Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

تكلس الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء والتصوير من الأورطي تكلس والتهاب

doi: 10.3791/54017 Published: May 31, 2016
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أمراض القلب والأوعية الدموية هي السبب الرئيسي للوفيات والأمراض في العالم، بما في ذلك الولايات المتحدة حيث تمثل ما يزيد عن 780،000 حالة وفاة سنويا. 1 التاجي تكلس الشرايين وتكلس الأبهر هي السمات المميزة لمرض تصلب الشرايين ويعمل تنبؤ قوية اعتبارا من أحداث القلب والأوعية الدموية. 2- تم الإبلاغ عن 4 نوعان رئيسيان من تكلس الأوعية الدموية لدى البالغين: تكلس باطنة، يرتبط مع تصلب الشرايين، وسطي (المعروف أيضا باسم منكيبيرغ) تكلس، ويرتبط مع مرض الكلى المزمن ومرض السكري يحدث 5 باطنة تكلس في الإعداد لتراكم الدهون والبلاعم. تسلل إلى جدار الوعاء الدموي يحدث 5،6 الإنسي تكلس جدار مستقل عن تكلس باطنة، يموضع للألياف الإيلاستين أو خلايا العضلات الملساء، وغير مقترن ترسب الدهون أو تسلل بلعم. 5،7،8 دراسات عن الآليات الجزيئية لوقد اعتمدت تكلس الأوعية الدموية على أنظمة نموذج قائم على الخلايا والحيوانات. وتشمل نماذج القوارض لمرض atherocalcific الفئران التي تعاني من نقص في أي ئي E (APOE) 9،10 أو منخفض الكثافة مستقبلات البروتين الدهني (LDLR) 11 تغذت على وجبات عالية الدهون، في حين تشمل نماذج للتكلس وسطي الفئران مع مصفوفة غلا البروتين (مجان) نقص 12 أو الفئران التي تعاني بولينا إما عن طريق استئصال الكلية شبه الكامل (نموذج استئصال الكلية 5/6) أو عن طريق التعرض لاتباع نظام غذائي عالي الأدينين 13

هنا، يركز نموذج من تكلس الأوعية الدموية وسطي المرتبطة نقص مجان جرا. مجان هو بروتين الخلية الذي يمنع تكلس الشرايين. وقد تم تحديد 12 الطفرات في الجين مجان في متلازمة Keutel، وهو مرض يصيب الانسان نادر يتصف تكلس الغضاريف منتشر بالإضافة إلى brachytelephalangy، فقدان السمع، وتضيق الرئوي الطرفية 14-18 على الرغم من عدم كثيرا ما لاحظت، 19وقد وصفت تكلس متحدة المركز الشرايين متعددة في متلازمة Keutel. وترتبط 20 الأشكال الشائعة في الجين مجان البشري مع خطر متزايد للتكلس الشريان التاجي، 21-23 بينما مستويات تداول أعلى من uncarboxylated، مجان غير نشط بيولوجيا تتوقع وفيات القلب والأوعية الدموية. 24 وخلافا للبشر مع متلازمة Keutel والفئران التي تعاني من نقص مجان تطوير النمط الظاهري الأوعية الدموية الشديدة التي تتكون من تلقاء أنفسهم تكلس الشرايين على نطاق واسع ابتداء من اسبوعين من العمر ويموت 6-8 أسابيع بعد الولادة بسبب تمزق الشريان الأورطي. 12

على عكس APOE - / - وLDLR - / - الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون، التي تنمي تكلس الأوعية الدموية باطنة مع المرتبطة التهاب الناجم عن بلعم، مجان - / - الفئران تطوير تكلس الأوعية الدموية وسطي في غياب تسلل بلعم 11،25 وعلى الرغم من وتشير هذه النتائج المحفزات الأساسية مختلفة لintimالقاعدة وتكلس وسطي، وهناك تداخل في آليات الإشارات التي تتوسط كلا أشكال تم تحديدها تكلس 26 مسارات الإشارات المتعددة التي تساهم في تكلس الأوعية الدموية بما في ذلك وسطاء التهابات مثل عامل نخر الورم α و IL-1 والعوامل المؤيدة للالمكونة للعظم مثل الشق، WNT، والبروتين المخلق للعظم (BMP) الإشارة. 27،28 تزيد هذه مسارات إشارات التعبير عن عوامل النسخ المتعلقة قزم عامل النسخ 2 (Runx2) وosterix، والتي بدورها تزيد من التعبير عن البروتينات ذات الصلة العظام ( . على سبيل المثال، أوستيوكالسين، sclerostin، والفوسفاتيز القلوية) في الأوعية الدموية التي تتوسط تكلس 28-30 نحن وغيرنا قد أظهرت أن تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في APOE - / - وLDLR - / - تغذية الفئران حمية عالية الدهون وعفوية تكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في مجان - / - الفئران وكلها تعتمد على البروتين المخلق للعظم (BMP) سيgnaling، وأنه هو هذا المسار تركز على هنا. 11،25،31 أفضل الممارسات الإدارية هي العوامل المكونة للعظم قوية المطلوبة لتكوين العظام، ومن المعروف أن تظهر زيادة التعبير في تصلب الشرايين البشرية. وقد تورط 32-34 في الدراسات المختبرية BMP الإشارات في تنظيم التعبير عن العوامل المكونة للعظم مثل Runx2. 35-37 overexpression من يجند BMP، BMP-2، ويسرع تطوير تكلس الأوعية الدموية في الفئران APOE التي تعاني من نقص تغذية نظام غذائي عالي الدهون. 38 وعلاوة على ذلك، فإن استخدام BMP محدد يشير مثبطات مثل هذه كما LDN-193189 (LDN) 39،40 و / أو ALK3-FC يمنع وضع تكلس الأوعية الدموية في كل من LDLR - / - الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي غني بالدهون والفئران التي تعاني من نقص مجان 11،25.

الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء (VSMCs) دورا حاسما في تطوير تكلس الأوعية الدموية. 30،41،42 وتكلس الأوعية الدموية وسطي أن يتطور في مجان التي تعاني من نقص الفئران هو characterized من قبل transdifferentiation من VSMCs إلى النمط الظاهري عظمي المنشأ. ويؤدي فقدان مجان في التعبير انخفض من علامات VSMC بما في ذلك myocardin وألفا الأكتين العضلات الملساء، مع ما يصاحب ذلك ارتفاع في علامات المكونة للعظم مثل Runx2 وosteopontin. وتتزامن هذه التغيرات مع تطور تكلس الأوعية الدموية. 25،43،44

وعادة ما يتم تقييمها تكلس الشريان الأورطي والتهاب في الفئران باستخدام تقنيات النسيجية مثل نشاط إنزيم الفوسفاتيز القلوية للتكلس المبكر والنشاط عظمي المنشأ، فون كوسا والصبغ الأحمر تلطيخ الأحمر في أواخر تكلس، والبروتوكولات المناعى التي تستهدف علامات البروتين بلعم (على سبيل المثال، CD68، F4 / 80، ماك-1، ماك-2، ماك-3). 9،45 ومع ذلك، هذه التقنيات التصوير القياسية تتطلب معالجة الأنسجة الأبهري في المقاطع العرضية، والتي هي مضيعة للوقت وغير كامل بسبب التحيز لأخذ العينات، وتقتصر في حياتهم القدرة على تحديد الالتهاب وcalcificatايون في الشريان الأورطي كله. يصف هذا البروتوكول وسيلة لتصور وتحديد كله الأبهر والمتوسطة تكلس الشرايين وتراكم بلعم باستخدام الفلورسنت الأشعة تحت الحمراء القريبة (الجرد) التصوير الجزيئي خارج الحي. كما قدم هو طريقة للحصاد وزراعة VSMCs الأبهر الأولية من الفئران وتحريض تكلس الفئران وVSMCs البشرية في المختبر من أجل تحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأوعية الدموية تكلس. توفر هذه التقنيات المحقق مع كل من في الحي وفي أساليب المختبر لدراسة مرض atherocalcific.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وقد أجريت جميع الدراسات على الفئران بما يتفق بدقة مع التوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة. تمت الموافقة على السكن وجميع الإجراءات التي تنطوي على الفئران وصفها في هذه الدراسة من قبل مؤسسات الرعاية الحيوانية واللجان استخدم من مستشفى ماساتشوستس العام (اللجنة الفرعية للبحوث رعاية الحيوان). تم تنفيذ كافة الإجراءات مع الحرص على تقليل المعاناة.

1. إعداد الكواشف

  1. بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الإسفار التصوير من الجامعة Aortas
    ملاحظة: A-المستمدة البايفوسفونيت، بالقرب من الأشعة تحت الحمراء الفلورسنت التصوير التحقيق يمكن أن تستخدم للاحتفال النشاط عظمي المنشأ في الأوعية الدموية عن طريق ملزمة لهيدروكسيباتيت 46،47 الفلورسنت التحقيق التصوير تنشيط كاثبسين يمكن أن تكون بمثابة علامة للحصول على بروتين بلعم والنشاط حال النسيج المرن في الأوعية الدموية. 9 للسماح الاستخدام المتزامن لكلا تحقيقات الفلورسنت، فمن المهملاستخدام المجسات التي تختلف طيفيا. الكالسيوم تدوين قوائم الجرد الوطنية وسوف تستخدم للإشارة إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة التحقيق الفلورسنت التصوير وكاثبسين الجرد الوطني تكلس محددة للدلالة على كاثبسين النشاط المحدد الأشعة تحت الحمراء القريبة التحقيق الفلورسنت التصوير.
    1. إعداد الحلول من الكالسيوم الجرد الوطني وكاثبسين الجرد الوطني. وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة، إضافة 1.2 مل من 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى القارورة التي تحتوي على 24 نانومول من الكالسيوم الجرد الوطني أو كاتيبسين الجرد الوطني ويهز بلطف.
      ملاحظة: وفقا لالصانع، أعيد مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، تبقى الحلول الجرد الوطني الكالسيوم وقوائم الجرد الوطنية كاثبسين مستقرة لمدة 14 يوما عند تخزينها في الظلام في 2-8 درجة مئوية.
  2. العزلة وتكلس الفئران الأورطي VSMCs
    1. الأورطي الهضم الحل:
      1. يعد حل الطازجة (~ 3-5 مل لكل الشريان الأورطي المقطوع) مع محلول ملح هانك المتوازن (HBSS) التي تحتوي على 175 وحدة / مل نوع 2 كولاجيناز و 1.25 U / الإيلاستاز مل. تعقيم الحل ثإيث نظام الترشيح 0.22 ميكرون يحركها الفراغ والحفاظ على حل على الجليد حتى الاستخدام.
    2. وسائل الإعلام الخلية:
      1. تكملة 500 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل الجنين البقري، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.
    3. تكلس وسائل الإعلام:
      1. تكلس وسائل الإعلام و(NaPhos، وتستخدم في خطوط الخلايا الماوس):
        1. تكملة 100-500 مل من DMEM (حجم حسب الحاجة) مع 10٪ مصل الجنين البقري، 2 ملي فوسفات الصوديوم، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.

          أو
      2. تكلس وسائل الإعلام ب (βGP / تصاعدي / DEX، تستخدم إما الماوس أو خطوط الخلايا البشرية):
        1. تكملة 100-500 مل من DMEM (حجم حسب الحاجة) مع 10٪ مصل بقري جنيني، ثنائي الصوديوم 10 ملي β-الغليسروفسفات، 50 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك L-10نانومتر ديكساميثازون، و 100 وحدة / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. تدفئة وسائل الإعلام إلى 37 درجة مئوية قبل استخدامها.

2. الذيل الوريد حقن

  1. قبل الحقن الذيل، تدفئة الفئران تحت مصباح التدفئة خفيفة لمدة 5 دقائق.
  2. كبح الماوس في حامل أنبوب القوارض. تطهير الذيل مع مسحة الكحول.
  3. استخدام إبرة 30 G للحقن الوريد الذيل. وتقع الأوردة الذيل أفقيا.
    1. ضع كمية لطيف الضغط إلى الأمام على حقنة كما تقدمت الإبرة في الذيل. يتم الوصول إلى الوريد مرة واحدة المقاومة لحقن لم تعد موجودة.
    2. حقن حجم 100 ميكرولتر من الكالسيوم الجرد الوطني و / أو 100 ميكرولتر من كاثبسين الجرد الوطني بمعدل ثابت. في نهاية الحقن، بعد توقف 5 ثانية، سحب الإبرة.
  4. حصاد aortas (انظر القسم 3) 3-24 ساعة بعد الحقن.

3. ماوس تشريح

  • الموت ببطء الفأر مع 200 ملغم / كغم من حقن بنتوباربيتال داخل الصفاق.
  • وضع مستلق الحيوانات على متن تشريح والاستقرار عن طريق تسجيل كل مخلب إلى المجلس. باستخدام مجهر تشريح ومقص صغير، وجعل شق خط الوسط تمتد من أسفل البطن إلى القفص الصدري العلوي.
  • قشر العودة الجلد بالملقط وإزالة الغشاء البريتوني، وكشف عن أعضاء البطن. إزالة الأجهزة الجهاز الهضمي، مع الحرص على عدم القطع الشريان الأورطي.
  • جعل شق الجانبي في الحجاب الحاجز الأمامي ومواصلة شق في البطن. باستخدام مقص تشريح، والإفراج عن القفص الصدري من خلال قطع الجانبين من أضلاعه وإزالة تمسكا الأنسجة اللينة إلى الجزء العلوي من عظمة القص. إزالة القفص الصدري، وكشف عن الرئتين.
  • ترك القلب في المكان في البداية (للمساعدة في تحديد وتشريح الشريان الأبهر الداني) وإزالة بعناية الرئتين. إزالة الغدة الصعترية، القصبة الهوائية، والمريء مع الرعاية، ensuriنانوغرام أن الشريان الأورطي لا تزال سليمة.
  • باستخدام ملقط مباشرة الجميلة ومقص تشريح الصغيرة، وإزالة الأنسجة الناعمة المحيطة الشريان الأورطي من التشعب الحرقفي إلى قوس الأبهر، مع إيلاء اهتمام دقيق عند إزالة شبه الأبهر الدهون (الشكل 1A). إزالة الأنسجة الدهنية وغير المادية المتبقية المحيطة فروع واسعة من قوس الأبهر (أي عضدي رأسي، السباتي المشترك وتحت الترقوة الشرايين، الشكل 1B).
    ملاحظة: من المهم لإزالة الدهون من الشريان الأورطي وذلك لأن الدهون يمكن أن تزيد من إشارة الخلفية أثناء أداء التصوير مضان.
  • إزالة القلب من تجويف الصدر، فصل بعناية من الشريان الأبهر الداني، وتجاهل. القطع الأبهر القاصي في التشعب الحرقفي. باستخدام إبرة الأنسولين، حقن محلول ملحي في الشريان الأورطي من قوس الأبهر لغسل خلايا الدم المتبقية. فصل الشريان الأورطي جنبا إلى جنب مع السفن قوس الأبهر، إزالته تمامامن الجسم.
  • وضع الشريان الأورطي في محلول ملحي طبيعي على الجليد حتى جاهزة للتصوير.
  • 4. الأورطي التصوير

    1. aortas صورة فيفو السابقين مباشرة بعد الحصاد من خلال الأشعة تحت الحمراء القريبة التصوير مضان الانعكاس. 25
      1. تعيين تصوير مضان في موجات متعددة القنوات المناسبة لقياس شدة إشارة مضان من aortas من الكالسيوم الجرد الوطني وكاثبسين الجرد الوطني حقن الفئران، كما هو موضح سابقا. 25 وفقا لالصانع، نير الكالسيوم يمكن أن ولع ~ 650-678 نانومتر ضوء مع انبعاث القصوى في ~ 680-700 نانومتر النطاق. كاثبسين الجرد الوطني يمكن أن ولع ~ 745-750 نانومتر الخفيفة مع الانبعاثات القصوى في ~ 770 نانومتر.

    5. عزل الابتدائية الفئران الأورطي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

    1. تنفيذ الخطوات 3،1-3،7 كما هو موضح أعلاه.
    2. وضع aortas في HBSS الباردة حتى تشريح كاملة. قطع بعناية بعيدا أي العينيةaining الدهون محيط بالأبهر والأنسجة اللينة، ولم يتبق سوى الشريان الأورطي.
    3. تحت غطاء نسيج الثقافة العقيمة، ونقل aortas إلى الهضم الحل الأورطي في 35 ملم أطباق زراعة الأنسجة × 10 مم. مكان في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع هزاز متقطع لطيف. بعد الهضم، وaortas تبدي مظهر تمدد أو المتوترة.
    4. مع المجهر تشريح وملقط معقم، وإزالة طبقة الغلالة البرانية الخارجية من الشريان الأبهر مع الحفاظ على طبقة وسطي سليمة. أسلوب واحد لإزالة البرانية هي قشر بعيدا عن الطبقة الخارجية من الشريان الأورطي في نهاية واحدة وإزالته من طبقة وسطي الأساسية مثل جورب يمكن مقشر الظهر وإزالتها.
    5. وبمجرد إزالة طبقة الغلالة البرانية، ضع الشريان الأورطي المتبقية في طبق نسيج الثقافة الجديد مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وتخزينها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 2-4 ساعة.
    6. تحت غطاء العقيمة واستخدام معقم 3 مم مقص تشريح الصغيرة، وقطع الشريان الأورطي إلى 1-2 ملم واسعةخواتم.
    7. ضع هذه الحلقات في طبق نسيج الثقافة الجديد مع الأورطي الهضم الحل واحتضان عند 37 درجة مئوية مع متقطعة لطيف هزاز لمدة 120 دقيقة. ماصة الحل صعودا وهبوطا عدة مرات خلال هذه الحضانة ل resuspend الخلايا.
    8. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية الحار الحل الهضم ونقل إلى 15 مل أنبوب مخروطي الشكل.
    9. أجهزة الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 200 × ز.
    10. نضح في وسائل الإعلام والخلايا resuspend في حجم المطلوب من وسائل الإعلام ثقافة الخلية (على سبيل المثال، 5 مل).
    11. لوحة كامل المبلغ من الخلايا المعزولة عن بعضها الشريان الأورطي في 25 سم 2 خلية قارورة الثقافة واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. نشر الخلايا باستخدام تقنيات القياسية، كما هو موضح سابقا. 25،48 خلال 7-10 أيام الأولى من الحضانة، وتغيير وسائل الاعلام كل 72-96 ساعة. مع اقتراب الخلايا التقاء، وتجديد وسائل الإعلام أكثر في كثير من الأحيان (كل 48 ساعة).
      ملاحظة: قد يستغرق عدة أسابيع لتنمو منه كافيةntity من الخلايا.
    12. مرة واحدة متموجة، وخلايا مرور مع التربسين التي تحسنت إلى 37 درجة مئوية.
      1. إضافة 0،5-1،0 مل من التربسين إلى كل قارورة الثقافة واحتضان لمدة 3-5 دقائق. اضغط برفق على جانب قارورة كل 30-60 ثانية حسب الحاجة لفصل الخلايا من السطح.
      2. مرة واحدة فصل الخلايا من الجزء السفلي من القارورة، إضافة 10 مل من وسائل الاعلام الخلايا إلى الخلايا في التربسين. الطرد المركزي الخلايا في 200 x ج لمدة 5 دقائق. نضح في وسائل الإعلام والتربسين من بيليه الخلية. resuspend الخلايا في المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام خلية جديدة (على سبيل المثال، 5-10 مل)، ونقل إلى قارورة جديدة (مع بعض الخلايا نقلها إلى شريحة غرفة).
    13. في مرور الأول من الخلايا، تأكيد سلسة نسب الخلايا العضلية مع تقنيات مناعية القياسية، كما هو موضح سابقا، 49 استخدام أجسام مضادة موجهة ضد α السلس الأكتين العضلات.

    6. حمل تكلس العضلات الملساء مثقفخلايا

    1. لوحة الخلايا التي تم الحصول عليها من 5.12 في شكل 6 جيدا. ملاحظة: بدءا من 1 × 10 5 خلية / جيدا في إجمالي حجم 2.0 مل من وسائل الاعلام خلية في ويوصى أيضا.
    2. تسمح للخلايا أن تنمو في تكلس وسائل الإعلام A أو B لمدة 7 أيام على الأقل في شكل لوحة 6 جيدا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2.
    3. تغيير وسائل الإعلام خلية كل 48 ساعة.

    7. تقييم VSMC تكلس باستخدام فون كوسا يلطخ الطريقة

    ملاحظة: وتستند هذه الطريقة فون كوسا لقياس تكلس المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة أو الخلايا المستزرعة على إحلال أيونات الكالسيوم ملزمة الفوسفات مع أيونات الفضة 50 في وجود مركبات الخفيفة والعضوية، ويتم تخفيض أيونات الفضة وتصور كما المعدنية فضي. تتم إزالة أي الفضة غير المتفاعل عن طريق العلاج مع ثيوكبريتات الصوديوم (50) وبروتوكول لفون كوسا تلطيخ على النحو التالي:

    1. وسائل الإعلام نضح من مكعب خليةلوحات lture.
    2. إصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مل من 10٪ من الفورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    3. إزالة الفورمالين وغسل الخلايا الثابتة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
    4. احتضان الخلايا في 1 مل من 5٪ من محلول نترات الفضة تحت لمبة 60-100 W لمدة 1-2 ساعة.
    5. نضح في محلول نترات الفضة ويغسل بالماء المقطر لمدة 5 دقائق.
    6. إزالة الفضة غير المتفاعل من خلال وضع الخلايا في 1 مل من 5٪ وحمض الصوديوم (ث / ت) حل في الماء المقطر لمدة 5 دقائق.
    7. شطف الخلايا مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر يغسل 3X. وصمة عار فون كوسا مستعدة للتصوير مع معيار المجهر الضوئي المقلوب.
    8. خطوة اختيارية: مباين مع 1ml من أحمر سريع النووي لمدة 5 دقائق. اتبع هذا مع ثلاثة يغسل بالماء المقطر (5 دقائق لكل منهما).

    أو

    8. تقييم VSMC تكلس مع التصوير الفلورسنت القريبة من الأشعة تحت الحمراء

    ملاحظة: على غرار قدرتهلتحديد تكلس داخل aortas الماوس، الكالسيوم الجرد الوطني يربط بسهولة المعدنية المكلس أودعتها الخلايا المستزرعة. باستخدام هذه التقنية، المجهر الفلورسنت والقراء لوحة مع مرشحات الطول الموجي الطويل يمكن أن الصور وتحديد في المختبر تكلس، على التوالي. انبعاث الطول الموجي الطويل من الكالسيوم الجرد الوطني يسمح للاستخدام في وقت واحد من أدنى الطول الموجي fluorophores الباعثة للكشف عن غيرها من الميزات. بروتوكول للكالسيوم الجرد الوطني تلطيخ على النحو التالي:

    1. كما هو موضح في القسم 1.1.1، إضافة 1.2 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى القارورة التي تحتوي على 24 نانومول من الكالسيوم الجرد الوطني.
    2. تمييع الكالسيوم الأسهم قوائم الجرد الوطنية 1: 100 في تكلس أو مراقبة وسائل الإعلام المناسبة.
    3. وسائل الإعلام خلية نضح من لوحات ثقافة واستبدالها مع الكالسيوم قوائم الجرد الوطنية التي تحتوي على وسائل الإعلام والثقافة.
    4. احتضان لوحات الثقافة مع وسائل الإعلام الجرد الوطني الكالسيوم ليلا 37 درجة مئوية.
    5. نضح في وسائل الإعلام من الآبار، ويغسل الآبار مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: عند هذه النقطة،يمكن إضافة وسائل الإعلام ثقافة الأصلي إلى الآبار، والخلايا يمكن تصوير العيش. خلاف ذلك، انتقل إلى الخطوات التالية.
    6. إصلاح الخلايا عن طريق وضعها في 1 مل من 10٪ من الفورمالين في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
    7. إزالة الفورمالين وغسل الخلايا الثابتة مع الماء المقطر لمدة 5 دقائق. كرر يغسل 3X.
    8. خطوة اختيارية: قم بإجراء تلطيخ المناعي أو counterstains البعض للبروتينات ذات الاهتمام 8،9
    9. صورة أو كشف وصمة عار الجرد الوطني الكالسيوم باستخدام موجات مضان المناسب الإثارة (مثل قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم يمكن ولع 650-678 ضوء نانومتر) والمرشحات الانبعاثات (~ 680-700 نانومتر).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    وقد تم قياس والبرية من نوع الفئران باستخدام التصوير مضان الجرد الوطني الكالسيوم - تكلس الشريان الأورطي في مجان - /. تم الكشف عن أي إشارة الجرد الوطني الكالسيوم في aortas من البرية من نوع الفئران، مما يدل على عدم وجود تكلس (الشكل 2). تم الكشف عن إشارة الجرد الوطني الكالسيوم قوية في aortas من مجان التي تعاني من نقص الفئران، وهو ما يتسق مع تكلس الأوعية الدموية المتقدمة. أقسام الأنسجة من aortas من النوع البري ومجان - / - كانت ملطخة الفئران مع الصبغ الأحمر الأحمر 25 (الشكل 3A - B)، مما يؤكد تكلس الأوعية الدموية واسعة النطاق التي لوحظت في الفئران التي تعاني من نقص مجان مع عدم وجود تكلس الكشف في البرية من نوع الفئران. لتحديد ما إذا كان تكلس الأوعية الدموية المرتبطة نقص مجان يعتمد على BMP الإشارات، مجان - / - عولجت فئران مع LDN، ALK3-FC، أو المركبات التي تبدأ في يوم 1 من حياة. تم حقن هذه الفئران مع الكالسيوم الجرد الوطني في يوم 27 وتم حصاد aortas في اليوم التالي. تثبيط الصيدلانية من BMP اشارة خفض تكلس الشريان الأورطي الكشف مع الكالسيوم الجرد الوطني (الشكل 2). على غرار النتائج مع الكالسيوم الجرد الوطني، وaortas من LDN- وALK3-FC المعاملة مجان - / - قد الفئران خفضت الصبغ الأحمر صبغة حمراء للكالسيوم مقارنة مع المعالجة المركبة مجان - / - الفئران (الشكل 3B - D). وتشير هذه النتائج ما هو مطلوب BMP إشارات للتكلس الأوعية الدموية التي لوحظت في مجان - / - الفئران.

    LDLR - / - تغذية الفئران حمية عالية الدهون تطوير كل من التهاب بلعم وتكلس جدار الشرايين 11 في وقت واحد حقن الوريد الذيل من المكلس وكاثبسين محددة تحقيقات الجرد الوطني في مجان - / - الفئران تم تنفيذ لتحديد ما إذا كان تكلس الأوعية الدموية مجان ويرتبط -deficiency مع تراكم بلعم 25 LDLR - / - الفئران التي غذيتاستخدمت نظام غذائي والبرية من نوع الدهون عالية الفئران كما الضوابط الإيجابية والسلبية، على التوالي. Aortas من البرية من نوع الفئران أظهرت يكاد لا توجد قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم أو قوائم الجرد الوطنية كاثبسين إشارة، كما كان متوقعا (الشكل 4A). وقد لوحظت الكالسيوم قوائم الجرد الوطنية وقوائم الجرد الوطنية كاثبسين إشارات مترجمة شارك تحابي المنطقة قوس الأبهر في LDLR - / - الفئران، مما يشير إلى وجود ارتباط قوي بين تسلل بلعم وتكلس الأوعية الدموية في هذا النموذج من تصلب الشرايين باطنة. على الرغم من أن لوحظ وجود إشارة منتشر وقوائم الجرد الوطنية الكالسيوم قوي في aortas من مجان - / - الفئران، وكانت إشارة كاثبسين الجرد الوطني لا تختلف عن تلك التي البرية من نوع الفئران. وتشير هذه النتائج إلى أن تكلس الأوعية الدموية في نقص مجان يحدث في غياب تراكم بلعم. لمزيد من تأكيد هذه النتائج، aortas من النوع البري، مجان - / -، وLDLR - / - تم حصادها الفئران، مقطوع، والملون مع الأجسام المضادة المحددة للعلامة بلعم MAC-2 ( - - /. لم يكن هناك اكتشاف MAC-2 تلطيخ في aortas من مجان - / - الفئران، مما يشير إلى عدم وجود الضامة الأوعية الدموية.

    لنموذج تكلس الأوعية الدموية في المختبر، وقد تم عزل VSMCs الأبهر من النوع البري ومجان - / - الفئران وتربيتها في ارتفاع الفوسفات التي تحتوي على وسائل الإعلام، وذلك باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه. لتحديد دور مجان في تحوير تكلس VSMCs مثقف، وكان يستخدم اتش معربا مجان (Ad.MGP) لاستعادة مجان في VSMCs الأبهر من مجان - / - الفئران. واستخدمت VSMCs مجان-ناقص المصابين اتش التعبير عن بروتين الفلورية الخضراء (Ad.GFP) عن السيطرة. وبالإضافة إلى ذلك، لتحديد تأثير إزالة التعبير مجان من VSMCs على تكلس لاحق، تم علاج VSMCs الأبهر من البرية من نوع الفئران مع سيرنا الموجهة ضد مجان (siMGP) أو سيطرة سيرنا (SISC). وكان المستحث تكلس في VSMCs مثقف من خلال زراعة خلايا في تكلس وسائل الإعلام ولمدة 7 أيام. تم إصلاح الخلايا في وقت لاحق وملطخة للكالسيوم باستخدام طريقة فون كوسا. استعادة مجان مع Ad.MGP خفض تكلس مجان - / - VSMCs مقارنة للسيطرة على الخلايا المعالجة اتش (الشكل 5A - E). علاج النوع البري VSMCs الأبهر مع siMGP، مما أدى إلى> 95٪ ضربة قاضية التعبير مجان، 25 زيادة تكلس مقارنة مع الخلايا المعالجة SISC (الشكل 5C - F). وتشير هذه النتائج إلى أن هذا النموذج في المختبر من يقلد تكلس VSMC النتائج في الفئران التي تعاني من نقص مجان وتبين أن مجان ينظم تكلس VSMCs مثقف.

    طريقة بديلة للكشف عن تكلس VSMCs المثقف هو مع الكالسيوم الجرد الوطني. لنموذج تكلس الأوعية الدموية في الخامس itro، تم شراء VSMCs الشريان التاجي البشرية وتربيتها لمدة 21 يوما في تكلس وسائل الإعلام B. وبعد فترة العلاج، وتبين تكلس باستخدام طريقة الجرد الوطني الكالسيوم وكانت counterstained الثقافات مع العرف الأخضر الفلورسنت الكولاجين التحقيق 51 وهويشت صبغ (1 ميكروغرام / مل لمدة 5 دقائق بعد تثبيت في 10٪ من الفورمالين) (الشكل 6). وقد لوحظت نوى VSMC مع الأزرق مضان هويشت بواسطة المجهر متحد البؤر (الشكل 6A). ويبين القسم البصري التمثيلي الملون الجرد الوطني الكالسيوم المعدنية المكلس داخل المصفوفة الكولاجين التي تنتجها VSMCs (الشكل 6B). إعادة البناء ثلاثي الأبعاد من البصرية ض مداخن توضح الطبقات التي تم إنشاؤها في الثقافة باعتبارها VSMCs على الجزء السفلي من إنتاج جيدا مصفوفة الكولاجين الذي المعدنية المكلس المودعة يصبح محاصر (الشكل 6C - D).

    إعادة 1 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    الشكل 1: وصفت الممثل تشريح من الشريان الأورطي من البرية من نوع ماوس (أ) صورة من الصدر والشريان الأورطي البطني تمتد إلى التشعب الشريان الحرقفي المشترك بعد إزالة أجهزة المغطي والدهون شبه الأبهري. (ب) وتركز ضوء قوس الأبهر مع عضدي رأسي، غادر السباتي المشترك، والشرايين تحت الترقوة اليسرى. الحانات النطاق = 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل 2
    الشكل 2: الأوعية الدموية تكلس في مجان - / - الفئران يعتمد على BMP اشارة مجان - / - تم علاج فئران مصابة داخل الصفاق (IP) حقن إما هاء. وعولج hicle، LDN-193189 (LDN، 2.5 ملغ / كغ / يوم)، أو ALK3-FC (2 ملغ / كغ كل يوم) والبرية من نوع الفئران مع حقن الملكية الفكرية من المركبات ابتداء من يوم 1 من الحياة حتى اليوم 28 . في يوم 27، تم حقن الفئران مع قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم عن طريق الوريد الذيل. تم حصاد Aortas في يوم 28 و تصوير مع مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة. الصور هي في نفس التكبير في كل اللوحات الأربع مع شريط المقياس الذي يبين 3 مم. لم البرية من نوع aortas الماوس لا يحمل الكالسيوم نير إشارة أثناء aortas من مجان - كان الفئران قوية إشارة الجرد الوطني الكالسيوم - /. مقارنة مع المعالجة المركبة مجان - / - الفئران، وaortas من مجان - / - الفئران التي عولجت مع أي LDN أو ALK3-FC معارضها انخفاض كبير إشارات الجرد الوطني الكالسيوم. يؤخذ هذا الرقم من إشارة 25. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    الشكل (3): الصيدلانية تثبيط BMP اشارة يمنع الأورطي تكلس في الفئران مجان التي تعاني من نقص عولجوا البرية من نوع الفئران مع حقن الملكية الفكرية من السيارة (A) ومجان - / - عولجت فئران إما حقن الملكية الفكرية من السيارة (B)، LDN. (C، 2.5 ملغ / كغ / يوم)، أو ALK3-FC (D، 2 ملغ / كغ كل يوم) ابتداء من يوم 1 من الحياة حتى اليوم تم حصادها 28. Aortas، مقطوع، وملطخة للكالسيوم مع الصبغ الأحمر الأحمر. وقد أخذت صور في نفس التكبير في كل اللوحات الأربع مع شريط المقياس الذي يبين 400 ميكرون. على غرار إشارات الجرد الوطني الكالسيوم في الشكل 2، وتلطيخ الأحمر الصبغ الأحمر يوضح عبئا ثقيلا من تكلس في aortas من المعالجة المركبة مجان - / - الفئران. وانخفض تكلس في aortas من LDN- وALK3-FC المعاملة مجان - / - الفئران. يؤخذ هذا الرقم منمرجع 25. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (4)
    . الشكل 4: تحديد وقت واحد من الأورطي تكلس وبلعم تسلل مع الكالسيوم الجرد الوطني وكاتيبسين الجرد الوطني (أ) من النوع البري، مجان - / -، وLDLR - / - الفئران التي غذيت اتباع نظام غذائي عالي الدهون وحقن الكالسيوم الجرد الوطني وكاثبسين الجرد الوطني عبر ذيل حقن الوريد. تم حصاد Aortas بعد 24 ساعة وتقييمها مع التصوير مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة. الصور هي في نفس التكبير مع شريط المقياس الذي يبين 3 مم. البرية من نوع الفئران تبدي عمليا أي تكلس الشريان الأورطي أو وجود بلعم. وaortas من LDLR - / - الفئران لها تكلس واسعة النطاق التي تشارك في يموضع مع تراكم البلاعم. في المقابل، مجان - / - الفئران يكون تكلس الشريان الأبهر الذي يحدث في حالة عدم وجود تسلل بلعم. تم حصادها (ب) Aortas من النوع البري، مجان - / -، وLDLR - / - تغذية الفئران حمية عالية الدهون. ومقطوع هذه aortas وملطخة للالضامة مع الأجسام المضادة المحددة لMAC-2. كانت ملطخة النوى مع دابي. سطح lumenal هو نحو اليمين في كل لوحة. وقد أخذت صور في نفس التكبير في كل اللوحات الثلاث مع شريط المقياس الذي يبين 100 ميكرون. على غرار النتائج في الفقرة (أ)، لم يكن هناك أي دليل على تراكم البلاعم في aortas من مجان - / - الفئران. هذا الرقم هو نسخة معدلة من شخصية من مرجع 25. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    .jpg و"/>
    . الرقم 5: مجان يحمي VSMCs مثقف من تكلس تم عزل VSMCs الأبهر مثقف من مجان - / - الفئران والمصابين اتش يعبرون إما GFP (A) أو مجان (B). و transfected VSMCs الأورطي معزولة من النوع البري الفئران إما السيطرة سارعت سيرنا (C) أو سيرنا استهداف مجان (D). وقد نمت الخلايا في تكلس وسائل الإعلام ولمدة 7 أيام، وبعد ذلك ثابتة وملطخة فون كوسا. أخذت الصور في نفس التكبير في كل اللوحات الأربعة (A - D) مع شريط المقياس الذي يبين 200 ميكرون. صورت حقول المسلسل عرض وكميا لتلطيخ الكالسيوم باستخدام صورة J البرامج بعد الطرح الخلفية (E و F)، مع أشرطة الخطأ تشير SEM. هذا الرقم هو نسخة معدلة من شخصية من مرجع 25.4017fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الشكل (6)
    الرقم 6: الكالسيوم الجرد الوطني يحدد تكلس في جمعية مع مصفوفة خارج الخلية في المختبر (A) مثقف VSMCs الشريان التاجي الإنسان في تكلس وسائل الإعلام ب لتم تحديد 21 يوما عن طريق تلطيخ النووي باستخدام هويشت صبغ. (ب) قسم الضوئية التي تم الحصول عليها بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر من نير الكالسيوم تلطيخ (الحمراء) جنبا إلى جنب مع الكولاجين التحقيق الأخضر الفلورسنت يظهر المعدنية المكلس في جميع أنحاء مصفوفة الكولاجين. صور أ - اتخذت B في نفس التكبير مع شريط المقياس الذي يبين 10 ميكرون. (C و D) إعادة البناء ثلاثي الأبعاد تظهر انحباس المعدنية المكلس في رانه الكولاجين مصفوفة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    تكلس الشرايين هو عامل خطر مهم للإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية في البشر ويمكن أن تسهم بصورة مباشرة في التسبب في أحداث القلب والأوعية الدموية. وقد اقترح 1،5،52 باطنة ترسب الكالسيوم في مباراة دولية ليفية رقيقة من مرض تصلب الشرايين لزيادة التوتر النشاط الحيوي المحلي والمساهمة في تمزق الترسبات. 53،54 الآثار تكلس الإنسي النتائج السريرية من خلال زيادة صلابة الشرايين، والتي يمكن أن تحدث تضخم القلب وتؤثر على وظيفة القلب. 55 لذلك، فهم الآليات الجزيئية التي تكمن وراء تكلس الأوعية الدموية وتوفير نظرة ثاقبة الأمراض التي تصيب البشر، وربما تحديد أهداف جديدة ل العلاج.

    هنا، يتم وصف طريقة للكشف عن تكلس الشريان الأورطي وتراكم بلعم في نماذج الفئران من تصلب الشرايين وتكلس الأوعية الدموية باستخدام NIRF التصوير. 9 ومن الأهمية بمكان لحقن بدقة الجرد الوطنيوكلاء F في الوريد الذيل. هذا هو الاسلوب الذي يتطلب ممارسة كبيرة قبل أن يتحقق إتقان. 56 بالإضافة إلى ذلك، فمن المهم لإزالة جميع الدهون شبه الأبهر من الشريان الأبهر، وهذه الدهون يمكن أن يسبب إشارة autofluorescent في نفس الموجة مثل قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم وكاثبسين إشارات الجرد الوطني. استخدام وكلاء NIRF العديد من المزايا الهامة على طرق نسيجية القياسية لتقييم تكلس الأوعية الدموية والالتهابات. وعلى النقيض من التقنيات النسيجية التقليدية، تسمح هذه العوامل الكمي للتكلس الشريان الأورطي كله وتسلل بلعم. وعلاوة على ذلك، لأنها توفر طريقة أكثر حساسية للكشف عن تغيرات المبكرة المرتبطة تطوير تكلس الشريان الأبهر من تلطيخ نسيجية، وبالتالي يمكن أن تقدم رؤى الآلية في المراحل الأولى من المرض. وترتبط 9 مواقع في وقت مبكر من إشارة الجرد الوطني الكالسيوم مع علامات تكوين العظام بما في ذلك زيادة النشاط الفوسفاتيز القلوية وأهلا وسهلال كتعبير Runx2 وosteopontin الجينات. وعلاوة على ذلك، فإن الاستخدام المتزامن لتحقيقات متميزة طيفيا للتكلس والنشاط كاثبسين تمكن الكمي وجمعية التقدم الزماني المكاني لكل من مرض عصيدي والمكلس. 9

    التعرف على الخصائص المكانية والزمانية من الأوعية الدموية تكلس والتهاب يساعد في فهمنا للآليات الفسيولوجية المرضية الكامنة وراء أمراض الأوعية الدموية. على سبيل المثال، أظهر استخدام وكلاء NIRF أنه في نماذج من تكلس باطنة (APOE - / - وLDLR - / - الفئران على نظام غذائي عالي الدهون)، تكلس المشارك يموضع لمواقع تراكم بلعم الأوعية الدموية (الشكل 4) و أن تكلس في أعقاب تراكم الضامة زمنيا. 9،11 ومن المثير للاهتمام، تم الكشف عن أي تراكم بلعم مع كاثبسين الجرد الوطني في تكلس الأوعية الدموية وسطي وجدت في الفئران التي تعاني من نقص مجان 25 الخميسالصورة، من التجارب باستخدام وكلاء NIRF، فإنه يمكن أن نخلص إلى أنه على الرغم من ويرتبط تراكم بلعم مع تكلس الأوعية الدموية باطنة، لا يطلب منه عن تكلس الأوعية الدموية وسطي.

    على غرار دورها في التصوير ودراسة أمراض الأوعية الدموية، وقد استخدمت NIRF التصوير لدراسة أمراض الصمام الأبهري. يتم وضع علامة 47 مرض الصمام الأبهر بواسطة البلاعم والمكلس الآفات الدهون المحملة على صمام والمعارض الآليات الجزيئية الكامنة مماثلة والمحددات الوراثية باسم تصلب الشرايين . يتسبب 57-59 الأبهر صمام تكلس الضعف في وظائف النشرة وهو السبب الرئيسي للتضيق الأبهر السريري في كبار السن. والعلاج الوحيد المتاح حاليا لتضيق الأبهر أعراض هي استبدال الصمام. فهم أفضل للآليات الجزيئية للأمراض الصمام الأبهري ضروري لمنع-مرحلة متأخرة المضاعفات السريرية للالتدريجي تكلس الصمام الأبهري. استخدام NIوكلاء RF كأدوات التصوير الجزيئي في النماذج الحيوانية يوفر طريقة حساسة لتقييم مرض الصمام الأبهري في مراحله المبكرة. 60

    تقنيات القياسية لتصور وركزت ويحات الشريان التاجي على شدة ضيق، ولكن الغالبية العظمى من متلازمة الشريان التاجي الحادة ينتج عن تمزق لويحات غير مما يحد من تدفق 6 عمليات البيولوجية داخل لويحات، مثل التهاب، بمثابة تنبؤ أفضل من تمزق اللوحة من درجة التضيق. 61 وعلى عكس تقنيات التصوير التقليدية، ويوفر NIRF التصوير فرصة لقياس النشاط الخلوي (أي نشاط بروتين بلعم مع الفلزي المصفوفة (MMP) وكيل activatable، النشاط بروتين وحال النسيج المرن مع كاثبسين الجرد الوطني، والنشاط عظمي المنشأ مع قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم). 9 هذه الطريقة بالتالي يوفر التقييم الوظيفي والتشريحي وقت واحد من أمراض القلب والأوعية الدموية. NIRF التصوير يستخدم البريدموجات xcitation في نطاق 650-900 نانومتر، والتي لديها ميزة زيادة اختراق الأنسجة مقارنة للضوء عند طول موجي أقل، وبالتالي السماح لمزيد من تقييم متعمق للآفات المرض. 60 وهناك أيضا انخفاض إشارة الخلفية autofluorescent من الأنسجة الوعائية في المستقبل القريب نطاق الطول الموجي -infrared. على الرغم من أن هذا البروتوكول يركز على استخدام NIRF التصوير خارج الحي، ويمثل NIRF التصوير أيضا منبرا مفيدا للتصوير الجزيئي الطولي في الجسم الحي. التصوير 9 NIRF، وعندما يقترن intravital المجهري، قد تكون لها تطبيقات التشخيص المستقبلية في البشر. 61 ومع ذلك، وجود قيود من الكالسيوم التصوير الجرد الوطني طوليا هو أن التحقيق المستمدة البايفوسفونيت في حد ذاته قد يغير العملية الفسيولوجية للتكلس. 62

    تكلس القلب والأوعية الدموية هي عملية تنظيم بنشاط ينطوي على transdifferentiation من VSMCs إلى النمط الظاهري عظمي المنشأ. 25،41،42 63 وحققت أعداد كافية من الخلايا في الشريان الأورطي الفئران لإجراء الدراسات في المختبر (الشكل 5). ولي بديللا تنطوي ثود لعزل VSMC الهضم الأنزيمي ولكن بدلا من ثقافة المباشرة لحلقات الأبهري explanted. تم الإبلاغ عن هذه التقنية لانتاج خلايا أقل من التقنية باستخدام الهضم الأنزيمي. 63،64

    اثنان وسائل الإعلام تكلس مختلفة، إما مع βGP / تصاعدي / DEX 65،66 أو NaPhos، 25،43 موصوفة التي يمكن استخدامها للحث على تكلس VSMCs. وقد استخدمت كلا النوعين من وسائل الإعلام إلى كلس VSMCs الفئران مع نجاح ما يعادلها. في حين أن وسائل الإعلام تكلس تحتوي على βGP / تصاعدي / استخدمت التنفيذ المباشر للكلس VSMCs الإنسان (الشكل 6)، لم تكن وسائل الإعلام التي تحتوي على NaPhos فعال في التكلس VSMCs الإنسان في تجربتنا. وعلاوة على ذلك، 21 - قد تكون هناك حاجة 28 يوما من ثقافة VSMCs الإنسان في تكلس وسائل الإعلام ب قبل أن يتم الكشف عن تكلس. تم زيادة تكلس البرية من نوع VSMCs في المختبر عندما تم تخفيض مستويات التعبير من مجان مع سيرنا وcalcificatiعلى خفض في مجان - / - VSMCs عندما أعيد مجان التعبير (الشكل 5). هذه النتائج تتفق مع تكلس الشريان الأبهر لوحظ في مجان - / - الفئران وتشير إلى أن هذا الأسلوب في المختبر من VSMC تكلس نموذجا مفيدا للفي الجسم الحي تكلس. ومن المهم أن نلاحظ، مع ذلك، أن هناك قيودا في رسم استنتاجات بشأن الأوعية الدموية سليمة من VSMCs مثقف. قد تفقد VSMCs مثقف في الجسم الحي خصائص مقلص، وخاصة في الممرات العليا، بالإضافة إلى تطوير التغييرات في أنماط التعبير الجيني، مورفولوجيا، وصلابة. 67-70 VSMCs مثقف في التكلس وسائل الإعلام لا نفرق إلى النسب بانية للعظم قبل تكلس، ولكن لا تظهر وسيطة chondrocytic التي كثيرا ما لوحظ في الجسم الحي. 71 ولذلك فمن المهم أن الاستنتاجات الميكانيكية المستمدة من الخلايا المستزرعة يمكن التحقق من صحة نظم في الجسم الحي. علىالبريد الطرق المحتملة للتغلب على هذا القيد هو دراسة VSMCs في دولتهم في الجسم الحي باستخدام حلقة السفينة سليمة مثقف. 70

    يتم عرض طريقتين مختلفتين للكشف عن تكلس VSMCs مثقف، وطريقة فون كوسا (الشكل 5)، وتلطيخ الجرد الوطني الكالسيوم (الشكل 6). على الرغم من أن كثيرا ما تستخدم لتقييم للتكلس، هو الأسلوب فون كوسا محدودة نوعا ما من انخفاض خصوصيته لبلورات الكالسيوم. 50 الكالسيوم يشعر قوائم الجرد الوطنية لتكون محددة للتكلس وهو مفيد بشكل خاص لأنه يتيح لتلطيخ المتزامن مع إضافي الفلورسنت طيفيا، متميزة وكلاء 9 التطبيقات المستقبلية لهذا البروتوكول استخدام قوائم الجرد الوطنية الكالسيوم مع تحقيقات الجزيئية إضافية يمكن أن توفر معلومات هامة في آليات تكلس وقد تمكن التقييم السريع للمثبطات جزيء صغير من VSMC تكلس بطريقة الإنتاجية العالية، إلى بيئة تطوير متكاملةntify علاجات جديدة محتملة للتكلس الأوعية الدموية.

    وباختصار، تكلس القلب والأوعية الدموية هو عامل خطر مهم للومساهم محتمل للأمراض السريرية. معرفة آليات تكلس القلب والأوعية الدموية ومرض تصلب الشرايين يعتمد على كل من النماذج القائمة على الخلية الحيوانية و. منهجيات لتقييم تكلس في في الجسم الحي، خارج الحي، وفي المختبر نماذج حاسمة لتعزيز فهمنا لمرض القلب والأوعية الدموية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129, (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103, (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114, (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291, (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47, (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3, (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119, (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116, (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14, (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32, (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386, (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31, (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96, (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21, (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24, (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142, (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48, (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9, (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17, (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6, (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33, (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55, (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65, (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10, (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4, (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25, (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109, (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97, (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107, (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91, (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23, (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586, (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20, (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283, (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199, (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30, (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18, (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14, (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19, (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104, (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110, (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89, (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67, (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19, (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115, (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56, (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350, (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99, (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12, (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39, (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312, (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368, (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90, (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108, (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29, (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101, (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23, (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59, (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308, (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19, (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49, (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104, (6), 710-711 (2009).
    تكلس الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء والتصوير من الأورطي تكلس والتهاب
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter