Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Обызвествление сосудистых гладких мышечных клеток и визуализации аортальной кальцификации и Воспаление

Published: May 31, 2016 doi: 10.3791/54017
Automatic Translation
*1, *1,2, 3,4, 2, 1, 2, 1, 1, 1, 1,4, 1,4, 2,4, 1,2,4, 5, 1,4, 3,4, 1,2,4, 3,4, 1,5,6, 2,4
1Anesthesia Center for Critical Care Research of the Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Cardiovascular Research Center and Cardiology Division of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital, 3Cardiovascular Division, Brigham and Women's Hospital, 4Harvard Medical School, 5Department of Anesthesiology, Uniklinik RWTH Aachen, RWTH Aachen University, 6Center for Immunology and Inflammatory Diseases and the Division of Rheumatology, Allergy, and Immunology of the Department of Medicine, Massachusetts General Hospital
* These authors contributed equally

Introduction

Сердечно - сосудистые заболевания являются ведущей причиной заболеваемости и смертности в мире, в том числе в Соединенных Штатах , где на его долю приходится более 780000 смертей ежегодно. 1 коронарного кальциноза артерии и кальцификации аорты являются отличительными чертами атеросклеротической болезни и служат сильные предикторы сердечно - сосудистых событий. 2- 4 Два основных типа сосудистой кальцификации было зарегистрировано у взрослых: интимы кальцификации, связанный с атеросклерозом, и медиальную (также известный как Монкеберг) кальцификации, связанной с хроническим заболеванием почек и диабетом 5 интимы кальцификации происходит в условиях накопления липидов и макрофагов. инфильтрация в стенку сосуда. 5,6 медиальной стенки кальцификации происходит независимо от интимы кальцификации, локализуется эластических волокон или гладких мышечных клеток, и не связано с отложением липидов или макрофагальной инфильтрации. 5,7,8 Исследования по выяснению молекулярных механизмовсосудистой кальцификации полагались на модельных системах на основе клеток и животных. Грызун модели для atherocalcific заболевания включают мышей с дефицитом в любом аполипопротеина Е (ApoE) 9,10 или липопротеинов низкой плотности рецептора (LDLR) 11 кормили высоким содержанием жиров, в то время как модели для медиальной кальцификации включают мышей с матрицы Gla белка (MGP) дефицит 12 или крыс , которые развиваются уремии либо почти полной нефрэктомии (нефрэктомии модель 5/6 - е) или под воздействием высокой аденин диеты. 13

Здесь, модель медиальной сосудистой кальцификации, связанной с дефицитом MGP сосредоточен на. MGP является внеклеточным белком , который ингибирует артериальной кальцификации. 12 Мутации в гене MGP были идентифицированы при синдроме Keutel, редким заболеванием человека характерны диффузные хрящевой кальцификации в дополнение к brachytelephalangy, потеря слуха, а также периферийное стеноза легочного. 14-18 Хотя не часто наблюдается, 19концентрические кальцификации нескольких артерий было описано при синдроме Keutel. 20 Общие полиморфизм в гене MGP человека связаны с повышенным риском развития кальцификации коронарных артерий, 21-23 , а более высокие уровни циркулирующих uncarboxylated, биологически неактивного MGP предсказывают сердечно - сосудистой смертности. 24 В отличие от людей с синдромом Keutel, MGP-дефицитных мышей разработать сильную сосудистую фенотип , состоящий из спонтанного широко распространенного артериальной кальцификации , начиная с двухнедельного возраста и умирают через 6-8 недель после родов из - за разрыва аорты. 12

В отличие от АроЕ - / - и LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров, которые развиваются интимы сосудистой кальцификации с ассоциированной макрофаг-индуцированной воспалением, MGP - / -. Мыши развивают медиальной сосудистой кальцификации при отсутствии инфильтрации макрофагами 11,25 Хотя эти данные свидетельствуют различные базовые стимулы для интимомаль и медиальная кальцификация, существует перекрытие в сигнальных механизмов , которые обеспечивают обе формы кальцификации. 26 Несколько сигнальных путей были идентифицированы , которые способствуют сосудистой кальцификации в том числе воспалительных медиаторов , таких как фактор некроза опухоли-альфа и IL-1 и про-остеогенных факторов такие как Notch, Wnt и костного морфогенетического белка (BMP) сигналов. 27,28 Эти сигнальные пути увеличивают экспрессию факторов транскрипции Рунт связанных фактора транскрипции 2 (RUNX2) и Osterix, что , в свою очередь , увеличивают экспрессию белков костной ткани ( . например, остеокальцина, sclerostin и щелочной фосфатазы) в сосудистую сеть , переносчики кальцификации 28-30 Мы и другие показали , что сосудистая кальцификация наблюдается в АроЕ - / - и LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров и спонтанная сосудистой кальцификации наблюдается у MGP - / - мышей все зависит от костного морфогенетического белка (BMP) SIgnaling, и именно этот путь , который ориентирован на здесь. 11,25,31 ВМР являются мощными остеогенных факторов , необходимых для формирования костной ткани и , как известно, проявляют повышенную экспрессию в человеческом атеросклерозе. 32-34 В пробирке исследования указывают на передачу сигналов BMP в регулировании выражение остеогенных факторов , таких как Runx2. 35-37 Избыточная экспрессия лиганда BMP, BMP-2, ускоряет развитие кальциноза сосудов в АпоЕ-дефицитных мышей , которых кормили диеты с высоким содержанием жира. 38 Кроме того, использование специфического BMP ингибиторы , такие сигнализации в качестве LDN-193189 (LDN) 39,40 и / или алк3-Fc предотвращает развитие сосудистой кальцификации в обоих LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров и MGP-дефицитных мышей 11,25.

Сосудистые клетки гладких мышц (VSMCs) играют важную роль в развитии сосудистой кальцификации. 30,41,42 медиальной кальцификации сосудов , которая развивается в MGP-дефицитных мышей является характеритеризуется трансдифференцировкой VSMCs к остеогенной фенотипа. Потеря результатов MGP к снижению экспрессии маркеров VSMC включая myocardin и альфа-актин гладких мышц, с одновременным повышением остеогенных маркеров, таких как Runx2 и остеопонтина. Эти изменения совпадают с развитием сосудистой кальцификации. 25,43,44

Аортальный кальциноз и воспаление у мышей , как правило , оцениваются с использованием гистохимических методов , таких как активность щелочной фосфатазы для ранней кальцификации и остеогенной активности, фон Косса и ализарин красный окрашивание на конце кальцификации и иммуногистохимических протоколов , которые нацелены на макрофаги белковые маркеры (например., CD68, F4 / 80, Mac-1, Mac-2, Mac-3). 9,45 Тем не менее, эти стандартные методы визуализации требуют обработки аортального тканей в поперечных сечений, который отнимает много времени и несовершенным из - за смещения выборки, и ограничены в своих возможность количественной оценки воспаления и calcificatиона в целом аорте. Этот протокол описывает способ визуализировать и количественно весь аортальный и среднего артериального кальцификации и макрофагами накопление с использованием ближней инфракрасной флуоресцентные (NIR) молекулярной визуализации ех естественных условиях. Также предложен способ сбора и культивирования первичных аортальных VSMCs от мышей и индуцируя кальциноз мышиных и человеческих VSMCs в пробирке для того , чтобы определить молекулярные механизмы , лежащие в основе сосудистой кальцификации. Эти методы обеспечивают исследователю как в естественных условиях и в пробирке методов изучения atherocalcific заболевания.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все исследования на мышах были проведены в строгом соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Корпус и все процедуры, связанные с мышей, описанных в данном исследовании были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитетов Massachusetts General Hospital (подкомитетом по научным исследованиям уходу за животными). Все процедуры были выполнены с осторожностью, чтобы свести к минимуму страдания.

1. Приготовление реагентов

  1. Ближней ИК-флуоресценция Визуализация всей аорте
    Примечание:. Бисфосфоната происхождения, в ближней инфракрасной области зонда флуоресцентных изображений может быть использован для обозначения остеогенной активности в сосудистую сеть путем связывания с гидроксиапатитом 46,47 катепсина активированные флуоресцентного зонда формирования изображения может служить маркером для макрофагальной протеолитических и эластолитической активности в сосудистая сеть . 9 Чтобы разрешить одновременное использование обоих флуоресцентных зондов, важноиспользовать зонды, которые спектрально различны. Обозначение кальция НДК будет использоваться для обозначения кальцификации конкретных ближней инфракрасной области зонда флуоресцентных изображений и катепсина NIR для указания относительно катепсина активности конкретного ближнего инфракрасного зонда флуоресцентных изображений.
    1. Готовят растворы кальция НДК и катепсина НДК. В соответствии с протоколами производителя, добавьте 1,2 мл 1х фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в пробирку, содержащую 24 нмоль кальция NIR или катепсина NIR и слегка встряхнуть.
      Примечание: Согласно данным производителя, после разведения с PBS, НДК кальция и катепсина NIR растворы остаются стабильными в течение 14 дней при хранении в темноте при температуре 2-8 ° C.
  2. Выделение и Обызвествление мышиной Аортальной VSMCs
    1. Расслоение Пищеварение Решение:
      1. Приготовить свежий раствор (~ 3-5 мл на аорте собирают) с Хенка сбалансированный солевой раствор (HBSS), содержащий 175 Ед / мл 2 Типа коллагеназы и 1,25 ед / мл эластазы. Стерилизовать решение шIth вакуумным приводом системы фильтрации 0,22 мкм и держать раствор на льду до момента использования.
    2. Сотовый Медиа:
      1. Дополнение 500 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Подогреть носитель до 37 ° C перед использованием.
    3. Кальцификация СМИ:
      1. Кальцификация Медиа A (NaPhos, используемый в клеточных линиях мыши):
        1. Дополнение 100-500 мл DMEM (объем в случае необходимости) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ фосфат натрия, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Подогреть носитель до 37 ° C перед использованием.

          ИЛИ
      2. Кальцификация Медиа B (βGP / Asc / DEX, используется либо мыши или клеточных линий человека):
        1. Дополнение 100-500 мл DMEM (объем по мере необходимости) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 10 мМ β-глицерофосфата динатрия, 50 мкг / мл L-аскорбиновой кислоты, 10нмоль дексаметазон, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Подогреть носитель до 37 ° C перед использованием.

2. хвостовую вену для инъекций

  1. Перед инъекцией хвост, согревать мышей под мягким нагревательной лампой в течение 5 мин.
  2. Сдерживайте мышь в держателе трубки с грызунами. Лечить хвост с тампоном, смоченным спиртом.
  3. Используйте 30 G иглу для инъекции в хвостовую вену. Хвостовые вены расположены в боковом направлении.
    1. Нанесите нежную количество давление вперед на шприце, как игла продвигается в хвост. Жила не доступен, как только сопротивление инъекции больше не присутствует.
    2. Придать объем 100 мкл кальция НДК и / или 100 мкл катепсина НДК с постоянной скоростью. В конце инъекции, после паузы 5 сек, извлечение иглы.
  4. Урожай (см аорты раздел 3) 3-24 ч после инъекции.

3. Мышь Вскрытие

  • Эвтаназии мышь с 200 мг / кг внутрибрюшинно пентобарбиталом инъекцией.
  • Положите животное на спине на рассечение борту и стабилизировать пластырем каждую лапу к доске. Использование рассекает микроскоп и маленькие ножницы, сделать срединный разрез, проходящий от нижней части живота до верхней части грудной клетки.
  • Отогните кожи с пинцетом и удалить брюшины, открывая органы брюшной полости. Удалите органы желудочно-кишечного тракта, следя за тем, чтобы не секут аорту.
  • Делают боковой разрез в передней диафрагмы и продолжить разрез через живот. Использование рассечение ножницами, освободить грудную клетку путем разреза по бокам ребер и удаления прилипших мягких тканей в верхней части грудины. Удалите грудную клетку, открывая легкие.
  • Оставьте сердце на месте первоначально (для помощи в выявлении и рассечения проксимального аорту) и осторожно удалить легкие. Удалите тимус, трахею и пищевод с осторожностью, ensuriнг, что аорта остается неизменным.
  • Используя прямые тонких щипцов и микро-рассечение ножницами, удалить мягких тканей , окружающих аорту из подвздошной бифуркации к дуге аорты, обращая особое внимание при снятии пери-аортальный жира (Фигура 1А). Удалите остатки жира и мягких тканей , окружающих крупные ветви дуги аорты (то есть, брахиоцефальных, общей сонной и подключичной артерий, рис 1B).
    Примечание: Важно, чтобы удалить жир из аорты, потому что жир может увеличить фоновый сигнал при выполнении флуоресцентных изображений.
  • Удалите сердце из грудной полости, тщательно ее отсоединении от проксимального отдела аорты, и выбросьте. Трансекте дистального аорту в подвздошной бифуркации. С помощью иглы инсулина, вводят физиологический раствор в аорту от дуги аорты, чтобы смыть оставшиеся клетки крови. Отделить аорту вместе с дуги аорты сосудов, полностью удаляя егоиз организма.
  • Поместите аорту в нормальном солевом растворе на льду до готовности для работы с изображениями.

    • 4. аортального изображений

    1. Image Аорты ех естественных условиях сразу после сбора урожая с помощью ближней инфракрасной флуоресценции отражательной томографии. 25
      1. Установите флуоресцентный томограф в соответствующих многоканальных длин волн для количественного определения интенсивности флуоресценции сигналов от аорте кальция НДК и катепсина NIR-впрыскивается мышей, как описано ранее. 25 По данным производителя, БИК кальция могут быть возбуждены ~ 650-678 нм света с максимальное излучение в ~ 680-700 нм диапазоне. Катепсина NIR могут быть возбуждены ~ 745-750 нм света с максимальным излучением при ~ 770 нм.

