierade pankreasceller orsakade av DNA-molecules frigörs av döda celler (se steg 1.3.2).
Alternativt, om malet vävnader fastna i 10 ml pipett, mala vävnaden i mindre bitar. Öppnandet av 10 ml pipett bör vara tillräckligt breda för vävnaden bitar att passera genom efter kollagenasdigerering. Om bitar fastnar vid spetsen av 10 ml pipett, indikerar detta att malningen av vävnaden genom fjäder sax är inte tillräcklig (se steg 1.3.4).
Ett annat problem som kan uppstå är ingen kolonitillväxt i murina ECM-proteiner från dissocierade pankreasceller (dvs. osorterade celler). Om detta inträffar, försök inte att bryta alla kluster i enskilda celler under bukspottkörteln dissociation steg, eftersom det kan leda till överdigerering och celldöd. Om det finns stora bitar, återgår röret till 37 ° C under ett fåtal (4) min och sprutan 7 gånger eller mindre. Kontrollera igen cellerna under mikroskop. Den maximala tiden för kollagenas B behandling är 30 minuter. DBeroende på om rådet kollagenas som används, den optimala tiden för matsmältningen kan skilja sig (se steg 1.4.2).
Dessutom kan klumpar av murina extracellulära matrisproteiner i odlingsbrunnar observeras efter inkubation. För att undvika detta, se till att alla kultur komponenter som kommer i kontakt med murina extracellulära matrixproteiner hålls kall på is för att undvika för tidig stel före inkubation i 37 ° C (se steg 3).
Dessutom kan det vara svårt i att plocka upp en cell i taget i ett glas pasteurpipett. En lösning på detta är att minska densiteten hos de nyligen sorterade celler utstrukna i halvfast medium för att se till att en cell har tillräckligt avstånd från de andra cellerna. Detta kommer att undvika att plocka upp flera celler samtidigt. Dessutom är det bättre att placera mikroskopets fokus nära botten av det halvfasta mediet, eftersom det är lättare att plocka upp enskilda celler för hand i närheten av detta plan utan en mikromanipulator (se steg 4.6.2).
Dessutom kan det vara oklart om enda cell manipulation är framgångsrik. En lösning är att träna en enda cell mikromanipulering innan själva experimentet. När cellen är plockade upp i glaset pasteurpipett, överföra cellen till en 35 mm petriskål med 1 ml av 1% metylcellulosalösning utan celler ( "no-cell" medium framställt i steg 4.4.1). Visualisera och placera öppningen av toppen av pasteurpipett i fokus under mikroskop, och tryck cellen långsamt. Räkna med en enda cell långsamt visas runt spetsen av pipetten och sedan flytta in i "no-cell" medium (se steg 4.8.2).
Slutligen kan ingen kolonitillväxt förekommer i sekundära kulturer från dissocierade primära Ring / Tät kolonier. För felsökning, se till att celler från dissocierade primära kolonier hålls i RT innan plätering i sekundära kulturer. För odling i murina ECM-proteiner, tillsättcellerna sista till röret innehållande kallt odlingsmedium före blandning 18, vilket minimerar exponeringen av cellerna för kall temperatur, som kan döda de dissocierade celler erhållna från primära kolonier. Däremot behöver åter plätering av celler i laminin hydrogel inte utföras på is före 37 ° C inkubation (se steg 7).
Sammanfattningsvis har två metylcellulosa innehållande kolonianalyser använts för att karakterisera stamceller-liknande celler från bukspottkörtlar av vuxna 7,11 och postnatal unga möss 9,10, liksom från levern hos unga möss 10. Framtida tillämpningar kommer att riktas mot identifiering och karakterisering av humana kolonibildande stamceller från avlidna pankreas organ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Lucy Brown och Alexander Spalla från Analytical Cytometry Kärna på City of Hope för att få hjälp i sortering. Detta arbete stöds delvis av National Institutes of Health (NIH) ger R01DK081587 och R01DK099734 till HTK och U01DK089533 till ADR, och av National Science Foundation NSF-DMR-1.206.121 och California Institute för regenerativ medicin bidrag RB5-07398 till DAT stöder från Joseph J. Jacobs Institutet för molekylär teknik för medicin vid Caltech till DAT, och de från Oxnard Foundation och Ella Fitzgerald Foundation till HTK är också tacksamma.
Finansiering: Detta arbete stöds delvis av National Institutes of Health (NIH) ger R01DK081587 och R01DK099734 till HTK och U01DK089533 till ADR, och av National Science Foundation NSF-DMR-1.206.121 och California Institute för regenerativ medicin bidrag RB5-07398 till DAT stöder från Joseph J. JacobsInstitutet för molekylär Teknik för medicin vid Caltech till DAT, och de från Oxnard Foundation och Ella Fitzgerald Foundation till HTK är också tacksamma. Research rapporterade i denna publikation ingår arbete som utförs i den analytiska Cytometry Core och ljusmikroskopi Digital Imaging Core stöds av National Cancer Institute i National Institutes of Health i tilldelning nummer P30CA33572.
Studie sponsor: Sponsorn inte delta i studiens utformning, insamling, analys eller tolkning av data.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murine ECM proteins (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 354230 | Stock kept at -20 °C |
| Laminin Hydrogel | Provided by David Tirrell (Pasadena, CA USA) | Stock kept at -20 °C | |
| Methylcellulose | Shinetsu Chemical (Tokyo, Japan) | 1,500 centipoise (dynamic viscosity unit equal to 15 g/cm/sec) (high viscosity) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, USA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| 50 ml Flacon Conical vial | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Suspension culture dish | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 430591 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | A8412 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Germany) | 260913 | |
| Collagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Switzerland) | 11088831001 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mouse CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 101310 | low endotoxin, azide free |
| PE-Cy7 Rat IgG2a κ Isotype Control | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 400522 | |
| Rat IgG1 κ Isotype Control | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotin | eBioscience (San Diego, CA, USA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 113812 | |
| Streptavidin-Allophycocyanin | Biolegend (San Diego, CA, USA) | 405207 | |
| 4',6-Diamidino-2-phenylindole | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 3571 | Stock kept at -20 °C |
| Anti-mucin 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA USA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Goat anti-Armenian Hamster | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 127-495-160 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 | Mediatech(Manassas, VA, USA) | 10-092-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Tissure Culture Biologicals (Long Beach, CA, USA) | 101 | Stock kept at -20 °C |
| Tris Ethylenediaminetetraacetic acid | TEKnova (Hollister, CA, USA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 74004 | |
| QuantiTec Reverse Transcription Kit | Qiagen (Venlo, Netherlands) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, USA) | 11753-100 | |
| Paraformaldehyde | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, USA) | SC-281692 | |
| Goat serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 005-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Donkey serum | Jackson Immuno (West Grove, PA, USA) | 0017-000-121 | Stock kept at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T9284 | |
| Trypsin | Sigma (St. Louis, MO, USA) | T-4799 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Invitrogen (Waltham, MA, USA) | 15575-020 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, USA) | 25200-056 | |
| Sterile Water | Gibco (Grand Island, NY, USA) | 15230-147 | Molecular biology grade |
| Pasteur Pipette | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 13-678-8B | |
| 40 μm Filter Mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-1 | |
| 70 μm filter mesh | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA , USA) | 08-771-2 | |
| TC Plate 96 Well Suspension | Sarstedt | 83.3924 (Previously 83.1835) | |
| 1 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 309659 | |
| 10 cc Syringe | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Dynamic Array Sample & Assay Loading Reagent Kit | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems (Grand Island, NY, USA) | 4304437 | |
| Polyethylene glycol sorbitan monolaurate | Sigma (St. Louis, MO, USA) | P7949 | |
| Glass Bottom Dish | MatTek (Ashland, MA, USA) | P35G-1.5-14-C | 35 mm Petri dish with glass bottom |
| Mouth Piece/Rubber Tubing | Renova Life Inc. (College Park, MD, USA) | MP-SET | |
| Nicotinamide | Sigma (St. Louis, MO, USA) | N0636 | Stock kept at -20 °C |
| Vascular Endothelial Growth Factor | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 293-VE | Stock kept at -80 °C |
| Activin B | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 659-AB | Stock kept at -80 °C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, USA) | E7144 | Stock kept at -20 °C |
| Rspondin-1 | R&D Systems (Minneapolis, MN, USA) | 3474-RS | Stock kept at -80 °C |
| Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 352054 | |
| PrecisionGlide Needle 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305196 | |
| PrecisionGlide Needle 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | 305198 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Surface 24 well flat bottom plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3473 | |
| Costar 96 Black Well Plate | Corning Inc. (Corning, NY, USA) | 3603 | Flat, clear bottom with lid. Black polystyrene TC-treated microplates |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Inverted Microscope | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Germany) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (San Francisco, CA, USA) | ||
| Aria Special Order Research Product Cell Sorter | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, USA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) |
||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0.1% (wt/vol) BSA PenStrep (49 Units/ml Penicillin, 49 μg/ml Streptomycin) Dnase 1 (2,400 Units/ml per pancreas) |
References
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
- DiGiusto, D. L., et al. RNA-based gene therapy for HIV with lentiviral vector-modified CD34(+) cells in patients undergoing transplantation for AIDS-related lymphoma. Science translational medicine. 2, 36-43 (2010).
- Inada, A., et al. Carbonic anhydrase II-positive pancreatic cells are progenitors for both endocrine and exocrine pancreas after birth. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 19915-19919 (2008).
- Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
- Ku, H. T. Minireview: pancreatic progenitor cells--recent studies. Endocrinology. 149, 4312-4316 (2008).
- Jin, L., et al. Colony-forming cells in the adult mouse pancreas are expandable in Matrigel and form endocrine/acinar colonies in laminin hydrogel. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3907-3912 (2013).
- Fu, X., et al. MicroRNA-26a targets ten eleven translocation enzymes and is regulated during pancreatic cell differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 17892-17897 (2013).
- Ghazalli, N., et al. Postnatal Pancreas of Mice Contains Tripotent Progenitors Capable of Giving Rise to Duct, Acinar, and Endocrine Cells In Vitro. Stem Cells Dev. , (2015).
- Jin, L., et al. Colony-forming progenitor cells in the postnatal mouse liver and pancreas give rise to morphologically distinct insulin-expressing colonies in 3D cultures. Rev Diabet Stud. 11, 35-50 (2014).
- Jin, L., et al. In Vitro Multilineage Differentiation and Self-Renewal of Single Pancreatic Colony-Forming Cells from Adult C57Bl/6 Mice. Stem Cells Dev. , (2014).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. Embo J. 32, 2708-2721 (2013).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140, 4452-4462 (2013).
- Lee, J., et al. Expansion and conversion of human pancreatic ductal cells into insulin-secreting endocrine cells. Elife. 2, e00940 (2013).
- Dorrell, C., et al. The organoid-initiating cells in mouse pancreas and liver are phenotypically and functionally similar. Stem Cell Res. 13, 275-283 (2014).
- Ku, H., Yonemura, Y., Kaushansky, K., Ogawa, M. Thrombopoietin, the ligand for the Mpl receptor, synergizes with steel factor and other early acting cytokines in supporting proliferation of primitive hematopoietic progenitors of mice. Blood. 87, 4544-4551 (1996).
- Ku, H. T., et al. Insulin-expressing colonies developed from murine embryonic stem cell-derived progenitors. Diabetes. 56, 921-929 (2007).
- Winkler, M., et al. A quantitative assay for insulin-expressing colony-forming progenitors. J Vis Exp. , e3148 (2011).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Formeister, E. J., et al. Distinct SOX9 levels differentially mark stem/progenitor populations and enteroendocrine cells of the small intestine epithelium. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296, G1108-G1118 (2009).
- Fluidigm. Real-Time PCR Analysis User Guide (PN) 68000088 K1. , Available from: http://www.fluidigm.com/documents (2015).
- Seymour, P. A., et al. A dosage-dependent requirement for Sox9 in pancreatic endocrine cell formation. Dev Biol. 323, 19-30 (2008).
- Ogawa, M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood. 81, 2844-2853 (1993).
- Suzuki, A., Nakauchi, H., Taniguchi, H. Prospective isolation of multipotent pancreatic progenitors using flow-cytometric cell sorting. Diabetes. 53, 2143-2152 (2004).
- Seaberg, R. M., et al. Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages. Nat Biotechnol. 22, 1115-1124 (2004).
- Zhou, Q., Brown, J., Kanarek, A., Rajagopal, J., Melton, D. A. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cells to beta-cells. Nature. 455, 627-632 (2008).
- Baeyens, L., et al. Transient cytokine treatment induces acinar cell reprogramming and regenerates functional beta cell mass in diabetic mice. Nat Biotechnol. 32, 76-83 (2014).
- Thorel, F., et al. Conversion of adult pancreatic alpha-cells to beta-cells after extreme beta-cell loss. Nature. 464, 1149-1154 (2010).