    5. Выделение первичного мышиного аортального гладких мышц сосудов клеток

    1. Выполните шаги 3,1-3,7, как было описано выше.
    2. Поместите в холодную аорты HBSS до тех пор, пока диссекция завершены. Аккуратно срежьте любой бэрAining periaortic жир и мягкие ткани, оставляя только аорту.
    3. Под стерильной капот культуры ткани, передают к аорты Аортальной Пищеварение раствора в 35 мм х 10 мм культуры тканей блюда. Место в инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 30 мин при осторожном прерывистого покачиванием. После пищеварения, аорты обнаруживают растянутую или перетертый внешний вид.
    4. С микроскопом рассечение и стерильным пинцетом, снимите внешний слой адвентиции аорты, сохраняя при этом медиальной слой остается неповрежденным. Один из способов удаления адвентиции является отслаиваться внешний слой аорты на одном конце и удалите его из основного медиального слоя, как носок может быть очищенными назад и удалены.
    5. После того , как адвентиции слой был удален, поместите оставшиеся аорту в новую культуру ткани Петри с среды для культивирования клеток и хранят при температуре 37 ° С с 5% CO 2 в течение 2-4 ч.
    6. Под капотом стерильной и с использованием стерильных 3 мм микро-рассечение ножницами, вырезать аорту в 1-2 мм ширинойкольца.
    7. Поместите эти кольца в новой культуре ткани блюдо с аневризмой Пищеварение раствора и инкубировать при температуре 37 ° С при осторожном прерывистый качалки в течение 120 мин. Внесите вверх и вниз раствор несколько раз во время инкубации для ресуспендирования клеток.
    8. Добавьте 5 мл теплой среды для культивирования клеток в растворе пищеварения и переноса в 15 мл коническую трубку.
    9. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 200 х г.
    10. Аспирируйте СМИ и ресуспендирования клеток в нужном объеме клеток медиакультуры (например, 5 мл).
    11. Пластинчатые всю сумму выделенных клеток из каждой аорты в 2 клеток колбу культуры 25 см и инкубировать при температуре 37 ° С с 5% CO 2. Размножаются клетки с использованием стандартных методов, как описано выше. 25,48 В течение первых 7-10 дней инкубации, измените носитель каждый 72-96 час. По мере того как клетки приближаются слияния, пополнения СМИ чаще (каждые 48 ч).
      Примечание: Это может занять несколько недель, чтобы вырастить достаточное количество кваntity клеток.
    12. После того, как сливающиеся, прохождение клеток с помощью трипсина , который нагревают до 37 ° С.
      1. Добавить 0.5-1.0 мл трипсина в каждую колбу культуры и инкубировать в течение 3-5 мин; слегка постучать по стенке колбы каждые 30-60 сек по мере необходимости, чтобы отделить клетки от поверхности.
      2. После того, как клетки отделяются от дна колбы, добавляют 10 мл клеточных сред к клеткам в трипсин. Центрифуга клетки при 200 мкг в течение 5 мин. Аспирируйте СМИ и трипсина из клеточного осадка. Ресуспендируют клеток в необходимом количестве свежей среды клеток (например, 5-10 мл) и переносят в новую колбу (с некоторыми клетками переносили в камеру слайде).
    13. При первом прохождении клеток, подтверждают происхождение клеток гладких мышц , с помощью стандартных методов иммуноцитохимию, как было описано ранее, 49 с использованием антитела , направленные против альфа-актин гладких мышц.

    6. побуждающих Обызвествление культивированный Гладкие мышцыячейки

    1. Пластинчатые клетки, полученные из 5,12 в формате 6-луночного. Примечание: Начиная с 1 х 10 5 клеток / лунку в общем объеме 2,0 мл клеточной среды на рекомендуется хорошо.
    2. Разрешить клеткам расти в кальцификации СМИ А или В, по крайней мере, 7 дней в формате пластины 6-луночного. Инкубируйте клетки при 37 ° С с 5% CO 2.
    3. Изменение клеточной среды каждые 48 часов.

    7. Оценка VSMC кальцификации Использование фон Косса Окрашивание метод

    Примечание:. Метод фон Косса для измерения внеклеточного матрикса кальцификации тканей или культивированных клеток на основе замещения фосфата переплете ионов кальция с ионами серебра , 50 в присутствии света и органических соединений, ионы серебра восстанавливаются и визуализируется в виде металлического Серебряный. Любой непрореагировавший серебро удаляется путем обработки раствором тиосульфата натрия 50 Протокол фон Косса окрашивания выглядит следующим образом .:

    1. Аспирируйте средств массовой информации из ячейки у.е.lture пластины.
    2. Закрепить клетки, помещая их в 1 мл 10% -ного формалина при комнатной температуре в течение 20 мин.
    3. Удалите формалина и промыть фиксированные клетки с дистиллированной водой в течение 5 мин.
    4. Инкубируйте клеток в 1 мл 5% -ного раствора нитрата серебра в рамках 60-100 Вт с в течение 1-2 ч.
    5. Аспирируйте раствор нитрата серебра и промывают дистиллированной водой в течение 5 мин.
    6. Удаления непрореагировавшего серебра путем размещения клеток в 1 мл 5% -ного тиосульфата натрия (вес / об) раствор в дистиллированной воде в течение 5 мин.
    7. Промыть клетки с дистиллированной водой в течение 5 мин. Повторить смывает 3x. Пятно фон Косса готова для работы с изображениями со стандартной перевернутой световой микроскопии.
    8. Необязательный шаг: контрастирующая с 1мл ядерной быстрой красной в течение 5 мин. Следуйте за этим с тремя промывок дистиллированной водой (5 мин каждая).

    ИЛИ

    8. Оценка VSMC кальцификации с ближней инфракрасной флуоресцентных изображений

    Примечание: Как и его способностидля выявления кальцификации в аорте мышей, кальция NIR легко связывает кальциевые минералом, отложенным культивируемыми клетками. Используя эту технику, флуоресцентной микроскопии и читателей пластины с длинными фильтрами длины волны могут изображения и количественно кальцификации в пробирке, соответственно. Длинное излучение длины волны кальция NIR позволяет одновременно использование нижней длины волны, испускающих флуорофоров для обнаружения других функций. Протокол для кальция NIR окрашивания выглядит следующим образом:

    1. Как описано в разделе 1.1.1, добавляют 1,2 мл 1x PBS во флакон, содержащий 24 нмоль кальция НДК.
    2. Развести кальция NIR запас 1: 100 в соответствующих кальцификации или контроля средств массовой информации.
    3. Отберите клеток среду из культуры пластин и заменить с кальцием NIR-содержащей питательные среды.
    4. Инкубируйте культуральные планшеты с NIR кальция сред в течение ночи при температуре 37 ° С.
    5. Аспирируйте носитель из лунок и промыть лунки один раз PBS.
      Примечание: На данный момент,оригинальные культуральные среды могут быть добавлены к лункам, и клетки могут быть отображены в прямом эфире. В противном случае, переходите к шагам, описанным ниже.
    6. Закрепить клетки, помещая их в 1 мл 10% -ного формалина при комнатной температуре в течение 20 мин.
    7. Удалите формалина и промыть фиксированные клетки с дистиллированной водой в течение 5 мин. Повторить смывает 3x.
    8. Необязательный шаг:. Выполните иммунофлюоресценции окрашивание или другие counterstains для представляющих интерес белков 8,9
    9. Изображение или обнаружить NIR кальция пятно с использованием соответствующей флуоресценции длины волн возбуждения (например, NIR кальция может быть возбуждена 650-678 нм) света и фильтров излучения (~ 680-700 нм).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Аортальный кальциноз в MGP - / - и дикого типа мышей измеряли с помощью визуализации NIR кальция флуоресценции. Нет сигнала БИК кальция не был обнаружен в аорте мышей дикого типа, что указывает на отсутствие кальцификации (рисунок 2). Сильный сигнал БИК кальция был обнаружен в аорте из MGP-дефицитных мышей, что согласуется с усовершенствованным кальциноза сосудов. Тканевые слои аорте из дикого типа и MGP - / - мышей окрашивали ализарин красным 25 (фиг.3А - B), что подтверждает обширное кальциноза сосудов , наблюдаемый в MGP-дефицитных мышей, без кальцификации обнаружены у мышей дикого типа. Для того, чтобы определить , является ли кальциноза сосудов , связанная с дефицитом MGP зависит от передачи сигналов BMP, MGP - / - мышей обрабатывали LDN, алк3-Fc, или транспортного средства , начиная с 1 -й день жизни. Эти мышам вводили кальция NIR на 27-й день иАорты собирали на следующий день. Фармакологическая ингибирование BMP сигнализации снижается кальцификации аорты , обнаруженных с помощью кальция НДК (рисунок 2). По аналогии с выводами с кальцием НДК, в аортах LDN- и алк3-Fc обработанных MGP - / - мышей сократили ализарин красное пятно кальция по сравнению с обработанных носителем MGP - / - мышей (рис 3B - D). Эти результаты указывают на то, что передача сигналов BMP необходима для сосудистой кальцификации , наблюдаемой в MGP - / - мышей.

    LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров развиваться как макрофаг воспаление и кальцификации артериальной стенки 11 Одновременное введение хвостовой вены кальциноза и катепсина-специфического NIR зондов в MGP -. / - Мышей было проведено с целью определить , является ли сосудистой кальцификации MGP -deficiency связан с макрофагами накопления 25 LDLR -. / - мышей , получавшихс высоким содержанием жира и дикого типа мышей использовали в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно. Аорте от мышей дикого типа не обнаруживали практически не NIR кальция или катепсина NIR сигнал, как и ожидалось (рис 4A). Колокализуются кальция NIR и катепсина NIR сигналы которые способствовали аортального область арки наблюдались в LDLR - / - мышей, что указывает на сильную связь между макрофагальной инфильтрации и сосудистой кальцификации в этой модели интимы атеросклероза. Хотя сигнал диффузного и NIR сильный кальция наблюдалось в аортах MGP - / - мышей, сигнал катепсина NIR ничем не отличалась от таковой у мышей дикого типа. Эти данные свидетельствуют о том, что сосудистой кальцификации при дефиците MGP происходит при отсутствии макрофагального накопления. Для дальнейшего подтверждения этих выводов из аорты дикого типа, MGP - / -, а LDLR - / - мышей собирали, делали срезы и окрашивали антителом , специфичным для макрофага маркера МАС-2 ( - / - мышей показали , обильные MAC-2 окрашивания; не было обнаружено МАС-2 окрашивания в аортах MGP - / - мышей, что указывает на отсутствие сосудистых макрофагов.

    Для моделирования кальциноза сосудов в пробирке, VSMCs аортальные выделяли из дикого типа и MGP - / - мышей и культивировали в высокой фосфат , содержащий носитель, с использованием протокола , описанного выше. Для того, чтобы определить роль в модуляции MGP кальцификации культивируемых VSMCs, аденовирус выражения MGP (Ad.MGP) был использован для восстановления MGP в аорте VSMCs из MGP - / - мышей. MGP-дефицитные VSMCs, инфицированных аденовирусом, экспрессирующим зеленый флуоресцентный белок (Ad.GFP) использовали в качестве контроля. Кроме того, чтобы определить эффект удаления экспрессии MGP из VSMCs на последующей кальцинации, аортальные VSMCs от мышей дикого типа обрабатывали миРНК, направленной против MGP (siMGP) или контроль миРНК (SISC). Кальциноза индуцировали в культивируемых VSMCs выращиванием клеток в кальцификации носителям в течение 7 дней. Затем клетки фиксировали и окрашивали для кальция с использованием метода фон Косса. Восстановление MGP с Ad.MGP снижается кальцификации MGP - / - VSMCs по сравнению с контрольными аденовирусные обработанных клеток (рис 5A - В, Е). Лечение дикого типа аорты VSMCs с siMGP, что приводит к> 95% нокдауна экспрессии MGP, 25 увеличилась по сравнению с кальцификации SISC-обработанных клеток (рис 5С - D, F). Эти результаты указывают на то, что это в пробирке модель VSMC кальцификации мимике находки в MGP-дефицитных мышей и показывает , что MGP модулирует кальцификации культивируемых VSMCs.

    Альтернативный метод обнаружения кальцификации культурных VSMCs является кальцием НДК. Для моделирования сосудистой кальцификации в V ITRO, VSMCs коронарной артерии человека были закуплены и культивировали в течение 21 дней в кальцификации СМИ B. После периода лечения, кальцификации был идентифицирован с помощью метода NIR кальция и культуры были контрастно с пользовательских зелено-флуоресцентной коллагеновой зонда 51 и Hoechst краситель (1 мкг / мл в течение 5 мин после фиксации в 10% формалине) (рисунок 6). Ядер VSMC наблюдались с голубой флуоресценции Hoechst с помощью конфокальной микроскопии (рис 6А). Представитель оптическая секция показывает кальция NIR-окрашенного кальциевые минерал внутри коллагеновых матрицы производимого VSMCs (рис 6В). Трехмерных реконструкций оптических Z-стеки иллюстрируют слоев , созданных в культуре как VSMCs на дне колодца производят коллагеновый матрикс , в котором осажденный кальцинирующая минерал становится захваченной (фиг.6С - D).

    Re 1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54017 / 54017fig1.jpg "/>
    Рисунок 1:. Представитель Рассечение аорте из мыши дикого типа (А) картина грудной и брюшной аорты , простирающейся к общей раздвоения подвздошных артерий изображен после удаления вышележащих органов и жира пери-аорты. (В) Сфокусированный вид дуги аорты с брахиоцефальный, в левую общую сонную и левой подключичной артерии. Шкала баров = 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    фигура 2
    Рисунок 2: Сосудистый Кальцификация в MGP - / - мышей зависит от BMP Signaling MGP - / - мышей обрабатывали внутрибрюшинного (ф) инъекции либо ве. биль, LDN-193189 (LDN, 2,5 мг / кг / день), или алк3-Fc (2 мг / кг каждый день) и дикого типа мышей обрабатывали IP-инъекции транспортного средства не начиная с 1-й день жизни до 28-й день . На 27-й день, мышам вводили БИК кальция через хвостовую вену. Аорте, собирали на 28-й день и визуализируют с помощью ближней инфракрасной флуоресценции. Изображения при том же увеличении во всех четырех панелей с масштабной линейки, указывающей на 3 мм. Дикого типа мыши аорты не проявляли NIR сигнал кальция в то время как от MGP Аорты - / - мышей имели сильный сигнал NIR кальция. По сравнению с обработанных носителем MGP - / - мышей, аорты из MGP - / - мышей , получавших либо LDN или алк3-Fc показали значительно снижается NIR сигналы кальция. Эта цифра взята из ссылки 25. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54017 / 54017fig3.jpg "/>
    Рисунок 3: Фармакологические ингибирование BMP Signaling Предотвращает Аортальной кальцификации в MGP-дефицитных мышей мышей дикого типа обрабатывали IP - инъекции транспортного средства (А) и MGP - / - мышей обрабатывали либо IP - инъекции транспортного средства (B), LDN. (с, 2,5 мг / кг / день), или алк3-Fc (D, 2 мг / кг через день) , начиная с 1 -й день жизни до 28 -й день аорте были собраны, рассекают и окрашивают для кальция ализариновым красным. Изображения были взяты при том же увеличении во всех четырех панелей с масштабной линейки, указывающей 400 мкм. Подобно NIR кальция сигналов на рисунке 2, красное окрашивание Ализарин демонстрирует тяжелое бремя кальцификации в аорте транспортного средства , обработанных MGP - / - мышей. Кальцификация уменьшается в аортах LDN- и алк3-Fc обработанных MGP - / - мышей. Эта цифра взята изссылка 25. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 4
    . Рисунок 4: Синхронный Определение Аортальной кальцификации и макрофагальная инфильтрация с кальцием НДК и катепсина НДК (A) дикого типа, MGP - / - и LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров были введены с кальцием НДК и катепсина НДК посредством инъекции в хвостовую вену. Аорте собирали 24 ч позже и оценивали с помощью ближней инфракрасной флуоресценции. Изображения при том же увеличении с масштабной линейки, указывающей на 3 мм. У мышей дикого типа не проявляют практически никакого аортальный кальциноз или макрофагами присутствия. Аорты от LDLR - / - мыши имеют обширную кальцификации , что совместное локализуется с накоплением макрофагов. В противоположность этому, MGP - / - Мыши имеют кальциноз аортального , что происходит при отсутствии инфильтрации макрофагами. (В) аорте собирали из дикого типа, MGP - / - и LDLR - / - мышей кормили высоким содержанием жиров. Эти Аорты рассекают и окрашивают для макрофагов с антителом, специфическим для MAC-2. Ядра окрашивали DAPI. Люменальной поверхность в направлении справа на каждой панели. Изображения были взяты при том же увеличении во всех трех панелях со шкалой бар, указывающей 100 мкм. По аналогии с выводами , содержащимися в (А), не было никаких доказательств накопления макрофагов в аортах MGP - / - мышей. Эта цифра представляет собой модифицированную версию фигуры из ссылки 25. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    .jpg "/>
    . Рисунок 5: MGP защищает культивированных VSMCs от кальцификации культивированный аортальные VSMCs были изолированы от MGP - / - мышей и инфицировали аденовирусом экспрессирующие либо GFP (А) или MGP (B). Аневризмы VSMCs , выделенные из мышей дикого типа были трансфицированы либо контролем зашифрованным миРНК (С) или миРНК ориентации MGP (D). Клетки выращивали в кальцификации носителям в течение 7 дней, а затем фиксировали и окрашивали фон Косса. Изображения были взяты при том же увеличении во всех четырех группах (A - D) со шкалой бар , указывающей 200 мкм. Последовательные поля зрения были сфотографированы и количественно для окрашивания кальция с использованием изображения программное обеспечение J после вычитания фона (E и F), с ошибками , указывающими SEM. Эта цифра представляет собой модифицированную версию фигуры из ссылки 25.4017fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Рисунок 6
    Рис . 6: Кальций NIR Обозначает Кальцификация в ассоциации с внеклеточным матриксом в пробирке (A) VSMCs человека коронарной артерии культивировать в кальцификации СМИ В течение 21 дней были идентифицированы с помощью ядерного окрашивания с использованием Hoechst красителя. (В) Оптический сечение , полученный с помощью конфокальной микроскопии БИК кальция окрашивания (красный) в сочетании с зеленым-флуоресцентный коллагеновой зонда показывает кальциевые минерал по всей коллагеновой матрице. Изображения A - B были взяты при том же увеличении с масштабной линейки , указывающей 10 мкм. (C и D) трехмерных реконструкций показывают накапливания кальцинирующая минерала в тон коллагеном матрицу. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Артериальное кальцификации является важным фактором риска развития сердечно - сосудистых заболеваний у людей и может внести свой ​​вклад непосредственно в патогенезе сердечно - сосудистых событий. 1,5,52 интимы отложение кальция в тонких волокнистых шапок атеросклерозом было предложено увеличить местную биомеханической стресс и способствуют разрыв бляшки. 53,54 Срединные кальцификации последствия клинических исходов за счет повышения жесткости артерий, что может вызвать гипертрофию сердца и влиять на сердечную функцию. 55 Таким образом, понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе сосудистой кальцификации обеспечит важную информацию о болезни человека и потенциально идентифицировать новые цели для терапия.

    Здесь, способ обнаружения кальцификации аортального и макрофагального накопления в мышиных моделях атеросклероза и кальциноза сосудов с использованием изображений NIRF описана. 9 Очень важно , чтобы точно вводить НДКF агентов в хвостовую вену. Это метод , который требует значительной практики , прежде чем мастерство достигается. 56 Кроме того, важно , чтобы удалить все пери-аортальный жира из аорты, так как этот жир может вызвать сигнал autofluorescent на той же длине волны, что и кальция НДК и катепсина NIR сигналы. Использование агентов NIRF имеет много важных преимуществ по сравнению со стандартными гистологических методов оценки сосудистой кальцификации и воспаление. В отличие от обычных гистологической техники, эти агенты позволяют количественно оценить всю аортального кальциноза и инфильтрацию макрофагов. Кроме того, они обеспечивают более чувствительный метод для выявления ранних изменений , связанных с развитием аортальной кальцификации , чем гистологического окрашивания и поэтому может предложить механистических понимание ранних стадиях заболевания. 9 мест раннего сигнала NIR кальция связаны с маркерами образования костной ткани, как рост активность щелочной фосфатазы, как вэйл как выражение Runx2 и остеопонтина гена. Кроме того, одновременное использование спектрально различных зондов для кальцификации и катепсина активности позволяет количественно оценить и объединение пространственно - временной прогрессии как атеросклеротической и кальцинирующая заболевания. 9

    Определение пространственно-временных характеристик кальцификации сосудов и воспаления помогает в нашем понимании основных патофизиологических механизмов сосудистых заболеваний. Например, использование агентов NIRF показал , что в моделях интимы кальцификации (АпоЕ - / - и LDLR - / - мышей на высоким содержанием жиров), сосудистой кальцификации совместно локализуется на участках накопления макрофагов (Рисунок 4) и что кальциноз следует накопление макрофагов во времени. 9,11 Интересно отметить , что нет макрофагального накопления с катепсина НДК не был обнаружен в медиальном кальциноза сосудов , найденного в MGP-дефицитных мышей. 25 чтс, из экспериментов с использованием агентов NIRF, можно сделать вывод о том, что несмотря на то макрофаг накопление связано с сосудистой интимы кальцификации, это не требуется для сосудов медиальной кальцификации.

    Подобно его роль в визуализации и изучения сосудистых заболеваний, формирования изображения NIRF была использована для изучения аортального клапана. 47 аортального клапана характеризуется липидами макрофагами и кальцинозных поражений на клапане и имеет аналогичные основные молекулярные механизмы и генетические детерминанты как атеросклероз . 57-59 кальцификации клапана аорты приводит к нарушению функции створок и является основной причиной клинической аортального стеноза у пожилых людей. Единственным способом лечения в настоящее время доступны для симптоматического аортального стеноза является замена клапана. Более глубокое понимание молекулярных механизмов аортального клапана необходимо, чтобы предотвратить поздней стадии клинических осложнений прогрессивной кальцификации клапана аорты. Использование Н.И.Радиочастотные агенты в качестве инструментов молекулярной визуализации в животных моделях обеспечивает чувствительный метод оценки аортального клапана на самых ранних стадиях. 60

    Стандартные методы для визуализации коронарных бляшек артерии сосредоточили от тяжести стеноза, однако большинство острых коронарных синдромов являются результатом разрыва недействующих проточных ограничивающими бляшек. 6 биологических процессов внутри бляшек, такие как воспаление, служат в качестве лучшего предикторы разрыва бляшки чем степень стеноза. 61 в отличие от традиционных методов визуализации, NIRF изображений дает возможность измерять клеточную активность (т.е. макрофага протеолитическую активность с матричной металлопротеиназы (ММР) активируемый агент, протеолитической и эластолитической активности с катепсина НДК и остеогенной активности с НДК кальция). 9 Этот метод поэтому обеспечивает одновременное функциональное и анатомическое оценку сердечно - сосудистых заболеваний. NIRF изображений использует еxcitation длины волн в диапазоне от 650 до 900 нм, который имеет преимущество в повышенной проникновения в ткани по сравнению с подсветке при более низкой длины волны, таким образом , что обеспечивает большую оценку глубины поражения заболеванием. 60 Там также снижается autofluorescent фоновый сигнал сосудистой ткани в ближнем -Инфракрасный диапазон длин волн. Хотя этот протокол фокусируется на использовании NIRF визуализации ех естественных условиях, NIRF изображения также представляет собой полезную платформу для продольной молекулярной визуализации в естественных условиях. 9 NIRF изображения, в сочетании с прижизненной микроскопии, может иметь в будущем диагностические применения в организме человека. 61 Тем не менее, ограничение БИК визуализации кальция в продольном направлении является то , что бисфосфонат полученный зонд может сам изменять физиологическое процесс кальцификации. 62

    Сердечно - сосудистые кальцификации активно регулируется процесс , который включает в себя трансдифференцировки VSMCs к остеогенной фенотипа. 25,41,42 63 и достиг достаточного количества клеток на мышиной аорты проводить исследования в условиях in vitro (рисунок 5). Альтернативным меняThOD для изоляции VSMC не предполагает ферментативного пищеварения, а скорее прямую культуру эксплантированных колец аорты; Эта методика, как сообщается, дают меньше клеток , чем техника с использованием ферментативного расщепления. 63,64

    Два различных кальцификации средства массовой информации, либо с βGP / Asc / DEX 65,66 или NaPhos, 25,43 описаны , которые могут быть использованы , чтобы вызвать кальцификацию VSMCs. Оба типа сред были использованы для отвердевают мышиные VSMCs с эквивалентным успехом. В то время как кальцификации средах , содержащих βGP / Asc / DEX был использован для отвердевают человека VSMCs (рисунок 6), средства массовой информации , содержащей NaPhos не была эффективной в обызвествляющиеся человеческих VSMCs в нашем опыте. Кроме того, 21 - 28 дней культуры человеческих VSMCs в кальцификации СМИ B может потребоваться до того кальцификации обнаружено. Обызвествление VSMCs дикого типа в пробирке был увеличен , когда уровни экспрессии MGP были сокращены с миРНК и calcificatiна была уменьшена в MGP - / - VSMCs когда выражение MGP было восстановлено (Рисунок 5). Эти результаты согласуются с аортального кальцификации , наблюдаемой в MGP - / - мышей , и предполагают , что этот метод в пробирке VSMC кальцификации служит полезной модели кальцификации в естественных условиях. Важно отметить, однако, что существуют ограничения в отношении выводов неповрежденных кровеносных сосудов из культивируемых VSMCs. Культивированный VSMCs могут потерять свои свойства в естественных условиях сократительные, особенно при более высоких пассажей, в дополнение к разработке изменений в экспрессии генов моделей, морфологии и жесткости. 67-70 VSMCs культивировать в обызвествляющиеся СМИ действительно дифференцироваться к остеобластов линии до кальцификации, но не демонстрируют chondrocytic промежуточный продукт, который часто наблюдается в естественных условиях. 71 поэтому важно , чтобы механистические выводы , сделанные из культивируемых клеток быть подтверждено в системах в естественных условиях. НаE потенциальный способ преодоления этого ограничения является изучение VSMCs в их состоянии в естественных условиях с использованием ферментированного неповрежденную кольцо сосуда. 70

    Существует два способа представлены для обнаружения кальцификации культивируемых VSMCs, метод фон Косса (рисунок 5) и НДК кальция окрашивания (рисунок 6). Хотя часто используется для оценки кальцификации, метод фон Косса несколько ограничена его уменьшенной специфичности кристаллов кальция. 50 кальция NIR ощущается быть специфическими для кальцификации и особенно выгодно тем , что она позволяет одновременно окрашивания с дополнительным спектрально-отчетливой флуоресцентной агенты. 9 Будущие применения этого протокола с использованием NIR кальция с дополнительными молекулярных зондов могут предоставить важную информацию о механизмах кальцификации и может позволить быструю оценку низкомолекулярные ингибиторы VSMC кальцификации в высокой пропускной способности таким образом, чтобы Identify потенциальные терапии новыми для сосудистой кальцификации.

    Таким образом, сердечно-сосудистой кальцификации является важным фактором риска развития и потенциальный вклад в клинической картины заболевания. Знание механизмов сердечно-сосудистой кальцификации и атеросклеротической болезни зависит от как животного, так и моделей на основе клеток. Методологии для оценки кальцификации в естественных условиях, экс естественных условиях, так и в лабораторных моделях имеют решающее значение для улучшения нашего понимания сердечно - сосудистых заболеваний.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    15 ml conical tube Falcon 352096
    30 G needle BD 305106
    Alpha smooth muscle actin antibody Sigma SAB2500963
    Chamber slide Nunc Lab-Tek 154461
    Collagenase, Type 2  Worthington LS004176
    Dexamethasone Sigma D4902
    Dulbecco's Modified Eagle Medium Life Technologies 11965-084
    Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, no calcium Gibco 14190-144
    Elastase Sigma E1250
    Fetal bovine serum Gibco 16000-044
    Forceps, fine point Roboz RS-4972
    Forceps, full curve serrated Roboz RS-5138
    Formalin (10%) Electron Microscopy Sciences 15740
    Hank's Balanced Salt Solution Gibco 14025-092
    Human coronary artery smooth muscle cells PromoCell C-12511
    Insulin syringe with needle Terumo SS30M2913
    L-ascorbic acid Sigma A-7506
    Micro-dissecting spring scissors (13 mm) Roboz RS-5676
    Micro-dissecting spring scissors (3 mm) Roboz RS-5610
    NIR, cathepsin (ProSense-750EX) Perkin Elmer NEV10001EX
    NIR, osteogenic (OsteoSense-680EX) Perkin Elmer NEV10020EX
    Normal Saline Hospira 0409-4888-10
    Nuclear fast red Sigma-Aldrich N3020
    Odyssey Imaging System Li-Cor Odyssey 3.0
    Penicillin/Streptomycin Corning 30-001-CI
    Silver nitrate (5%) Ricca Chemical Company 6828-16
    Sodium phosphate dibasic heptahydrate Sigma-Aldrich S-9390
    Sodium thiosulfate Sigma S-1648
    ß-glycerophosphate disodium salt hydrate Sigma G9422
    Tissue culture flask, 25 cm2 Falcon 353108
    Tissue culture plate (35 mm x 10 mm) Falcon 353001
    Tissue culture plate, six-well Falcon 353046
    Trypsin Corning 25-053-CI
    Tube rodent holder Kent Scientific RSTR551
    Vacuum-driven filtration system Millipore SCGP00525

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Go, A. S., et al. Heart disease and stroke statistics--2014 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 129 (3), e28-e292 (2014).
    2. Wilson, P. W., et al. Abdominal aortic calcific deposits are an important predictor of vascular morbidity and mortality. Circulation. 103 (11), 1529-1534 (2001).
    3. Budoff, M. J., et al. Assessment of coronary artery disease by cardiac computed tomography: a scientific statement from the American Heart Association on Committee on Cardiovascular Imaging and Intervention, Council on Cardiovascular Radiology and Intervention, and Committee on Cardiac Imaging, Council on Clinical Cardiology. Circulation. 114 (16), 1761-1791 (2006).
    4. Greenland, P., LaBree, L., Azen, S. P., Doherty, T. M., Detrano, R. C. Coronary artery calcium score combined with Framingham score for risk prediction in asymptomatic individuals. Jama. 291 (2), 210-215 (2004).
    5. Otsuka, F., Sakakura, K., Yahagi, K., Joner, M., Virmani, R. Has our understanding of calcification in human coronary atherosclerosis progressed? Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 724-736 (2014).
    6. Virmani, R., Burke, A. P., Farb, A., Kolodgie, F. D. Pathology of the vulnerable plaque. J Am Coll Cardiol. 47 (8 Suppl), C13-C18 (2006).
    7. Amann, K. Media calcification and intima calcification are distinct entities in chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol. 3 (6), 1599-1605 (2008).
    8. Aikawa, E., et al. Arterial and aortic valve calcification abolished by elastolytic cathepsin S deficiency in chronic renal disease. Circulation. 119 (13), 1785-1794 (2009).
    9. Aikawa, E., et al. Osteogenesis associates with inflammation in early-stage atherosclerosis evaluated by molecular imaging in vivo. Circulation. 116 (24), 2841-2850 (2007).
    10. Qiao, J. H., et al. Pathology of atheromatous lesions in inbred and genetically engineered mice. Genetic determination of arterial calcification. Arterioscler Thromb. 14 (9), 1480-1497 (1994).
    11. Derwall, M., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (3), 613-622 (2012).
    12. Luo, G., et al. Spontaneous calcification of arteries and cartilage in mice lacking matrix GLA protein. Nature. 386 (6620), 78-81 (1997).
    13. Shobeiri, N., Adams, M. A., Holden, R. M. Vascular calcification in animal models of CKD: A review. Am J Nephrol. 31 (6), 471-481 (2010).
    14. Keutel, J., Jorgensen, G., Gabriel, P. [A new autosomal-recessive hereditary syndrome. Multiple peripheral pulmonary stenosis, brachytelephalangia, inner-ear deafness, ossification or calcification of cartilages]. Dtsch Med Wochenschr. 96 (43), 1676-1681 (1971).
    15. Munroe, P. B., et al. Mutations in the gene encoding the human matrix Gla protein cause Keutel syndrome. Nat Genet. 21 (1), 142-144 (1999).
    16. Cormode, E. J., Dawson, M., Lowry, R. B. Keutel syndrome: clinical report and literature review. Am J Med Genet. 24 (2), 289-294 (1986).
    17. Fryns, J. P., van Fleteren, A., Mattelaer, P., van den Berghe, H. Calcification of cartilages, brachytelephalangy and peripheral pulmonary stenosis. Confirmation of the Keutel syndrome. Eur J Pediatr. 142 (3), 201-203 (1984).
    18. Ozdemir, N., et al. Tracheobronchial calcification associated with Keutel syndrome. Turk J Pediatr. 48 (4), 357-361 (2006).
    19. Cranenburg, E. C., et al. Circulating matrix gamma-carboxyglutamate protein (MGP) species are refractory to vitamin K treatment in a new case of Keutel syndrome. J Thromb Haemost. 9 (6), 1225-1235 (2011).
    20. Meier, M., Weng, L. P., Alexandrakis, E., Ruschoff, J., Goeckenjan, G. Tracheobronchial stenosis in Keutel syndrome. Eur Respir J. 17 (3), 566-569 (2001).
    21. Wang, Y., et al. Common genetic variants of MGP are associated with calcification on the arterial wall but not with calcification present in the atherosclerotic plaques. Circ Cardiovasc Genet. 6 (3), 271-278 (2013).
    22. Cassidy-Bushrow, A. E., et al. Matrix gla protein gene polymorphism is associated with increased coronary artery calcification progression. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (3), 645-651 (2013).
    23. Crosier, M. D., et al. Matrix Gla protein polymorphisms are associated with coronary artery calcification in men. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 55 (1), 59-65 (2009).
    24. Liu, Y. P., et al. Inactive matrix Gla protein is causally related to adverse health outcomes: a Mendelian randomization study in a Flemish population. Hypertension. 65 (2), 463-470 (2015).
    25. Malhotra, R., et al. Inhibition of bone morphogenetic protein signal transduction prevents the medial vascular calcification associated with matrix Gla protein deficiency. PLoS One. 10 (1), e0117098 (2015).
    26. Demer, L. L., Tintut, Y. Inflammatory, metabolic, and genetic mechanisms of vascular calcification. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (4), 715-723 (2014).
    27. Rusanescu, G., Weissleder, R., Aikawa, E. Notch signaling in cardiovascular disease and calcification. Curr Cardiol Rev. 4 (3), 148-156 (2008).
    28. Leopold, J. A. Vascular calcification: Mechanisms of vascular smooth muscle cell calcification. Trends Cardiovasc Med. 25 (4), 267-274 (2015).
    29. Bostrom, K. I., Rajamannan, N. M., Towler, D. A. The regulation of valvular and vascular sclerosis by osteogenic morphogens. Circ Res. 109 (5), 564-577 (2011).
    30. Hruska, K. A., Mathew, S., Saab, G. Bone morphogenetic proteins in vascular calcification. Circ Res. 97 (2), 105-114 (2005).
    31. Yao, Y., et al. Inhibition of bone morphogenetic proteins protects against atherosclerosis and vascular calcification. Circ Res. 107 (4), 485-494 (2010).
    32. Bostrom, K., et al. Bone morphogenetic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest. 91 (4), 1800-1809 (1993).
    33. Bragdon, B., et al. Bone morphogenetic proteins: a critical review. Cell Signal. 23 (4), 609-620 (2011).
    34. Cai, J., Pardali, E., Sanchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. BMP signaling in vascular diseases. FEBS Lett. 586 (14), 1993-2002 (2012).
    35. Lee, K. S., et al. Runx2 is a common target of transforming growth factor beta1 and bone morphogenetic protein 2, and cooperation between Runx2 and Smad5 induces osteoblast-specific gene expression in the pluripotent mesenchymal precursor cell line C2C12. Mol Cell Biol. 20 (23), 8783-8792 (2000).
    36. Matsubara, T., et al. BMP2 regulates Osterix through Msx2 and Runx2 during osteoblast differentiation. J Biol Chem. 283 (43), 29119-29125 (2008).
    37. Li, X., Yang, H. Y., Giachelli, C. M. BMP-2 promotes phosphate uptake, phenotypic modulation, and calcification of human vascular smooth muscle cells. Atherosclerosis. 199 (2), 271-277 (2008).
    38. Nakagawa, Y., et al. Paracrine osteogenic signals via bone morphogenetic protein-2 accelerate the atherosclerotic intimal calcification in vivo. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 30 (10), 1908-1915 (2010).
    39. Cuny, G. D., et al. Structure-activity relationship study of bone morphogenetic protein (BMP) signaling inhibitors. Bioorg Med Chem Lett. 18 (15), 4388-4392 (2008).
    40. Yu, P. B., et al. BMP type I receptor inhibition reduces heterotopic ossification. Nat Med. 14 (12), 1363-1369 (2008).
    41. Schurgers, L. J., Uitto, J., Reutelingsperger, C. P. Vitamin K-dependent carboxylation of matrix Gla-protein: a crucial switch to control ectopic mineralization. Trends Mol Med. 19 (4), 217-226 (2013).
    42. Speer, M. Y., et al. Smooth muscle cells give rise to osteochondrogenic precursors and chondrocytes in calcifying arteries. Circ Res. 104 (6), 733-741 (2009).
    43. Speer, M. Y., Li, X., Hiremath, P. G., Giachelli, C. M. Runx2/Cbfa1 but not loss of myocardin, is required for smooth muscle cell lineage reprogramming toward osteochondrogenesis. J Cell Biochem. 110 (4), 935-947 (2010).
    44. Steitz, S. A., et al. Smooth muscle cell phenotypic transition associated with calcification: upregulation of Cbfa1 and downregulation of smooth muscle lineage markers. Circ Res. 89 (12), 1147-1154 (2001).
    45. Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney Int. 67 (6), 2488-2493 (2005).
    46. Zaheer, A., et al. In vivo near-infrared fluorescence imaging of osteoblastic activity. Nat Biotechnol. 19 (12), 1148-1154 (2001).
    47. Aikawa, E., et al. Multimodality molecular imaging identifies proteolytic and osteogenic activities in early aortic valve disease. Circulation. 115 (3), 377-386 (2007).
    48. Lee, K. J., Czech, L., Waypa, G. B., Farrow, K. N. Isolation of pulmonary artery smooth muscle cells from neonatal mice. J Vis Exp. (80), e50889 (2013).
    49. Tang, Y., Herr, G., Johnson, W., Resnik, E., Aho, J. Induction and analysis of epithelial to mesenchymal transition. J Vis Exp. (78), (2013).
    50. Puchtler, H., Meloan, S. N. Demonstration of phosphates in calcium deposits: a modification of von Kossa's reaction. Histochemistry. 56 (3-4), 177-185 (1978).
    51. Krahn, K. N., Bouten, C. V., van Tuijl, S., van Zandvoort, M. A., Merkx, M. Fluorescently labeled collagen binding proteins allow specific visualization of collagen in tissues and live cell culture. Anal Biochem. 350 (2), 177-185 (2006).
    52. Johnson, R. C., Leopold, J. A., Loscalzo, J. Vascular calcification: pathobiological mechanisms and clinical implications. Circ Res. 99 (10), 1044-1059 (2006).
    53. Vengrenyuk, Y., et al. A hypothesis for vulnerable plaque rupture due to stress-induced debonding around cellular microcalcifications in thin fibrous caps. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (40), 14678-14683 (2006).
    54. Maldonado, N., et al. A mechanistic analysis of the role of microcalcifications in atherosclerotic plaque stability: potential implications for plaque rupture. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303 (5), H619-H628 (2012).
    55. Toussaint, N. D., Kerr, P. G. Vascular calcification and arterial stiffness in chronic kidney disease: implications and management. Nephrology (Carlton). 12 (5), 500-509 (2007).
    56. Vines, D. C., Green, D. E., Kudo, G., Keller, H. Evaluation of mouse tail-vein injections both qualitatively and quantitatively on small-animal PET tail scans. J Nucl Med Technol. 39 (4), 264-270 (2011).
    57. Smith, J. G., et al. Association of low-density lipoprotein cholesterol-related genetic variants with aortic valve calcium and incident aortic stenosis. Jama. 312 (17), 1764-1771 (2014).
    58. Thanassoulis, G., et al. Genetic associations with valvular calcification and aortic stenosis. N Engl J Med. 368 (6), 503-512 (2013).
    59. Otto, C. M., Kuusisto, J., Reichenbach, D. D., Gown, A. M., O'Brien, K. D. Characterization of the early lesion of 'degenerative' valvular aortic stenosis. Histological and immunohistochemical studies. Circulation. 90 (2), 844-853 (1994).
    60. New, S. E., Aikawa, E. Molecular imaging insights into early inflammatory stages of arterial and aortic valve calcification. Circ Res. 108 (11), 1381-1391 (2011).
    61. Jaffer, F. A., Libby, P., Weissleder, R. Optical and multimodality molecular imaging: insights into atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (7), 1017-1024 (2009).
    62. Stern, P. H. Antiresorptive agents and osteoclast apoptosis. J Cell Biochem. 101 (5), 1087-1096 (2007).
    63. Ray, J. L., Leach, R., Herbert, J. M., Benson, M. Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta. Methods Cell Sci. 23 (4), 185-188 (2001).
    64. Chamley-Campbell, J., Campbell, G. R., Ross, R. The smooth muscle cell in culture. Physiol Rev. 59 (1), 1-61 (1979).
    65. Trion, A., Schutte-Bart, C., Bax, W. H., Jukema, J. W., van der Laarse, A. Modulation of calcification of vascular smooth muscle cells in culture by calcium antagonists, statins, and their combination. Mol Cell Biochem. 308 (1-2), 25-33 (2008).
    66. Mori, K., Shioi, A., Jono, S., Nishizawa, Y., Morii, H. Dexamethasone enhances In vitro vascular calcification by promoting osteoblastic differentiation of vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 19 (9), 2112-2118 (1999).
    67. Thyberg, J. Differentiated properties and proliferation of arterial smooth muscle cells in culture. Int Rev Cytol. 169, 183-265 (1996).
    68. Dinardo, C. L., et al. Vascular smooth muscle cells exhibit a progressive loss of rigidity with serial culture passaging. Biorheology. 49 (5-6), 365-373 (2012).
    69. Metz, R. P., Patterson, J. L., Wilson, E. Vascular smooth muscle cells: isolation, culture, and characterization. Methods Mol Biol. 843, 169-176 (2012).
    70. Proudfoot, D., Shanahan, C. Human vascular smooth muscle cell culture. Methods Mol Biol. 806, 251-263 (2012).
    71. Hruska, K. A. Vascular smooth muscle cells in the pathogenesis of vascular calcification. Circ Res. 104 (6), 710-711 (2009).

    Tags

    Медицина выпуск 111 сосудистой кальцификации клетки гладкой мышцы матрица GLA белка атеросклерозе макрофаг ближней инфракрасной области спектра флуоресцентные изображения воспаление сосудистой
    Обызвествление сосудистых гладких мышечных клеток и визуализации аортальной кальцификации и Воспаление
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    O'Rourke, C., Shelton, G.,… More

    O'Rourke, C., Shelton, G., Hutcheson, J. D., Burke, M. F., Martyn, T., Thayer, T. E., Shakartzi, H. R., Buswell, M. D., Tainsh, R. E., Yu, B., Bagchi, A., Rhee, D. K., Wu, C., Derwall, M., Buys, E. S., Yu, P. B., Bloch, K. D., Aikawa, E., Bloch, D. B., Malhotra, R. Calcification of Vascular Smooth Muscle Cells and Imaging of Aortic Calcification and Inflammation. J. Vis. Exp. (111), e54017, doi:10.3791/54017 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter